CN115290769A - 一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法，该方法由以下步骤组成：首先配制混合内标溶液、混合标准品溶液和待检测进样液，再按下述方法进行检测：按进样量为1～10μL对柱温为20～40℃的Poroshell 120EC‑C18色谱柱进样，接着用由A相和B相组成的流动相以0.15～0.45mL/min的流速并按照规定的程序进行梯度洗脱，同时采用多反应监测分析，获得被检测物以及标准品的谱图；最后将被检测物以及标准品的谱图比对，确定小儿七星茶颗粒中26种有效成分及含量。本方法能同时对小儿七星茶颗粒中26种有效成分进行定性和定量检测，而且具有精密度高和重复性好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体是涉及小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法。
背景技术
小儿七星茶颗粒为中国药典收录的成方制剂(中华人民共和国药典2020年版一部第552页)，该药由薏苡仁893g、稻芽893g、山楂446g、淡竹叶670g、钩藤335g、蝉蜕112g和甘草112g为原料，经过提取浓缩配制灭菌包装加工制成。小儿七星茶颗粒的功能主治为开胃消滞、清热定惊。用于小儿积滞化热、消化不良、不思饮食、烦躁易惊、夜寐不安、大便不畅、小便短赤。但是，中国药典仅采用高效液相色谱法对方剂中的甘草酸(C42H62O16)的含量进行了规定，这显然还不能满足全面控制小儿七星茶颗粒质量的要求。
目前，已有学者开始小儿七星茶颗粒多成分测定的方法，如学者朱焕容等采用高效液相色谱法，经9次梯度洗脱，测定了小儿七星茶颗粒中甘草苷、绿原酸、芹菜素三种成分[朱焕容,赵小宁,王秀芬,等.小儿七星茶颗粒指纹图谱[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(13):93-96.]，但一套梯度洗脱程序加上平衡到最初流动相要花费进118分钟，且分离色谱图基线高低不平，难以准确定量；再如申请公布号为CN108627581A的发明专利申请公开了一种小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱含量测定方法，该方法利用高效液相色谱法，经9次梯度洗脱，测定小儿七星茶颗粒中钩藤碱和异钩藤碱两种成分，但提取方法复杂，分析一针花费测定时间43分钟。
此外，由于小儿七星茶颗粒由薏苡仁、稻芽、山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕和甘草七味药制成，而根据相关报导其中每一味中药材中都含有好几种有效成分，远不止上述现有所公开的甘草酸、绿原酸、芹菜素、钩藤碱和异钩藤碱五种，因此寻求一种同时检测20种以上化学成分的方法，对于全面控制小儿七星茶颗粒质量具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法，该方法具有能同时对小儿七星茶颗粒中26种有效成分进行定性和定量检测的优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法，该方法是高效液相色谱串联质谱法检测小儿七星茶颗粒中的各种有效成分，具体包括以下步骤：
(1)配制混合内标溶液：分别精密称取磺胺甲恶唑900μg和氯霉素890μg，用体积浓度为的80％甲醇溶解并定容至10mL，即得所述混合内标溶液；
(2)配制混合标准品溶液：分别精密称取标准品分别精密称取标准品N-乙酰多巴胺二聚体Aa 880μg、N-乙酰多巴胺二聚体Ab 930μg、毛钩藤碱1100μg、去氢毛钩藤碱1090μg、钩藤碱1220μg、异钩藤碱1240μg、异去氢钩藤碱1250μg、去氢钩藤碱1110μg、甘草苷1070μg、异甘草苷1140μg、甘草素1110μg、异甘草素1040μg、甘草酸1140μg、绿原酸1050μg、新绿原酸1050μg、隐绿原酸1080μg、金丝桃苷1220μg、新西兰牡荆苷1020μg、日当要黄素1070μg、芦丁1095μg、对香豆酸1300μg、咖啡酸1015μg、枸橼酸1115μg、木犀草苷1200μg、木犀草素1010μg和槲皮素1160μg，加入步骤(1)制得的混合内标溶液10μL，用体积浓度为80％的甲醇溶解并定容至10mL，即得所述混合标准品储备液；
(3)配制待检测进样液：分别称取薏苡仁8.93g、稻芽8.93g、山楂4.46g、淡竹叶6.70g、钩藤3.35g、蝉蜕1.12g和甘草1.12g；其中薏苡仁和稻芽加水煎煮二次，每次2小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至55℃下相对密度为1.08，加入乙醇使含醇量达体积百分数45％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏；山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕和甘草加水煎煮二次，每次2小时，煎液滤过，滤液合并，滤液浓缩至适量，与所述的稠膏合并，负70～75℃减压干燥，得待检样品；
取所述待检样品0.5g，加入体积浓度为80％的甲醇10mL，在20℃的条件下超声30min，冷却至室温，补足减失的体积浓度为80％的甲醇质量，离心10min，吸取上清液200μL，加入步骤(1)制得的混合内标溶液10μL，用体积浓度为80％的定容至10mL，即得所述待检测进样液；
(4)检测方法和条件：将待检进样液和混合标准品溶液分别按下述方法注入高效液相色谱串联质谱仪并采用HPLC-MS/MS多反应监测法进行检测，获得被检测物以及标准品各化学成分的离子流谱图：其中，
高效液相色谱检测的方法和色谱条件为：按进样量为1～10μL对柱温为20～40℃的Poroshell 120EC-C18 3.0×50mm,2.7-Micron色谱柱进样，接着用由A相为0.01～0.1％甲酸水溶液和B相为乙腈组成的流动相，以0.15～0.45mL/min的流速进行正负离子梯度洗脱，其中正离子洗脱的程序如下表1所示，负离子洗脱的程序如下表2所示；
表1正离子洗脱的程序
表2负离子洗脱的程序
质谱检测的方法和质谱条件为：正离子检测的毛细管电压为3300～3600V，负离子检测的毛细管电压为2800～3200V；喷嘴电压为400～550V；雾化气体、干燥气体和鞘气气体为氮气；干燥气体温度为300～400℃；雾化气体压力为30～60psi；干燥气体流速为4～6L/min；鞘气气体温度为300～400℃；鞘气气体流速为9～13L/min；
多反应监测的方法和条件为：正负离子交替进行检测分析26种成分的含量测定，其中26种成分和2种内标及MS-MRM参数如下表3：
表3
(5)化学成分的定性与定量测定：将获得被检测物与标准品各化学成分的离子流谱图进行比较，与混合标准品溶液各化学成分的离子流图谱中相应成分的保留时间相同的离子峰即是与该化学成分相同物质的特征峰；以标准品和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为纵坐标，以该标准品的浓度为横坐标绘制出线性回归曲线，得到每一标准品的标准曲线方程；然后，将待检进样液中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值分别代入相应的标准曲线方程中，即可计算出每一有效成分在待检进样液中的浓度，进而计算出所述小儿七星茶颗粒中各有效成分的含量。
本方法检测出所述小儿七星茶颗粒中的有效成分为下述26种化学成分：N-乙酰多巴胺二聚体Aa、N-乙酰多巴胺二聚体Ab、毛钩藤碱、去氢毛钩藤碱、钩藤碱、异钩藤碱、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、新西兰牡荆苷、日当要黄素、芦丁、对香豆酸、咖啡酸、枸橼酸、木犀草苷、木犀草素和槲皮素。
上述方法中，所述最优的高效液相色谱条件为：按进样量为5μL对柱温为30℃的Poroshell 120EC-C183.0×50mm,2.7-Micron色谱柱进样，接着用由A相为0.1％甲酸水溶液和B相为乙腈组成的流动相，以0.40mL/min的流速进行正负离子梯度洗脱。
上述方法中，所述串联质谱MS并结合多反应监测MRM进行检测分析的优化的条件为：正离子检测的毛细管电压为3500V，负离子检测的毛细管电压为3000V；喷嘴电压为500V；雾化气体、干燥气体和鞘气气体为氮气；干燥气体温度为300℃；雾化气体压力为45psi；干燥气体流速为5.1L/min；鞘气气体温度为350℃；鞘气气体流速为11L/min。
本申请所述小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法具有以下有益效果：
(1)能同时对由7种原料药制成的小儿七星茶颗粒中的26种有效成分进行定性和定量检测，而且稳定好，重复性好；
(2)洗脱程序和多反应监测方法科学合理，方便快速。
附图说明：
图1为本发明所述检测方法的一个具体实施例中混合标准品的总离子流图；其中，A图为正离子，B图为负离子；图中各特征峰依次为：1：N-乙酰多巴胺二聚体Aa，2：N-乙酰多巴胺二聚体Ab，3：钩藤碱，4：异钩藤碱，5：异去氢钩藤碱，6：去氢钩藤碱，7：毛钩藤碱，8：去氢毛钩藤碱，IS1：磺胺甲恶唑，9：甘草酸，10：芦丁，11：新西兰牡荆苷，12：金丝桃苷，13：日当要黄素，14：木犀草苷，15：甘草苷，16：异甘草苷，17：新绿原酸，18：绿原酸，19：隐绿原酸，20：槲皮素，21：木犀草素，22：甘草素，23：异甘草素，24：枸橼酸，25：咖啡酸，26：对香豆酸，IS2：氯霉素。
图2为本发明所述检测方法的一个具体实施例中正离子检测混合标准品各成分的离子流图，图中各特征峰依次为：1：N-乙酰多巴胺二聚体Aa，2：N-乙酰多巴胺二聚体Ab，3：钩藤碱，4：异钩藤碱，5：异去氢钩藤碱，6：去氢钩藤碱，7：毛钩藤碱，8：去氢毛钩藤碱，IS1：磺胺甲恶唑。
图3为本发明所述检测方法的一个具体实施例中负离子检测混合标准品各成分的离子流图，图中各特征峰依次为：9：甘草酸，10：芦丁，11：新西兰牡荆苷，12：金丝桃苷，13：日当要黄素，14：木犀草苷，15：甘草苷，16：异甘草苷，17：新绿原酸，18：绿原酸，19：隐绿原酸，20：槲皮素，21：木犀草素，22：甘草素，23：异甘草素，24：枸橼酸，25：咖啡酸，26：对香豆酸，IS2：氯霉素。
图4为本发明所述检测方法的一个具体实施例中小儿七星茶颗粒的总离子流图；其中，A图为正离子，B图为负离子；图中各特征峰依次为：1：N-乙酰多巴胺二聚体Aa，2：N-乙酰多巴胺二聚体Ab，3：钩藤碱，4：异钩藤碱，5：异去氢钩藤碱，6：去氢钩藤碱，7：毛钩藤碱，8：去氢毛钩藤碱，IS1：磺胺甲恶唑，9：甘草酸，10：芦丁，11：新西兰牡荆苷，12：金丝桃苷，13：日当要黄素，14：木犀草苷，15：甘草苷，16：异甘草苷，17：新绿原酸，18：绿原酸，19：隐绿原酸，20：槲皮素，21：木犀草素，22：甘草素，23：异甘草素，24：枸橼酸，25：咖啡酸，26：对香豆酸，IS2：氯霉素。
图5为本发明所述检测方法的一个具体实施例中正离子检测小儿七星茶颗粒各成分的离子流图，图中各特征峰依次为：1：N-乙酰多巴胺二聚体Aa，2：N-乙酰多巴胺二聚体Ab，3：钩藤碱，4：异钩藤碱，5：异去氢钩藤碱，6：去氢钩藤碱，7：毛钩藤碱，8：去氢毛钩藤碱，IS1：磺胺甲恶唑。
图6为本发明所述检测方法的一个具体实施例中负离子检测小儿七星茶颗粒各成分的离子流图，图中各特征峰依次为：9：甘草酸，10：芦丁，11：新西兰牡荆苷，12：金丝桃苷，13：日当要黄素，14：木犀草苷，15：甘草苷，16：异甘草苷，17：新绿原酸，18：绿原酸，19：隐绿原酸，20：槲皮素，21：木犀草素，22：甘草素，23：异甘草素，24：枸橼酸，25：咖啡酸，26：对香豆酸，IS2：氯霉素。
图7为本发明所述检测方法中液相色谱串联质谱条件对准确度影响的曲线图；其中，A图为进样量对准确度影响的曲线图，B图为柱温对准确度影响的曲线图，C图为流速对准确度影响的曲线图，D图为正离子检测毛细管电压对准确度影响的曲线图，E图为负离子检测毛细管电压对准确度影响的曲线图，F图为喷嘴电压对准确度影响的曲线，G图为干燥气温度对准确度影响的曲线图，H图为雾化气压力对准确度影响的曲线图，I图为干燥气流速对准确度影响的曲线图，J图为鞘气温度对准确度影响的曲线图，K图为鞘气流速对准确度影响的曲线图。
具体实施方式
实施例1(检测方法)
1.仪器与试药
仪器：Agilent 1240高效液相色谱仪；串联Agilent 6460质谱仪；Poroshell120EC-C18(3.0×50mm,2.7-Micron)色谱柱；Agilent Mass Hunter Profinder versionB.10.00数据处理软件；KQ5200超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-QAdvantage A10超纯水系统(美国Merck Millipore公司)；冷冻干燥仪(德国Ependoff公司)；TB-25十万分之一电子分析天平(北京丹佛仪器有限公司)。
标准品：N-乙酰多巴胺二聚体Aa、N-乙酰多巴胺二聚体Ab、毛钩藤碱、去氢毛钩藤碱、钩藤碱、异钩藤碱、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、甘草酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、新西兰牡荆苷、日当要黄素、芦丁、对香豆酸、咖啡酸、枸橼酸、木犀草苷、木犀草素、槲皮素。
内标：氯霉素、磺胺甲恶唑。
待检样品：中华人民共和国药典2020年版一部第552页记载的小儿七星茶颗粒，其组方为：薏苡仁893g、稻芽893g、山楂446g、淡竹叶670g、钩藤335g、蝉蜕112g和甘草112g。
甲醇和乙腈为LC-MS级(美国Honeywell)，甲酸为LC-MS级(美国Fluka公司)。
2.方法
2.1混合内标溶液的制备：使用TB-25十万分之一电子分析天平分别称取磺胺甲恶唑900μg和氯霉素890μg，用体积浓度为的80％甲醇溶解并定容至10mL，作为混合内标溶液。
2.2标准品进样液的制备：使用TB-25十万分之一电子分析天平分别称取标准品分别精密称取标准品N-乙酰多巴胺二聚体Aa 880μg、N-乙酰多巴胺二聚体Ab 930μg、毛钩藤碱1100μg、去氢毛钩藤碱1090μg、钩藤碱1220μg、异钩藤碱1240μg、异去氢钩藤碱1250μg、去氢钩藤碱1110μg、甘草苷1070μg、异甘草苷1140μg、甘草素1110μg、异甘草素1040μg、甘草酸1140μg、绿原酸1050μg、新绿原酸1050μg、隐绿原酸1080μg、金丝桃苷1220μg、新西兰牡荆苷1020μg、日当要黄素1070μg、芦丁1095μg、对香豆酸1300μg、咖啡酸1015μg、枸橼酸1115μg、木犀草苷1200μg、木犀草素1010μg和槲皮素1160μg，用体积浓度为80％的甲醇溶解并定容至1.0mL，即得26种单一标准品储备母液。
2.3待测进样液的制备：使用TB-25十万分之一电子分析天平，按小儿七星茶颗粒组方的比例分别称取薏苡仁8.93g、稻芽8.93g、山楂4.46g、淡竹叶6.70g、钩藤3.35g、蝉蜕1.12g和甘草1.12g；其中薏苡仁、稻芽加纯水煎煮二次，每次2小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至55℃下相对密度为1.08，加入乙醇使含醇量达体积百分数为45％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏；其余山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕、甘草等五味加水煎煮二次，每次2小时，煎液滤过，滤液合并，滤液浓缩至适量，与上述稠膏合并，使用冷冻干燥仪减压在负70～75℃的条件下冷冻干燥，得待检样品；
取所述待检样品0.5g，加入体积浓度为80％的甲醇10mL，使用KQ5200超声波清洗机在20℃的条件下超声30min，冷却至室温，补足减失的体积浓度为80％的甲醇质量，离心10min，吸取上清液200μL，用体积浓度为80％的定容至10mL，即得待检测进样液。
2.4将上述混合内标溶液、待检进样液和混合标准品溶液分别注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，并采用HPLC-MS/MS多反应监测法进行检测，得到如图4～6所示的小儿七星茶颗粒有效成分的总离子流谱图和各有效成分的离子流谱图，以及如图1～3所示的标准品的总离子流谱图和各化学成分的离子流谱图：其中，
高效液相色谱检测的方法和色谱条件：按进样量为5μL对Poroshell 120EC-C183.0×50mm,2.7-Micron色谱柱进样，控制柱温30℃，接着用由A相0.1％甲酸水溶液和B相为乙腈组成的流动相，以0.4mL/min的流速进行正负离子梯度洗脱，其中正离子洗脱的程序如下表1所示，负离子洗脱的程序如下表2所示；
表1正离子洗脱的程序
表2负离子洗脱的程序
质谱检测的方法和质谱条件为：电喷雾离子化，正、负离子交替检测；正离子检测的毛细管电压为3500V，负离子检测的毛细管电压为3000V；喷嘴电压为500V；雾化气体、干燥气体和鞘气气体为氮气；干燥气体温度为300℃；雾化气体压力为45psi；干燥气体流速为5.1L/min；鞘气气体温度为350℃；鞘气气体流速为11L/min；
多反应监测的方法和条件为：正、负离子交替进行检测分析26种成分的含量测定，其中26种成分和2种内标及MS-MRM参数如表3：
表3
2.5将混合内标与混合标准品混合均匀，注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，进样5μL分析，使用Agilent Mass HunterProfinder软件获得混合内标与混合标准品的离子流谱图，从而确定混合标准品溶液各化学成分的保留时间和相应离子峰如图1～3所示，图中各特征峰依次为：1：N-乙酰多巴胺二聚体Aa，2：N-乙酰多巴胺二聚体Ab，3：钩藤碱，4：异钩藤碱，5：异去氢钩藤碱，6：去氢钩藤碱，7：毛钩藤碱，8：去氢毛钩藤碱，IS1：磺胺甲恶唑，9：甘草酸，10：芦丁，11：新西兰牡荆苷，12：金丝桃苷，13：日当要黄素，14：木犀草苷，15：甘草苷，16：异甘草苷，17：新绿原酸，18：绿原酸，19：隐绿原酸，20：槲皮素，21：木犀草素，22：甘草素，23：异甘草素，24：枸橼酸，25：咖啡酸，26：对香豆酸，IS2：氯霉素；
将混合内标与与混合标准品混合均匀后，吸取1、2、5、10、20、50、100、200、500μL置于不同10mL量瓶中，加入体积浓度为80％的甲醇稀释并定容至刻度，得系列浓度的混合标准品溶液，注入Agilent1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，进样5μL分析，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件对标准品和内标定量离子峰进行积分记录其峰面积，以标准品和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为纵坐标，以该标准品的浓度为横坐标绘制出线性回归曲线，并计算其标准回归曲线方程；
待检进样液混合均匀，注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，进样5μL分析，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件获得待检进样液中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值，分别代入相应的标准曲线方程中，即可计算出每一待检测物在待检进样液中的浓度。
3.结果
3.1标准回归曲线方程及相关系数如表4所示。
表4
3.2小儿七星茶颗粒中N-乙酰多巴胺二聚体Aa的含量为15.318±1.125μg/g、N-乙酰多巴胺二聚体Ab的含量为11.785±1.237μg/g、钩藤碱的含量为16.378±1.703μg/g、异钩藤碱的含量为4.791±0.236μg/g、异去氢钩藤碱的含量为2.486±0.214μg/g、去氢钩藤碱的含量为0.327±0.015μg/g、毛钩藤碱的含量为4.687±1.016μg/g、去氢毛钩藤碱的含量为20.710±0.719μg/g、甘草酸的含量为263.986±22.357μg/g、芦丁的含量为3.808±0.238μg/g、新西兰牡荆苷的含量为4.745±0.273μg/g、金丝桃苷的含量为8.616±0.536μg/g、日当要黄素的含量为3.618±0.224μg/g、木犀草苷的含量为0.861±0.074μg/g、甘草苷的含量为34.213±2.737μg/g、异甘草苷的含量为25.290±1.840μg/g、新绿原酸的含量为11.402±1.289μg/g、绿原酸的含量为56.125±1.978μg/g、隐绿原酸的含量为12.110±1.580μg/g、槲皮素的含量为76.802±1974μg/g、木犀草素的含量为0.170±0.013μg/g、苷草素的含量为7.675±0.332μg/g、异甘草素的含量为2.698±0.215μg/g、枸橼酸的含量为120.330±9.048μg/g、咖啡酸的含量为1.482±0.202μg/g、对香豆酸的含量为16.812±1.199μg/g。
实施例2(本方法的有益效果考察)
1.仪器、试药：本例中所用仪器与试药均与实施例1相同。
2.方法
2.1高效液相色谱检测的方法和色谱条件：采用例1中高效液相色谱检测的方法和色谱条件。
2.2质谱检测的方法和质谱条件：采用例1中质谱检测的方法和质谱条件。
2.3多反应监测的方法和条件：采用例1中多反应监测的方法和条件。
2.4混合内标溶液：采用例1中混合内标溶液的制备。
2.5标准品进样液：采用例1中标准品进样液的制备。
2.6待检测进样液：采用例1中待测进样液的制备。
2.7标准回归曲线：采用例1中标准回归曲线方程。
2.7稳定性考察：为了检验上述实施例中建立结果的稳定性，按上述待测进样液方法制备一份小儿七星茶颗粒待测进样液，于0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时各时间点进样5μL测定一次，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录待检进样液中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值分别代入相应的标准回归曲线方程中，计算出每一待检测成分在待检进样液中的浓度，根据下述公式计算每一待检测物的相对标准偏差(RSD)。
其中xi为待检进样液中待测成分的浓度，
为待测成分在不同时间点测定的平均浓度，n为不同时间点测定。本发明中认为稳定性相对标准偏差(RSD)在5％范围内属于正常误差范围。统计结果如表5所示，小儿七星茶颗粒待测进样液中各待测成分的稳定性相对标准偏差(RSD)在0.21％～4.05％之间，表明待检进样液中26个待测成分在24小时内稳定性较好，上述实施例稳定性好。
2.8重复性考察：为了检验上述实施例的重复性，按上述待测进样液方法制备6份不同小儿七星茶颗粒待测进样液，连续进样5μL，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录待检进样液中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值分别代入相应的标准曲线方程中，即可计算出每一待检测物在待检进样液中的浓度，根据下述公式计算每一待检测物的相对标准偏差(RSD)。
其中xi为待检进样液中待测成分的浓度，
为待测成分在不同待检进样液测定的平均浓度，n为样本数。本发明中认为重复性相对标准偏差(RSD)在5％范围内属于正常误差范围。统计结果如表5所示，小儿七星茶颗粒待测进样液中每一待检测物浓度的相对标准偏差(RSD)在0.27％～3.84％之间，表明制备的6份不同小儿七星茶颗粒待测进样液每一待测物数据重复性高，上述实施例重复性好。
2.9准确度考察：准确度系指用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度，一般用加标回收率(％)表示，即向已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的待检测物标准品，依法测定。用实测值与待测样品中含有量之差，除以加入标准品量计算加标回收率。称取小儿七星茶颗粒冷冻干燥粉约0.25g，按上述待测进样液方法制备待测进样液6份，分别加入相应浓度的各个组分的标准品储备液，配得加入标准品待检测进样液，进样5μL分析，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录待检进样液中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值分别代入相应的标准曲线方程中，即可计算出待检进样液中加入标准品待检进样液的测定值(Ai)；待检进样液测定值(B)方法同例1，按下述公式计算回收率，并计算平均回收率相对标准偏差(RSD)，本发明平均回收率在95％～105％范围内，回收率相对标准偏差(RSD)在5％范围内属于正常误差范围。
其中Ai为加入标准品待测样品的测定值，B为待测样品测定值，C为加入标准品的量。统计结果如表5所示，平均回收率在98.04％～103.88％，平均回收率相对标准偏差(RSD)在1.79％～4.02％之间，表明上述实施例准确度较好。
表5
实施例3(本方法的液相色谱串联质谱条件对准确度影响的考察)
1.仪器、试药：本例中所用仪器与试药均与实施例1相同。
2.方法
2.1混合内标溶液：采用实施例1制备的混合内标溶液。
2.2标准品进样液：采用实施例1制备的标准品进样液。
2.3研究方法：由上述实施例1所述的检测方法可见，影响准确度的主要参数为：进样量、色谱柱的柱温、流动相的流速、正离子检测毛细管电压、负离子检测毛细管电压、喷嘴电压、干燥气温度、雾化气压力、干燥气流速、鞘气温度和鞘气流速11参数，因此本例中将待研究参数设置为可变因数，而其它10个参数设置为固定值(与实施例1相同)。
2.4进样量对标准品准确度的考察：准确度系指用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度。流速和柱温两因素不变，改变进样量水平，将标准品注入Agilent1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中检测方法参照实施例1，进样量按0.1、0.5、1、3、5、7、9、11μL注入上述检测系统，使用Agilent Mass HunterProfinder软件记录待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7A所示，在其他条件不变，改变进样量水平，进样量为0.1～11μL，进样量与标准品准确度曲线图呈现先上升再下降的趋势，在5μL时，准确度达到最大值，此时准确度为98.61％。
2.5柱温对标准品准确度的考察：进样量和流速两因素不变，改变柱温水平，将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中检测方法参照实施例1，柱温按15、20、25、30、35、40、45℃设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7B所示，在其他条件不变，改变柱温水平，柱温为15～45℃，柱温与标准品准确度曲线图呈现先上升再下降的趋势，在30℃时，准确度达到最大值，此时准确度为98.62％。
2.6流速对标准品准确度的考察：进样量和柱温两因素不变，改变流速水平，将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中检测方法参照实施例1，流速按0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mL/min设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7C所示，在其他条件不变，改变流速水平，流速为0.10～0.50mL/min，流速与标准品准确度曲线图呈现先缓满上升再下降的趋势，在0.40mL/min时，准确度达到最大值，此时准确度为98.68％。
2.7正离子检测毛细管电压对标准品准确度的考察：将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中高效液相色谱检测的方法和色谱条件不变，质谱检测的方法和质谱条件中改变正离子检测毛细管电压，正离子检测毛细管电压按下述3100、320、3300、3400、3500、3600、3700V设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录改变正离子检测毛细管电压时，待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7D所示，在其他条件不变，改变正离子检测毛细管电压为3100～3700V时，与标准品准确度曲线图呈现先迅速上升再缓慢上升最后达到拐点下降的趋势，在正离子检测毛细管电压为3500V时，准确度达到最大值，此时准确度为97.65％。
2.8正离子检测毛细管电压对标准品准确度的考察：将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中高效液相色谱检测的方法和色谱条件不变，质谱检测的方法和质谱条件中改变负离子检测毛细管电压，负离子检测毛细管电压按下述2700、2800、2900、3000、3100、320、3300V设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录改变负离子检测毛细管电压时，待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7E所示，在其他条件不变，改变负离子检测毛细管电压为2700～3300V时，与标准品准确度曲线图呈现先上升达到拐点再缓慢下降的趋势，在负离子检测毛细管电压为3000V时，准确度达到最大值，此时准确度为98.62％。
2.9喷嘴电压对标准品准确度的考察：将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中高效液相色谱检测的方法和色谱条件不变，质谱检测的方法和质谱条件中改变喷嘴电压，喷嘴电压按下述350、400、450、500、550、600V设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录改变喷嘴电压时，待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7F所示，在其他条件不变，改变喷嘴电压为350～600V时，与标准品准确度曲线图呈现先缓慢上升再迅速上升达到拐点再缓慢下降的趋势，在喷嘴电压为500V时，准确度达到最大值，此时准确度为95.95％。
2.10干燥气温度对标准品准确度的考察：将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中高效液相色谱检测的方法和色谱条件不变，质谱检测的方法和质谱条件中改变干燥气温度，干燥气按下述260、300、340、380、420℃设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录改变干燥气温度时，待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7G所示，在其他条件不变，改变干燥气温度为260～420℃时，与标准品准确度曲线图呈现先迅速上升达到拐点再缓慢下降的趋势，在干燥气温度为300℃时，准确度达到最大值，此时准确度为96.57％。
2.11雾化气压力对标准品准确度的考察：将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中高效液相色谱检测的方法和色谱条件不变，质谱检测的方法和质谱条件中改变雾化气压力，雾化气压力按下述25、30、35、40、45、50、55、60、65psi设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录改变雾化气压力时，待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7H所示，在其他条件不变，改变雾化气压力为25～65psi(psi为压强计量单位)时，与标准品准确度曲线图呈现先上升达到拐点再下降的趋势，在雾化气压力为45psi时，准确度达到最大值，此时准确度为96.86％。
2.12干燥气流速对标准品准确度的考察：将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中高效液相色谱检测的方法和色谱条件不变，质谱检测的方法和质谱条件中改变干燥气流速，干燥气流速按3、4、5、6、7L/min设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录改变干燥气流速时，待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7I所示，在其他条件不变，改变干燥气流速为3～7L/min时，与标准品准确度曲线图呈现先上升达到拐点再平缓变化的趋势，在干燥气流速为5.1L/min时，准确度达到最大值，此时准确度为97.651％。
2.13鞘气温度对标准品准确度的考察：将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中高效液相色谱检测的方法和色谱条件不变，质谱检测的方法和质谱条件中改变鞘气温度，鞘气温度按下述250、300、350、400、450℃设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录改变鞘气温度时，待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7J所示，在其他条件不变，改变鞘气温度为250～450℃时，与标准品准确度曲线图呈现先上升达到拐点再平缓变化再下降的趋势，在鞘气温度为350℃时，准确度达到最大值，此时准确度为96.36％。
2.14鞘气流速对标准品准确度的考察：将标准品注入Agilent 1240高效液相色谱仪串联Agilent 6460质谱仪组成的检测系统，其中高效液相色谱检测的方法和色谱条件不变，质谱检测的方法和质谱条件中改变鞘气流速，鞘气流速按下述8、9、10、11、12、13、14L/min设置，注入上述检测系统，使用Agilent Mass Hunter Profinder软件记录改变鞘气流速时，待标准品中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为建立方法测定值(M)，按下述公式计算标准品准确值(％)。
其中M为标准品测定值，N为标准品的量。统计结果如图7K所示，在其他条件不变，改变鞘气流速为8～14L/min时，与标准品准确度曲线图呈现先上升达到拐点再平缓变化的趋势，在鞘气流速为11L/min时，准确度达到最大值，此时准确度为97.65％。
Claims (3)
1.一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)配制混合内标溶液：分别精密称取磺胺甲恶唑900μg和氯霉素890μg，用体积浓度为的80％甲醇溶解并定容至10mL，即得所述混合内标溶液；
(2)配制混合标准品溶液：分别精密称取标准品分别精密称取标准品N-乙酰多巴胺二聚体Aa 880μg、N-乙酰多巴胺二聚体Ab 930μg、毛钩藤碱1100μg、去氢毛钩藤碱1090μg、钩藤碱1220μg、异钩藤碱1240μg、异去氢钩藤碱1250μg、去氢钩藤碱1110μg、甘草苷1070μg、异甘草苷1140μg、甘草素1110μg、异甘草素1040μg、甘草酸1140μg、绿原酸1050μg、新绿原酸1050μg、隐绿原酸1080μg、金丝桃苷1220μg、新西兰牡荆苷1020μg、日当要黄素1070μg、芦丁1095μg、对香豆酸1300μg、咖啡酸1015μg、枸橼酸1115μg、木犀草苷1200μg、木犀草素1010μg和槲皮素1160μg，加入步骤(1)制得的混合内标溶液10μL，用体积浓度为80％的甲醇溶解并定容至10mL，即得所述混合标准品储备液；
(3)配制待检测进样液：分别称取薏苡仁8.93g、稻芽8.93g、山楂4.46g、淡竹叶6.70g、钩藤3.35g、蝉蜕1.12g和甘草1.12g；其中薏苡仁和稻芽加水煎煮二次，每次2小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩至55℃下相对密度为1.08，加入乙醇使含醇量达体积百分数45％，静置，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏；山楂、淡竹叶、钩藤、蝉蜕和甘草加水煎煮二次，每次2小时，煎液滤过，滤液合并，滤液浓缩至适量，与所述的稠膏合并，负70～75℃减压干燥，得待检样品；
取所述待检样品0.5g，加入体积浓度为80％的甲醇10mL，在20℃的条件下超声30min，冷却至室温，补足减失的体积浓度为80％的甲醇质量，离心10min，吸取上清液200μL，加入步骤(1)制得的混合内标溶液10μL，用体积浓度为80％的定容至10mL，即得所述待检测进样液；
(4)检测方法和条件：将待检进样液和混合标准品溶液分别按下述方法注入高效液相色谱串联质谱仪并采用HPLC-MS/MS多反应监测法进行检测，获得被检测物以及标准品各化学成分的离子流谱图：其中，
高效液相色谱检测的方法和色谱条件为：按进样量为1～10μL对柱温为20～40℃的Poroshell 120EC-C18 3.0×50mm,2.7-Micron色谱柱进样，接着用由A相为0.01～0.1％甲酸水溶液和B相为乙腈组成的流动相，以0.15～0.45mL/min的流速进行正负离子梯度洗脱，其中正离子洗脱的程序如下表1所示，负离子洗脱的程序如下表2所示；
表1正离子洗脱的程序
表2负离子洗脱的程序
质谱检测的方法和质谱条件为：正离子检测的毛细管电压为3300～3600V，负离子检测的毛细管电压为2800～3200V；喷嘴电压为400～550V；雾化气体、干燥气体和鞘气气体为氮气；干燥气体温度为300～400℃；雾化气体压力为30～60psi；干燥气体流速为4～6L/min；鞘气气体温度为300～400℃；鞘气气体流速为9～13L/min；
多反应监测的方法和条件为：正负离子交替进行检测分析26种成分的含量测定，其中26种成分和2种内标及MS-MRM参数如下表3：
表3
(5)化学成分的定性与定量测定：将获得被检测物与标准品各化学成分的离子流谱图进行比较，与混合标准品溶液各化学成分的离子流图谱中相应成分的保留时间相同的离子峰即是与该化学成分相同物质的特征峰；以标准品和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值为纵坐标，以该标准品的浓度为横坐标绘制出线性回归曲线，得到每一标准品的标准曲线方程；然后，将待检进样液中每一待检测物和内标定量离子与相应离子流峰面积的比值分别代入相应的标准曲线方程中，即可计算出每一有效成分在待检进样液中的浓度，进而计算出所述小儿七星茶颗粒中各有效成分的含量。
2.根据权利要求1所述的一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的方法和色谱条件为：按进样量为5μL对柱温为30℃的Poroshell120EC-C18 3.0×50mm,2.7-Micron色谱柱进样，接着用由A相为0.1％甲酸水溶液和B相为乙腈组成的流动相，以0.40mL/min的流速进行正负离子梯度洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的一种小儿七星茶颗粒有效成分的检测方法，其特征在于，所述质谱检测的方法和质谱条件为：正离子检测的毛细管电压为3500V，负离子检测的毛细管电压为3000V；喷嘴电压为500V；雾化气体、干燥气体和鞘气气体为氮气；干燥气体温度为300℃；雾化气体压力为45psi；干燥气体流速为5.1L/min；鞘气气体温度为350℃；鞘气气体流速为11L/min。
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