CN103698453A

CN103698453A - 小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法及构建方法

Info

Publication number: CN103698453A
Application number: CN201310695252.6A
Authority: CN
Inventors: 方广宏; 郑荣波; 苏子仁; 黄晓丹; 彭绍忠
Original assignee: WANGLAOJI PHARMACEUTICAL CO Ltd GUANGZHOU CITY
Current assignee: WANGLAOJI PHARMACEUTICAL CO Ltd GUANGZHOU CITY
Priority date: 2013-12-16
Filing date: 2013-12-16
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-16
Also published as: CN103698453B

Abstract

本发明公开了一种小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法及构建方法，检测方法包括以下步骤：（1）对照品溶液的配制；（2）供试品溶液的制备；（3）采用高效液相色谱仪进行测定。本发明能有效表征小儿七星茶制剂的质量，有利于监控产品的质量；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

Description

小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法及构建方法

技术领域

本发明涉及中药制剂质量控制方法，特别是涉及小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法及构建方法。

背景技术

小儿七星茶制剂以中药材薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕、甘草为原料，经水提取后，按常规的制药工艺制成。具有开胃消滞，清热定惊的功效，用于小儿积滞化热，消化不良，不思饮食，烦躁易惊，夜寐不安，大便不畅，小便短赤。小儿七星茶制剂在中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第九册中收载有小儿七星茶冲剂（颗粒）、小儿七星茶糖浆，是儿科常用的中药制剂，深受患者欢迎。现已有小儿七星茶口服液等剂型上市销售。

《中华人民共和国药典》2010年版一部主要采用薄层色谱法鉴别是否含有山楂、甘草，采用高效液相色谱法测定其甘草苷的含量。

曾常青等在“小儿七星茶冲剂质量标准研究”，中成药，2006年03期：报道了采用薄层层析鉴别小儿七星茶冲剂稻芽、山楂、甘草和钩藤,用反相高效液相测定其钩藤碱含量的方法。

肖树雄等在“小儿七星茶糖浆质量标准提高研究”，中成药，2008年07期，报道了采用薄层色谱法制定小儿七星茶糖浆钩藤、甘草的薄层色谱鉴别,用高效液相色谱法测定甘草中甘草酸单铵盐含量的方法。

李冬等在“HPLC测定小儿七星茶冲剂中槲皮素含量”，中国药物经济学，2012年06期，报道了采用HPLC法测定小儿七星茶冲剂中槲皮素含量的方法。

以上方法均是对小儿七星茶制剂中个别成分进行鉴别或含量测定，对小儿七星茶制剂质量控制方法有待进一步完善。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法及构建方法。

具体的技术方案如下：

一种小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法，采用高效液相色谱进行检测，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制：

将甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸对照品各取10mg，分别用体积百分比浓度为28-32%的乙醇溶液溶解并定容至20mL，摇匀；将胱氨酸、酪氨酸各取10mg，分别用0.08-0.12mol/mL盐酸溶解并定容至20mL，摇匀；得19种氨基酸溶液；

分别吸取上述氨基酸溶液，分别加入体积百分比浓度为15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、体积百分比浓度为1.75-1.85%的苯异硫氰酸酯（PITC）的乙腈溶液，涡旋混匀，室温放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下层溶液，微孔滤膜滤过，得19种氨基酸单一对照品溶液；取等量的上述19种氨基酸单一对照品溶液，构成19种氨基酸混合对照品溶液；

（2）供试品溶液的制备：

取小儿七星茶制剂样品，上阳离子树脂，先用蒸馏水洗脱，弃去水洗液；再用氨水洗脱，收集氨洗液；将上述氨洗液减压浓缩，吸取浓缩液，加入体积百分比浓度为15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、体积百分比浓度为1.75-1.85%的苯异硫氰酸酯的乙腈溶液，涡旋混匀，室温放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下层溶液，微孔滤膜滤过，得供试品溶液；所述小儿七星茶制剂样品为小儿七星茶糖浆、小儿七星茶口服液或用蒸馏水溶解后的小儿七星茶颗粒；

（3）测定：

分别进样所述19种氨基酸混合对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定。

在其中一些实施例中，所述步骤（3）中的高效液相色谱仪的条件为：色谱柱以碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料，流动相：0.025mol/L乙酸钠溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式；流速：1mL/min；检测波长：254nm。

在其中一些实施例中，所述乙酸钠溶液用体积百分比浓度为36%的乙酸调pH值为6。

在其中一些实施例中，所述步骤（2）中所述氨水洗脱为先用1.8-2.2mol/L氨水洗脱，收集氨洗液；再用0.8-1.2mol/L氨水洗脱，收集氨洗液。

本发明还提供一种小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制：

（2）供试品溶液的制备：

（3）测定：

分别进样所述19种氨基酸混合对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，构建指纹图谱，得到由11个共有特征峰构成的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱。

在其中一些实施例中，所述步骤（3）为：分别进样所述19种氨基酸混合对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，以脯氨酸峰为参照峰，其相对保留时间、相对峰面积为1.0，构建得到由11个共有特征峰构成的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱。

本发明相较于现有技术的优点及有益效果为：

本发明发明人经过大量实验以及长久积累的经验，确定了小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法以及构建方法，并确定了检测方法及构建方法中对照品溶液配制（如采用加入三乙胺的乙腈溶液、PITC的乙腈溶液进行对照品溶液的配制）以及整个检测过程及构建过程的最优参数，有效表征小儿七星茶制剂的质量，有利于监控产品的质量；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的优点；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

附图说明

图1为小儿七星茶10批次样品的原始指纹图谱，其中S1-S10分别为10批小儿七星茶样品，横坐标为：保留时间，纵坐标为：峰高；

图2为小儿七星茶样品的HPLC指纹图谱，其中，S1-空白溶液图谱，S2-19种氨基酸混合对照品溶液图谱，S3-供试品溶液图谱，横坐标为：保留时间，纵坐标为：峰高；

图3为小儿七星茶10批次样品匹配后的指纹图谱，其中S1-S10分别为10批小儿七星茶样品，R为：小儿七星茶制剂氨基酸的对照指纹图谱，横坐标为：保留时间，纵坐标为：峰高；

图4为小儿七星茶制剂氨基酸的对照指纹图谱，横坐标为：保留时间，纵坐标为：峰高。

具体实施方式

下面对本发明的实施例进行详细说明。

实施例1

小儿七星茶制剂氨基酸类成分指纹图谱的构建

1仪器与设备

岛津LC—20AD高效液相色谱仪（岛津公司）；

Sartorius CP225D分析天平（d=0.01mg）（德国Sartorius公司）；

Ratavapor R-Ⅱ旋转蒸发仪（瑞士步琪公司）；

SHZ-D(Ⅲ)循环水式正空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；

RTHW电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）；

SK-1快速混匀机（江苏金坛市佳美仪器厂）；

2材料与试剂

小儿七星茶颗粒样品（由广州王老吉药业股份有限公司提供）；

19种氨基酸对照品：甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸、胱氨酸、酪氨酸（中国药品生物制品检定所）；

苯异硫氰酸酯（PITC）（色谱纯，SIGMA公司）；

乙腈（色谱纯，Merk公司）；

三乙胺（分析纯，广州化学试剂厂）；

正己烷（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；

氨水（分析纯，广州化学试剂厂）；

36%乙酸（分析纯，广州化学试剂厂）；

无水乙酸钠（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；

乙醇（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；

盐酸（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；

蒸馏水。

3方法

3.1衍生试剂的配制

3.1.1PITC的乙腈溶液的配制：PITC（苯异硫氰酸酯）54μL与乙腈3mL混匀，得体积百分比浓度为1.8%的苯异硫氰酸酯（PITC）的乙腈溶液；

3.1.2三乙胺的乙腈溶液的配制：三乙胺417μL与乙腈2.583mL混匀，得体积百分比浓度为16%的三乙胺的乙腈溶液。

3.2对照品溶液的配制

将甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、精氨酸、色氨酸、谷氨酸对照品各取10mg，精密称定，分别用少量体积百分比浓度为30%的乙醇溶液溶解于20mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀；将胱氨酸、酪氨酸各取10mg，精密称定，分别用少量0.1mol/mL盐酸溶解于20mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，即得；得19种氨基酸溶液；

分别精密吸取上述氨基酸溶液各1mL，分别精密加入1mL体积百分比浓度为16%的三乙胺的乙腈溶液、1mL体积百分比浓度为1.8%的PITC的乙腈溶液，涡旋混匀1min，室温放置1h，加入正己烷3mL萃取，取下层溶液，微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得19种氨基酸单一对照品溶液；取上述19种氨基酸单一对照品溶液各100μL，构成19种氨基酸混合对照品溶液。

3.3XZ-2阳离子树脂的预处理

XZ-2阳离子树脂先用10%（质量百分比）食盐水浸泡一天，再用蒸馏水洗至清液，然后用7%（体积百分比）盐酸浸泡一天，用蒸馏水洗至中性，即得。

3.4供试品溶液的制备

取小儿七星茶样品颗粒4g，用少量蒸馏水溶解（蒸馏水的用量为足以溶解小儿七星茶样品颗粒即可），上XZ-2阳离子树脂，先用100mL蒸馏水洗脱，弃去水洗液；再用2mol/L氨水600mL洗脱，收集氨洗液；最后用1mol/L氨水100mL洗脱，收集氨洗液；将上述氨洗液减压浓缩至12.5mL。精密吸取浓缩液1mL，精密加入1mL体积百分比浓度为16%的三乙胺的乙腈溶液、1mL体积百分比浓度为1.8%的PITC的乙腈溶液，涡旋混匀1min，室温放置1h，加入正己烷3mL萃取，取下层溶液，微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得小儿七星茶供试品溶液。

3.5色谱条件

色谱仪：岛津LC—20AD高效液相色谱仪；

色谱柱：SymmetryShiedTM PR18柱（3.9mm×2mm，5μm），以碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料；

流动相：0.025mol/L乙酸钠（36%（体积百分比）乙酸调为pH6）溶液(A)—乙腈（B）梯度洗脱：

表1流动相的梯度洗脱

流速：1mL/min；检测波长：254nm；

测定：分别进样19种氨基酸混合的对照品溶液、供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定各色谱图。

4.110批样品共有峰的标定

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）对10批样品的原始HPLC图谱进行分析（见图1），确定氨基酸指纹图谱共有峰11个。其中，4号峰（脯氨酸）最强，分离度高，因此以4号峰为参照峰，其相对保留时间、相对峰面积为1.0，计算10批样品（S1-S10）中11个氨基酸指纹图谱共有峰的相对保留时间（见表2）及相对峰面积（见表3）。

表2相对保留时间

表3相对峰面积

4.2样品指纹图谱分析

通过对19种氨基酸混合对照品溶液图谱、供试品溶液图谱以及空白溶液图谱分析（见图2），可辨认出指纹图谱中有11个氨基酸共有峰，占峰面积51.35%，其中1号峰为丝氨酸，2号峰为甘氨酸，3号峰为组氨酸，4号峰为脯氨酸，5号峰为精氨酸，6号峰为缬氨酸，7号峰为酪氨酸，8号峰为异亮氨酸，9号峰为亮氨酸，10号峰为苯丙氨酸，11号峰为赖氨酸。可分为3个特征峰群，其中1～5号峰为特征峰群Ⅰ，五个峰的峰面积约占总峰面积的45.73%，保留时间为7～14min，4号峰强度较大；6～9号峰为特征峰Ⅱ，四个峰的峰面积约占总面积峰的3.94%，保留时间为26-35min；10～11号峰为特征峰群Ⅲ，两个峰的峰面积约占总面积峰的1.68%，保留时间为41-51min。

4.310批样品指纹图谱相似度评价

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）对10批样品HPLC图谱进行评价，以相对面积平均数为对照，以S6样品为参照进行相似度计算。匹配前、匹配后以及生成对照指纹图谱分别为图1、图3、图4。相似度计算为表4。

比较各批样品与参照图谱（S6）的相似度，10批样品均高于0.9；比较各批样品与对照图谱（图4）的相似度，低于0.95的有S2、S3；其余8批样品均高于0.95。

表4相似度计算

实施例2

运用小儿七星茶制剂氨基酸类成分指纹图谱对小儿七星茶制剂进行检测

1仪器与设备

同实施例1。

2材料与试剂

另取10批小儿七星茶颗粒样品（由广州王老吉药业股份有限公司提供），其他材料与试剂同实施例1。

3方法

3.1衍生试剂的配制

同实施例1。

3.2对照品溶液的配制

同实施例1。

3.3XZ-2阳离子树脂的预处理

同实施例1。

3.4供试品溶液的制备

同实施例1。

3.5色谱条件

同实施例1。

利用上述检测方法分别对10批小儿七星茶制剂样品进行检测，记录色谱图并导入中药色谱相似度评价系统软件（2004A版处理），与对照图谱比较，计算相似度（见表5），各批样品相似度均大于0.9。表明小儿七星茶氨基酸类成分的相似度较高，可以作为小儿七星茶质量控制和评价指标。

表5相似度计算

本发明采用HPLC色谱法建立了小儿七星茶氨基酸类成分的指纹图谱分析，测定了10批小儿七星茶氨基酸类成分指纹图谱。指纹图谱中共有11个氨基酸特征共有峰，分别为丝氨酸，甘氨酸，组氨酸，脯氨酸，精氨酸，缬氨酸，酪氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸。

本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版）对10批小儿七星茶样品HPLC图谱进行相似度分析评价。比较各批样品与参照图谱的相似度，10批样品均高于0.9；比较各批样品与对照图谱的相似度，低于0.95的有S2、S3；其余8批样品均高于0.95（请见表4）。说明小儿七星茶氨基酸类成分的相似度较高，可以作为小儿七星茶质量控制和评价指标。

由上可知，本发明能有效表征小儿七星茶制剂的质量，有利于监控产品的质量；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱进行检测，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制：

分别吸取上述氨基酸溶液，分别加入体积百分比浓度为15.5-16.5%的三乙胺的乙腈溶液、体积百分比浓度为1.75-1.85%的苯异硫氰酸酯的乙腈溶液，涡旋混匀，室温放置0.8-1.5h，加入正己烷萃取，取下层溶液，微孔滤膜滤过，得19种氨基酸单一对照品溶液；取等量的上述19种氨基酸单一对照品溶液，构成19种氨基酸混合对照品溶液；

（2）供试品溶液的制备：

（3）测定：

2.根据权利要求1所述的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中的高效液相色谱仪的条件为：色谱柱以碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料，流动相：0.025mol/L乙酸钠溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式；流速：1mL/min；检测波长：254nm。

3.根据权利要求2所述的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述乙酸钠溶液用体积百分比浓度为36%的乙酸调pH值为6。

4.根据权利要求1所述的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述氨水洗脱为先用1.8-2.2mol/L氨水洗脱，收集氨洗液；再用0.8-1.2mol/L氨水洗脱，收集氨洗液。

5.一种小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的配制：

（2）供试品溶液的制备：

（3）测定：

6.根据权利要求5所述的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）为：分别进样所述19种氨基酸混合对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪测定，以脯氨酸峰为参照峰，其相对保留时间、相对峰面积为1.0，构建得到由11个共有特征峰构成的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱。

7.根据权利要求5或6所述的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中的高效液相色谱仪的条件为：色谱柱以碳十八烷基硅烷基键合硅胶为填料，流动相：0.025mol/L乙酸钠溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱方式；流速：1mL/min；检测波长：254nm。

8.根据权利要求7所述的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述乙酸钠溶液用体积百分比浓度为36%的乙酸调pH值为6。

9.根据权利要求5或6所述的小儿七星茶制剂氨基酸指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述氨水洗脱为先用1.8-2.2mol/L氨水洗脱，收集氨洗液；再用0.8-1.2mol/L氨水洗脱，收集氨洗液。