CN114047268A - 广地龙药物制剂的指纹图谱及其构建方法和含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药检测技术领域，具体提供了广地龙药物制剂的指纹图谱及其构建方法和含量测定方法，所述广地龙药物制剂指纹图谱的构建方法中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含磷酸二氢钾的水溶液‑乙腈为流动相，梯度洗脱，在特定的洗脱程序下即可得到10个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，洗脱程序简单，得到的指纹图谱基线平稳，噪音干扰较小，特征峰峰形好、分离度高，为广地龙药物制剂的质量检测和控制提供依据，实现对广地龙药物制剂整体成分表征和含量测定。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种广地龙药物制剂的指纹图谱及其构建方法和含量测定方法。
背景技术
广地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)的干燥体，主要含有蛋白质、氨基酸、脂类、核苷酸、酶类及微量元素等多种成分，主要的药理作用为抗血栓形成，抗癌，调节免疫功能等。因此，广地龙在临床中主要被用于高血压疾病治疗，哮喘治疗，心脏病治疗等，具有极强的临床价值和广阔的应用前景。广地龙配方颗粒是通过对中药广地龙进行提取、浓缩、干燥、制粒所得，利用配方颗粒可以生产广地龙其他类别的药物制剂，例如片剂、胶囊剂等。
目前临床上常用的地龙有广地龙和沪地龙，另市场上存在较多的伪品“土地龙”流通。2020版中国药典对广地龙药材的质量控制方法较为简单，仅从外观性状上对广地龙和沪地龙进行了区分，且无严格的质量控制方法，在制备成广地龙配方颗粒或其他制剂后，失去了广地龙原有药材的形态，通过外观性状不能进行区分，另缺少相关的有效成分含量和指纹图谱的控制，不利于广地龙配方颗粒或其他制剂质量稳定和控制，也会影响临床用药的安全性和有效性。文献对广地龙的含量测定指标主要分为四类：①核苷类化合物(尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、2′－脱氧肌苷、2′－脱氧鸟苷)；②总蛋白质或氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸)；③有机酸(琥珀酸)；④其他成分(腐胺、苯甲酸钠)。然而，一方面，通过上述一类成分的含量测定或鉴别广地龙配方颗粒，不能从整体上检测和控制其质量；另一方面，通过一类成分的含量测定联合其他成分的鉴别广地龙配方颗粒，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。
中药及其制剂均为多组分复杂体系，但是在现有技术中，广地龙配方颗粒的制备方法尚未统一，同时，其质量检测方法也不完善，使得广地龙配方颗粒的质量未能得到全面的控制，导致市场上出现质量良莠不齐的产品，严重影响了临床使用的效果。因此，建立一种能够全面地、快速地检测广地龙配方颗粒的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。
发明内容
因此，本发明的目的在于建立一种能够全面地、快速地检测广地龙配方颗粒的方法，进一步的，本发明目的在于提供了一种广地龙药物制剂的指纹图谱及其构建方法和含量测定方法。
具体的，本发明公开了广地龙药物制剂的指纹图谱构建方法，包括以下步骤，
(1)取广地龙药物制剂制备供试品溶液；
(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含磷酸二氢钾的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→15分钟→30分钟→50分钟→52分钟→70分钟→75分钟，流动相中乙腈的体积百分比为0％→0％→1％→2％→4％→5％→50％。
根据本发明任一项所述的构建方法，其中，步骤(1)包括：采用溶剂对广地龙药物制剂进行提取、固液分离、取滤液的步骤。
根据本发明任一项所述的构建方法，
可选的，所述广地龙药物制剂的质量与有机溶剂的体积比为(0.4-0.6)：(20-30)，比例关系为g/mL；可选的，采用的溶剂为体积分数为20～40％甲醇水溶液；更可选用，采用的溶剂为30％甲醇水溶液；可选的，提取方式为加热回流提取或超声提取；更优选的，所述提取方式为超声提取；可选的，提取时间为15-45min；更可选的，提取时间为30min；可选的，固液分离为离心或者过滤，优选的，固液分离之后还包括超滤和再过滤的步骤；超滤离心(15000rpm)时间为15-45min分钟；更可选的，超滤离心(15000rpm)时间为30min；
可选的，步骤1)供试溶液的制备方法包括如下步骤：取广地龙的药物制剂0.5重量份，精密称定，精密加入体积百分数为30％甲醇水溶液25体积份，称定重量，超声提取45分钟，放冷，再称定重量，取体积百分数为30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。
根据本发明任一项所述的构建方法，步骤(2)中含磷酸二氢钾的水溶液的浓度为8-12mmoL/L；优选地，高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为200-220nm，流速为0.5-1.0ml/min，柱温20-25℃或者35-40℃，进样量为2-20μl。
根据本发明任一项所述的构建方法，所述的构建方法还包括采用酪氨酸、次黄嘌呤、腺苷酸、苯丙氨酸、肌苷、鸟苷、色氨酸、腺苷中的至少一种为对照品制备对照品溶液的步骤和将所述的步骤(2)中的供试品溶液替换为对照品溶液，得到对照品指纹图谱的步骤。
可选的，对照品溶液的制备方法包括如下步骤a)、b)和c)：
a)精密称取肌苷对照品，加体积百分比为20％-40％(30％)甲醇水溶液，摇匀，制成对照品A溶液；每1体积份对照品A溶液含0.00015-0.00035重量份(0.00025重量份)肌苷的溶液；
b)精密称取鸟苷对照品，加体积百分比为20％-40％(30％)甲醇水溶液，摇匀，制成对照品B溶液；每1体积份对照品B溶液含0.00005-0.00015重量份(0.0001重量份)鸟苷的溶液；
c)精密称取色氨酸对照品，加体积百分比为20％-40％(30％)甲醇水溶液，摇匀，制成对照品C溶液；每1体积份对照品C溶液含0.000015-0.000035重量份(0.000025重量份)色氨酸的溶液；上述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
根据本发明任一项所述的构建方法，可选的，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，所述广地龙的药物制剂通过以下方法制备而成：
取广地龙，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少10min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04-1.12，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，取广地龙，加热回流提取1～5次，每次加入7～25重量倍量的水提取10min～60min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04～1.12，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。更可选的，取广地龙，加热回流提取2次，第1次加入9重量倍量的水提取30min，第2次加入7重量倍量的水提取25min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04-1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
本发明还提供了一种广地龙药物制剂的指纹图谱，由上述任一所述的构建方法得到。
本发明还提供了一种广地龙药物制剂的对照指纹图谱，其具有10个共有特征峰，保留时间分别为14.39min、17.34min、21.16min、28.30min、39.13min、41.07min、47.60min、51.15min、68.50min、72.70min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<10％、<5％或者3％；
本发明还提供了一种广地龙药物制剂的对照指纹图谱，其具有10个共有特征峰，以肌苷峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.30(峰1)、0.36(峰2)、0.44(峰3)、0.59(峰4)、0.82(峰5)、0.86(峰6)、1.00(峰7)、1.07(峰8)、1.44(峰9)、1.53(峰10)；
本发明还提供了一种广地龙药物制剂的对照指纹图谱，其具有10个共有特征峰，以肌苷峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.30(峰1)、0.36(峰2)、0.44(峰3)、0.59(峰4)、0.82(峰5)、0.86(峰6)、1.00(峰7)、1.07(峰8)、1.44(峰9)、1.53(峰10)；以峰9为参比峰，峰2与峰9的相对峰面积不低于0.62，以峰7为参比峰，峰8与峰7的相对峰面积不低于0.03；
本发明中，广地龙药物制剂的对照指纹图谱还可以使用单批次或者多批次广地龙药物制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的指纹图谱；可选的，广地龙药物制剂的对照指纹图谱还可以使用多批次广地龙药物制剂按照本发明任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱。
可选的，至少采用2批广地龙药物制剂得到对照指纹谱图，例如采用3个批次、5个批次、11个批次、15个批次的广地龙配方颗粒、18批广地龙标准汤剂冻干粉。
本发明还提供了一种广地龙药物制剂中中肌苷和色氨酸的的含量测定方法，包括如下步骤：
广地龙药物制剂供试品溶液的制备；
肌苷和色氨酸对照品溶液的制备；
测试步骤：取广地龙药物制剂供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，取供试品溶液和对照品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含磷酸二氢钾的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→5分钟→15分钟→35分钟→37分钟→42分钟，流动相中乙腈的体积百分比为2％→2％→3％→10％→45％→55％。
具体地，步骤(1)包括：采用溶剂对广地龙药物制剂进行提取、固液分离、取滤液的步骤。
可选的，所述广地龙药物制剂的质量与有机溶剂的体积比为(0.1-0.3)：(20-30)，比例关系为g/mL；可选的，采用的溶剂为体积分数为20～40％甲醇水溶液；更可选用，采用的溶剂为30％甲醇水溶液；可选的，提取方式为加热回流提取或超声提取；更优选的，所述提取方式为超声提取；可选的，提取时间为15-45min；更可选的，提取时间为30min；可选的，固液分离为离心或者过滤，优选的，固液分离之后还包括超滤和再过滤的步骤；超滤离心(15000rpm)时间为15-45min分钟；更可选的，超滤离心(15000rpm)时间为30min；
可选的，供试溶液的制备方法包括如下步骤：取广地龙的药物制剂0.2重量份，精密称定，精密加入体积百分数为30％甲醇水溶液25体积份，称定重量，超声提取45分钟，放冷，再称定重量，取体积百分数为30％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。本发明中，超滤步骤中选用截留分子量3kD的超滤管对供试品溶液过滤处理，可有效的除去分子量大于3000的大分子蛋白质等物质，避免大分子蛋白质等物质在色谱柱里面变性失活，影响色谱柱柱效。
具体地，含磷酸二氢钾的水溶液的浓度为8-12mmoL/L；优选地，高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为200-220nm，流速为0.5-1.0ml/min，柱温20-25℃或者35-40℃，进样量为2-20μl。
可选的，对照品溶液的制备方法包括如下步骤a)和/或b)：
a)精密称取肌苷对照品，加体积百分比为20％-40％(30％)甲醇水溶液，摇匀，制成对照品A溶液；每1体积份对照品A溶液含0.00005-0.00015重量份(0.0001重量份)肌苷的溶液；
b)精密称取色氨酸对照品，加体积百分比为20％-40％(30％)甲醇水溶液，摇匀，制成对照品C溶液；每1体积份对照品C溶液含0.000005-0.000015重量份(0.00001重量份)色氨酸的溶液；上述重量份与所述体积份的关系为g/mL。
可选的，本品按干燥品计算，每1g含肌苷(C10H12N4O5)应为4.0mg～16.0mg，含色氨酸(C11H12N2O2)应为0.50mg～1.60mg。
本发明还提供了一种广地龙药物制剂的质量检测方法，包括将待测广地龙产品的指纹图谱与广地龙药物制剂的对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测广地龙产品的指纹图谱为使用待测广地龙产品按照本发明任一所述的构建方法得到，所述广地龙药物制剂的对照指纹图谱为本发明所述的广地龙药物制剂的对照指纹图谱；和/或，包括按照本发明所述的广地龙药物制剂中肌苷和色氨酸的含量测定方法测定待测广地龙药物制剂的含量的步骤。
某些实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成广地龙药物制剂的对照指纹图谱。
待测广地龙产品的指纹图谱与广地龙药物制剂的对照指纹图谱的相似度如果不低于0.90-0.95(例如0.90)，则为质量合格；如果低于0.90-0.95(例如0.90)，则为不合格；具体地，所述相似度通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件得到。
某些优选的实施方式中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成广地龙药物制剂的对照指纹图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的广地龙药物制剂指纹图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为含磷酸二氢钾的水溶液-乙腈，梯度洗脱，在如下特定的洗脱程序下(0→15分钟→30分钟→50分钟→52分钟→70分钟→75分钟，流动相中乙腈的体积百分比为0％→0％→1％→2％→4％→5％→50％)即可得到10个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，洗脱程序简单，得到的指纹图谱基线平稳，噪音干扰较小，特征峰峰形好、分离度高，为广地龙药物制剂的质量检测和控制提供依据，实现对广地龙药物制剂整体成分表征。
2.本发明提供了一种建立广地龙的药物制剂的指纹图谱方法。该方法，以广地龙配方颗粒为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立对照指纹图谱，标定了10个共有特征峰，确认了共有特征峰2号峰为酪氨酸、3号峰为次黄嘌呤、4号峰为腺苷酸、6号峰为苯丙氨酸、7号峰为肌苷、8号峰为鸟苷、9号峰为色氨酸、10号峰为腺苷，选择7号峰肌苷作为内参考峰，确定了广地龙配方颗粒的共有特征峰的相对保留时间；且对2号峰酪氨酸、8号峰鸟苷进行相对峰面积的评价。本发明方法能够全面地、快速地检测其质量，有利于广地龙的药物制剂的全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性、有效性和稳定性。
本发明通过LC/MS/MS对各个特征峰进行分析，确认峰2、峰3、峰4、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10其分子结构式分别与酪氨酸、次黄嘌呤、腺苷酸、苯丙氨酸、肌苷、鸟苷、色氨酸、腺苷对照品分子结构式一致。
3.本发明建立广地龙的药物制剂的指纹图谱的方法所建立的广地龙配方颗粒的指纹图谱，同构相对峰面积的规定(峰2与内参考峰9号峰的相对峰面积不低于0.62、峰8与内参考峰7号峰的相对峰面积不低于0.03)，确保了广地龙配方颗粒产品的质量水平，并且对指纹图谱中10个特征峰的相对保留时间进行了规定，避免其它非共有峰的干扰，调高了标准的专属性。
4.本发明提供一种建立同时测定广地龙的药物制剂中肌苷和色氨酸的方法。以广地龙配方颗粒为检测对象，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为含磷酸二氢钾的水溶液-乙腈，梯度洗脱，在如下特定的洗脱程序下(0→5分钟→15分钟→35分钟→37分钟→42分钟，流动相中乙腈的体积百分比为2％→2％→3％→10％→45％→55％)，建立了针对该药物制剂的含量测定的方法，确定了肌苷和色氨酸的含量范围。本发明方法灵敏度高，具有很好的分离度，可以同时检测肌苷和色氨酸的含量。而且该检测方法具有精密度高、重现性好、稳定性好等优点，因此，能够快速、准确、可靠的检测广地龙的药物制剂中有效成分的含量。本发明前期研究发现若采用指纹图谱的梯度洗脱以及其他程序进行含量测定时，不仅检测时间过长，而且含量测定准确性低下。
5.本发明针对广地龙的药物制剂提供了全面的、科学化的质量标准检测方法，包括相关成分含量的测定和指纹图谱检测。测定方法使用参数精准控制，能完全反应出广地龙的药物制剂的质量，并可作为大规模生产的广地龙的药物制剂的疗效一致性的评价依据，为广地龙的药物制剂的安全有效和标准化生产提供保障。
在本发明的广地龙药物制剂中肌苷和色氨酸的含量测定和指纹图谱供试品处理方法中使用了超滤离心技术，该方法的使用可根据分子量大小的不同，除去样品中的大分子蛋白质等成分，有效的保护色谱柱，延长色谱柱使用寿命。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实验例5中梯度1的梯度条件下的色谱图；
图2为本发明实验例5中梯度2的梯度条件下的色谱图；
图3为本发明实验例5中梯度3的梯度条件下的色谱图；
图4为本发明实验例5中Intertsustain AQ-C18柱条件下的色谱图；
图5为本发明实验例5中Waters XSelect HSS T3 C18柱条件下的色谱图；
图6为本发明实验例5中Agilent Zorbax SB Aq-C18柱条件下的色谱图；
图7为本发明实施例5中流速为0.5mL/min的色谱图；
图8为本发明实施例5中流速为0.8mL/min的色谱图；
图9为本发明实施例5中流速为1.0mL/min的色谱图；
图10为本发明实施例5中柱温为30℃的色谱图；
图11为本发明实施例5中柱温为35℃的色谱图；
图12为本发明实施例5中柱温为40℃的色谱图；
图13为15批广地龙配方颗粒的指纹图谱(S1～S15)；
图14为广地龙配方颗粒对照指纹图谱；
图15为不同特征峰的对照品定位图谱；
图16为对比例1色谱图；
图17为对比例2色氨酸对照品色谱图；
图18为对比例2广地龙配方颗粒供试品色谱图；
图19为紫外光谱图，左侧附图为色氨酸对照品紫外光谱图；右侧附图为峰(29.797)紫外光谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
以下实施例、实验例和对比例中，广地龙配方颗粒的制备方法为：取广地龙，加热回流提取2次，第1次加入9重量倍量的水提取30min，第2次加入7重量倍量的水提取25min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04～1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。取颗粒剂按照1g/个胶囊的规格装入胶囊中制得胶囊剂。
实施例2
本实施例建立广地龙配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测广地龙配方颗粒0.5g，精密称定，精密加入30％(v/v)甲醇水溶液25mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取30％(v/v)甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取肌苷对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00025g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；精密称取鸟苷对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.0001g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；精密称取色氨酸对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.000025g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm，5μm的Intertsustain AQ-C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以10mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～15min，A与B的体积比为0％：100％；15～30min，A与B的体积比由0％：100％变为1％：99％；30～50min，A与B的体积比由1％：99％变为2％：98％；50～52min，A与B的体积比由2％：98％变为4％：96％；52～70min，A与B的体积比由4％：96％变为5％：95％；70～75min，A与B的体积比由5％：95％变为50％：50％；上述百分比为体积百分比，检测波长为210nm；柱温35℃；流速0.5mL/min。
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.005mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液得液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例3
本实施例建立广地龙配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测广地龙配方颗粒0.4g，精密称定，精密加入40％(v/v)甲醇水溶液20mL，称定重量，热回流提取40分钟，放冷，再称定重量，取40％(v/v)甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取肌苷对照品，加40％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00025g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；精密称取鸟苷对照品，加40％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.0001g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；精密称取色氨酸对照品，加40％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.000025g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：同实施例2。
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.005mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液得液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例4
本实施例建立广地龙胶囊剂的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测广地龙胶囊剂内容物0.6g，精密称定，精密加入20％(v/v)甲醇水溶液30mL，称定重量，热回流提取20分钟，放冷，再称定重量，取20％(v/v)甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取肌苷对照品，加20％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00025g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；精密称取鸟苷对照品，加20％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.0001g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；精密称取色氨酸对照品，加20％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.000025g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(3)色谱条件：同实施例2。
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液0.005mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液得液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液和对照品C溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例5广地龙配方颗粒指纹图谱分析条件的确立
1)检测波长的选择：除检测波长不同外，其他条件与实施例2相同，以检测波长作为变量，分析不同吸收波长210nm、254nm、280nm下的色谱图，以色谱峰数量和峰高作为指标，确定210nm作为检测波长；
2)梯度的选择：除梯度洗脱程序外，其他条件与实施例2相同，以梯度洗脱程序作为变量，不同的梯度洗脱程序如表1所示，不同梯度洗脱程序的色谱图如图1～3所示。由图1～3可知，梯度3洗脱呈现的图谱，其色谱信息较丰富，主要色谱峰分离度较好，基线较平稳且分析时间较为合理，确定了流动相梯度为梯度3。
表1梯度1～3的梯度洗脱程序
3)不同色谱柱的考察：除色谱柱外，其他条件与实施例2相同，以色谱柱作为变量，取同一份广地龙配方颗粒样品的供试品溶液,考察了实验室中现有的色谱柱:(1)Intertsustain AQ-C18，5μm,4.6mm×250mm；(2)Waters XSelect HSS T3 C18,5μm,4.6mm×250mm；(3)Agilent Zorbax SB Aq-C18,5μm,4.6mm×250mm。按0.5mL/min的流速进行梯度洗脱分析，不同色谱柱的色谱图如图4～6所示。由图4～6可知，Intertsustain AQ-C18对广地龙配方颗粒的分离效果较好。
4)不同流速的考察：除流速外，其他条件与实施例2相同，以流速作为变量，分别以0.5mL/min、0.8mL/min,1.0mL/min流速测定，不同流速的色谱图如图7～9所示。由图7～9可知，流速为0.5mL/min流速的色谱效果较好。
5)不同柱温的选择：除柱温外，其他条件与实施例2相同，以柱温作为变量，取同一份广地龙配方颗粒样品的供试品溶液，考察不同柱温30℃、35℃、40℃对本品的分离效果，不同柱温的色谱图如图10～12所示。由图10～12可知，特征图谱中峰5与峰6保留时间不稳定，出峰时间会出现前后互换情况。当柱温为20℃、25℃时，峰6出峰时间在峰5前，当柱温为30℃时，峰5与峰6出峰时间重合，当柱温为35℃、40℃时，峰6出峰时间在峰5后。因为柱温可以选择20-25℃或者35-40℃。柱温为35℃的色谱图，其各成分分离效果较好，结合色谱峰系统适应性参数，故最选择柱温为35℃。
6)最终色谱条件：色谱柱：Intertsustain AQ-C18色谱柱(250mm,4.6mm,5μm)；以乙腈-10mmol·L-1磷酸二氢钾水溶液为流动相，梯度洗脱如表2所示；流速：0.5mL/min；柱温为35℃；检测波长为210nm；理论板数按肌苷峰计算应不低于5000,进样量：10μL。
表2梯度洗脱程序
实施例6广地龙配方颗粒指纹图谱供试品溶液的制备
1)提取溶剂的选择：除提取溶剂不同外，其他条件同实施例2，以提取溶剂作为变量，提取溶剂为水、甲醇、乙醇、30％(v/v)甲醇、50％(v/v)甲醇和70％(v/v)甲醇，主要特征峰的系统适应性参数如表3所示。由表3可知，提取溶剂为30％(v/v)甲醇时，所得色谱图的峰形较好，系统适应性参数相对较优。
表3不同提取溶剂下广地龙配方颗粒色谱图参数
表3-1
表3-2
表3-3
表3-4
表3-5
表3-6
2)提取时间的选择：除提取时间不同外，其他条件同实施例2，以提取时间作为变量，提取时间为15min、30min、45min的主要特征峰的系统适应性参数如表4所示。由表4可知，不同的超声时间的溶解效果及色谱图无明显差异，故选择提取时间为45min。
表4不同提取时间下广地龙配方颗粒色谱图参数
表4-1
表4-2
表4-3
3)样品取样量的选择：除样品取样量不同外，其他条件同实施例2，以样品取样量作为变量，考察样品的不同提取量：0.1g、0.2g、0.5g，以特征峰的系统适应性参数作为考察指标，不同取样量的主要特征峰的系统适应性参数如表5所示。由表5可知，取样量0.1g～0.5g，随着取样量增加，特征峰的总峰面积呈现相应比例上升。考虑到特征峰的响应值情况，选择取样量为0.5g。
表5不同取样量的广地龙配方颗粒色谱图参数
表5-1
表5-2
表5-3
(4)最终提取方案：供试品溶液的制备方法为：取本品粉末约0.5g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加30％(v/v)甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，加30％(v/v)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，即得。
实施例7广地龙配方颗粒指纹图谱的建立
参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用特征峰的相对保留时间值，并且结合中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012”软件，对所得图谱峰2酪氨酸、峰8鸟苷的相对峰面积进行评价，并进行方法学考察。
根据实施例5和6，确定广地龙配方颗粒HPLC指纹图谱按如下方法建立：
(1)供试品溶液的制备：取广地龙配方颗粒粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加30％(v/v)甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，加30％(v/v)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，即得；参照物溶液的制备：精密称取肌苷对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00025g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；精密称取鸟苷对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.0001g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；精密称取色氨酸对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.000025g的溶液，摇匀，作为对照品C溶液；
(2)高效液相色谱条件：以4.6mm×250mm，5μm的Intertsustain AQ-C18为色谱柱，以乙腈-10mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相，梯度洗脱如表4所示；检测波长为210nm；柱温35℃；流速：0.5mL/min，理论板数按肌苷峰计算应不低于5000，进样量：10μL。按上述方法进行广地龙配方颗粒指纹图谱的共有模式的建立。
取15批次的广地龙配方颗粒样品按照上述确定的方法通过高效液相色谱得到广地龙配方颗粒指纹图谱，图13为15批广地龙配方颗粒的指纹图谱(S1～S15)，图14为广地龙配方颗粒对照指纹图谱。
广地龙配方颗粒(编号1-15，以及对应的药材产地信息如下表)由华润三九医药股份有限公司提供，按照实施例1的制备方法制备而成。
表6广地龙样品编号及对应的药材产地
采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012”，生成对照指纹图谱，对广地龙配方颗粒指纹图谱的检测结果进行分析、比较。由图13～14可知，广地龙配方颗粒HPLC指纹图谱共有色谱峰10各，其中8个峰(峰2、3、4、6、7、8、9、10)为已知成分峰；选取7号峰肌苷为内参考峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值得±10％范围之内，规定值分别为：0.30(1号峰)、0.36(2号峰，酪氨酸)、0.44(3号峰，次黄嘌呤)、0.59(4号峰，腺苷酸)、0.82(5号峰)、0.86(6号峰，苯丙氨酸)、1.00(7号峰，肌苷)、1.07(8号峰，鸟苷)、1.44(9号峰，色氨酸)、1.53(10号峰，腺苷)；计算峰2与峰9色氨酸、峰8与峰7肌苷的相对峰面积，其相对峰面积应在规定范围内，规定范围为：不低于0.62(峰2)、不低于0.03(峰8)。所得结果如表7～9所示，不同特征峰的对照品定位见图15所示。
表7广地龙配方颗粒指纹图谱共有模式相对保留时间
表8 15批广地龙配方颗粒指纹图谱相对保留时测定结果
表9 15批广地龙配方颗粒指纹图谱中峰2、峰8相对峰面积测定结果
(3)通过LC/MS/MS对各个特征峰进行分析，确认峰2、3、4、6、7、8、9、10其分子结果式分别与酪氨酸、次黄嘌呤、腺苷酸、苯丙氨酸、肌苷、鸟苷、色氨酸、腺苷对照品分子结构式一致，并且确定了其他特征峰成分的分子量。结果见下表。
表10广地龙配方颗粒(实施例1中制备的)LC/MS/MS分析检测结果
实施例8广地龙配方颗粒指纹图谱的方法学验证
1精密度
1.1精密度实验
取同一份供试品溶液(按照实施例7确定的方法制备得到，编号A1)，按实施例7项下色谱条件，重复进样6次，测定10个共有峰的相对保留时间和指纹图谱的相似度，结果可知，各特征峰与参照物S峰(7号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.13％、0.10％、0.13％、0.23％、0.11％、0.23％、0％、0.01％、0.26％、0.25％，与广地龙配方颗粒对照指纹图谱的相似度均大于0.996，表明精密度较好。
1.2重复性实验
取同一批供试品6份，按实施例7的方法分别测定10个共有峰的相对保留时间和指纹图谱的相似度，结果可知，各特征峰与参照物S峰(7号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.26％、0.17％、0.28％、0.56％、0.49％、0.03％、0％、0.01％、0.13％、0.14％，与广地龙配方颗粒对照指纹图谱的相似度均大于0.995，表明该方法重复性良好。
1.3中间精密度实验
取同一批供试品2份，分别由三名检验员在不同的时间，用同一台设备，按实施例7的方法分别测定10个共有峰的相对保留时间和指纹图谱的相似度，结果可知，各特征峰与参照物S峰(7号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.21％、0.08％、0.04％、0.22％、0.17％、0.18％、0％、0.02％、0.21％、0.21％，与广地龙配方颗粒对照指纹图谱的相似度均大于0.995，表明该方法中间精密度良好。
2专属性实验
供试品采用提取溶剂为30％甲醇，精密吸取供试品溶液、阴性对照品溶液(本发明实施例1采用的常规辅料为麦芽糊精，取0.5g麦芽糊精溶解于25mL体积百分数为30％甲醇中，制得阴性对照品溶液)各10μL，分别注入高效液相色谱仪，按实施例7的方法进行高效液相色谱检测，结果可知，空白溶剂在相应保留时间处无色谱峰，无干扰。
3稳定性实验
取同一批供试品，按实施例7的方法操作，分别在0、3、6、9、12、24小时进样，测定10个共有峰的相对保留时间和指纹图谱的相似度，结果可知，各特征峰与参照物S峰(7号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.38％、0.23％、0.29％、0.50％、0.45％、0.20％、0％、0.02％、0.31％、0.31％，与广地龙配方颗粒对照指纹图谱的相似度均大于0.995，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。
4耐用性
不同流速考察
取同一批供试品(编号S1)，按实施例7的方法操作，分别用0.5mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min的流速下测定10个共有峰的相对保留时间和指纹图谱的相似度，结果可知，各特征峰与参照物S峰(7号峰)的相对保留时间的RSD分别为8.23％、7.93％、7.62％、7.07％、3.52％、4.15％、0％、0.54％、1.98％、8.04％，表明流速在发生变化时，各特征色谱峰相对保留时间变化较大，建议固定流速为0.5mL/min。
实施例9
本实施例建立广地龙配方颗粒的含量测定的方法，包括如下步骤：
(1)取待测广地龙的配方颗粒0.1g，精密称定，精密加入30％(v/v)甲醇水溶液25mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取30％(v/v)甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取肌苷对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.0001g的溶液，摇匀，作为对照品D溶液；精密称取色氨酸对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00001g的溶液，摇匀，作为对照品E溶液；
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm，5μm的Waterssymmetry C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以10mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～5min，A与B的体积比为2％：98％；5～15min，A与B的体积比由2％：98％变为3％：97％；15～35min，A与B的体积比由3％：97％变为10％：90％；35～37min，A与B的体积比由10％：90％变为45％：55％；37～42min，A与B的体积比为45％：55％；上述百分比为体积百分比，检测波长为210nm；柱温35℃；流速0.5mL/min。
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液0.005mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液得液相色谱，并根据供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液的峰面积计算对照品D和对照品E的含量。
实施例10
本实施例建立广地龙配方颗粒的含量测定的方法，包括如下步骤：
(1)取待测广地龙的配方颗粒0.2g，精密称定，精密加入30％(v/v)甲醇水溶液25mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取30％(v/v)甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取肌苷对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.0001g的溶液，摇匀，作为对照品D溶液；精密称取色氨酸对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00001g的溶液，摇匀，作为对照品E溶液；
(3)色谱条件：同实施例9。
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液0.005mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液得液相色谱，并根据供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液的峰面积计算对照品D和对照品E的含量。
实施例11
本实施例建立广地龙配方颗粒的含量测定的方法，包括如下步骤：
(1)取待测广地龙的配方颗粒0.3g，精密称定，精密加入30％(v/v)甲醇水溶液25mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取30％(v/v)甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取肌苷对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.0001g的溶液，摇匀，作为对照品D溶液；精密称取色氨酸对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00001g的溶液，摇匀，作为对照品E溶液；
(3)色谱条件：同实施例9。
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液0.005mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液得液相色谱，并根据供试品溶液、对照品D溶液和对照品E溶液的峰面积计算对照品D和对照品E的含量。
实施例12广地龙配方颗粒含量测定供试品溶液的制备
1)提取溶剂的选择：除提取溶剂不同外，其他条件同实施例10，以提取溶剂作为变量，提取溶剂为水、甲醇、乙醇、30％(v/v)甲醇、50％(v/v)甲醇和70％(v/v)甲醇，表11-12可知，提取溶剂为30％(v/v)甲醇时，所得色谱图的峰形较好，系统适应性参数相对较优，且含量最高。
表11不同提取溶剂下广地龙配方颗粒色谱图参数
表12不同提取溶剂下广地龙配方颗粒含量测定结果
2)提取溶剂体积考察：除提取溶剂体积不同外，其他条件同实施例10，以提取溶剂30％(v/v)甲醇体积作为变量，提取溶剂体积为10mL、25mL、50mL，肌苷和色氨酸的系统适应性参数及含量测定结果如表13-14所示。由表13-14可知，提取溶剂30％(v/v)甲醇体积为25mL时，所得色谱图的峰形较好，系统适应性参数相对较优，且含量相对较高。
表13不同提取溶剂体积下广地龙配方颗粒色谱图参数
表14不同提取溶剂体积下广地龙配方颗粒含量测定结果
3)提取时间的选择：除提取时间不同外，其他条件同实施例10，以提取时间作为变量，提取时间为15min、30min、45min的以肌苷和色氨酸的系统适应性参数及含量测定结果如表15-16所示。由表15-16可知，不同的超声时间的溶解效果及色谱图无明显差异，故选择提取时间为30min。
表15不同提取时间下广地龙配方颗粒色谱图参数
表16不同提取时间下广地龙配方颗粒含量测定结果
4)样品取样量的选择：除样品取样量不同外，其他条件同实施例10，以样品取样量作为变量，考察样品的不同提取量：0.1g、0.2g、0.3g，以肌苷和色氨酸的系统适应性参数及含量测定结果作为考察指标，不同取样量的色谱图肌苷和色氨酸的系统适应性参数及含量测定结果如表17-18所示。由17-18可知，取样量0.1g～0.3g，随着取样量增加，肌苷和色氨酸的峰面积呈现相应比例上升。考虑到肌苷、色氨酸的响应值情况，选择取样量为0.2g。
表17不同取样量的广地龙配方颗粒色谱图参数
表18不同取样量的广地龙配方颗粒含量测定结果
5)最终提取方案：供试品溶液的制备方法为：取本品粉末约0.2g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加30％(v/v)甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，加30％(v/v)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，即得。
实施例13广地龙配方颗粒含量测定方法的建立
核苷类成分和氨基酸类成分是广地龙中主要活性成分中的两大类物质，通过建立一种可以同时测定两类成分的含量检测方法，可以更好地反映广地龙的质量属性。因肌苷为广地龙药材种的核苷类成分之一，色氨酸为氨基酸类成分之一，从两大类成分含量考虑，并结合成分的含量高低、稳定性、药理活性和临床疗效，确定肌苷和色氨酸作为广地龙的指标成分进行含量测定及方法学考察。
根据实施例10和12，确定广地龙配方颗粒含量测定按如下方法建立：
(1)供试品溶液的制备：取广地龙配方颗粒粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加30％(v/v)甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，加30％(v/v)甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，超滤离心(15000rpm)30分钟，取下层溶液，过滤，取续滤液，即得；参照物溶液的制备：精密称取肌苷对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.0001g的溶液，摇匀，作为对照品D溶液；精密称取色氨酸对照品，加30％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00001g的溶液，摇匀，作为对照品E溶液；
(2)高效液相色谱条件：以4.6mm×250mm，5μm的Waters symmetry C18为色谱柱，以乙腈-10mmol/L磷酸二氢钾溶液为流动相，梯度洗脱同实施例9；检测波长为210nm；柱温35℃；流速：0.5mL/min，理论板数按肌苷峰计算应不低于5000，进样量：5μL。按上述方法进行广地龙配方颗粒含量测定方法的建立。
取15批次的广地龙配方颗粒样品按照上述最优方法进行含量测定，所得结果如表19所示。
表19 15批广地龙配方颗粒含量测定结果
15批广地龙配方颗粒肌苷含量均值为13.4mg/g，均值的±30％范围为9.38～17.42mg/g，标准差为3.4，均值的±3SD范围为3.2～23.6mg/g，故规定广地龙配方颗粒肌苷含量范围为9.4～17.4mg/g(均值±30％)；15批广地龙配方颗粒色氨酸含量均值为1.1mg/g，均值的±30％范围为0.77～1.43mg/g，标准差为0.3，均值的±3SD范围为0.2～2.0mg/g，故规定广地龙配方颗粒色氨酸含量范围为0.8～1.4mg/g。
实施例14广地龙配方颗粒含量测定的方法学验证
1专属性实验
供试品采用提取溶剂为30％甲醇，精密吸取供试品溶液、阴性对照品溶液(0.2g麦芽糊精溶解于25mL体积百分数为30％甲醇中)各5μL，分别注入高效液相色谱仪，按实施例13的方法进行高效液相色谱检测，供试品溶液的色谱图省略。空白溶剂在与肌苷和色氨酸相应的保留时间处无色谱峰，无干扰。
2线性关系实验
2.1不同浓度肌苷线性关系实验：取肌苷对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含0.00535mg、0.0107mg、0.02675mg、0.0535mg、0.107mg、0.2675mg、0.535mg肌苷的溶液，按实施例13项下色谱条件，精密吸取以上7个不同浓度的肌苷对照品溶液10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以肌苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。肌苷的回归方程为Y＝4×107X+303869(R2＝0.9994)。肌苷在0.0535μg～5.35μg范围内线性关系良好。
2.2不同浓度色氨酸线性关系实验：取色氨酸对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含0.00055mg、0.0011mg、0.00275mg、0.0055mg、0.011mg、0.0275mg、0.055mg色氨酸的溶液，按实施例13项下色谱条件，精密吸取以上7个不同浓度的色氨酸对照品溶液10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以色氨酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。色氨酸的回归方程为Y＝9×107X+60572(R2＝0.9993)。色氨酸在0.0055μg～0.55μg范围内线性关系良好。
3精密度
3.1精密度实验
取同一份供试品溶液(编号A2)，按实施例13项下色谱条件，重复进样6次，测定肌苷和色氨酸峰面积，肌苷和色氨酸峰面积的RSD分别为0.27％、1.34％，表明仪器精密度较好。
3.2重复性实验
取同一批供试品6份，按实施例13的方法分别测定肌苷和色氨酸的含量，肌苷和色氨酸含量的RSD分别为0.61％、1.31％，表明该方法重复性良好。
3.3中间精密度实验
取同一批供试品2份，分别由三名检验员在不同的时间，用同一台设备，按实施例13的方法分别测定肌苷和色氨酸的含量，肌苷和色氨酸含量的RSD分别为0.91％、2.84％，表明该方法中间精密度良好。
3.4准确度实验取同一批供试品(肌苷含量为13.0993mg/g，色氨酸含量为1.1538mg/g)6份，每份样品取约0.1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入肌苷对照品溶液(4.1833mg/ml)0.3ml、色氨酸对照品溶液(1.0375mg/ml)0.12ml，按实施例13的方法分别测定肌苷和色氨酸的含量，并计算回收率。肌苷和色氨酸的平均回收率分别为99.3％、101.5％，表明该方法准确性良好。
4稳定性实验
取同一批供试品，按实施例13的方法操作，分别在0、2、4、8、12、24小时进样，测定肌苷和色氨酸的峰面积，肌苷和色氨酸峰面积的RSD分别为0.14％、1.27％，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。
5耐用性试验
考察不同浓度的磷酸二氢钾、不同流速、不同柱温、不同色谱柱、不同色谱仪对本色谱条件的耐用性，按实施例13的方法分别测定肌苷和色氨酸的含量。
结果表明，不同浓度的磷酸二氢钾浓度、不同柱温、不同色谱柱条件下测定结果基本一致，RSD％<4％，不同流速条件下测定色氨酸含量结果RSD值差异较大，表明本方法不同浓度的磷酸二氢钾浓度、不同柱温、不同色谱柱耐用性良好，为保证肌苷和色氨酸含量测定的准确需固定流速为0.5ml/min。以上的研究结果实验表明，广地龙配方颗粒中肌苷和色氨酸的含量测定方法的专属性强，稳定性、重复性、中间精密度、准确度等均符合规定，且色谱条件的耐用性较好，故此液相色谱条件可以用于广地龙配方颗粒中肌苷和色氨酸的含量测定。
实验例15
前期研究发现，广地龙配方颗粒供试品溶液进入液相后，色谱柱的寿命大幅降低(连续使用7天后无法分离出10个峰)，因广地龙配方颗粒为动物药，考虑到生物样品中可能存在较多大分子蛋白质等物质干扰试验，超滤离心可有效的除去分子量较大的物质，故采取超滤离心的方法，对样品进行前处理比较考察，以期达到延长色谱柱寿命的目的。取广地龙配方颗粒，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；另取部分续滤液进行超滤离心(15000rpm，30min，3kd)，即得。比较超滤离心前后广地龙配方颗粒特征图谱的差异。
试验结果表明超滤离心前后的供试品色谱图中各特征峰的系统适应性参数差异不大，前10分钟色谱峰及峰10后的洗脱峰明显变小，且长期试验表明，该处理方法大幅延长了色谱柱寿命，故后续试验中供试品制备采用超滤离心的方法进行处理。
表12广地龙配方颗粒取样量色谱峰系统适应性参数比较
对比例1
本对比例与实施例2方法基本相同，区别仅在于将流动相中的乙腈替换成70％甲醇，结果如图16所示。虽然能呈现10个特征峰，但峰5与峰6无法完全分离，且整体10个特征峰的响应值较低，特别是峰9与峰10峰面积极度小，不便于积分处理。
对比例2
色谱条件色谱柱：IntertsustainAQ-C18柱(250mm×4.6mm5μm)；检测波长：254nm；柱温20℃；流速：0.8mL/min；进样量10μL，流动相：以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相A，以70％甲醇溶液为流动相B进行梯度洗脱，流动相梯度洗脱条件为：0～5min，流动相中A(100％)，流动相中B(0％)；5～20min，流动相中A(100％→80％)，流动相中B(0％→20％)；20～30min，流动相中A(80％→50％)，流动相中B(20％→50％)；30～40min，流动相中A(50％→0％)，流动相中B(50％→100％)；40～45min，流动相中A(0％)，流动相中B(100％)。
对照品溶液制备取色氨酸对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1ml含色氨酸25μg的对照品溶液。
供试品溶液制备取广地龙配方颗粒提取物样品粉末约0.5g，精密称定，置于100mL具塞三角锥形瓶中，分别加入0.9％NaCl溶液10mL，超声提取30min，5000r/min离心10min，取上清液，用0.9％NaCl溶液定容至10mL，0.45μm微孔滤膜滤过即得。所得结果如表32所示。
表2供试品溶液的特征峰参数结果表
通过色谱图分析知，仅能分离出5个色谱峰，且该5个峰分离效果较差，且均存在拖尾现象(见表2)。在相同色谱条件下，色氨酸对应的色谱峰保留时间为30.050，供试品在色氨酸保留时间附近色谱峰为29.797，通过对该峰(29.797)与色氨酸对照品紫外光谱图分析可知，该峰与色氨酸对照品紫外光谱不一致，表明该峰对应的物质非色氨酸。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种广地龙药物制剂的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)取广地龙药物制剂制备供试品溶液；
(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含磷酸二氢钾的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→15分钟→30分钟→50分钟→52分钟→70分钟→75分钟，流动相中乙腈的体积百分比为0％→0％→1％→2％→4％→5％→50％。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括：采用溶剂对广地龙药物制剂进行提取、固液分离、取滤液的步骤；
优选的，步骤(1)满足如下A-D中的任意一项或者多项：
A、所述广地龙药物制剂的质量与有机溶剂的体积比为(0.4-0.6)：(20-30)，比例关系为g/mL；
B、采用的溶剂为体积分数为20～40％甲醇水溶液；优选的，采用的体积百分数为30％甲醇水溶液；
C、提取方式为加热回流提取或超声提取，优选的，提取时间为15-45min；
D、固液分离为离心或者过滤，优选的，固液分离之后还包括超滤和再过滤的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中含磷酸二氢钾的水溶液的浓度为8-12mmoL/L；优选地，高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为200-220nm，流速为0.5-1.0ml/min，柱温20-25℃或者35-40℃，进样量为2-20μl。
4.根据权利要求1-3中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用酪氨酸、次黄嘌呤、腺苷酸、苯丙氨酸、肌苷、鸟苷、色氨酸、腺苷中的至少一种为对照品制备对照品溶液的步骤和将步骤(2)中的供试品溶液替换为对照品溶液，得到对照品指纹图谱的步骤。
5.权利要求1-4中任一所述的构建方法构建得到的广地龙药物制剂的指纹图谱。
6.一种广地龙药物制剂的对照指纹图谱，其特征在于，所述广地龙药物制剂的对照指纹图谱选自如下(1)-(5)中的任意一项：
(1)其具有10个共有特征峰，保留时间分别为14.39min、17.34min、21.16min、28.30min、39.13min、41.07min、47.60min、51.15min、68.50min、72.70min；或者其保留时间与上述各保留时间的RSD<10％、<5％或者3％；
(2)其具有10个共有特征峰，以肌苷峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.30(峰1)、0.36(峰2)、0.44(峰3)、0.59(峰4)、0.82(峰5)、0.86(峰6)、1.00(峰7)、1.07(峰8)、1.44(峰9)、1.53(峰10)；
(3)其具有10个共有特征峰，以肌苷峰为参比峰，各特征峰与参比峰的相对保留时间在规定值的±10％、±5％或者±3％的范围之内；规定值为：0.30(峰1)、0.36(峰2)、0.44(峰3)、0.59(峰4)、0.82(峰5)、0.86(峰6)、1.00(峰7)、1.07(峰8)、1.44(峰9)、1.53(峰10)；以峰9为参比峰，峰2与峰9的相对峰面积不低于0.62，以峰7为参比峰，峰8与峰7的相对峰面积不低于0.03；
(4)使用单批次或者多批次广地龙药物制剂按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到的指纹图谱；
(5)使用多批次广地龙药物制剂按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱。
7.一种广地龙药物制剂中肌苷和色氨酸的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
取广地龙药物制剂制备供试品溶液；
肌苷和色氨酸对照品溶液的制备；
测试步骤：取供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法检测，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含磷酸二氢钾的水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0→5分钟→15分钟→35分钟→37分钟→42分钟，流动相中乙腈的体积百分比为2％→2％→3％→10％→45％→55％。
8.根据权利要求7所述的广地龙药物制剂中肌苷和色氨酸的含量测定方法，其特征在于，
供试品溶液制备步骤包括：采用溶剂对广地龙药物制剂进行提取、固液分离、取滤液的步骤；
优选的，供试品溶液制备步骤中还满足如下A-D中的任意一项或者多项：
A、所述广地龙药物制剂的质量与有机溶剂的体积比为(0.1-0.3)：(20-30)，比例关系为g/mL；
B、采用的溶剂为体积分数为20～40％甲醇水溶液；优选的，采用体积百分数为30％甲醇水溶液；
C、提取方式为加热回流提取或超声提取，优选的，提取时间为15-45min；
D、固液分离为离心或者过滤，优选的，固液分离之后还包括超滤和再过滤的步骤。
9.根据权利要求7或8所述的广地龙药物制剂中肌苷和色氨酸的含量测定方法，其特征在于，
流动相中，采用的含磷酸二氢钾的水溶液的浓度为8-12mmoL/L；优选地，高效液相色谱法的色谱条件还包括：检测波长为200-220nm，流速为0.5-1.0ml/min，柱温20-25℃或者35-40℃，进样量为2-20μl。
10.一种广地龙药物制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测广地龙药物制剂的指纹图谱与广地龙药物制剂的对照指纹图谱进行比较的步骤；所述待测广地龙药物制剂的指纹图谱为使用待测广地龙药物制剂按照权利要求1-4中任一所述的构建方法得到，所述广地龙药物制剂的对照指纹图谱为权利要求6所述的广地龙药物制剂的对照指纹图谱；和/或，包括按照权利要求7-9中任一所述的广地龙药物制剂中肌苷和色氨酸的含量测定方法测定待测广地龙药物制剂中肌苷和色氨酸的含量的步骤。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114894934A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-08-12 | 江阴天江药业有限公司 | 一种全蝎药材及其配方颗粒uplc特征图谱的构建方法及应用 |
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| CN115144522A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-10-04 | 江阴天江药业有限公司 | 一种全面控制壁虎配方颗粒质量的控制方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1844912A (zh) * | 2006-01-24 | 2006-10-11 | 李振国 | 一种地龙指纹图谱的建立方法和地龙药材的鉴别方法 |
| CN109324141A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-02-12 | 广州市药材公司中药饮片厂 | 一种广地龙或其炮制品的特征指纹图谱及其构建方法和应用 |
-
2021
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1844912A (zh) * | 2006-01-24 | 2006-10-11 | 李振国 | 一种地龙指纹图谱的建立方法和地龙药材的鉴别方法 |
| CN109324141A (zh) * | 2018-12-18 | 2019-02-12 | 广州市药材公司中药饮片厂 | 一种广地龙或其炮制品的特征指纹图谱及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张玉;董文婷;霍金海;王伟明;: "基于UPLC-Q-TOF-MS技术的广地龙化学成分分析", 中草药, no. 02, pages 252 - 262 * |
| 肖会敏;何悦;雷美娜;冯甜;王晋;李振;王四旺;李豫蓉;: "地龙胶囊的HPLC特征图谱和10种成分的定量研究", 西北药学杂志, no. 05, pages 569 - 574 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115015405A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-09-06 | 华润三九医药股份有限公司 | 一种赤小豆或其药物制剂特征图谱的构建方法及其用途 |
| CN115015405B (zh) * | 2022-05-13 | 2023-07-11 | 华润三九医药股份有限公司 | 一种赤小豆或其药物制剂特征图谱的构建方法及其用途 |
| CN114894934A (zh) * | 2022-05-17 | 2022-08-12 | 江阴天江药业有限公司 | 一种全蝎药材及其配方颗粒uplc特征图谱的构建方法及应用 |
| CN114894934B (zh) * | 2022-05-17 | 2023-09-22 | 江阴天江药业有限公司 | 一种全蝎药材及其配方颗粒uplc特征图谱的构建方法及应用 |
| CN115144522A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-10-04 | 江阴天江药业有限公司 | 一种全面控制壁虎配方颗粒质量的控制方法 |
| CN115144522B (zh) * | 2022-06-02 | 2023-09-22 | 江阴天江药业有限公司 | 一种全面控制壁虎配方颗粒质量的控制方法 |
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