CN110441459A - 一种蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,该方法包括供试品溶液的制备和超高效液相色谱仪进行定性分析,一共鉴定出31种乙酰多巴胺。本发明通过大量实验筛选,采用超高效液相色谱质谱联用进行定性分析,该定性检测方法可以同时定性分析31种不同的乙酰多巴胺化合物。该方法检测灵敏度高,稳定性好,可以客观、全面、准确地评价蝉蜕药材的质量,对控制其质量和保证疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材的质量定性检测方法,具体涉及蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法。
背景技术
蝉蜕来源于蝉科昆虫黑蚱Cryptotympana pustulata Fabricius的若虫羽化时脱落的皮壳,性味甘,寒,归肺、肝经。具有散风除热,利咽,透疹,退翳,解痉功效。可用于风热感冒,咽痛,音哑,麻疹不透,风疹瘙痒,目赤翳障,惊风抽搐,破伤风。
蝉蜕药材含、蛋白质、氨基酸和乙酰多巴胺二聚体、三聚体、四聚体、五聚体。市场上的蝉蜕品种混乱,目前关于蝉蜕中的有效成分乙酰多巴胺仅仅只有3种成分的检测,未能全面、客观的对蝉蜕进行检测分析,未能严控把关蝉蜕的质量。
发明内容
发明目的:本发明的目的是解决现有技术的不足,经过大量实验筛选,采用超高效液相色谱联用质谱对蝉蜕进行定性分析检测。本发明通过大量实验筛选流动相组成,洗脱方式,质谱检测条件等关键色谱条件。该定性检测方法可以同时检测蝉蜕中的乙酰多巴胺二聚体、三聚体、四聚体、五聚体共31个不同的化合物,其中可定性鉴别乙酰多巴胺二聚体4种同分异构体,乙酰多巴胺三聚体11种同分异构体,乙酰多巴胺四聚体10种同分异构体,乙酰多巴胺五聚体6种同分异构体。该方法检测灵敏度高,稳定性好,可以客观、全面、准确地评价蝉蜕药材的质量,对控制质量和保证疗效具有重要意义。
技术方案:为了实现以上目的,本发明采取的技术方案为:
一种蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,包括以下步骤:
(1)供试品溶液的制备
精密称取蝉蜕药材,加入8倍量的乙醇,超声提取2次,每次30分钟,过滤,合并二次提取的滤液,减压浓缩,续滤液过0.22μm滤膜,得供试品溶液;
(2)定性分析检测
取步骤(1)的蝉蜕供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行定性分析,鉴定出31种乙酰多巴胺;其中乙酰多巴胺二聚体4种,乙酰多巴胺三聚体11种,乙酰多巴胺四聚体10种,乙酰多巴胺五聚体6种。
以上的蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,步骤(2)色谱条件为:仪器为WatersACQUITY UPLC,二极管矩阵检测器;自动进样器;ACQUITY HSS C18 column;流动相为0.1%冰醋酸-水为流动相A相和乙腈为流动相B相;流速0.5mL/min;Acquity UPLC BEH C18(2.1mm×100mm,1.7μm色谱柱),柱温35℃;进样量1L;洗脱梯度为:0-5min,10-55%B;5-7min,55-95%B。
质谱条件为:电喷雾离子源;离子范围m/z50~2000;碰撞气为氦气;辅助气体和屏蔽气体为氮气;喷雾电压:3.0kV;离子源温度500.0℃;辅助气和喷雾气压40.0psi;裂解电压:40V;MS碰撞能:6eV;MS/MS碰撞能:20-60V,采用MassLynx软件,版本4.1,Waters,美国,得到化合物的保留时间、母离子、碎片离子信息。
作为优选方案,以上所述的蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,定性鉴别31种乙酰多巴胺化合物的信息如下:
色谱条件的优化
为了实现31种化合物的最佳分离,本发明考察了不同色谱柱、流动相、流速及柱温这4个因素并进行优化。首先考察了水-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇、甲醇-乙腈、水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈和0.1%冰醋酸水溶液-乙腈等多种流动相系统,结果显示,0.1%冰醋酸水溶液-乙腈是分离31种化合物的最佳流动相系统。由于同分异构体比较多,在筛选出最佳流动相组成后,采用常规的等度洗脱方式无法实现各化合物很好的分离,本发明采用梯度洗脱方式,对流动相的洗脱体积进行了大量实验筛选,优选得到的最佳梯度洗脱方式为:0-5min,10-55%B;5-7min,55-95%B。
另外本发明还考察了0.1~1.0mL·min-1之间的流速以及30~45℃之间的柱温,结果显示,采用0.5·min-1的流速以及35℃的柱温时效果最好。
质谱条件的优化:
本发明采用全扫描模式研究了31种化合物在正负离子模式下的响应并进行优化。结果显示,31种化合物在正负离子模式下的信号强度和灵敏度选择最佳检测条件为:喷雾电压:3.0kV;离子源温度500.0℃;辅助气和喷雾气压40.0psi;裂解电压:40V;MS碰撞能:6eV;MS/MS碰撞能:20-60V。
有益效果:本发明提供的蝉蜕质量定性检测方法和现有技术相比具有以下优点:
本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成,梯度洗脱程序、流速,色谱柱、质谱条件等分析条件。经多次实验验证表明,本发明可以同时快速的检测蝉蜕中31种化合物。可克服现有技术只能检测有限3个成分的不足,并且本发明分析效率更高!
并且方法学检测结果表明,本发明建立的检测分析方法检测灵敏度高,稳定性好,可以客观、全面、准确的评价蝉蜕药材及其制剂的质量,对控制质量和保证临床疗效具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明,应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,在阅读了本发明之后,本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
附图说明
图1为本发明蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测的色谱图。
图2为乙酰多巴胺二聚体、乙酰多巴胺三聚体、乙酰多巴胺四聚体和乙酰多巴胺五聚体的结构示意图。
实施例1
一种蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,包括以下步骤:
(1)供试品溶液的制备
精密称取蝉蜕药材50g,加入8倍量的乙醇,超声提取2次,每次30分钟,过滤,合并二次提取的滤液,减压浓缩,续滤液过0.22μm滤膜,得供试品溶液;
(2)定性分析检测
取步骤(1)的蝉蜕供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行定性分析,鉴定出31种乙酰多巴胺;其中乙酰多巴胺二聚体4种,乙酰多巴胺三聚体11种,乙酰多巴胺四聚体10种,乙酰多巴胺五聚体6种。结构如图2所示。
以上的蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,步骤(2)色谱条件为:仪器为WatersACQUITY UPLC,二极管矩阵检测器;自动进样器;ACQUITY HSS C18 column;流动相为0.1%冰醋酸-水为流动相A相和乙腈为流动相B相;流速0.5mL/min;Acquity UPLC BEH C18(2.1mm×100mm,1.7μm色谱柱),柱温35℃;进样量1L;洗脱梯度为:0-5min,10-55%B;5-7min,55-95%B。
质谱条件为:电喷雾离子源;离子范围m/z50~2000;碰撞气为氦气;辅助气体和屏蔽气体为氮气;喷雾电压:3.0kV;离子源温度500.0℃;辅助气和喷雾气压40.0psi;裂解电压:40V;MS碰撞能:6eV;MS/MS碰撞能:20-60V,采用MassLynx软件,版本4.1,Waters,美国,得到化合物的保留时间、母离子、碎片离子信息。色谱图如图1所示。
以上所述的蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,定性鉴别31种乙酰多巴胺化合物的信息如下:
实施例2方法学考察
1、稳定性试验
取上述实施例1的蝉蜕样品粉末(s1)约5.0g,按实施例1方法制备供试品溶液,按照实施例1的色谱和质谱条件,分别在0、2、4、8、12和24h进样测定21种化学成分峰面积,并计算其相对标准偏差(RSD%),RSD<3.68%。
2、重复性试验
取蝉蜕样品粉末(S1)约5.0g,平行称定6份,分别按照实施例1的色谱和质谱条件下制备供试品溶液,按照实施例1的色谱和质谱条件进样测定,测定21种化学成分峰面积,并计算其相对标准偏差(RSD%),RSD<3.12%。
本发明提供的定性检测方法能同时定性检测蝉蜕中31种蝉蜕中乙酰多巴胺化合物。并且本发明提供的蝉蜕的质量控制方法,精密度、灵敏度、稳定性,分析效率高,可以客观、全面、准确地评价蝉蜕药材的质量,对准确控制蝉蜕药材及其制剂的质量具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)供试品溶液的制备
精密称取蝉蜕药材,加入8倍量的乙醇,超声提取2次,每次30分钟,过滤,合并二次提取的滤液,减压浓缩,续滤液过0.22μm滤膜,得供试品溶液;
(2)定性分析检测
取步骤(1)的蝉蜕供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行定性分析,鉴定出31种乙酰多巴胺;其中乙酰多巴胺二聚体4种,乙酰多巴胺三聚体11种,乙酰多巴胺四聚体10种,乙酰多巴胺五聚体6种。
2.根据权利要求1所述的蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,其特征在于,
步骤(2)色谱条件为:仪器为Waters ACQUITY UPLC,二极管矩阵检测器;自动进样器;ACQUITY HSS C18 column;流动相为0.1%冰醋酸-水为流动相A相和乙腈为流动相B相;流速0.5mL/min;柱温35℃;进样量1L;洗脱梯度为:0-5min,10-55%B;5-7min,55-95%B。
质谱条件为:电喷雾离子源;离子范围m/z50~2000;碰撞气为氦气;辅助气体和屏蔽气体为氮气;喷雾电压:3.0kV;离子源温度500.0℃;辅助气和喷雾气压40.0psi;裂解电压:40V;MS碰撞能:6eV;MS/MS碰撞能:20-60V,采用MassLynx软件,版本4.1,Waters,美国,得到化合物的保留时间、母离子、碎片离子信息。
3.根据权利要求1所述的蝉蜕中乙酰多巴胺的定性检测方法,其特征在于,定性鉴别31种乙酰多巴胺化合物的信息如下:
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