CN113702541B - 茯苓药材特征图谱构建方法以及茯苓三萜类成分检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种茯苓药材特征图谱构建方法以及茯苓三萜类成分检测方法，构建方法包括：取茯苓对照药材和茯苓药材供试品，分别制备对照药材溶液和供试品溶液；采用高效液相色谱法对所述对照药材溶液和所述供试品溶液进行检测，将检测所述对照药材溶液所得图谱和检测所述供试品溶液所得图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，制定茯苓药材的特征图谱；检测所采用条件包括：固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A采用甲醇和乙腈的混合物，流动相B为乙酸溶液，采用梯度洗脱。本发明构建的特征图谱具有8个共有峰且能展示茯苓药材主要化学成分的特征，为茯苓药材的质量控制提供依据。

Description

茯苓药材特征图谱构建方法以及茯苓三萜类成分检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种茯苓药材特征图谱构建方法以及茯苓三萜类成分检测方法。
背景技术
《中国药典》2020年版记载，茯苓为多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核。茯苓是一种真菌类中药，多寄生于松科植物赤松(Pinus densiflora Sieb.etZucc)或者马尾松(Pinus massonianaLamb.)等树根上。茯苓(Poria cocos)隶属于真菌门(Eumycophyta)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、茯苓属(Wolfiporia)，又名茯灵、茯兔、松茯苓、松柏玉、玉灵、万灵桂、云苓、松薯等。
茯苓性味甘、淡、平，归心、肺、脾、肾经，载于《神农本草经》，列为上品，具有利水渗湿、健脾、宁心的功效，用于水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安和惊悸失眠等症，在临床上具有广泛的应用，因此展开对茯苓的质量控制工作尤显重要。
关于茯苓药材的质量控制，现行中国药典2020版第一部仅对水分、总灰分、浸出物及理化鉴别项做了规定，成分含量测定项及其他相关质量控制内容尚未收载。而文献大多采用紫外分光光度法对茯苓多糖、三萜类总成分进行含量测定。
因此，亟待构建一种茯苓药材的特征图谱，以期为茯苓药材的质量控制提供有效手段。
发明内容
基于以上背景技术，本发明的主要目的是提供一种茯苓药材的特征图谱的构建方法，通过该构建方法构建的特征图谱，能展示茯苓药材主要化学成分(即茯苓三萜类成分)的特征，为茯苓药材的质量控制提供依据。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种茯苓药材的特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
取茯苓对照药材和茯苓药材供试品，分别制备对照药材溶液和供试品溶液；
采用高效液相色谱法对所述对照药材溶液和所述供试品溶液进行检测，将检测所述对照药材溶液所得图谱和检测所述供试品溶液所得图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，制定茯苓药材的特征图谱；
检测所采用条件包括：固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A采用甲醇和乙腈的混合物，流动相B为乙酸溶液，采用梯度洗脱。
在其中一个实施例中，梯度洗脱的程序包括：
0min～9min，所述流动相A的体积百分比为63％；
9min～16min，所述流动相A的体积百分比上升至90％；
16min～20min，所述流动相A的体积百分比上升至100％；
20min～20.1min，所述流动相A的体积百分比下降至63％；
20.1min～25min，所述流动相A的体积百分比为63％。
在其中一个实施例中，所述流动相A包含体积比1：(3.5～4.5)的所述甲醇和所述乙腈；或/和，所述流动相B为含乙酸体积百分比为0.08％～0.12％的乙酸溶液。
在其中一个实施例中，制备所述供试品溶液的步骤包括：以甲醇为提取溶剂对所述茯苓药材供试品进行提取，去除所得提取液中的溶剂，所得残渣用甲醇溶解。
在其中一个实施例中，提取采用的方式为加热回流提取。
在其中一个实施例中，每1g所述茯苓药材供试品对应的所述提取溶剂的用量为20ml～30ml。
在其中一个实施例中，制备所述对照药材溶液的步骤包括：以甲醇为提取溶剂对所述茯苓对照药材进行提取，去除所得提取液中的溶剂，所得残渣用甲醇溶解。
在其中一个实施例中，提取采用的方式为加热回流提取；或/和，每1g所述茯苓对照药材对应的所述提取溶剂的用量为20ml～30ml。
在其中一个实施例中，检测所采用条件还包括：流速为0.35ml/min～0.45ml/min，柱温为28℃～32℃，波长为240nm～245nm。
在其中一个实施例中，所述特征图谱包含8个特征峰，其中，峰1为茯苓酸B，峰2为去氢土莫酸，峰3为茯苓酸A，峰4为猪苓酸C，峰7为去氢茯苓酸。
一种茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
提供含茯苓三萜类成分的对照品溶液，并取茯苓药材样品制备供试品溶液；
采用高效液相色谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，并根据检测所述对照品溶液所得图谱和检测所述供试品溶液所得图谱中各特征峰的峰面积，确定所述茯苓药材样品中所述茯苓三萜类成分的含量；
所述茯苓三萜类成分包含茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C和去氢茯苓酸中的至少一种；
检测所采用条件包括：固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A采用甲醇和乙腈的混合物，流动相B为乙酸溶液，采用梯度洗脱。
在其中一个实施例中，梯度洗脱的程序包括：
0min～9min，所述流动相A的体积百分比为63％；
9min～16min，所述流动相A的体积百分比上升至90％；
16min～20min，所述流动相A的体积百分比上升至100％；
20min～20.1min，所述流动相A的体积百分比下降至63％；
20.1min～25min，所述流动相A的体积百分比为63％。
在其中一个实施例中，所述流动相A包含体积比1：(3.5～4.5)的所述甲醇和所述乙腈。
在其中一个实施例中，所述流动相B为含乙酸体积百分比为0.08％～0.12％的乙酸溶液。
在其中一个实施例中，制备所述供试品溶液的步骤包括：以甲醇为提取溶剂对所述茯苓药材样品进行提取，去除所得提取液中的溶剂，所得残渣用甲醇溶解。
在其中一个实施例中，提取采用的方式为加热回流提取。
在其中一个实施例中，每1g所述茯苓药材样品对应的所述提取溶剂的用量为20ml～30ml。
在其中一个实施例中，检测所采用条件还包括：流速为0.35ml/min～0.45ml/min，柱温为28℃～32℃，波长为240nm～245nm。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明针对茯苓药材，选择合适的高效液相色谱检测条件构建特征图谱，采用该检测条件构建的特征图谱具有8个共有峰且能展示茯苓药材主要化学成分(即茯苓三萜类成分--茯苓酸B，去氢土莫酸，茯苓酸A，猪苓酸C，去氢茯苓酸)的特征，为茯苓药材的质量控制提供依据。并且，采用该检测条件对上述茯苓三萜类成分进行含量测试，为茯苓药材的有效含量评价和化学成分的深入研究提供依据，也进一步有效评定茯苓药材品质的优劣提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为茯苓对照药材特征图谱；
图2为茯苓药材对照特征图谱；峰1：茯苓酸B；峰2：去氢土莫酸；峰3茯苓酸A；峰4(S)：猪苓酸C；峰7：去氢茯苓酸；
图3为26批茯苓药材特征图谱；
图4为茯苓药材含量测定专属性考察图；
图5为不同产地茯苓药材样品的含量折线图；
图6为S24、S25和S26茯苓药材及其制得的标准汤剂和配方颗粒的特征图谱；
图7为采用不同(含酸种类不同)的流动相B获得的色谱图；
图8为采用不同(含酸浓度不同)的流动相B获得的色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
茯苓所含成分中，以茯苓多糖及三萜类成分为主，除此之外，已报道茯苓中还含有甾体类成分、脂肪酸、蛋白质、腺嘌呤、氨基酸等有机成分以及钙、镁、铁、钾等无机元素。
随着中药质量控制要求的日益严格，对药材进行多成分同时测定已是必然趋势，成分的含量测定和药材指纹图谱的研究是目前茯苓关于质量控制研究的主要集中领域。传统的茯苓药材的指纹图谱的构建方法例如：张琦、王振中等在《茯苓UPLC特征指纹图谱》提到其建立了茯苓UPLC特征指纹图谱共有模式，标定了20个共有峰，指认了其中7个共有峰。陈素娥在《茯苓药材高效液相色谱指纹图谱及多指标成分定量研究》，构建了茯苓药材的HPLC指纹图谱，确定共有峰18个并指认了去氢土莫酸、猪苓酸C、去氢茯苓酸和松苓新酸，同时对去氢土莫酸、猪苓酸C、去氢茯苓酸和松苓新酸这4种指标成分进行了含量测定。传统构建的这些指纹图谱尽管在一定程度上全面反映了茯苓药材所含化学成分特征，然而检测耗时相对较长，且局限于茯苓药材。基于此，本发明方法采用超高效液相色谱方法，相比起上述传统技术能短时间内测定茯苓的特征图谱及3种指标成分的含量，能同时反映茯苓药材及其汤剂的特征，从而可用于这些种类产品的鉴别。
第一方面，本发明提供一种茯苓药材的特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
取茯苓对照药材和茯苓药材供试品，分别制备对照药材溶液和供试品溶液；
采用高效液相色谱法对所述对照药材溶液和所述供试品溶液进行检测，将检测所述对照药材溶液所得图谱和检测所述供试品溶液所得图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，制定茯苓药材的特征图谱；
检测所采用条件包括：固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A采用甲醇和乙腈的混合物，流动相B为乙酸溶液，采用梯度洗脱。
在其中一个示例中，梯度洗脱的程序包括：
0min～9min，所述流动相A的体积百分比为63％；
9min～16min，所述流动相A的体积百分比上升至90％；
16min～20min，所述流动相A的体积百分比上升至100％；
20min～20.1min，所述流动相A的体积百分比下降至63％；
20.1min～25min，所述流动相A的体积百分比为63％。
在其中一个示例中，所述流动相A包含体积比1：(3.5～4.5)的所述甲醇和所述乙腈，例如甲醇和乙腈的体积比为1:3.5、1:4、1:4.5。为更好地理解本发明的技术方案，本发明以下实施例以甲醇和乙腈的体积比为1:4的混合物作为流动相A进行举例，但这非是对本发明技术方案的限定。
在其中一个示例中，所述流动相B为含乙酸体积百分比为0.08％～0.12％的乙酸溶液。例如乙酸溶液含乙酸的体积百分比为0.08％、0.1％、0.12％。为更好地理解本发明的技术方案，本发明以下实施例以乙酸体积百分比为0.1％的乙酸溶液作为流动相B进行举例，但这非是对本发明技术方案的限定。
本发明所述的色谱柱例如可以为Agilent ZORBAX SB-C18(2.1mm×150mm，1.8μm)。
在其中一个示例中，制备所述供试品溶液的步骤包括：以甲醇为提取溶剂对所述茯苓药材供试品进行提取，去除所得提取液中的溶剂，所得残渣用甲醇溶解。
在其中一个示例中，提取采用的方式为加热回流提取。
在其中一个示例中，每1g所述茯苓药材供试品对应的所述提取溶剂的用量为20ml～30ml(例如20ml、25ml、30ml)。
在其中一个示例中，制备所述对照药材溶液的步骤包括：以甲醇为提取溶剂对所述茯苓对照药材进行提取，去除所得提取液中的溶剂，所得残渣用甲醇溶解。
在其中一个示例中，提取采用的方式为加热回流提取。
在其中一个示例中，每1g所述茯苓对照药材对应的所述提取溶剂的用量为20ml～30ml(例如20ml、25ml、30ml)。
在其中一个示例中，检测所采用条件还包括：流速为0.35ml/min～0.45ml/min(例如0.35ml/min、0.4ml/min、0.45ml/min)，柱温为28℃～32℃(例如28℃、30℃、32℃)，波长为240nm～245nm(例如240nm、242nm、245nm)。
在其中一个示例中，所述特征图谱包含8个特征峰，其中，峰1为茯苓酸B，峰2为去氢土莫酸，峰3为茯苓酸A，峰4为猪苓酸C，峰7为去氢茯苓酸。
第二方面，本发明提供一种茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
提供含茯苓三萜类成分的对照品溶液，并取茯苓药材样品制备供试品溶液；
采用高效液相色谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，并根据检测所述对照品溶液所得图谱和检测所述供试品溶液所得图谱中各特征峰的峰面积，确定所述茯苓药材样品中所述茯苓三萜类成分的含量；
所述茯苓三萜类成分包含茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C和去氢茯苓酸中的至少一种；
检测所采用条件包括：固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A采用甲醇和乙腈的混合物，流动相B为乙酸溶液，采用梯度洗脱。
可以理解的是，根据检测所述对照品溶液所得图谱和检测所述供试品溶液所得图谱中各特征峰的峰面积确定所述茯苓药材样品中所述茯苓三萜类成分的含量的过程中，可以采用的方法包括但不限于外标法。
在其中一个示例中，梯度洗脱的程序包括：
0min～9min，所述流动相A的体积百分比为63％；
9min～16min，所述流动相A的体积百分比上升至90％；
16min～20min，所述流动相A的体积百分比上升至100％；
20min～20.1min，所述流动相A的体积百分比下降至63％；
20.1min～25min，所述流动相A的体积百分比为63％。
可以理解的是，本发明所述茯苓三萜类成分包含如下情形：
(1)包含茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C和去氢茯苓酸中的一种；
(2)包含茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C和去氢茯苓酸中的两种；
(3)包含茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C和去氢茯苓酸中的三种；
(4)包含茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C和去氢茯苓酸中的四种；
(5)包含茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C和去氢茯苓酸中的五种。
在其中一个示例中，所述流动相A包含体积比1：(3.5～4.5)的所述甲醇和所述乙腈，例如甲醇和乙腈的体积比为1:3.5、1:4、1:4.5。为更好地理解本发明的技术方案，本发明以下实施例以甲醇和乙腈的体积比为1:4的混合物作为流动相A进行举例，但这非是对本发明技术方案的限定。
在其中一个示例中，所述流动相B为含乙酸体积百分比为0.08％～0.12％的乙酸溶液。例如乙酸溶液含乙酸的体积百分比为0.08％、0.1％、0.12％。为更好地理解本发明的技术方案，本发明以下实施例以乙酸体积百分比为0.1％的乙酸溶液作为流动相B进行举例，但这非是对本发明技术方案的限定。
在其中一个示例中，制备所述供试品溶液的步骤包括：以甲醇为提取溶剂对所述茯苓药材样品进行提取，去除所得提取液中的溶剂，所得残渣用甲醇溶解。
在其中一个示例中，提取采用的方式为加热回流提取。
在其中一个示例中，每1g所述茯苓药材样品对应的所述提取溶剂的用量为20ml～30ml(例如20ml、25ml、30ml)。
在其中一个示例中，检测所采用条件还包括：流速为0.35ml/min～0.45ml/min(例如0.35ml/min、0.4ml/min、0.45ml/min)，柱温为28℃～32℃(例如28℃、30℃、32℃)，波长为240nm～245nm(例如240nm、242nm、245nm)。
需要说明的是，本发明的鉴别方法所涉步骤没有顺序限制。
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
实施例1
1.仪器和试药
1.1仪器：Waters超高效液相色谱仪(Waters H-class，沃特世公司)，Thermo超高效液相色谱仪(Vanquish，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm)，万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(XP26，梅特勒-托利多公司)，超纯水系统(Milli-Q Direct，默克股份有限公司)，数控超声波清洗器(KQ500D，昆山市超声仪器有限公司)，恒温水浴锅(HWS28型，上海一恒科技有限公司)。
1.2试剂：乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)均为分析纯；液相用乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、乙腈(默克股份有限公司)、甲醇(默克股份有限公司)为HPLC色谱级，水为超纯水(实验室自制)。
1.3试药：去氢土莫酸(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：Q-105-19225，含量：90.99％)；猪苓酸C(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20011509，含量：97.0％)；茯苓酸B(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18030805，含量：91.0％)；茯苓酸A(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq18030905，含量：96.0％)；去氢茯苓酸(ChemFaces，批号：CFS201803，含量：98.0％)；茯苓对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121117-201308)。
中国药典2020版一部规定茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。本发明研究所用药材经广东一方制药有限公司质量中心鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，具体信息见表1。
表1、26批茯苓药材产地信息表
Figure BDA0003248462860000131
Figure BDA0003248462860000141
2方法与结果
2.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以甲醇-乙腈(1:4)为流动相A，以0.1％乙酸溶液为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml；柱温为30℃；检测波长为242nm。理论板数按去氢土莫酸峰计算应不低于8000。
表2、梯度洗脱表
Figure BDA0003248462860000142
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.2对照品溶液的配制
取去氢土莫酸对照品、茯苓酸A对照品、猪苓酸C对照品、茯苓酸B对照品、去氢茯苓酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含150μg去氢土莫酸、50μg茯苓酸A、50μg猪苓酸C、50μg茯苓酸B、200μg去氢茯苓酸的溶液，即得。
2.3供试品溶液的制备
取茯苓药材粉末(过三号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，精密量取20ml续滤液蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2ml量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4特征图谱测定
2.4.1特征峰的确定
取茯苓对照药材(批号：121117-201308)及26批茯苓药材，按“2.1”项下色谱条件与“2.3”项下确定的供试品溶液制备方法，进样测定，得到茯苓对照药材特征图谱如图1所示，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》，按平均数法(或中位数法)生成对照图谱，建立茯苓药材对照特征图谱，如图2。对26批茯苓药材进行共有峰标识，选择与茯苓对照药材保留时间相一致的8个共有峰作为茯苓药材特征图谱的特征峰，如图3所示，并与茯苓药材对照特征图谱中的8个特征峰保留时间相对应。
2.4.2专属性考察
精密吸取茯苓药材(S1)“2.3”项下供试品溶液、“2.2”项下对照品混标溶液与空白溶剂(即甲醇)各2μl，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件进行分析，结果见图4。
2.4.3精密度考察
精密吸取茯苓药材(S1)“2.3”项下供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，各主要成分相对峰面积的RSD为0.31％～2.57％，相对保留时间的RSD为0.07％～0.30％，表明该方法精密度良好。
2.4.4重复性考察
取同一批茯苓样品(S1)6份，每份约1.0g，分别按"2.3"项下方法制备供试品溶液，再按"2.1"项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，各主要成分相对峰面积的RSD为0.61％～2.21％，相对保留时间的RSD为0.07％～0.27％，表明该方法重复性良好。
2.4.5特征图谱测定结果
对26批茯苓药材特征图谱进行分析，以猪苓酸C色谱峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，实验结果见表3、表4。
表3、26批茯苓药材特征图谱(相对保留时间)
Figure BDA0003248462860000161
Figure BDA0003248462860000171
表4、26批茯苓药材特征图谱(相对峰面积)
Figure BDA0003248462860000172
2.5多指标含量测定
茯苓的化学成分主要有茯苓糖、茯苓三萜(茯苓酸、土莫酸等)等，因此以上这几类化学成分的含量是评价茯苓药材质量的关键因素。以下对去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C进行多指标含量测定，以实现评价茯苓的质量的目的。
2.5.1线性关系考察
分别精密称定去氢土莫酸对照品7.106mg、茯苓酸A对照品2.354mg、猪苓酸C对照品3.309mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得对照品混标贮备液。
精密量取上述对照品混标贮备液0.1ml，0.5ml，1ml，2ml，5ml，分别置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1ml含去氢土莫酸6.96μg、34.82μg、69.64μg、139.28μg和348.19μg，含茯苓酸A 2.28μg、11.42μg、22.83μg、45.67μg和114.17μg，含猪苓酸C 2.33μg、11.66μg、23.33μg、46.66μg和116.64μg的对照品应用液，分别精密吸取上述对照品应用液和对照品混标贮备液，按照“2.1”项下色谱条件依次进样2μl，记录色谱峰面积。线性范围见下表5。
表5、3个化合物的回归方程及线性范围
Figure BDA0003248462860000181
/>
2.5.2加样回收率考察
取已测定含量的茯苓药材(G1611124)约0.5g，精密称定，平行称定3组，每组3份，按对照品与样品含量比例为1:0.5，1:1，1:1.5加入对照品，按“2.3”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液9份。再取茯苓药材(G1611124)约1g，按“2.3”项下确定的供试品溶液制备方法，制备未加样空白对照2份，测得茯苓药材(G1611124)中去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C的平均含量分别为0.137mg/g、0.042mg/g、0.131mg/g。
按“2.1”项下色谱条件测定，计算去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C的加样回收率，见表6～表8。
表6、茯苓药材去氢土莫酸加样回收率考察结果表(n＝9)
Figure BDA0003248462860000191
表7、茯苓药材茯苓酸A加样回收率考察结果表(n＝9)
Figure BDA0003248462860000192
表8、茯苓药材猪苓酸C加样回收率考察结果表(n＝9)
Figure BDA0003248462860000193
Figure BDA0003248462860000201
结果显示，去氢土莫酸的平均加样回收率为103.09％，茯苓酸A的平均加样回收率为101.41％，猪苓酸C的加样回收率为98.66％，根据中国药典2020年版“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量在0.01％～0.1％范围时，回收率限度为90％～108％，表明回收率良好。
2.5.3含量测定结果
取茯苓药材样品，按照“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定分析，采用外标法计算茯苓药材中茯苓酸A、猪苓酸C和去氢土莫酸的含量(见表9)。结果如下：
表9、26批茯苓药材含量测定结果
Figure BDA0003248462860000202
Figure BDA0003248462860000211
结果分析与讨论：结果显示，去氢土莫酸平均含量为0.209mg/g，茯苓酸A平均含量为0.100mg/g，猪苓酸C平均含量为0.201mg/g。数据显示，不同产地及同一产地不同批次间茯苓药材的含量差异较大，没有明显的规律，26批茯苓样品间的去氢土莫酸含量最大相差5倍多，茯苓酸A含量最大相差近17倍，猪苓酸C含量最大相差2倍。
实施例2
本发明构建的指纹图谱以及茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法也适用于茯苓标准汤剂和茯苓配方颗粒。具体如下：
茯苓标准汤剂供试品溶液，其制备方法包括如下步骤：取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，取20ml续滤液蒸干，用甲醇定容至2ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
茯苓配方颗粒供试品溶液，其制备方法包括如下步骤：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，取20ml滤液蒸干，用甲醇定容至2ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(1)含量测定：色谱条件同实施例1“2.1”项，测得对应上述药材批次所得的标准汤剂的含量如下表10，配方颗粒的含量如下表11所示：
表10、3批茯苓药材对应标准汤剂含量测定结果表
Figure BDA0003248462860000221
表11、3批药材对应配方颗粒含量测定结果表
Figure BDA0003248462860000222
(2)特征图谱：
色谱条件同实施例1“2.1”项，测得S24、S25、S26药材制得的标准汤剂、配方颗粒的特征图谱如图6所示。由图6可知，标准汤剂和配方颗粒色谱峰与待测药材一致，量值传递过程均一致。说明配方颗粒、标准汤剂与药材物质基础一致，与药材“形不同，但质相同”。
对比例1
(1)不同流动相B的对比
按照实施例1“2.3”项下制备供试品溶液，除流动相B分别选取0.1％磷酸溶液、0.1％乙酸溶液、0.1％甲酸溶液三种流动相进行比较外，其余条件均按实施例1“2.1”项下色谱条件进行测定分析，对比不同类型的流动相。结果如图7，发现选取0.1％乙酸溶液作为水相时，峰的信息较完整，分离度较好，基线平稳，响应值较高。
(2)不同浓度流动相B的对比
按照实施例1“2.3”项下制备供试品溶液，除流动相B分别选取水、0.05％乙酸溶液、0.1％乙酸溶液、0.2％乙酸溶液三种流动相进行比较外，其余条件均按实施例1“2.1”项下色谱条件进行测定分析，对比不同类型的流动相。结果如图8，发现选取0.1％乙酸溶液作为水相时，峰的信息较完整，分离度较好，基线平稳，响应值较高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (6)

1.一种茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
提供含茯苓三萜类成分的对照品溶液，并取茯苓药材样品制备供试品溶液；
采用超高效液相色谱法对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，并根据检测所述对照品溶液所得图谱和检测所述供试品溶液所得图谱中各特征峰的峰面积，确定所述茯苓药材样品中所述茯苓三萜类成分的含量；
所述茯苓三萜类成分包含茯苓酸B、去氢土莫酸、茯苓酸A、猪苓酸C和去氢茯苓酸；
检测所采用条件包括：固定相采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，色谱柱规格为：2.1mm×150mm，1.8μm；流动相A包含体积比1：（3.5~4.5）的甲醇和乙腈；流动相B为含乙酸体积百分比为0.08%~0.12%的乙酸溶液，采用梯度洗脱；
梯度洗脱的程序包括：
0min~9min，所述流动相A的体积百分比为63%；
9min~16min，所述流动相A的体积百分比由63%上升至90%；
16min~20min，所述流动相A的体积百分比由90%上升至100%；
20min~20.1 min，所述流动相A的体积百分比由100%下降至63%；
20.1min~25 min，所述流动相A的体积百分比为63%；
制备所述供试品溶液的步骤包括：以甲醇为提取溶剂对所述茯苓药材样品进行提取，去除所得提取液中的溶剂，所得残渣用甲醇溶解。
2.根据权利要求1所述的茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法，其特征在于，提取采用的方式为加热回流提取。
3.根据权利要求1所述的茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法，其特征在于，每1g所述茯苓药材样品对应的所述提取溶剂的用量为20 ml~30ml。
4.根据权利要求1至3任一项所述的茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法，其特征在于，检测所采用条件还包括：流速为0.35ml/min~0.45ml/min。
5.根据权利要求1至3任一项所述的茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法，其特征在于，检测所采用条件还包括：柱温为28℃~32℃。
6.根据权利要求1至3任一项所述的茯苓药材中茯苓三萜类成分的检测方法，其特征在于，检测所采用条件还包括：波长为240nm~245nm。
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