CN107831259A - 一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，包括步骤一，溶液配制，配制对照品储备液、内标储备液、流动相A、流动相B；步骤二，样品处理；步骤三，柱前衍生；步骤四，色谱分离，进样，梯度洗脱，检测波长依次为338nm、262nm，测出峰面积；步骤五，游离氨基酸含量计算。本发明具有以下优点和效果：采用柱前衍生的液相色谱，样品经过衍生后进样，通过色谱分离时的梯度洗脱，将脾氨肽内的游离氨基酸依次洗脱下来；通过选用氨基酸标准品进行色谱洗脱，计算出以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，再根据峰面积计算出脾氨肽内的游离氨基酸含量，测定结果准确性高，便于控制脾氨肽制品的含量。

Description

一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，特别涉及一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法。
背景技术
脾氨肽是从动物脏器中提取出来的一种生化药，主要成分包括氨基酸、多肽、核苷酸等物质，作为免疫调节剂，用于反复呼吸道感染、支气管炎、哮喘、肺炎、癌症等病症的辅助治疗。临床观察显示，能够有效提高患者的抵抗力，减少呼吸道感染的发生率，并具有调节细胞免疫的功能，脾氨肽中主要的活性物质为多肽，国家药品标准WS1-(X-002)-2002Z中，测定多肽的含量是控制脾氨肽产品含量的唯一指标，并没有对脾氨肽内游离氨基酸含量的测定和控制。
为进一步控制脾氨肽制品的品质和稳定，已有现有技术公开了脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，如山广志、左利民等人在中国新药杂质2013年第22卷第11期公开的文献“柱前衍生HPLC法测定脾氨肽口服液中17中游离氨基酸”，针对氨基酸分析仪测定法、离子色谱法等方法测定氨基酸时，需要价格昂贵的专用仪器，操作复杂，难以普及的缺陷，设计了柱前衍生HPLC测定脾氨肽内游离氨基酸的方法。左广志等人在文献中指出，脾氨肽口服液在色谱分离前经过各种强制条件降解破坏后，游离氨基酸含量有所增加，其他降解产物不影响各氨基酸的测定。
脾氨肽内主要成分为多肽、核苷酸、游离氨基酸，成分中以多肽稳定性较差，因此脾氨肽多经过冷冻干燥处理后以冻干粉的形式保存。但是上述游离氨基酸的测定过程中，脾氨肽口服液在强制条件降解破坏过程中，脾氨肽内的多肽容易发生降解形成氨基酸，出现左广志等人在文献中指出的现象，即在测定前游离氨基酸含量会增加，会影响测定结果的准确性。
发明内容
本发明的目的是提供一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，具有准确性高的效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，包括以下步骤，步骤一，溶液配制，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品，用HCl溶液稀释后，配制成对照品储备液；内标储备液，称取L-2氨基酸，溶于HCl溶液，配制成内标储备液；硼酸盐缓冲液，称取硼酸和氢氧化钠，溶于水后，用氢氧化钠溶液调节pH至10.2；邻苯二甲醛衍生试剂，称取邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3-巯基丙酸，再用硼酸盐缓冲液稀释，超声溶解；9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，称取9-芴甲基氯甲酸酯，用乙腈溶解；流动相A，磷酸氢二钠与硼酸钠缓冲液；流动相B，以体积比，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；进样溶剂，包括流动相A和磷酸；步骤二，样品处理，取脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，，振荡均匀后，静置30-50分钟，介孔二氧化硅微球孔径范围在7-11nm，粒径在1.0-1.5μm之间，介孔二氧化硅微球上负载有铁粒子；超声波处理0.5-1min，频率在21000-23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入内标储备液、HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液；步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液-吸取水解样品溶液-混合-等待2min-吸取邻苯二甲醛衍生试剂-混合-吸取9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂-混合-吸取进样溶剂-混合；步骤四，色谱分离，进样，梯度洗脱，检测波长依次为338nm、262nm，测出峰面积；步骤五，游离氨基酸含量计算，取对照品储备液，取不同浓度进行步骤二、步骤三、步骤四，以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，根据步骤四测出的峰面积，计算出各种氨基酸的含量。
通过采用上述技术方案，本申请采用色谱分离技术测定脾氨肽内游离氨基酸的含量，脾氨肽原液内存在分子量大小不一、稳定性较差的多肽，测定游离氨基酸含量时，多肽容易发生水解生成新的游离氨基酸，因此，有必要在测定游离氨基酸含量之前，去除脾氨肽原液内的多肽物质。本申请采用在脾氨肽原液内加入介孔二氧化硅微球，粒径在1.0μm-1.5μm之间，介孔孔径在7-11nm。介孔二氧化硅微球的介孔内形成疏水空腔，能够吸附多肽肽链上的疏水基团。同时介孔二氧化硅微球的介孔内负载铁粒子，通过铁粒子与多肽肽链的结合，进一步提高多肽与介孔二氧化硅微球之间的相互作用力。介孔二氧化硅微球在吸附多肽的同时，还能吸附部分带有疏水基团的游离氨基酸，通过超声处理使样品溶液内剧烈振荡后，吸附在介孔二氧化硅微球上的游离氨基酸脱离下来，多肽仍然吸附在介孔二氧化硅微球上，通过有机膜过滤，将吸附有多肽的介孔二氧化硅微球分离出来，得到的滤液经过处理后，依次柱前衍生、色谱分离，通过测出的峰面积计算出氨基酸的含量，在样品处理时将多肽从样品内分离，测定游离氨基酸含量时，准确性高。
本发明的进一步设置为：步骤一，溶液配制，对照品储备液，每份对照品储备液配制方法如下，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品各10mg，至10mL容量瓶，用0.1mol/LHCl稀释至刻度线，配制成1mg/mL对照品储备液；内标储备液，每份内标储备液配制方法如下，称取10mg L-2氨基酸，置于10mL容量瓶内，用0.1mol/LHCl稀释至刻度线，配制成浓度为1mg/mL的内标储备液；硼酸盐缓冲液，每份硼酸盐缓冲液配制方法如下，称取4.96g硼酸和2.28g氢氧化钠，加水溶解并稀释至200mL，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.2；邻苯二甲醛衍生试剂，每份邻苯二甲醛衍生试剂配制方法如下，称取50mg邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3-巯基丙酸100μL，再用硼酸盐缓冲液稀释至10mL，超声溶解,保存于4℃；9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，每份9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂配制方法如下，称取9-芴甲基氯甲酸酯25mg，用乙腈溶解并稀释至10mL；流动相A，由10mmol/L磷酸氢二钠与10mmol/L硼酸钠缓冲液；流动相B，以体积比计，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；进样溶剂，每份进样溶剂，包括100mL流动相A和0.25mL磷酸。
本发明的进一步设置为：步骤二，样品处理，取0.5mL脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，介孔二氧化硅微球孔径范围在7-11nm，粒径在1.0-1.5μm之间，振荡均匀后，静置30-50分钟；超声波处理0.5-1min，频率在21000-23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入0.5mL内标储备液、2mL的6M HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液。
通过采用上述技术方案，向滤液中加入内标储备液、HCl溶液后，混合，在真空下封口，在100℃水解24小时后，冷却开口得到水解液，水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干，用于去除HCl，再加入蒸馏水后得到水解样品溶液。
本发明的进一步设置为：步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液25μL-吸取水解样品溶液10μL-混合-等待2min-吸取邻苯二甲醛衍生试剂5μL-混合-吸取9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂4μL-混合-吸取进样溶剂320μL-混合。
通过采用上述技术方案，柱后衍生依赖色谱柱对氨基酸的分离，且需要消耗衍生剂的量较大，不适合多种氨基酸的同时分离，因此采用柱前衍生。
本发明的进一步设置为：步骤四，色谱分离，进样体积为20μL，色谱柱为硅胶柱，规格为4.6mm×100mm，2.4μm；流速为每分钟1mL，柱温40℃，梯度洗脱为时间0-0.5-20-20.1-23.5-23.6-25，流动相A-98％-98％-43％-0％-0％-98％-98％，0-16min，检测波长338nm；16-20，检测波长262nm，测出峰面积。
通过采用上述技术方案，色谱柱选用硅胶柱，直径4.6mm，柱长100mm，填料颗粒直径为2.4μm，在338nm处进行一级氨基酸的检测，在262nm处进行二级氨基酸的检测。
本发明的进一步设置为：步骤五，游离氨基酸含量计算，取对照品储备液，分别取1mmol/L、250μmol/L、100μmol/L、25μmol/L、10μmol/L浓度的对照品储备液，进行步骤二、步骤三、步骤四，以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，根据步骤四测出的峰面积，计算出各种氨基酸的含量。
通过采用上述技术方案，通过选取不同浓度的对照品储备液，进行步骤二、步骤三、步骤四，计算出线性回归方程。
本发明的进一步设置为：步骤一，对照品储备液内氨基酸标准品包括Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys、Pro。
通过采用上述技术方案，对照品内的氨基酸标准品，包括上述17种氨基酸的标准品。
综上所述，本发明具有以下有益效果：采用柱前衍生的液相色谱，样品经过衍生后进样，通过色谱分离时的梯度洗脱，将脾氨肽内的游离氨基酸依次洗脱下来；通过选用氨基酸标准品进行色谱洗脱，计算出以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，再根据峰面积计算出脾氨肽内的游离氨基酸含量，达到了测定结果准确性高、操作简单的效果。
附图说明
图1是实施例的游离氨基酸的出峰情况；
具体实施方式
实施例：一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，包括以下步骤，步骤一，溶液配制，对照品储备液，每份对照品储备液配制方法如下，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品各10mg，至10mL容量瓶，用0.1mol/LHCl稀释至刻度线，配制成1mg/mL对照品储备液。对照品储备液内氨基酸标准品包括Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys、Pro。
内标储备液，每份内标储备液配制方法如下，称取10mgL-2氨基酸，置于10mL容量瓶内，用0.1mol/LHCl稀释至刻度线，配制成浓度为1mg/mL的内标储备液。
硼酸盐缓冲液，每份硼酸盐缓冲液配制方法如下，称取4.96g硼酸和2.28g氢氧化钠，加水溶解并稀释至200mL，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.2。
邻苯二甲醛衍生试剂，每份邻苯二甲醛衍生试剂配制方法如下，称取50mg邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3-巯基丙酸100μL，再用硼酸盐缓冲液稀释至10mL，超声溶解,保存于4℃。
9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，每份9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂配制方法如下，称取9-芴甲基氯甲酸酯25mg，用乙腈溶解并稀释至10mL。
流动相A，由10mmol/L磷酸氢二钠与10mmol/L硼酸钠缓冲液。流动相B，以体积比，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；进样溶剂，每份进样溶剂，包括100mL流动相A和0.25mL磷酸。
步骤二，样品处理，取脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，介孔二氧化硅微球孔径范围在7-11nm，粒径在1.0-1.5μm之间，振荡均匀后，静置30-50分钟；超声波处理0.5-1min，频率在21000-23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入内标储备液、HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液。
步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液25μL-吸取水解样品溶液10μL-混合-等待2min-吸取邻苯二甲醛衍生试剂5μL-混合-吸取9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂4μL-混合-吸取进样溶剂320μL-混合。
步骤四，色谱分离，进样体积为20μL，色谱柱为硅胶柱，规格为4.6mm×100mm，2.4μm；流速为每分钟1mL，柱温40℃，梯度洗脱为时间0-0.5-20-20.1-23.5-23.6-25，流动相A-98％-98％-43％-0％-0％-98％-98％，0-16min，检测波长338nm；16-20，检测波长262nm，测出峰面积。
步骤五，游离氨基酸含量计算，游离氨基酸含量计算，取对照品储备液，分别取1mmol/L、250μmol/L、100μmol/L、25μmol/L、10μmol/L浓度的对照品储备液，进行步骤二、步骤三、步骤四，以溶液质量浓度X(mg/mL)对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，根据步骤四测出的峰面积，计算出各种氨基酸的含量。
多肽检测试验：步骤二样品处理中，用有机膜过滤后，分别收集滤液和沉淀，用BCA蛋白浓度试剂盒检测滤液和沉淀，沉淀颜色呈紫色，滤液颜色没有出现紫色。试验结果表明，介孔二氧化硅微球在去除脾氨肽内的多肽时效果较好。
表1-梯度洗脱
表2-氨基酸检测结果
峰编号 出峰时间 氨基酸 峰面积 峰面积百分比％
1 1.855 Asp 56245 7.74
2 3.418 Glu 146316 20.12
4 7.126 Ser 45403 6.24
5 8.052 his 34518 4.75
7 8.57 gly 17033 2.34
8 8.83 thr 44407 6.11
10 10.023 Arg 25844 3.55
11 10.232 ala 63582 8.74
13 11.655 Tyr 17416 2.39
14 13.113 cys 4677 0.64
15 13.88 val 40633 5.59
16 14.135 met 17050 2.34
18 15.648 phe 22055 3.03
19 15.851 lle 24705 3.4
20 16.599 Leu 47939 6.59
21 18.564 Lys 55229 7.6
22 20.91 pro 64024 8.81
表3-线性关系结果
成分 线性范围 线性方程
asp 1.33-133.11 Y＝1862.22649X+0.901218
glu 1.47-147.00 Y＝1662.715X-1.74997
ser 1.05-105.09 Y＝2450.29166X+0.328929
his 1.55-155.16 Y＝1111.24934X-0.174207
gly 0.75-75.00 Y＝3282.45187X+1.09743
thr 1.19-119.12 Y＝2112.21427X+0.917292
Arg 1.74-174.20 Y＝1509.96052X+0.124512
ala 0.89-89.00 Y＝2876.22628X+3.87668
Tyr 1.81-181.19 Y＝1341.89060X+0.280268
cys 2.40-240.30 Y＝1833.42834X+0.259261
val 1.17-117.15 Y＝2360.80910X+0.320589
met 1.49-149.21 Y＝1779.75210X-0.0999985
phe 1.65-165.19 Y＝1492.535X+0.144796
lle 1.31-131.16 Y＝1933.07786X+0.699395
leu 1.31-131.00 Y＝1934.36867X+3.22018
lys 1.47-146.19 Y＝2960.83196X-6.79988
pro 1.15-115.13 Y＝2311.71692X+8.15672
具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (7)

1.一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于，包括以下步骤
步骤一，溶液配制，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品，用HCl溶液稀释后，配制成对照品储备液；内标储备液，称取L-2氨基酸，溶于HCl溶液，配制成内标储备液；硼酸盐缓冲液，称取硼酸和氢氧化钠，溶于水后，用氢氧化钠溶液调节pH至10.2；邻苯二甲醛衍生试剂，称取邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3-巯基丙酸，再用硼酸盐缓冲液稀释，超声溶解；9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，称取9-芴甲基氯甲酸酯，用乙腈溶解；流动相A，磷酸氢二钠与硼酸钠缓冲液；流动相B，以体积比计，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；进样溶剂，包括流动相A和磷酸；
步骤二，样品处理，取脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，振荡均匀后，静置30-50分钟，介孔二氧化硅微球孔径范围在7-11nm，粒径在1.0-1.5μm之间，介孔二氧化硅微球上负载有铁粒子；超声波处理0.5-1min，频率在21000-23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入内标储备液、HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液；
步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液-吸取水解样品溶液-混合-等待2min-吸取邻苯二甲醛衍生试剂-混合-吸取9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂-混合-吸取进样溶剂-混合；
步骤四，色谱分离，进样，梯度洗脱，检测波长依次为338nm、262nm，测出峰面积；
步骤五，游离氨基酸含量计算，取对照品储备液，取不同浓度进行步骤二、步骤三、步骤四，以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，根据步骤四测出的峰面积，计算出各种氨基酸的含量。
2.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤一，溶液配制，
对照品储备液，每份对照品储备液配制方法如下，精密称取多种氨基酸标准品及氨基葡萄糖对照品各10mg，至10mL容量瓶，用0.1mol/LHCl稀释至刻度线，配制成1mg/mL对照品储备液；
内标储备液，每份内标储备液配制方法如下，称取10mgL-2氨基酸，置于10mL容量瓶内，用0.1mol/LHCl稀释至刻度线，配制成浓度为1mg/mL的内标储备液；
硼酸盐缓冲液，每份硼酸盐缓冲液配制方法如下，称取4.96g硼酸和2.28g氢氧化钠，加水溶解并稀释至200mL，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至10.2；
邻苯二甲醛衍生试剂，每份邻苯二甲醛衍生试剂配制方法如下，称取50mg邻苯二甲醛，加入硼酸盐缓冲液溶解，加入3-巯基丙酸100μL，再用硼酸盐缓冲液稀释至10mL，超声溶解,保存于4℃；
9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂，每份9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂配制方法如下，称取9-芴甲基氯甲酸酯25mg，用乙腈溶解并稀释至10mL；
流动相A，由10mmol/L磷酸氢二钠与10mmol/L硼酸钠缓冲液；
流动相B，以体积比，包括45份乙腈、45份甲醇、10份水；
进样溶剂，每份进样溶剂，包括100mL流动相A和0.25mL磷酸。
3.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤二，样品处理，取脾氨肽原液，加入介孔二氧化硅微球，介孔二氧化硅微球孔径范围在7-11nm，粒径在1.0-1.5μm之间，振荡均匀后，静置30-50分钟；超声波处理0.5-1min，频率在21000-23000HZ之间，用孔径为0.8μm的有机膜过滤；向滤液中加入内标储备液、HCl溶液，混合，真空下封口，在100℃水解24小时，冷却后开口，将水解液转移到蒸发皿，减压干燥后，加入蒸馏水，蒸干后，再加入蒸馏水得到水解样品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤三，柱前衍生，吸取硼酸盐缓冲液25μL-吸取水解样品溶液10μL-混合-等待2min-吸取邻苯二甲醛衍生试剂5μL-混合-吸取9-芴甲基氯甲酸酯衍生试剂4μL-混合-吸取进样溶剂320μL-混合。
5.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤四，色谱分离，进样体积为20μL，色谱柱为硅胶柱，规格为4.6mm×100mm，2.4μm；流速为每分钟1mL，柱温40℃，梯度洗脱为时间0-0.5-20-20.1-23.5-23.6-25，流动相A-98％-98％-43％-0％-0％-98％-98％，0-16min，检测波长338nm；16-20，检测波长262nm，测出峰面积。
6.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤五，游离氨基酸含量计算，游离氨基酸含量计算，取对照品储备液，分别取1mmol/L、250μmol/L、100μmol/L、25μmol/L、10μmol/L浓度的对照品储备液，进行步骤二、步骤三、步骤四，以溶液质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，计算出线性回归方程，根据步骤四测出的峰面积，计算出各种氨基酸的含量。
7.根据权利要求1所述的一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法，其特征在于：步骤一，对照品储备液内氨基酸标准品包括Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys、Pro。
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