CN114894934A - 一种全蝎药材及其配方颗粒uplc特征图谱的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全蝎药材及其配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法，包括1)取全蝎药材或其配方颗粒中一种，处理后加入溶剂进行提取制成供试品溶液；2)取酪氨酸、色氨酸，加入溶剂制成对照品溶液；3)取全蝎对照药材，加入溶剂进行提取制成对照药材溶液；4)将供试品溶液、对照品溶液与对照药材溶液分别注入液相色谱仪，根据创建的色谱条件，获得特征图谱；5)通过建立的UPLC特征图谱来检测全蝎药材及其配方颗粒的质量。本发明提供更加全面、简单、快捷、有效的全蝎药材及其配方颗粒的质量控制方法，为全蝎药材质量的提高和配方颗粒的产业化提供更有力保障。

Description

一种全蝎药材及其配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及中药领域，尤其涉及一种全蝎药材及其配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法及应用。

背景技术

全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎Buthus martensii Karsch的干燥体。味辛，性平。有毒，归肝经。具有息风镇痉，通络止痛，攻毒散结之效。用于肝风内动，痉挛抽搐，小儿惊风，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，偏正头痛，疮疡，瘰疬。

全蝎的主要成分为：蛋白质类、氨基酸类、脂肪油类、多糖和微量元素等。现代药理作用与临床研究表明，全蝎在抗哮喘、抗凝、抗血栓、促纤溶、镇痛、抗癫痫、抗肿瘤，治疗支气管哮喘、白血病、扁桃体炎等方面都有较好的效果。临床常与蜈蚣配对使用，制成散剂或膏剂用于治疗各种疮疡肿痛。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，是饮片改革的一种新形式，相比于传统饮片汤剂具有方便携带，使用简单的特性，能够满足现代快节奏工作与生活的要求。近年来，中药配方颗粒快速发展，多个中药品种的配方颗粒国家标准相继出台，为规范中药配方颗粒的生产，推动中药现代化做出了巨大贡献。全蝎配方颗粒是全蝎饮片经过现代工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成，保留了全蝎的临床效果，同时兼顾了使用的便携性。

关于全蝎的质量控制手段目前已有部分报道。张政等人采用高效毛细管蛋白电泳法对全蝎酶解液中蛋白类成分(>10kDa)进行电泳分析，初步建立了以25个峰为共有峰的指纹图谱，10批次全蝎药材相似度均在0.999以上。王聪聪在药典基础上研究道地产区山东全蝎药材质量评价，通过建立灰色关联度法、红外光谱、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)指纹图谱、RAPD技术以及蝎毒指纹图谱研究，全面评价5个不同产地10批次全蝎药材质量。通过聚类分析，均显示山东济南千佛山产全蝎质量优于其他产区。

刘凯娜等人利用RP-HPLC法测定全蝎中甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸含量，采用酸水解法制备游离氨基酸样品溶液，结果显示以上4种氨基酸溶液稳定，不易被酸氧化破坏，建议规定含氨基酸以甘氨酸、精氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的总量计不得少于15.0％。郑晓媚以高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法测定全蝎中未衍生化牛磺酸含量，4批全蝎牛磺酸含量为0.81％-2.02％。

全蝎现行法定质量标准收录于《中国药典》2020年版一部，主要由性状、显微鉴别、水分、灰分、黄曲霉毒素检查项和浸出物组成。这些检测项目在一定程度上能反映全蝎药材的质量，但内容相对简单，质量控制效果有限。

市场上的全蝎原主要来源于野生，使用量大，野生资源消耗严重，现用量逐年攀升，市场供不应求，已逐渐转为家养，价格也一路攀升。作为价值较高的药材，全蝎在市场上存在掺伪现象，例如掺蛋清、水泥、淀粉等，药材质量参差不齐，给全蝎的药品质量和市场经营管理带来极大挑战，亟需开展进一步的研究丰富与全蝎质量相关的检测项目，从而完善质量标准，保障用药安全。

现有文献资料中，多将全蝎样品进行酸解，并采用柱前衍生HPLC法测定全蝎中氨基酸类成分，但该方法为水解之后样品，呈现检测结果与原样品存在一定偏离，不能有效区别不同动物药，且操作步骤繁琐，对操作人员及仪器要求均较苛刻。此外还有毛细管电泳法，亦存在较多缺点：1、毛细管柱内径小，蛋白质易吸附堵塞；2、与HPLC相比，操作复杂，重现性较差；3、反应条件较为苛刻，如蛋白电泳的方向会因pH值的改变而改变。因此，亟需开发新的方法对全蝎药材及其配方颗粒进行质量控制。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种全蝎药材及其配方颗粒UPLC特征图谱的构建及应用，提供更加全面、简单、快捷、有效的全蝎药材及其配方颗粒的质量控制方法，为全蝎药材质量的提高和配方颗粒的产业化提供更有力保障。

技术方案：本发明的一种全蝎药材及其配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：

1)取全蝎药材或其配方颗粒中一种，处理后加入溶剂进行提取制成供试品溶液；

2)取酪氨酸、色氨酸，加入溶剂制成对照品溶液；

3)取全蝎对照药材，加入溶剂进行提取制成对照药材溶液；

4)将供试品溶液、对照品溶液与对照药材溶液分别注入液相色谱仪，根据创建的色谱条件，获得特征图谱；

5)通过建立的UPLC特征图谱来检测全蝎药材及其配方颗粒的质量。

其中，所述的步骤1)中取全蝎药材或其配方颗粒中一种，过筛后称量0.3g～0.5g，加入0～100％甲醇水溶液10ml～50ml，超声或加热回流或振摇处理15min～60min，冷却后用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液即为供试品溶液。

其中，所述的步骤1)中取全蝎药材粉末0.5g或者取全蝎配方颗粒0.3g研细，精密称定后置具塞容器中，加入10％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量后超声处理30min，超声功率为250W，超声频率为40kHz，取出放冷后再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得全蝎药材或配方颗粒样品溶液。

其中，所述的步骤4)中液相色谱仪采用超高效液相色谱仪；固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；色谱条件为：进样量1μl～5μl、流速0.25ml/min～0.35ml/min、柱温25℃～35℃、检测波长205nm～320nm、乙腈为流动相A，0.05％～0.3％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱。

其中，所述的色谱柱采用Waters ACQUITY

HSS T3的100mm×2.1mm 1.8μm型号的色谱柱，乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；色谱条件中流速0.3ml/min、柱温30℃、检测波长205nm、进样量2μl；

梯度洗脱为：0～3min，流动相A的体积分数为0％，流动相B的体积分数为100％；3min～8min，流动相A的体积分数变化为0→5％，流动相B的体积分数变化为100％→95％；8min～22min，流动相A的体积分数变化为5％→15％，流动相B的体积分数变化为95％→85％；22min～23min，流动相A的体积分数为15％，流动相B的体积分数为85％。

其中，所述的步骤2)中对照品溶液中酪氨酸浓度10μg/ml～50μg/ml；色氨酸浓度10μg/ml～20μg/ml。

其中，所述的步骤3)中取全蝎对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇10ml，加热或超声处理30min，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。

其中，所述的步骤4)中获得的特征图谱具有共有峰6个；以峰2(酪氨酸)为S1峰，计算峰1、峰3与S1峰的相对保留时间，以峰6(色氨酸)为S2峰，计算峰4、峰5与S2峰的相对保留时间，相对保留时间规定值为：0.71(峰1)、1.53(峰3)、0.90(峰4)、0.96(峰5)。

全蝎药材及其配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法在中药上的应用。

全蝎药材及其配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法在中药上的应用，其特征在于：包括下述步骤：

1)制备20批全蝎药材供试品溶液与3批全蝎配方颗粒供试品溶液；

2)按照上述构建方法对供试品溶液分别进行检测，得到全蝎药材20个UPLC特征图谱与全蝎配方颗粒3个UPLC特征图谱；

3)将得到的UPLC特征图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”来建立全蝎药材及其配方颗粒的对照图谱；

4)当全蝎药材或其配方颗粒特征图谱中含有所建对照图谱中相对应的6个特征峰，则判定该全蝎药材或其配方颗粒在特征图谱这一质量检测项目上合格。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明同时以酪氨酸对照品、色氨酸对照品、全蝎对照药材为参照物，配合合适的色谱条件，通过对全蝎药材和全蝎配方颗粒图谱的比较确定全蝎药材UPLC特征图谱，针对其药材与配方颗粒共有的水溶性特征成分进行研究，并作为全蝎药材特征图谱的确定依据，并且水溶性成分色谱峰实现较好分离，特征图谱信息丰富，色谱峰形好。该特征图谱不仅能用于定性分析全蝎药材的质量，而且能够确保采用该药材制备的全蝎配方颗粒的质量，也适用于检测配方颗粒的质量。

本发明操作简便、快速，重现性高，降低药品检测成本；提供更加全面、简单、快捷、有效的全蝎药材及其配方颗粒的质量控制方法，为全蝎药材质量的提高和配方颗粒的产业化提供更有力保障。本发明提供的全蝎药材及其配方颗粒对照图谱共确定了6个特征峰，指认了3个，达50％，同时使用对照药材作为参照物，更能体现配方颗粒和药材的一致性；将所得全蝎配方颗粒的特征图谱与对照图谱进行对比，以此对全蝎配方颗粒质量进行评价，结果较为客观、准确。

附图说明

图1为全蝎配方颗粒纯水提取色谱图；

图2为全蝎配方颗粒10％甲醇水溶液提取色谱图；

图3为全蝎配方颗粒30％甲醇水溶液提取色谱图；

图4为全蝎配方颗粒50％甲醇水溶液提取色谱图；

图5为全蝎配方颗粒100％甲醇水溶液提取色谱图；

图6为全蝎配方颗粒特征图谱提取方式考察UPLC图谱；

图7为全蝎配方颗粒205nm检测色谱图；

图8为全蝎配方颗粒220nm检测色谱图；

图9为全蝎配方颗粒275nm检测色谱图；

图10为全蝎配方颗粒320nm检测色谱图；

图11为全蝎配方颗粒Waters ACQUITY

HSS T3检测色谱图；

图12为全蝎配方颗粒CORTECS UPLC T3检测色谱图；

图13为全蝎配方颗粒Thermo Syncronis C18检测色谱图；

图14为全蝎配方颗粒梯度1检测色谱图；

图15为全蝎配方颗粒梯度2检测色谱图；

图16为全蝎配方颗粒梯度3检测色谱图；

图17为全蝎配方颗粒0.25ml/min流速检测色谱图；

图18为全蝎配方颗粒0.30ml/min流速检测色谱图；

图19为全蝎配方颗粒0.35ml/min流速检测色谱图；

图20为全蝎配方颗粒25℃柱温检测色谱图；

图21为全蝎配方颗粒30℃柱温检测色谱图；

图22为全蝎配方颗粒35℃柱温检测色谱图；

图23为全蝎药材UPLC对照特征图谱；

图24为全蝎配方颗粒UPLC对照特征图谱；

图25为全蝎药材和配方颗粒UPLC对照特征图谱对比图；

图26为20批全蝎药材UPLC特征图谱；

图27为全蝎配方颗粒特征图谱专属性试验UPLC图谱1；

图28为全蝎配方颗粒特征图谱专属性试验UPLC图谱2；

图29为全蝎配方颗粒特征图谱中间精密度试验图；

图30为3批全蝎配方颗粒UPLC特征图谱。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。

本发明的研发过程如下：

1、仪器与试药

仪器：Vanquish F超高效液相色谱仪(美国赛默飞)(Chromeleon工作站)、Waters-H-Class超高效液相色谱仪(美国沃特世)(Empower工作站)，Me204E/02电子天平(瑞士梅特勒托利多)、JJ500电子天平(常熟双杰)、KQ-250E超声波清洗器(昆山超声)、HY-4调速多用振荡器(金坛科兴)、HH-4数显恒温水浴锅(常州国华)、TGL-16C高速离心机(上海安亭)、LabUF250纯水系统(美国密理博)。

试剂：乙腈(色谱纯，赛默飞世尔)、磷酸(色谱纯，阿拉丁)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

对照品：酪氨酸(140609-201914)，购自中国食品药品检定研究院。

全蝎配方颗粒(由江阴天江药业有限公司提供)。

2、液相条件

色谱柱：Waters ACQUITY

HSS T3，1.8μm，2.1mm×100mm。

流动相A：乙腈

流动相B：0.2％磷酸水溶液(v/v)

梯度洗脱程序：

色谱参数：

检测器：DAD，205nm

流速：0.3ml/min

柱温：30℃

进样量：2μl

3、供试品溶液的制备

(1)提取溶剂的选择

由于全蝎配方颗粒是全蝎水提浓缩而成，水溶性强。考察了纯水、10％甲醇水溶液、30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液以及100％甲醇溶液共五种不同溶剂对全蝎配方颗粒的提取效果，这里的百分比为甲醇体积百分比。

具体实验方法如下：

取本品适量，研细，取约0.3g，共5组，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入纯水、10％甲醇水溶液、30％甲醇水溶液、50％甲醇水溶液和100％甲醇溶液各25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补足减失的重量，摇匀，12000rpm离心10min，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

配方颗粒特征图谱提取溶剂考察

色谱图比较结果见附图1～附图5，其中图1为全蝎配方颗粒用纯水提取所得供试品溶液的色谱图，图2为全蝎配方颗粒用10％甲醇水溶液提取所得供试品溶液的色谱图，图3为全蝎配方颗粒用30％甲醇水溶液提取所得供试品溶液的色谱图，图4为全蝎配方颗粒用50％甲醇水溶液提取所得供试品溶液的色谱图，以及图5为全蝎配方颗粒用100％甲醇提取所得供试品溶液的色谱图。

对峰面积数据进行分析，采用纯水、10％甲醇水溶液、30％甲醇水溶液进行提取时，各特征峰峰面积无明显差异。

对液相色谱图进行分析，采用50％甲醇水溶液和100％甲醇溶液提取时，各特征峰峰形较差。采用纯水及10％甲醇水溶液进行提取时，各特征峰分布较为均匀且谱图无明显差异。

最终，由于10％甲醇水溶液进行提取时，色谱峰峰形较好，且相对于纯水所提供试品溶液较易保存，故选取10％甲醇水溶液作为提取溶剂。

(2)提取方式的考察

取本品(批号：21110079)适量，研细，取约0.3g，共3组，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，密塞，称定重量，分别振摇提取、超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流30min，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取各供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，按正文色谱条件测定，计算特征峰峰面积/称样量，结果见下表、附图6。

配方颗粒特征图谱提取方式考察

结果表明：3种提取方式结果相接近，从实验操作的简便性角度，确定提取方式为超声处理。

(3)提取时间的选择

选取10％甲醇水溶液作为提取溶剂，考察了超声处理(频率250W，功率40kHz)15min、30min、45min、60min对全蝎配方颗粒的提取效果。对提取峰数目、各特征峰峰面积数据进行分析。

取本品适量，研细，取约0.3g，共4组，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)15min、30min、45min和60min，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，12000rpm离心10min，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

配方颗粒特征图谱提取时间考察

结果表明，提取时间为15min、30min、45min和60min时，提取峰数目无明显差异，各特征峰峰面积无明显差异，故选择常规提取时间30min进行供试品提取。

4、色谱分析条件的确定

供试品溶液的制备：

取全蝎配方颗粒适量，研细，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，12000rpm离心10min，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

(1)检测波长的选择

色谱条件如下：

色谱柱：Waters ACQUITY

HSS T3，1.8μm，2.1mm×100mm。

流动相A：乙腈

流动相B：0.2％磷酸水溶液(v/v)

梯度洗脱程序：

色谱参数：

检测器：DAD，全波长扫描(200～400nm)

流速：0.3ml/min

柱温：30℃

进样量：2μl

考察了从低波长至高波长4个不同波长，分别是205nm、220nm、275nm和320nm，进行检测的结果，所得色谱图见附图7～附图10，其中，图7为205nm下检测色谱图，图8为220nm下检测色谱图，图9为275nm下检测色谱图，以及图10为320nm下检测色谱图。

结果表明，205nm条件下信息量多，且峰分布较为均匀。故选取205nm波长作为检测条件。

(2)不同色谱柱的选择

本实验考察了不同厂家及填料的色谱柱对分离效果的影响，色谱柱信息见下表。

考察结果见附图11～附图13，其中图11为Waters ACQUITY

HSS T3检测色谱图，图12为Waters CORTECS

T3检测色谱图，图13为Thermo Syncronis C18检测色谱图。

结果表明，色谱柱2测定的3号峰峰形较差，5号峰和6号峰分离较差，色谱柱3测定的特征峰3峰形较差，色谱柱1测定的各特征峰分离效果较好。故最终选择色谱柱1即WatersACQUITY

HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)作为特征图谱分析色谱柱。

(3)不同梯度的选择

色谱条件如下：

色谱柱：Waters ACQUITY

HSS T3，1.8μm，2.1mm×100mm。

流动相A：乙腈

流动相B：0.2％磷酸水溶液(v/v)

色谱参数：

检测器：DAD，205nm

流速：0.3ml/min

柱温：30℃

进样量：1～2μl

本实验考察了一下三个不同洗脱梯度对分离效果的影响。

梯度1:0/3/8/22/23分钟，0/0/5/15/15％乙腈；

梯度2:0/3/20/25分钟，0/0/25/25％乙腈；

梯度3:0/3/16/17分钟，0/0/15％乙腈；

考察结果见附图14～附图16，其中，图14为梯度1检测色谱图，图15为梯度2检测色谱图，图16为梯度3检测色谱图。

结果表明，采用梯度2进行洗脱时，5号峰和6号峰分离度不佳；采用梯度3进行洗脱时，3号峰有包峰，综合考虑各特征峰的分离度、拖尾因子和理论塔板数，采用梯度1进行洗脱时，分离效果最佳。

故最终选择梯度1检测特征图谱。

(4)不同流速的选择

色谱检测条件如下：

色谱柱：Waters ACQUITY

HSS T3，1.8μm，2.1mm×100mm。

流动相A：乙腈

流动相B：0.2％磷酸水溶液(v/v)

梯度洗脱程序：

色谱参数：

检测器：DAD，205nm

柱温：30℃

进样量：2μl

本实验考察了0.25ml/min、0.30ml/min和0.35ml/min三种不同流动相流速对分离效果的影响。

考察结果见附图17～附图19，其中图17为0.25ml/min流速检测色谱图，图18为0.30ml/min流速检测色谱图，图19为0.35ml/min流速检测色谱图。

结果表明，流速为0.35ml/min时，3号峰分离度不佳。综合考虑各特征峰的分离度、拖尾因子和理论塔板数，流速为0.30ml/min时，分离效果最佳。故最终选择0.30ml/min流速条件下检测特征图谱。

(5)不同柱温的选择

色谱柱：Waters ACQUITY

HSS T3，1.8μm，2.1mm×100mm。

流动相A：乙腈

流动相B：0.2％磷酸水溶液(v/v)

梯度洗脱程序：

色谱参数：

检测器：DAD，205nm

流速：0.3ml/min

进样量：2μl

本实验考察了25℃、30℃、35℃三个不同温度对分离效果的影响。

考察结果见附图20～附图22，其中图20为25℃柱温检测色谱图，图21为30℃柱温检测色谱图，图22为35℃柱温检测色谱图。

结果表明，柱温为25℃时，峰5分离效果不佳；柱温为35℃时，峰2存在包峰，峰3分离效果不佳。

综合考虑各特征峰的分离度、拖尾因子和理论塔板数，柱温为30℃时，分离效果最佳。故最终选择30℃柱温条件下检测特征图谱。

应用时所得全蝎药材的特征图谱大体上如附图23所示；全蝎配方颗粒的特征图谱大体上如附图24所示。所得全蝎配方颗粒的特征图谱与全蝎药材的特征图谱基本一致，表明全蝎配方颗粒与全蝎药材的质量具有一致性，如附图25所示。

实施例1：

本实施例为全蝎药材的UPLC特征图谱的检测和对照图谱的建立。

S11.取全蝎药材粉末适量，取约0.5g，精密称定，置具塞容器中，精密加入10％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，12000rpm离心10min，滤过，取续滤液，即得。

S12.取酪氨酸、色氨酸对照品适量，加10％甲醇水溶液制成每1ml含酪氨酸20μg、含色氨酸10μg的溶液，即得。

S13.取全蝎对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇10ml，超声处理30min，摇匀，12000rpm离心10min，取上清液，滤过，即得。

S14.分别精密吸取对照品溶液、对照药材溶液和全蝎药材供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱，Waters ACQUITY

HSS T3(1.8μm，2.1mm×100mm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；检测波长为205nm。

S21.制备20批全蝎药材供试品溶液。

S22.获得20批全蝎药材UPLC特征图谱。

S23.将得到的全蝎药材UPLC特征图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，建立全蝎药材的对照图谱，见附图26。

实验结果：20批全蝎药材均显示相同的6个共有特征峰，并以峰2(酪氨酸)、峰6(色氨酸)为参照峰进行标准研究。最终规定全蝎配方颗粒特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中峰2、峰6应与酪氨酸对照品、色氨酸对照品参照物峰保留时间相对应。以酪氨酸参照物相应的峰为S1峰，计算峰1、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间均应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.71(峰1)、1.53(峰3)；与色氨酸参照物相应的峰为S2峰，计算峰4、峰5与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间均应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.90(峰4)、0.96(峰5)。

建立的全蝎药材对照图谱可以用于较为准确地控制全蝎药材质量，见附图23。

实施例2：

本实施例为全蝎配方颗粒的UPLC特征图谱的检测和对照图谱的建立。

S11.取全蝎配方颗粒适量，研细，取约0.3g，精密称定，置具塞容器中，精密加入10％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，12000rpm离心10min，滤过，取续滤液，即得。

S12.取酪氨酸、色氨酸对照品适量，加10％甲醇水溶液制成每1ml含酪氨酸20μg、含色氨酸10μg的溶液，即得。

S13.取全蝎对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇10ml，超声处理30min，摇匀，12000rpm离心10min，取上清液，滤过，即得。

S14.分别精密吸取对照品溶液、对照药材溶液和全蝎配方颗粒供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱，Waters ACQUITY

HSS T3(1.8μm，2.1mm×100mm)；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；检测波长为205nm。

S21.制备3批全蝎配方颗粒供试品溶液。

S22.获得3批全蝎配方颗粒UPLC特征图谱。

S23.将得到的全蝎配方颗粒UPLC特征图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，建立全蝎配方颗粒的对照图谱。

实验结果：3批全蝎配方颗粒均显示相同的6个共有特征峰，并以峰2(酪氨酸)、峰6(色氨酸)为参照峰进行标准研究。最终规定全蝎配方颗粒特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现6个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的6个特征峰保留时间相对应，其中峰2、峰6应与酪氨酸对照品、色氨酸对照品参照物峰保留时间相对应。以酪氨酸参照物相应的峰为S1峰，计算峰1、峰3与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间均应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.71(峰1)、1.53(峰3)；与色氨酸参照物相应的峰为S2峰，计算峰4、峰5与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间均应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.90(峰4)、0.96(峰5)。

建立的全蝎配方颗粒对照图谱可以用于较为准确地控制全蝎配方颗粒质量，见附图24。

实施例3：

本实施例为全蝎配方颗粒的UPLC特征图谱方法学考察。

(1)专属性考察

取本品(批号：21110079)，按正文供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取酪氨酸对照品溶液、全蝎对照药材溶液、含辅料的阴性样品和供试品溶液各2μl，测定，结果见附图27。

结果表明：辅料对本品特征图谱的检测没有干扰，具有一定的专属性。

(2)整体性考察

取本品(批号：21110079)，按正文特征图谱项下内容制备供试品溶液并测定，在相同的色谱条件上，保持乙腈最高比例，洗脱时间延长一倍，即下表梯度2，记录色谱图，并与标准正文所规定的梯度1进行对比，结果见附图28。

特征图谱整体性试验洗脱梯度

结果表明：原梯度洗脱结束后无明显色谱峰流出，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，对后续样品的分析无干扰。

(3)精密度考察

取本品(批号：21110079)，按正文特征图谱项下内容制备供试品溶液并测定，连续进样6次，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见下表。

配方颗粒特征图谱仪器精密度试验

结果表明：各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2％，精密度良好。

(4)稳定性考察

取本品(批号：21110079)，按正文特征图谱项下内容制备供试品溶液，分别于0、2、6、10、14、18、20、24h进行测定，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见下表。

配方颗粒特征图谱稳定性试验

结果表明：供试品溶液在24h内测定，相对保留时间无显著波动，但相对峰面积有较大波动，前期标准汤剂质量标准研究结果表明，不同批次间相对峰面积差异较大，暂不考虑将其纳入指标，故仅从相对保留时间结果看，本品供试品溶液在24h内，可用于检测特征图谱。

(5)重复性考察

取本品(批号：21110079)，按正文特征图谱项下内容制备供试品溶液并测定，平行6份，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果见下表。

配方颗粒特征图谱重复性试验

结果表明：各特征峰的相对保留时间RSD均小于2％，重复性良好。但相对峰面积波动较大，因暂未将其纳入指标，未做深入研究。

(6)中间精密度考察

由本项目组其他分析人员在不同厂家色谱仪下操作，取同批样品(批号：21110079)，按正文特征图谱项下内容制备供试品溶液并测定，平行3份。考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果见下表、附图29。

配方颗粒特征图谱中间精密度试验-相对保留时间

配方颗粒特征图谱中间精密度试验-相对峰面积

结果表明：全蝎配方颗粒特征图谱在不同品牌的两台仪器间可以重现，各特征峰分离度尚可且峰型较好，相对保留时间差异较小，RSD均小于4％，但相对峰面积差别较大。

实施例4：

本实施例为全蝎配方颗粒的质量鉴别。

1.1对照品溶液的制备：取酪氨酸、色氨酸对照品适量，加10％甲醇水溶液制成每1ml含酪氨酸20μg、含色氨酸10μg的溶液，即得。

1.2色谱条件：采用Waters ACQUITY

HSS T3(1.8μm，2.1mm×100mm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温为30℃；检测波长为205nm。

1.3待鉴别样品供试品溶液的制备：取待鉴别样品适量，研细，取约0.3g，精密称定，置具塞容器中，精密加入10％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，12000rpm离心10min，滤过，取续滤液，即得。

2.测定法：分别精密吸取对照品溶液和全蝎配方颗粒待鉴别样品供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

样品测定

取大生产验证的3批全蝎配方颗粒，按照(特征图谱)项下内容，测定3批全蝎配方颗粒特征图谱，结果见下表。

样品测定结果(相对保留时间)

样品测定结果(相对峰面积)

结果表明，以上3批样品中各特征峰的相对保留时间均比较稳定，RSD均小于1％，且均在标准规定范围内。各特征峰的相对峰面积差异较大。

将待测定的全蝎配方颗粒特征图谱与构建出的全蝎配方颗粒对照图谱进行比较，见附图30。待鉴别的全蝎配方颗粒特征图谱中含有与所建全蝎配方颗粒对照图谱中相对应的6个特征峰，因此判定全蝎配方颗粒在特征图谱这一质量检测项目上合格。

Claims (10)

1.一种全蝎药材及其配方颗粒UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：

1)取全蝎药材或其配方颗粒中一种，处理后加入溶剂进行提取制成供试品溶液；

2)取酪氨酸、色氨酸，加入溶剂制成对照品溶液；

3)取全蝎对照药材，加入溶剂进行提取制成对照药材溶液；

4)将供试品溶液、对照品溶液与对照药材溶液分别注入液相色谱仪，根据创建的色谱条件，获得特征图谱；

5)通过建立的UPLC特征图谱来检测全蝎药材及其配方颗粒的质量。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的步骤1)中取全蝎药材或其配方颗粒中一种，过筛后称量0.3g～0.5g，加入0～100％甲醇水溶液10ml～50ml，超声或加热回流或振摇处理15min～60min，冷却后用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液即为供试品溶液。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述的步骤1)中取全蝎药材粉末0.5g或者取全蝎配方颗粒0.3g研细，精密称定后置具塞容器中，加入10％甲醇水溶液25ml，密塞，称定重量后超声处理30min，超声功率为250W，超声频率为40kHz，取出放冷后再称定重量，用10％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得全蝎药材或配方颗粒样品溶液。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的步骤4)中液相色谱仪采用超高效液相色谱仪；固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；色谱条件为：进样量1μl～5μl、流速0.25ml/min～0.35ml/min、柱温25℃～35℃、检测波长205nm～320nm、乙腈为流动相A，0.05％～0.3％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述的色谱柱采用Waters

HSS T3的100mmX2.1mm 1.8μm型号的色谱柱，乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱；色谱条件中流速0.3ml/min、柱温30℃、检测波长205nm、进样量2μl；

梯度洗脱为：0～3min，流动相A的体积分数为0％，流动相B的体积分数为100％；3min～8min，流动相A的体积分数变化为0→5％，流动相B的体积分数变化为100％→95％；8min～22min，流动相A的体积分数变化为5％→15％，流动相B的体积分数变化为95％→85％；22min～23min，流动相A的体积分数为15％，流动相B的体积分数为85％。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的步骤2)中对照品溶液中酪氨酸浓度10μg/ml～50μg/ml；色氨酸浓度10μg/ml～20μg/ml。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的步骤3)中取全蝎对照药材0.5g，置具塞锥形瓶中，加10％甲醇10ml，加热或超声处理30min，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照药材溶液。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的步骤4)中获得的特征图谱具有共有峰6个；以峰2(酪氨酸)为S1峰，计算峰1、峰3与S1峰的相对保留时间，以峰6(色氨酸)为S2峰，计算峰4、峰5与S2峰的相对保留时间，相对保留时间规定值为：0.71(峰1)、1.53(峰3)、0.90(峰4)、0.96(峰5)。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的构建方法在中药上的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：包括下述步骤：

1)制备20批全蝎药材供试品溶液与3批全蝎配方颗粒供试品溶液；

2)按照上述构建方法对供试品溶液分别进行检测，得到全蝎药材20个UPLC特征图谱与全蝎配方颗粒3个UPLC特征图谱；

3)将得到的UPLC特征图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”来建立全蝎药材及其配方颗粒的对照图谱；

4)当全蝎药材或其配方颗粒特征图谱中含有所建对照图谱中相对应的6个特征峰，则判定该全蝎药材或其配方颗粒在特征图谱这一质量检测项目上合格。

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