CN113702522A - 蝉蜕药材的特征图谱构建方法及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法 - Google Patents

蝉蜕药材的特征图谱构建方法及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蝉蜕药材的特征图谱构建方法及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法。所述蝉蜕药材的特征图谱构建方法包括如下步骤：制备对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品和乙酰多巴胺二聚体对照品，加第三溶剂溶解；将所述对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，所述超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液；洗脱方式为梯度洗脱。该蝉蜕药材的特征图谱构建方法耗时短，且能够通过蝉蜕药材全面反映蝉蜕中药汤剂和蝉蜕中药配方颗粒质量。

Description

蝉蜕药材的特征图谱构建方法及其中药汤剂、中药配方颗粒 的检测方法
技术领域
本发明涉及中药材检测技术领域，特别是涉及一种蝉蜕药材的特征图谱构建方法及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法。
背景技术
蝉蜕为蝉科昆虫黑蚱Cryptotympana pustulata Fabricius的若虫羽化时脱落的皮壳，主产山东、河南、河北、湖北、江苏、四川等地，具有疏散风热、利咽、透疹、明目退翳、解痉的功效，临床上常用于风热感冒、咽痛音哑、麻疹不透、风瘆瘙痒、目赤翳障、惊风抽搐、破伤风等症。
传统方法中对蝉蜕研究多集中在单一成分的含量测定，但由于中药有效成分多样性及复杂性，单一成分的含量测定不足以说明药材的内在质量，亦缺乏专属性。另外，蝉蜕中药汤剂指将蝉蜕药材或饮片加水煎煮或沸水浸泡后，去渣取汁而得到的液体制剂，是一种中医临床使用较为广泛的一种剂型。蝉蜕中药配方颗粒是将蝉蜕药材或饮片经过水提取、浓缩、干燥、制粒而成，供临床配伍使用。与蝉蜕药材和饮片相比，蝉蜕中药汤剂和蝉蜕中药配方颗粒均已失去固有的形态，在质量控制上缺少性状和显微鉴别的重要指标，而目前没有建立有效的，蝉蜕中药汤剂和蝉蜕中药配方颗粒的质量标准，无法有效控制和较全面评价蝉蜕中药汤剂和蝉蜕中药配方颗粒的质量。
中药指纹图谱和特征图谱能够提供中药材更为全面、丰富的信息，因此常用于中药材的质量控制研究。有方法涉及蝉蜕的指纹图谱构建或质量研究，其通常以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B进行液相色谱检测，但是该方法均耗时较长，且难以通过蝉蜕药材全面反映蝉蜕中药汤剂和蝉蜕中药配方颗粒的质量。
发明内容
基于此，本发明提供一种耗时短，且能够通过蝉蜕药材全面反映蝉蜕中药汤剂和蝉蜕中药配方颗粒质量的蝉蜕药材的特征图谱构建方法及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法。
本发明的第一方面，提供一种蝉蜕药材的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
制备对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，其中，所述对照药材溶液的制备方法包括如下步骤：取蝉蜕对照药材，加第一溶剂进行第一次提取；所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取蝉蜕药材或其饮片，加第二溶剂进行第二次提取；所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品和乙酰多巴胺二聚体对照品，加第三溶剂溶解；
将所述对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，所述超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液；洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，所述流动相A的体积百分比由6％上升至8％；
7min～10min，所述流动相A的体积百分比由8％上升至11％；
10min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至15％；
22min～32min，所述流动相A的体积百分比由15％上升至23％；
32min～35min，所述流动相A的体积百分比由23％上升至90％；
35min～38min，保持所述流动相A的体积百分比为90％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的检测条件还包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.3mL/min～0.4mL/min；柱温：33℃～37℃；检测波长：275nm～285nm。
在其中一个实施例中，所述第一溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液；及/或
所述第二溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液。
在其中一个实施例中，第一次提取为加热至回流提取25min～35min；及/或
第二次提取为加热至回流提取25min～35min。
在其中一个实施例中，所述第三溶剂为体积浓度为45％～55％的甲醇水溶液。
本发明的第二方面，提供一种蝉蜕药材及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法，包括如下步骤：
取待测样品，加第四溶剂进行第三次提取，提取液过滤，取续滤液，制备待测样品溶液；所述待测样品为蝉蜕药材或其饮片、蝉蜕中药汤剂或蝉蜕中药配方颗粒中的一种；
将所述待测样品溶液进行超高效液相色谱检测，所述超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液；洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，所述流动相A的体积百分比由6％上升至8％；
7min～10min，所述流动相A的体积百分比由8％上升至11％；
10min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至15％；
22min～32min，所述流动相A的体积百分比由15％上升至23％；
32min～35min，所述流动相A的体积百分比由23％上升至90％；
35min～38min，保持所述流动相A的体积百分比为90％。
在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱的检测条件还包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.3mL/min～0.4mL/min；柱温：33℃～37℃；检测波长：275nm～285nm。
在其中一个实施例中，所述第四溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液。
在其中一个实施例中，所述待测样品为蝉蜕药材或其饮片，第三次提取为加热至回流提取；或
所述待测样品为蝉蜕中药汤剂或蝉蜕中药配方颗粒，第三次提取为超声提取，超声功率为250W～350W、频率为30kHZ～50kHZ。
在其中一个实施例中，第三次提取的时间为25min～35min。
上述蝉蜕药材的特征图谱构建方法，选择合适的对照品，结合合适的超高效液相色谱检测条件设置进行蝉蜕药材特征图谱的构建，该蝉蜕药材的特征图谱包含的特征峰分离度高、信息丰富、色谱峰形好，能够较为特征性和全面性地反映蝉蜕药材的质量，便于对蝉蜕药材的质量进行评价和监控。同时，该特征图谱构建方法的耗时明显较传统方法短，且精密度高、准确度高、稳定性好、重现性好，便于大规模推广应用。
另外，通过合适的超高效液相色谱检测条件设置，在实现蝉蜕药材质量评价和监控的同时，还能够针对蝉蜕药材对应的中药汤剂与中药配方颗粒共有的水溶性成分特征成分进行研究，因此上述蝉蜕药材的特征图谱构建方法和检测方法还能够用于蝉蜕药材制备的蝉蜕中药汤剂和蝉蜕中药配方颗粒的质量检测和监控。
附图说明
图1为蝉蜕药材UPLC色谱中的特征峰指认；
图2为17批蝉蜕药材UPLC特征图谱；
图3为蝉蜕药材UPLC对照特征图谱；
图4为不同波长条件下蝉蜕药材UPLC对比图；
图5为不同流动相条件下蝉蜕药材UPLC对比图；
图6为不同柱温条件下蝉蜕药材UPLC对比图；
图7为17批蝉蜕标准汤剂UPLC特征图谱；
图8为蝉蜕标准汤剂UPLC对照特征图谱；
图9为3批蝉蜕中药配方颗粒UPLC特征图谱；
图10为蝉蜕中药配方颗粒UPLC对照特征图谱；
图11为蝉蜕药材及其标准汤剂、中药配方颗粒UPLC对比图；
图12为待测蝉蜕药材图谱；
图13为待测蝉蜕药材制成的标准汤剂图谱；
图14为待测蝉蜕药材制成的中药配方颗粒图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的蝉蜕药材的特征图谱构建方法及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中，若无特别说明，溶液的基质为水。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本发明提供一种蝉蜕药材的特征图谱构建方法，包括如下步骤：
制备对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，其中，对照药材溶液的制备方法包括如下步骤：取蝉蜕对照药材，加第一溶剂进行第一次提取；供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取蝉蜕药材或其饮片，加第二溶剂进行第二次提取；对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品和乙酰多巴胺二聚体对照品，加第三溶剂溶解；
将对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液；洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一些具体的示例中，梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积百分比由6％上升至8％；
7min～10min，流动相A的体积百分比由8％上升至11％；
10min～22min，流动相A的体积百分比由11％上升至15％；
22min～32min，流动相A的体积百分比由15％上升至23％；
32min～35min，流动相A的体积百分比由23％上升至90％；
35min～38min，保持流动相A的体积百分比为90％。
在其中一些具体的示例中，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液。具体地，甲酸水溶液的体积浓度包括但不限于：0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％。
在其中一些具体的示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：流速为0.3mL/min～0.4mL/min。具体地，流速包括但不限于：0.3mL/min、0.31mL/min、0.32mL/min、0.33mL/min、0.34mL/min、0.35mL/min、0.36mL/min、0.37mL/min、0.38mL/min、0.39mL/min、0.4mL/min。
在其中一些具体的示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：柱温为33℃～37℃。具体地，柱温包括但不限于：33℃、34℃、35℃、36℃、37℃。
在其中一些具体的示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：检测波长为275nm～285nm。进一步地，检测波长为280nm。
在其中一些具体的示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.3mL/min～0.4mL/min；柱温：30℃～40℃；检测波长：275nm～285nm。
在其中一些具体的示例中，第一溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液。具体地，甲醇水溶液的浓度包括但不限于：50％、55％、60％、65％、68％、70％、72％、75％、80％、85％、90％。
在其中一些具体的示例中，第二溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液。具体地，甲醇水溶液的浓度包括但不限于：50％、55％、60％、65％、68％、70％、72％、75％、80％、85％、90％。
在其中一些具体的示例中，第一次提取为加热至回流提取25min～35min。具体地，回流提取的时间包括但不限于：25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min。
在其中一些具体的示例中，第一次提取完成后，还包括复溶步骤：将第一次提取的提取液进行离心，收集上清液，蒸干；蒸干所得固体以第一溶剂溶解。
在其中一些具体的示例中，离心的条件包括：转速为3500r/min～4500r/min，时间为3min～7min。
在其中一些具体的示例中，第二次提取为加热至回流提取25min～35min。具体地，回流提取的时间包括但不限于：25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min。
在其中一些具体的示例中，第二次提取完成后，还包括复溶步骤：将第二次提取的提取液进行离心，收集上清液，蒸干；蒸干所得固体以第二溶剂溶解。
在其中一些具体的示例中，离心的条件包括：转速为3500r/min～4500r/min，时间为3min～7min。
在其中一些具体的示例中，第三溶剂为体积浓度为45％～55％的甲醇水溶液。具体地，甲醇水溶液的浓度包括但不限于：45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％。
在其中一些具体的示例中，对照品溶液中，原儿茶酸对照品的浓度为15μg/mL～25μg/mL、原儿茶醛对照品的浓度为5μg/mL～15μg/mL、乙酰多巴胺二聚体对照品的浓度为10μg/mL～20μg/mL。
本发明提供一种蝉蜕药材及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法，包括如下步骤：
取待测样品，加第四溶剂进行第三次提取，提取液过滤，取续滤液，制备待测样品溶液；待测样品为蝉蜕药材或其饮片、蝉蜕中药汤剂或蝉蜕中药配方颗粒中的一种；
将待测样品溶液进行超高效液相色谱检测，超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液；洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，流动相A的体积百分比由6％上升至8％；
7min～10min，流动相A的体积百分比由8％上升至11％；
10min～22min，流动相A的体积百分比由11％上升至15％；
22min～32min，流动相A的体积百分比由15％上升至23％；
32min～35min，流动相A的体积百分比由23％上升至90％；
35min～38min，保持流动相A的体积百分比为90％。
在其中一些具体的示例中，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液。具体地，甲酸水溶液的体积浓度包括但不限于：0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％。
在其中一些具体的示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：流速为0.3mL/min～0.4mL/min。具体地，流速包括但不限于：0.3mL/min、0.31mL/min、0.32mL/min、0.33mL/min、0.34mL/min、0.35mL/min、0.36mL/min、0.37mL/min、0.38mL/min、0.39mL/min、0.4mL/min。
在其中一些具体的示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：柱温为33℃～37℃。具体地，柱温包括但不限于：33℃、34℃、35℃、36℃、37℃。
在其中一些具体的示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：检测波长为275nm～285nm。进一步地，检测波长为280nm。
在其中一些具体的示例中，超高效液相色谱的检测条件还包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.3mL/min～0.4mL/min；柱温：30℃～40℃；检测波长：275nm～285nm。
在其中一些具体的示例中，第四溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液。具体地，甲醇水溶液的浓度包括但不限于：50％、55％、60％、65％、68％、70％、72％、75％、80％、85％、90％。
在其中一些具体的示例中，所述待测样品为蝉蜕药材或其饮片，第三次提取为加热至回流提取。在其中一些具体的示例中，第三次提取的时间为25min～35min。具体地，第三次提取的时间包括但不限于：25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min。
在其中一些具体的示例中，所述待测样品为蝉蜕中药汤剂或蝉蜕中药配方颗粒，第三次提取为超声提取。进一步地，超声功率为250W～350W、频率为30kHZ～50kHZ。
在其中一些具体的示例中，超声功率为250W～350W。具体地，超声功率包括但不限于：250W、260W、270W、280W、290W、300W、310W、320W、330W、340W、350W。
在其中一些具体的示例中，超声频率为30kHZ～50kHZ。具体地，超声频率包括但不限于：30kHZ、33kHZ、36kHZ、38kHZ、40kHZ、42kHZ、44kHZ、47kHZ、50kHZ。
在其中一些具体的示例中，第三次提取的时间为25min～35min。具体地，超声提取的时间包括但不限于：25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min。
以下为具体实施例。
实施例1
本实施例为一种蝉蜕药材UPLC特征图谱建立方法。
1.仪器与试药
1.1仪器
旋转蒸发仪(YRE-501，巩义市予华仪器有限公司)，陶瓷保健壶(3L，深圳一枚王有限公司)，百分之一天平(JJ600，常熟市双杰测试仪器厂)，循环水真空泵(SHZ-DШ，巩义市予华仪器有限公司)，低温冷却液循环水泵(DLSB-5/20，郑州长城科工贸有限公司)，真空冷冻干燥机(TRL-0.5，大连双瑞科技有限公司)，350目筛网。Waters超高效液相色谱仪(Waters H-Class，沃特世公司)，万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(XP26，梅特勒-托利多公司)，超纯水系统(Milli-Q Direct，默克股份有限公司)；低速台式大容量离心机(TDL-4000C，上海安亭科学仪器厂)。
1.2试剂
乙腈(默克股份有限公司)、甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)均为HPLC色谱纯，甲醇(西陇科学股份有限公司)、乙醇(西陇科学股份有限公司)为分析纯，水为超纯水(实验室自制)。
1.3试药
乙酰多巴胺二聚体(广州牌牌生物科技有限公司，批号：PIYXDBA-Dimer-20200810-01，含量：91.43％)；原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号110809-201906，含量：97.7％)；原儿茶醛(中国食品药品检定研究院，批号110810-201909，含量：99.6％)；蝉蜕对照药材(批号：125008-201202A，广东一方制药有限公司)；17批蝉蜕药材主要来源为山东临沂、河南洛阳、湖北襄阳、安徽阜阳及宿州。蝉蜕中药配方颗粒样品均由广东一方制药有限公司提供，为市售产品。
2.方法与结果
2.1蝉蜕标准汤剂的制备
取蝉蜕原药材，拣去杂质、变质品，洗净，晒干，即得蝉蜕饮片。取蝉蜕饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入14倍量水，浸泡30分钟后，武火(功率500W)煮沸后文火(功率200W)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却。第二次煎煮加12倍量水，武火(功率500W)煮沸后文火(功率200W)保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.08MPa～-0.1MPa)，转速60转/分钟，浓缩至体积约为100mL；在磁力搅拌下，精密吸取流浸膏2mL均匀分装于10mL西林瓶中，转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得。
2.2色谱条件
色谱柱：Agilent SB C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm)；流动相：以乙腈为流动相A，0.2％甲酸为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.35ml；柱温为35℃；检测波长为280nm；进样量为2μL。
表1梯度洗脱表
Figure BDA0003219899420000131
2.3供试品溶液制备：
2.3.1蝉蜕药材供试品溶液制备：
取蝉蜕药材粉末(过三号筛)适量，约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，回流提取30分钟，取出，放冷，称定重量，用70％甲醇补足减失的重量。离心(转速4000r/min，时间5min)，取上清液25mL置蒸发皿中，蒸干，残渣用70％甲醇溶解至5mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.2蝉蜕标准汤剂供试品溶液制备：
取蝉蜕标准汤剂适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，超声处理(300W，40KHz)30分钟，取出，放冷，称定重量，用70％甲醇补足减失的重量。离心(转速4000r/min，时间5min)，取上清液25mL置蒸发皿中，蒸干，残渣用70％甲醇溶解至5mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.3蝉蜕中药配方颗粒供试品溶液制备：
取蝉蜕中药配方颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，称定重量，超声处理(300W，40KHz)30分钟，取出，放冷，称定重量，用70％甲醇补足减失的重量。离心(转速4000r/min，时间5min)，取上清液25mL置蒸发皿中，蒸干，残渣用70％甲醇溶解至5mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4对照品溶液制备：取原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品、乙酰多巴胺二聚体对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液制成每1mL含原儿茶酸20μg、原儿茶醛10μg、乙酰多巴胺二聚体15μg的混合溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液制备：取蝉蜕对照药材适量，约1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇溶液50mL，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，称定重量，用70％甲醇溶液补足损失的重量，离心(转速4000r/min，时间5min)，取上清液25mL置蒸发皿中，蒸干，残渣加70％甲醇溶液溶解至5mL容量瓶中，并用70％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。
2.5测定法
分别精密吸取对照品溶液、对照药材溶液与蝉蜕药材供试品溶液各2μL，注入Waters超高效液相色谱仪记录色谱图，即得蝉蜕药材特征图谱。
2.6色谱峰指认
采用原儿茶酸、原儿茶醛、乙酰多巴胺二聚体等对照品进行定位，结果表明：峰1为原儿茶酸，峰2为原儿茶醛，峰3为乙酰多巴胺二聚体，见图1。
2.7参照峰和共有峰的选择
比较17批蝉蜕药材所得色谱图，按共有峰出现率100％计，确定了6个共有峰，见图2。
2.8蝉蜕药材对照特征图谱的建立和相似度评价
将17批自生产的蝉蜕药材色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用平均数法生成对照特征图谱(见图3)，17批蝉蜕相似度均在0.99以上(见表2)。
表2 17批蝉蜕药材样品相似度计算结果
Figure BDA0003219899420000151
3.方法学考察
3.1精密度试验
取蝉蜕药材(G161010)样品1份，按“2.3.1蝉蜕药材供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取同一供试品溶液2μL，连续进样6次，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，以乙酰多巴胺二聚体参照物峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3和表4。精密度试验结果显示，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2.0％，表明仪器精密度良好。
表3精密度试验-相对保留时间比值
Figure BDA0003219899420000161
表4精密度试验-相对峰面积比值
Figure BDA0003219899420000162
3.2重复性试验
取蝉蜕药材(G161010)样品6份，按“2.3.1蝉蜕药材供试品溶液制备”项下方法制备，分别精密吸取供试品溶液2μL，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，以乙酰多巴胺二聚体参照物峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表5和表6。重复性试验结果显示，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2.0％，表明该方法重复性良好。
表5重复性试验-特征峰相对保留时间比值
Figure BDA0003219899420000163
表6重复性试验-相对峰面积比值
Figure BDA0003219899420000164
Figure BDA0003219899420000171
3.3稳定性试验
取蝉蜕药材(G161010)样品1份，按“2.3.1蝉蜕药材供试品溶液制备”项下方法制备，分别于0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，按“2.2色谱条件”项下方法测定，记录色谱图，以乙酰多巴胺二聚体参照物峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表7和表8。稳定性试验结果显示，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于2.0％，表明样品在24小时内稳定。
表7稳定性试验-相对保留时间比值
Figure BDA0003219899420000172
表8稳定性试验-相对峰面积比值
Figure BDA0003219899420000173
3.4色谱条件考察：
3.4.1波长考察：比较了检测波长230nm、254nm、280nm、300nm下的色谱峰，在280nm下的色谱峰峰数较多，各峰之间的分离度较好，信息量大，基线平稳，故检测波长确定为280nm，见图4。
3.4.2流动相选择：本实验考察了3种不同流动相的分离效果，分别为：
Ⅰ：乙腈-体积浓度为0.1％的磷酸水溶液梯度洗脱；
Ⅱ：乙腈-体积浓度为0.2％的甲酸水溶液梯度洗脱；
Ⅲ：乙腈-体积浓度为0.2％的乙酸水溶液梯度洗脱。
结果表明：采用流动相Ⅱ进行测定所得色谱图中色谱峰数目较多，理论塔板数、分离度、对称性均更好，故优选流动相Ⅱ，见图5。
3.4.3柱温考察：比较了30℃、35℃、40℃的色谱图，结果显示35℃的色谱峰峰形最佳，分离度最好，故柱温确定为35℃，见图6。
4.蝉蜕药材、标准汤剂、配方颗粒特征图谱共有峰的确定
(1)17批蝉蜕标准汤剂的制备：取17批不同产地蝉蜕饮片，按照“2.1蝉蜕标准汤剂的制备”项制备17批蝉蜕标准汤剂。
(2)样品测定：取17批蝉蜕标准汤剂，按“2.3.2蝉蜕标准汤剂供试品溶液制备”项制备方法与“2.2色谱条件”进行检测，获得17批次蝉蜕标准汤剂UPLC特征图谱(见图7)，并进行共有峰标识，建立蝉蜕标准汤剂UPLC对照特征图谱(图8)。取3批蝉蜕中药配方颗粒，按“2.3.3蝉蜕中药配方颗粒供试品溶液制备”项制备方法与“2.2色谱条件”进行检测，获得3批蝉蜕中药配方颗粒UPLC特征图谱(图9)，并进行共有峰标识，建立蝉蜕中药配方颗粒UPLC对照特征图谱(图10)。
(3)实验结果：选择分离度较好，色谱峰较纯的共有峰为蝉蜕标准汤剂特征图谱的特征峰，17批蝉蜕标准汤剂与3批蝉蜕中药配方颗粒具有6个特征峰，且6个特征峰均能从蝉蜕药材特征图谱中找到，说明6个特征峰均能从蝉蜕药材稳定转移到蝉蜕标准汤剂及配方颗粒中，具体见蝉蜕标准汤剂、蝉蜕配方颗粒及蝉蜕药材UPLC对照特征图谱之间的比较(图11)。因此，根据蝉蜕药材UPLC特征图谱中的6个特征峰，并以峰3(乙酰多巴胺二聚体)为参照峰，还能够对蝉蜕标准汤剂及中药配方颗粒进行标准研究。
实施例2
取待测蝉蜕药材(批号：125008-201202A，广东一方制药有限公司)，按照实施例1“2.3.1蝉蜕药材供试品溶液制备”项下方法制成待测样品。
按实施例1“2.2色谱条件”进行检测，得到待测蝉蜕药材图谱(图12)。
进一步将该待测蝉蜕药材按照实施例1“2.1蝉蜕标准汤剂的制备”项下方法制备成待测蝉蜕标准汤剂，以及按照广东一方制药有限公司市售产品方法制成待测蝉蜕中药配方颗粒。按实施例1“2.3供试品溶液制备”项、以及“2.2色谱条件”进行待测样品制备，并进行检测，得到待测蝉蜕标准汤剂(图13)和待测蝉蜕中药配方颗粒图谱(图14)。
由图12与图3之间的比较可知，待测药材呈现6个色谱峰，与药材对照特征图谱色谱峰相对应，符合要求。
由图12～14间的比较可知，汤剂和配方颗粒色谱峰与待测药材一致，量值传递过程均一致。说明配方颗粒、标准汤剂与药材物质基础一致，与蝉蜕药材“形不同，但质相同”。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (12)

1.一种蝉蜕药材的特征图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液，其中，所述对照药材溶液的制备方法包括如下步骤：取蝉蜕对照药材，加第一溶剂进行第一次提取；所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取蝉蜕药材或其饮片，加第二溶剂进行第二次提取；所述对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品和乙酰多巴胺二聚体对照品，加第三溶剂溶解；
将所述对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液进行超高效液相色谱检测，所述超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液；洗脱方式为梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的蝉蜕药材的特征图谱构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，所述流动相A的体积百分比由6％上升至8％；
7min～10min，所述流动相A的体积百分比由8％上升至11％；
10min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至15％；
22min～32min，所述流动相A的体积百分比由15％上升至23％；
32min～35min，所述流动相A的体积百分比由23％上升至90％；
35min～38min，保持所述流动相A的体积百分比为90％。
3.根据权利要求1所述的蝉蜕药材的特征图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的检测条件还包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.3mL/min～0.4mL/min；柱温：33℃～37℃；检测波长：275nm～285nm。
4.根据权利要求1～3任一项所述的蝉蜕药材的特征图谱构建方法，其特征在于，所述第一溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液；及/或
所述第二溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液。
5.根据权利要求4所述的蝉蜕药材的特征图谱构建方法，其特征在于，第一次提取为加热至回流提取25min～35min；及/或
第二次提取为加热至回流提取25min～35min。
6.根据权利要求1～3任一项所述的蝉蜕药材的特征图谱构建方法，其特征在于，所述第三溶剂为体积浓度为45％～55％的甲醇水溶液。
7.一种蝉蜕药材及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待测样品，加第四溶剂进行第三次提取，提取液过滤，取续滤液，制备待测样品溶液；所述待测样品为蝉蜕药材或其饮片、蝉蜕中药汤剂或蝉蜕中药配方颗粒中的一种；
将所述待测样品溶液进行超高效液相色谱检测，所述超高效液相色谱的检测条件包括：采用的流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.1％～0.3％的甲酸水溶液；洗脱方式为梯度洗脱。
8.根据权利要求7所述的蝉蜕药材及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括如下程序：
0min～7min，所述流动相A的体积百分比由6％上升至8％；
7min～10min，所述流动相A的体积百分比由8％上升至11％；
10min～22min，所述流动相A的体积百分比由11％上升至15％；
22min～32min，所述流动相A的体积百分比由15％上升至23％；
32min～35min，所述流动相A的体积百分比由23％上升至90％；
35min～38min，保持所述流动相A的体积百分比为90％。
9.根据权利要求7所述的蝉蜕药材及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的检测条件还包括：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：0.3mL/min～0.4mL/min；柱温：33℃～37℃；检测波长：275nm～285nm。
10.根据权利要求7～9任一项所述的蝉蜕药材及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述第四溶剂为体积浓度为50％～90％的甲醇水溶液。
11.根据权利要求10所述的蝉蜕药材及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，所述待测样品为蝉蜕药材或其饮片，第三次提取为加热至回流提取；或
所述待测样品为蝉蜕中药汤剂或蝉蜕中药配方颗粒，第三次提取为超声提取，超声功率为250W～350W、频率为30kHZ～50kHZ。
12.根据权利要求11所述的蝉蜕药材及其中药汤剂、中药配方颗粒的检测方法，其特征在于，第三次提取的时间为25min～35min。
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