CN115078588B - 一种九香虫及其炮制品的质量评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种九香虫及其炮制品的质量评价方法，构建九香虫及其炮品样品的超高效液相色谱特征图谱；制备待评价样品的测试溶液并进行超高效液相色谱分析，获得超高效液相色谱图与特征图谱比对，进行待评价样品的定性分析；以特征峰中1,4‑二氢‑4‑氧代喹啉‑2‑羧酸为含量测定指标，进行待评价样品的定量分析。本发明显著提升了九香虫及其炮制品的质量控制，所建方法兼顾指标成分的定量和特征图谱整体定性，同时满足快速，简便，成本较低，具有普适性等原则，科学合理的评价九香虫配方颗粒及其药材、炒九香虫配方颗粒及其饮片，以及对应提取物，标准汤剂的质量。

Description

一种九香虫及其炮制品的质量评价方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种九香虫及其炮制品的质量评价方法。
背景技术
九香虫为蝽科昆虫九香虫Aspongopus chinensis Dallas的干燥体，全国各地均有产。其功效为理气止痛，温中助阳。用于胃寒胀痛，肝胃气痛，肾虚阳痿，腰膝酸痛等症。文献报道，九香虫主要有脂肪酸、蛋白质、氨基酸等营养成分，以及臭气类成分、核苷类和多巴胺类化合物等。炒九香虫为九香虫经清炒后的炮制品，现代研究表明，其化学成分和与九香虫较为接近。
现行版中国药典2020年版一部九香虫项下规定了九香虫及炒九香虫的质量要求但仅以九香虫对照药材及油酸对照品作为TLC鉴别定性指标，无特征图谱及含量测定项，难以准确、全面地控制九香虫及其炮制品的内在质量。
现有关于九香虫及其炮制品的质量评价体系主要集中在药材、饮片中核苷类、脂肪酸类、氨基酸类的含量测定，并未对九香虫及其炮制品配方颗粒的含量测定作进一步研究。
鉴别研究方面，李莎、鞠康利用生物显微镜及扫描电镜等设备对九香虫及其伪品进行真伪鉴别，可以方便快捷的用于九香虫类药材的鉴定，但其方法普适性不高。特征图谱研究方面，孙龙对10批九香虫指纹图谱进行相似度分析评价，确定了18个共有峰，但缺乏合适的对照品，未确定各峰归属；徐子杰通过HPLC法建立指纹图谱，对九香虫及其伪品进行研究分析，整体研究对于九香虫/炒九香虫配方颗粒的质量评价具有一定的参考意义，但部分共有峰峰面积较小，且收集九香虫药材批次较少，研究数据不具有代表性。含量测定研究方面，逯春玲采用高效液相色谱法建立了适用于九香虫药材中尿苷、尿嘧啶、黄嘌吟、次黄嘌呤等4种核苷类成分的含量测定，为九香虫药材质量控制提供了方法，但其含量均较低，且核苷类成分专属性较差；王新雨采用HPLC-ELSD法同时测定九香虫中的亚油酸、油酸及软脂酸含量，指标专属性不高，且药典九香虫鉴别项下已将油酸对照品作为鉴别指标，造成检测资源浪费；张成江采用固相微萃取法(SPME)萃取活体及炮制九香虫的气味成分，结合气相色谱一质谱联用(GC-MS)分析其组成，以面积归一化法计算各组分的相对百分含量，但作为质量评价体系，GC-MS价格昂贵，对操作人员素质要求更高，目前国内药厂和饮片厂无法广泛适用，因此作为研究尚可，作为标准的评价方法适用性欠佳。
专利CN113984918A公开了炒九香虫或其提取物的高效液相特征图谱及其构建方法和用途。该专利特征图谱共建立5个共有峰，经对照品指认出峰2为犬尿喹啉酸(含量指标)，但在前期试验中未能在九香虫配方颗粒中检测出核苷类成分。而文献显示，九香虫主要有脂肪酸、蛋白质、氨基酸、核苷类和多巴胺类化合物等。即该专利发明未能将上游原料九香虫中的核苷类成分传递至配方颗粒标准中。
发明内容
发明目的：本发明旨在提供一种快速、简便、成本较低、具有普适性的九香虫及其炮制品的质量评价方法。
技术方案：本发明的一种九香虫及其炮制品的质量评价方法，以九香虫/炒九香虫配方颗粒及其上游原料为研究对象，建立了九香虫/炒九香虫的质量检测方法，构建能够整体定性研究与定量相结合的质量评价方法，所述质量评价方法包括以下步骤：
(1)构建九香虫及其炮制品的超高效液相色谱特征图谱，其特征图谱包括至少8个共有峰，所述共有峰包括尿酸、黄嘌呤、腺苷、3,4-二羟基喹啉-2-羧酸、1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的特征峰；
(2)制备待评价样品的测试溶液并采用与步骤(1)中相同的色谱条件进行超高效液相色谱分析，并获得超高效液相色谱图；
(3)步骤(2)中获得的超高效液相色谱图与步骤(1)中的特征图谱比对，进行待评价制剂的定性分析；以特征峰中1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为含量测定指标，进行待评价九香虫及其炮制品的定量分析。
进一步地，步骤(1)中，构建九香虫及其炮制品的超高效液相色谱特征图谱的方法包括以下步骤：
1)制备九香虫及其炮制品的多个供试品溶液；制备对照药材的参照物溶液，其中对照药材为九香虫；
2)将步骤1)中制备的供试品溶液以及参照物溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到相应的超高效液相色谱图；
3)对照药材的超高效液相色谱图作为对照，从步骤2)中得到的供试品溶液的超高效液相色谱图中选择至少8个共有峰，构成及其炮制品的超高效液相色谱特征图谱。
进一步地，所述超高效液相色谱分析的条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05-0.3％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0～3min，0→1A％，3～10min，1→3％A％，10～22min，3→6A％，22～26min，6→10A％，26～31min，10→40A％，31～37min，40→50A％，37～40min，50A％。
更更进一步地，检测波长为240-254nm；柱温30～40℃；流速每分钟0.25～0.35ml。
更更进一步地，色谱柱为HSS T3色谱柱。
进一步地，九香虫及其炮制品的超高效液相色谱特征图谱包括8个共有峰。以黄嘌呤特征峰为参照峰S1，6个共有峰的相对保留时间如下：0.77(±10％)、1.00(±10％)、1.15(±10％)、1.32(±10％)、1.70(±10％)、1.81(±10％)；以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸特征峰为参照峰S2，2个共有峰的相对保留时间如下：0.77(±10％)和1.00(±10％)。
更进一步地，步骤2)中还包括制备对照品的参照物溶液并进行超高效液相色谱分析，得到的超高效液相色谱用于指认步骤3)中的共有峰，所述对照品包括尿酸、黄嘌呤、腺苷和1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸。
更进一步地，步骤3)中，3,4-二羟基喹啉-2-羧酸的特征峰通过质谱进行指认。
更进一步地，步骤1)中，供试品溶液制备包括提取步骤，其中提取溶剂体积质量分数为10～50％的甲醇水溶液。
其中，供试品制备方法：取药材，饮片，标准汤剂，提取物或颗粒适量，研细，称定0.2～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水或10～50％甲醇(优选为50％甲醇)溶液，密塞，称定重量，超声或加热或震荡15min～60min(优选为45min)后，放冷，再称定重量，用水或10～50％甲醇(优选为50％甲醇)补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
参照物或对照品的制备方法：取九香虫对照药材0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20ml，加热或超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取〔含量测定〕项下的对照品溶液，作为对照品参照物溶液。再取尿酸、黄嘌呤、腺苷对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含尿酸20μg、黄嘌呤20μg、腺苷15μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
进一步地，九香虫及其炮制品选自九香虫或炒九香虫的配方颗粒及其上游原料，优选九香虫样品选自九香虫药材、炒九香虫饮片、九香虫配方颗粒、炒九香虫配方颗粒、九香虫标准汤剂、炒九香虫标准汤剂、九香虫提取物或炒九香虫提取物。
本发明利用超高效液相(UPLC)，采用一套色谱条件，一份供试品制备和对照品制备方法，同时实现指标成分定量和特征图谱定性；定量以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为含测指标；并在此基础上确定了8个共有峰(共指认出5个特征峰，分别为尿酸、黄嘌呤、腺苷、3,4-二羟基喹啉-2-羧酸、1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸)，作为特征图谱，构建了九香虫及其炮制品的质量评价方法。
在特征图谱研究方面，本发明所建立的特征图谱，共确定了8个特征峰，其中共明确5个成分，分别为尿酸、黄嘌呤、腺苷、3,4-二羟基喹啉-2-羧酸、1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸，更加全面的反映了待测样品的化学组成全貌，弥补了现有专利CN113984918A无法检测出在九香虫颗粒中核苷类成分的缺陷。同时对九香虫药材、炒九香虫饮片、标准汤剂、提取物、配方颗粒的特征图谱研究中均有对应的特征峰，为九香虫/炒九香虫配方颗粒及上游原料中特征成分的溯源提供了依据。
在含量测定研究方面，本发明基于中国药典2020年版一部“九香虫”药材无含量测定方法，且现有文献均是对九香虫药材、饮片中专属性成分差、含量相对较低的核苷类、脂肪酸类进行含量限定的前提下，经研究，选择含量高、成分稳定的1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸作为的指标性成分作为含量指标，进行九香虫/炒九香虫配方颗粒及其上游原料的量值传递分析。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：兼顾指标成分的定量和特征图谱整体定性，同时满足快速，简便，成本较低，具有普适性等原则，科学合理的评价九香虫配方颗粒及其药材、炒九香虫配方颗粒及其饮片，提取物，标准汤剂的质量。
附图说明
图1为实施例1中的1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸全波长扫描图；
图2为实施例1中的1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品的线性关系图；
图3为实施例1中的九香虫配方颗粒含量专属性试验；
图4为实施例1中的九香虫配方颗粒含量延迟性试验；
图5为实施例1中的九香虫配方颗粒含量不同流速考察；
图6为实施例1中国的九香虫配方颗粒含量不同柱温考察；
图7为实施例1中的九香虫配方颗粒含量不同色谱柱考察；
图8为实施例2中的九香虫配方颗粒特征DAD-3D图；
图9为实施例2中的九香虫配方颗粒特征不同检测波长色谱图；
图10为实施例2中的九香虫颗粒特征专属性色谱图；
图11为实施例2中的九香虫颗粒特征延迟性色谱图；
图12为实施例2中的九香虫配方颗粒特征不同色谱柱的分离效果；
图13为实施例2中的九香虫配方颗粒特征不同柱温的分离效果；
图14为实施例2中的九香虫配方颗粒特征不同流速的分离效果；
图15为实施例4中的九香虫多批次药材特征图谱叠加图；
图16为实施例4中的九香虫多批次标准汤剂特征图谱叠加图；
图17为实施例4中的九香虫多批次颗粒特征图谱叠加图；
图18为实施例4中的炒九香虫多批次饮片特征图谱叠加图；
图19为实施例4中的炒九香虫多批次标准汤剂特征图谱叠加图；
图20为实施例4中的炒九香虫多批次颗粒特征图谱叠加图；
图21为实施例4中的九香虫药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征共有峰图谱；
图22为实施例4中的特征对照品指认；
图23为九香虫样品的超高效液相色谱特征图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明的一种九香虫及其炮制品的质量评价方法，包括以下步骤：
(1)构建九香虫及其炮制品的超高效液相色谱特征图谱，其特征图谱包括至少8个共有峰，所述共有峰包括尿酸、黄嘌呤、腺苷、3,4-二羟基喹啉-2-羧酸、1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的特征峰；
(2)制备待评价制剂的测试溶液并采用与步骤(1)中相同的色谱条件进行超高效液相色谱分析，并获得超高效液相色谱图；
1)制备九香虫及其炮制品的多个供试品溶液；取药材，饮片，标准汤剂，提取物或颗粒适量，研细，称定0.2～0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水或10～50％甲醇溶液，密塞，称定重量，超声或加热或震荡15min～60min后，放冷，再称定重量，用水或10～50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。优选为50％甲醇。
制备对照药材的参照物溶液，其中对照药材为九香虫；取九香虫对照药材0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20ml，加热或超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取〔含量测定〕项下的对照品溶液，作为对照品参照物溶液。再取尿酸、黄嘌呤、腺苷对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含尿酸20μg、黄嘌呤20μg、腺苷15μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2)将步骤1)中制备的供试品溶液以及参照物溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到相应的超高效液相色谱图；
①色谱条件：采用超高效液相色谱仪，色谱条件为：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。优选为HSS T3色谱柱(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)为色谱柱；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.05-0.3％(优选为0.1％)磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0～3min，0→1A％，3～10min，1→3％A％，10～22min，3→6A％，22～26min，6→10A％，26～31min，10→40A％，31～37min，40→50A％，37～40min，50A％；
检测波长为240nm(含量)、254nm(特征)；
柱温30～40℃(优选为35℃)；
流速每分钟0.25～0.35ml，优选为0.30ml。
②测定方法：
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
3)对照药材的超高效液相色谱图作为对照，从步骤2)中得到的供试品溶液的超高效液相色谱图中选择至少8个共有峰，构成九香虫药材的超高效液相色谱特征图谱。
具体的，特征图谱：如图23所示，供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应；其中峰1、峰2、峰4、峰8应与尿酸对照品、黄嘌呤对照品、腺苷对照品和1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品参照物峰保留时间相一致。与黄嘌呤参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰3、峰5、峰6与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：1.15(峰3)、1.70(峰5)、1.81(峰6)。与1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸参照物峰相应的峰作为S2峰，计算峰7与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.77(峰7)。
(3)步骤(2)中获得的超高效液相色谱图与步骤(1)中的特征图谱比对，进行九香虫、炒九香虫及其配方颗粒的定性分析；以特征峰中1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为含量测定指标，进行待评价制剂中九香虫药材的定量分析。具体的，本发明以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸含量，以及8个共有峰的有无作为九香虫/炒九香虫配方颗粒及其上游原料的质量评价体系。
实施例1
本实施例用于确认九香虫配方颗粒与炒九香虫配方颗粒的质量评价方法中定量分析的最优方案，具体包括含量测定指标、色谱条件、波长选择、供试品溶液制备的方案对比，选出最优色谱条件和供试品制备方案。
1、仪器与试剂
Agilent Technologies 1290Infinity超高效液相色谱仪；1290DAD FS二极管阵列检测器；1290MCT柱温箱；1290Vial Sampler自动进样器；1290Fiexible Pump四元泵；Open LAB 2.3色谱工作站；KQ-250B超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；HY-4振荡器(金坛市科兴仪器厂)；纯水系统(Sartorius公司)；TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)；乙腈(色谱纯，Thermo Fisher公司)；磷酸(色谱纯，阿拉丁公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。
九香虫配方颗粒由江阴天江药业有限公司提供(批号：22020019，22020029，22020039，21100269)；炒九香虫配方颗粒由江阴天江药业有限公司提供(批号：22020049，22020059，22020069)。
2、对照品来源
1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸(编号：Y22N11S13697)购于上海源叶生物科技有限公司，供含量测定用，含量以98％计，使用前无须处理。
3、确定的色谱条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.30ml；柱温为35℃；检测波长为240nm。理论板数按1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸峰计算应不低于5000。
表1实施例1中的梯度洗脱程序
Figure BDA0003745784580000071
Figure BDA0003745784580000081
4、波长的选择
实验对1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品溶液进行全波长扫描，记录其紫外吸收图如图1所示。确定1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸在240nm波长处有较大吸收，因此选择检测波长为240nm。
5、对照品溶液的制备
取1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸80μg的溶液，即得。
6、供试品溶液的制备
(1)不同提取溶剂的考察
取本品(批号：21100269)适量，研细，取约0.2g，共5组，每组平行两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇和水各25ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40Khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。分别精密吸取各供试品溶液1μl，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，计算1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸含量，结果见下表。
表2不同提取溶剂的比较
Figure BDA0003745784580000082
采用甲醇、70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、水作为提取溶剂时，测得1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的含量接近，无显著性差异。结合相同条件下，甲醇、70％甲醇为提取溶剂时，特征图谱部分色谱峰出现溶剂效应，故确定九香虫配方颗粒含量测定的提取溶剂为50％甲醇。
(2)不同提取方法的考察
取本品(批号：21100269)适量，研细，取约0.2g，共3组，每组平行两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，分别超声处理(功率250W，频率40Khz)、加热回流、振荡处理30min，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。分别精密吸取各供试品溶液1μL，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，计算1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸含量，结果见下表。
表3不同提取方法的比较
Figure BDA0003745784580000091
当提取方式为振摇提取、超声处理、加热回流时，三种方法对1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸提取效率均相近，考虑到实验操作的简便性，所以选择提取方式为超声处理作为提取方式。
(3)不同提取时间的考察
取本品(批号：21100269)适量，研细，取约0.2g，共4组，每组平行两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，密塞，分别超声处理(功率250W，频率40Khz)15分钟、30分钟、45分钟、60分钟取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取各供试品溶液1μL，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，计算1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸含量，结果见下表。
表4不同提取时间的比较
Figure BDA0003745784580000101
结果表明：超声处理不同时间九香虫配方颗粒中1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸含量接近，为保证提取完全，因此确定提取时间为45分钟。
(4)不同提取体积的考察
取本品(批号：21100269)适量，研细，取约0.2g，共3组，每组平行两份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇15ml、25ml、50ml，密塞，超声处理(功率250W，频率40Khz)30分钟、取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。分别精密吸取各供试品溶液1μl，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，计算1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸含量，结果见下表。
表5不同提取体积的比较
Figure BDA0003745784580000102
不同提取体积提取测得的1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸提取效率相近，15ml可基本提取完全，为确保提取充分，确定提取体积为25ml。
(5)供试品溶液制备方法的确定
根据上述研究结果，确定九香虫配方颗粒含量测定的供试品溶液制备方法为：
取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
7、方法学验证
(1)线性
分别精密吸取1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品溶液(138.769ug/ml)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以峰面积积分值为纵坐标，1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：Y＝28765.0890X-69.1847，r＝1.0000。结果见下表，图谱见图2。
表6 1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品峰面积积分值与进样量关系
Figure BDA0003745784580000111
结果表明：1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸在0.0139μg～0.2775μg范围内，进样量与峰面积值呈良好的线性关系。
(2)精密度试验
1)仪器精密度试验
精密吸取供试品溶液(批号：21100269)，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，连续进样6次，记录其峰面积，计算相对标准偏差，结果见下表。
表7仪器精密度试验-峰面积(mAu)
Figure BDA0003745784580000112
Figure BDA0003745784580000121
结果表明：仪器的精密度试验良好。
2)重复性试验
取九香虫配方颗粒(批号：21100269)适量，研细，取约0.2g，精密称定，平行6份，分别按正文供试品溶液制备方法制成供试品溶液，分别进样1μl，测定1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的峰面积，计算其含量及RSD，结果见下表。
表8九香虫颗粒样品的重复性试验
Figure BDA0003745784580000122
结果表明：样品的重复性试验良好。
3)中间精密度试验
取九香虫配方颗粒(批号：21100269)，分别由两个实验员按正文供试品溶液制备方法制备3份供试品溶液，分别于不同时间在不同仪器上(Thermo Vanquish超高效液相色谱系统；Agilent1290超高效液相色谱系统)分别进样1μl，测定其峰面积值，并计算其含量，计算其RSD，结果见下表。
表9中间精密度试验
Figure BDA0003745784580000123
Figure BDA0003745784580000131
结果表明：样品的中间精密度试验良好。
4)准确度试验
取已知含量的样品(批号：21100269，含量：8.52mg/g)0.1g，精密称定，分别加入1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品溶液(0.085044mg/ml)5ml、10ml、15ml各三份，按正文供试品溶液制备方法制成加样回收供试品溶液，按正文〔含量测定〕项下的色谱条件，分别进样1μl，以下列公式计算回收率，RSD，结果见下表。
Figure BDA0003745784580000132
表10准确度试验
Figure BDA0003745784580000133
试验结果表明：回收率在98％—105％之间，准确度试验良好。
(3)专属性试验
取九香虫配方颗粒(批号：21100269)供试品溶液、阴性溶液与1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品溶液注入液相色谱仪。图谱见图3。
实验结果表明：阴性色谱图中在与对照品相应的保留时间没有色谱峰，说明辅料及溶剂对1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的测定无干扰，以本法测定九香虫配方颗粒中1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的含量具有专属性。
(4)延迟性试验
在确定的色谱条件上，保持最高流动相比例，延长洗脱时间，考察在既定的色谱条件系统下，是否会残留杂质峰对后续样品造成影响。图谱见图4。
由实验结果可知，延长进样时间至81min，无杂质峰，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，对后续样品的分析亦无影响。
(5)耐用性试验
1)稳定性试验
取本品(批号：21100269)，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，共测定24小时，测定峰面积值，计算其RSD。
表11稳定性试验测定结果-峰面积(mAu)
Figure BDA0003745784580000141
结果：样品供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2)不同流速考察
取本品(批号：21100269)，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察每分钟0.25ml、每分钟0.30ml、每分钟0.35ml三个流速下色谱峰分离效果。
表12不同流速考察
Figure BDA0003745784580000142
图谱见图5。结果：三种流速下，色谱峰的分离度均较好，含量接近，耐用性较好。
3)柱温考察
取本品(批号：21100269)，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，考察30℃、35℃、40℃三个温度下色谱峰分离效果。
表13不同柱温的考察
Figure BDA0003745784580000151
图谱见图6。结果：三种柱温下色谱峰分离效果均较好，含量接近，耐用性较好。
4)色谱柱考察
取本品(批号：21100269)，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别考察Waters HSS T3(2.1×150mm，1.8μm)，Waters CORTECS T3(2.1×150mm，1.6μm)，WatersHSS T3(2.1×100mm，1.8μm)三种色谱柱对九香虫配方颗粒的分离效果。
表14不同色谱柱的比较
Figure BDA0003745784580000152
图谱见图7。结果：三种色谱柱的分离均较好，保留时间适中，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小，此方法具有普遍适应性。本实验采用Waters HSS T3(2.1×150mm，1.8μm)色谱柱进行九香虫颗粒含量测定。
实施例2
本实施例用于确认九香虫配方颗粒、炒九香虫配方颗粒的质量评价方法中定性分析的最优方案，具体包括色谱条件、波长选择、参照物溶液制备、供试品溶液的制备，并通过方法学验证确认方法的可行性。
1、仪器与试剂
同1.1仪器与试剂。
2、对照品来源
腺苷、黄嘌呤对照品均购自中国食品药品检定研究院，编号分别为110879-201703、140662-200802；1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品购自上海源叶生物科技有限公司，编号为Y22N11S131967；尿酸对照品购自上海诗丹德标准技术服务有限公司，编号为9602。九香虫对照药材购自中国食品药品检定研究院，编号为121651-201402。
3、色谱条件
检测波长为254nm，其余同实施例1中确定的色谱条件。
4、波长的选择
取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定，记录190～400nm范围内的吸收光谱(见图8-9)。
结果表明，在254nm波长下，色谱峰信息丰富、响应较好，选用254nm作为检测波长。
5、参照物溶液的制备
取九香虫对照药材0.2g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取〔含量测定〕项下的对照品溶液，作为对照品参照物溶液。再取尿酸、黄嘌呤、腺苷对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含尿酸20μg、黄嘌呤20μg、腺苷15μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
6、供试品溶液的制备
同实施例1中的供试品溶液制备。
7、方法学验证
(1)专属性考察
下图为九香虫配方颗粒的专属性试验图谱，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取含辅料的阴性样品和供试品溶液各1μl，测定。图谱见图10。
结果表明辅料、提取溶剂对九香虫配方颗粒特征图谱的测定无干扰。
(2)整体性考察
在相同的色谱条件上，保持有机相最高时的洗脱比例，洗脱时间延长一倍，记录色谱图。图谱见图11。
结果表明，原梯度洗脱结束后无明显色谱峰流出，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，并且对后续样品的分析无干扰。
(3)精密度考察
取同一批号样品(批号：21100269)，按供试品溶液制备方法制备成供试液，连续进样6次，每次1μl，记录色谱图。以黄嘌呤所对应的峰2为参照峰S1，计算峰1、峰3、峰4、峰5、峰6的相对保留时间和相对峰面积，以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为参照峰S2，计算峰7的相对保留时间，结果见下表。
表15精密度实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0003745784580000171
结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于1％，精密度良好。
(4)稳定性考察
取同一批号样品(批号：21100269)，按供试品溶液制备方法制备成供试液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h进样1μl，记录色谱图。以黄嘌呤所对应的峰2为参照峰S1，计算峰1、峰3、峰4、峰5、峰6的相对保留时间和相对峰面积，以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为参照峰S2，计算峰7的相对保留时间，结果见下表。
表16稳定性实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0003745784580000172
/>
结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于1％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
(5)重复性考察
取同一批号样品(批号：21100269)，按供试品溶液制备方法制备样品6份，每次1μl，记录色谱图。以黄嘌呤所对应的峰2为参照峰S1，计算峰1、峰3、峰4、峰5、峰6的相对保留时间和相对峰面积，以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为参照峰S2，计算峰7的相对保留时间，结果见下表。
表17重复性实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0003745784580000181
结果表明，各特征峰的相对保留时间的RSD均小于1％，重复性良好。
(6)中间精密度考察
取同一批号样品(批号：21100269)，分别由两个实验员按正文供试品溶液制备方法制备3份供试品溶液，分别于不同时间在不同仪器上(Thermo Vanquish和Agilent 1290)分别进样1μl，记录色谱图。以黄嘌呤所对应的峰2为参照峰S1，计算峰1、峰3、峰4、峰5、峰6的相对保留时间，以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为参照峰S2，计算峰7的相对保留时间，结果见下表。
表18中间精密度实验结果(相对保留时间)
Figure BDA0003745784580000182
结果表明，样品的特征峰相对保留时间的RSD均小于3％，中间精密度较好。
耐用性试验
1)色谱柱考察
本研究中分别考察了ACQUITY UPLC HSS T3(Waters，2.1mm×100mm，1.8μm)；ACQUITY UPLC HSS T3(Waters，2.1mm×150mm，1.8μm)；ACQUITY UPLC CORTECS T3(Waters，2.1mm×150mm，1.6μm)3种不同填料的色谱柱的分离效果。图谱见图12。
结果表明，使用其他两种色谱柱，部分色谱峰分离度不佳，出现包峰现象；HSS T3(2.1mm×150mm，1.8μm)色谱柱，峰信息丰富，分离度佳，基线平稳因此确定使用该色谱柱。
2)柱温考察
以ACQUITY UPLC HSS T3(Waters，2.1mm×150mm，1.8μm)为色谱柱，分别考察了柱温为30℃、35℃、40℃时的样品分离效果。图谱见图13。
结果表明，30℃～40℃柱温条件下，不影响样品的分离效果，适用性良好。
3)流速考察
以ACQUITY UPLC HSS T3(Waters，2.1mm×150mm，1.8μm)为色谱柱，分别考察了流速为0.25ml/min、每分钟0.30ml/min、每分钟0.35ml/min时的样品分离效果。图谱见图14。
结果表明，0.25～0.35ml/min流速的变动不影响样品的分离效果，适用性良好。
实施例3
本实施例使用实施例1确定的1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为含量测定指标，进行九香虫/炒九香虫配方颗粒及其上游原料(包括药材和饮片)的定量分析。1、不同批次九香虫/炒九香虫配方颗粒含量测定
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸80μg的溶液，即得。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.30ml；柱温为35℃；检测波长为240nm。理论板数按1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸峰计算应不低于5000。
表19九香虫/炒九香虫配方颗粒含量测定的梯度洗脱程序
Figure BDA0003745784580000201
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
取九香虫配方颗粒、炒九香虫配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液供试液，测定1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的含量，结果见下表。
表20不同批次九香虫、炒九香虫配方颗粒含量测定
Figure BDA0003745784580000202
Figure BDA0003745784580000211
2、不同批次九香虫/炒九香虫饮片含量测定结果
供试品溶液的制备：取本品粉末(过二号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：取1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸12μg的溶液，即得。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.30ml；柱温为35℃；检测波长为240nm。理论板数按1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸峰计算应不低于5000。
表21九香虫/炒九香虫饮片含量测定的梯度洗脱程序
Figure BDA0003745784580000212
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
取配方颗粒对应的3批上游原料九香虫药材、炒九香虫饮片粉末(过二号筛)约0.2g，精密称定，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液供试液，测定1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的含量，结果见下表。
表22不同批次九香虫、炒九香虫饮片含量测定
Figure BDA0003745784580000213
Figure BDA0003745784580000221
实施例4
本实施例使用实施例2确认的最优方案构建的九香虫样品的超高效液相色谱特征图谱，并对九香虫/炒九香虫配方颗粒及其上游原料质量进行定性分析，通过特征图谱反映九香虫-炮制品-中间体-制剂的质量一致性和可追溯性。
1、共有峰的选择
使用如实施例2相同的方法分别测定多批次的九香虫药材、多批次的九香虫标汤、多批次的九香虫颗粒、多批次的炒九香虫饮片、多批次的炒九香虫标准汤剂、多批次的炒九香虫颗粒的特征图谱，结果如图15-20所示；将上述得到的九香虫药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱比对，确定其共有峰，结果如图21所示。
2、对照品指认
如图22-23所示，根据药材，饮片，标准汤剂和颗粒多批次共有峰，结合实际可实施性，以及对照品指认的情况，最终特征图谱规定8个共有峰。作为九香虫配方颗粒、炒九香虫配方颗粒特征峰，用以评价其质量，其中峰1：尿酸；峰2(S1)：黄嘌呤；峰4：腺苷；峰8(S2)：1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸。
3、峰定位—相对保留时间的确定：
为了更加客观的确定待测峰相对保留时间，更加准确的进行峰定位，考虑以黄嘌呤参照物相对应的峰为S1峰，以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸参照物相对应的峰为S2峰，对1，3，4，5，6，7号峰进行定位，结合多批次九香虫药材、炒九香虫饮片、标准汤剂、配方颗粒数据均值确定其相对保留时间。
表23特征峰相对保留时间的确定
Figure BDA0003745784580000231
结合多批次药材、饮片、标准汤剂、颗粒数据均值，以黄嘌呤和1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为S1和S2，计算1，3，4，5，6号峰与S1峰的相对保留时间，计算7号峰与S2峰的相对保留时间。分析上述数据，各特征峰相对保留时间均较稳定。经对照品指认，峰1、峰4色谱峰分别为尿酸、腺苷，故对峰3、峰5、峰6、峰7相对保留时间作以下规定，规定值为：1.15(峰3)、1.70(峰5)、1.81(峰6)、0.77(峰7)。其相对保留时间应在规定值的±10％之内。
4、特征图谱的应用价值
上述多批次药材、饮片、标准汤剂、颗粒特征图谱测定结果具有重要的应用价值和指导意义，即从九香虫药材-标准汤剂-配方颗粒，均呈现8个共有特征峰，表明九香虫配方颗粒与标准汤剂、药材的关键质量一致；从炒九香虫饮片-标准汤剂-配方颗粒均呈现8个共有特征峰，表明炒九香虫配方颗粒与标准汤剂、药材的关键质量一致。

Claims (6)

1.一种九香虫及其炮制品的质量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建九香虫及其炮制品的超高效液相色谱特征图谱，其特征图谱包括至少8个共有峰，所述共有峰包括尿酸、黄嘌呤、腺苷、3,4-二羟基喹啉-2-羧酸、1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸的特征峰；
（2）制备待评价制剂的测试溶液并采用与步骤（1）中相同的色谱条件进行超高效液相色谱分析，并获得超高效液相色谱图；
（3）步骤（2）中获得的超高效液相色谱图与步骤（1）中的特征图谱比对，进行待评价样品的定性分析；以特征峰中1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸为含量测定指标，进行待评价样品中九香虫及其炮制品的定量分析；
其中，步骤（1）中包括九香虫及其炮制品的前处理，前处理所使用的提取溶剂为体积质量分数为10～50%的甲醇水溶液；
所述超高效液相色谱分析的条件如下：色谱柱为HSS T3色谱柱；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05-0.3%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0～3min，0→1A%，3～10min，1→3%A%，10～22min，3→6A%，22～26min，6→10A%，26～31min，10→40A%，31～37min，40→50A%，37～40min，50A%。
2.根据权利要求1所述的质量评价方法，其特征在于，步骤（1）中，构建九香虫及其炮制品的超高效液相色谱特征图谱的方法包括以下步骤：
1）制备九香虫及其炮制品的多个供试品溶液；制备对照药材的参照物溶液，其中对照药材为九香虫；
2）将步骤1）中制备的供试品溶液以及参照物溶液分别进行超高效液相色谱分析，得到相应的超高效液相色谱图；
3）对照药材的超高效液相色谱图作为对照，从步骤2）中得到的供试品溶液的超高效液相色谱图中选择至少8个共有峰，构成九香虫药材的超高效液相色谱特征图谱。
3. 根据权利要求1所述的质量评价方法，其特征在于，检测波长为240- 254nm；柱温30～40℃；流速每分钟0.25～0.35ml。
4.根据权利要求1或2所述的质量评价方法，其特征在于，九香虫及其炮制品的超高效液相色谱特征图谱包括8个共有峰；以黄嘌呤特征峰为参照峰S1，6个共有峰的相对保留时间如下：0.77±10%、1.00±10%、1.15±10%、1.32±10%、1.70±10%、1.81±10%；以1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸特征峰为参照峰S2，2个共有峰的相对保留时间如下：0.77±10%和1.00±10%。
5.根据权利要求2所述的质量评价方法，其特征在于，步骤2）中还包括制备对照品的参照物溶液并进行超高效液相色谱分析，得到的超高效液相色谱用于指认步骤3)中的共有峰，所述对照品包括尿酸、黄嘌呤、腺苷和1,4-二氢-4-氧代喹啉-2-羧酸。
6.根据权利要求2所述的质量评价方法，其特征在于，步骤3）中，3,4-二羟基喹啉-2-羧酸的特征峰通过质谱进行指认。
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