CN117169391B - 一种蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法和应用，属于中药材检测技术领域。待检测样品溶液使用液相色谱‑高分辨质谱联用仪检测，获得总离子流图，在特定质荷比范围内提取离子图；若在总离子流图中同时提取到m/z=395.699（双电荷）、m/z=559.380（单电荷）和m/z=720.824（双电荷）的特征离子，则判断为蝉蜕；若在总离子流图中同时提取到m/z=1021.871（三电荷）、m/ z=803.878（四电荷）和m/z=887.932（双电荷）的特征离子，则判断为蟪蛄蜕。本发明蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法实现了对蝉蜕和蟪蛄蜕的准确定性鉴别，鉴别方法高效，成本低，重现性好，可用于蝉蜕的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于中药材检测技术领域，具体涉及一种蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法和应用。
背景技术
评价中药质量，首先是对中药进行真伪判别，其次才是优劣的评定，真伪是前提，是首要条件。目前中药质量控制在真伪鉴别方面普遍存在缺陷，中药材质量标准在起草过程中，一般收集多批不同产地样品，根据多批样品在多个指标项目如性状、显微、水分、薄层、浸出物、指纹图谱和含量测定等项目的检测结果，然后直接拟定一个新标准，而往往不会对其易混淆样品进行比对研究，导致起草的质量标准往往没有专属性，部分中药标准只能依靠补充检验方法去补漏洞，造成大量带有先天缺陷的中药标准的出现。例如阿胶的质量标准因为缺乏专属性，然后不断去开发牛皮、马皮、猪皮、骆驼皮、象皮、骡皮等的补充检验方法，造成大量实验资源的浪费，每年都要耗费不菲的研究及检验经费，而且相关的补充检验方法研究是无穷尽，这些检验方法的公布，不但在世人面前使中药的声誉大受负面影响，也大大增加检验成本，关键是无法从根本上解决中药掺伪问题。故中药质量标准在起草过程中还应对其主要易混淆品进行研究，确保所起草标准的定性检验项目能够具有很高的专属性，应确保相关检验项目能够鉴别正品也能区别易混淆品，而不像目前中药标准收载的鉴别项目缺乏专属性，故应重视中药专属性的鉴别方法研究。
蝉蜕为蝉科昆虫黑蚱Cryptotympana pustulataFabricius的若虫羽化时脱落的皮壳。夏、秋二季收集，除去泥沙，晒干。其主要成分为甲壳质，蛋白质，有机酸，酚类，黄酮类，甾体类及多种微量元素等。市场上主要易混淆品为蟪蛄蜕，其为蝉科昆虫蟪蛄Platypleura kaempferi的若虫羽化时脱落的皮壳。本品与蝉蜕的主要区别：体型较瘦小，长1.5～2cm，宽0.8～1.2cm，而且两者具有相似的化学成分和临床应用，但蟪蛄蜕为伪品，蝉蜕是正品。2020年版《中国药典》中蝉蜕的标准中除性状外，没有任何检测项目，易混淆品蟪蛄蜕除个头稍小之外，其他方面同蝉蜕基本相同，如果药材破碎以后，或者作为提取物制成单味中药配方颗粒，或制成中成药则无法进行有效鉴别。部分研究采用液相-质谱联用检测蝉蜕特征离子，采用电喷雾正离子（ESI+）模式，在低分辨质谱条件下，选择质荷比（m/z）530.8（z=2）→632.3和m/z530.8(z=2）→761.4作为检测特征离子对，通过判断检测特征离子对的有无进行蝉蜕鉴别，经验证该特征离子对在蟪蛄蜕中同样存在，故现有的研究方法无法从根本上区分蟪蛄蜕和蝉蜕，现有的蝉蜕标准及鉴定研究方面存在严重不足。
发明内容
针对现有技术中无法从根本上区分蟪蛄蜕和蝉蜕的问题，本发明提供了一种蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法和应用，检测效率高、定性准确的同时鉴别蝉蜕与蟪蛄蜕。
本发明通过以下技术方案实现：
一种蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法，包括以下步骤：
（1）待检测样品溶液使用液相色谱-高分辨质谱联用仪检测，获得总离子流图；
（2）步骤（1）获得的总离子流图在特定质荷比范围内提取离子图；
若在总离子流图中同时提取到m/z=395.699（双电荷）、m/z=559.380（单电荷）和m/ z=720.824（双电荷）的特征离子，则判断待检测样品为蝉蜕；若在总离子流图中同时提取到m/z=1021.871（三电荷）、m/z=803.878（四电荷）和m/z=887.932（双电荷）的特征离子，则判断待检测样品为蟪蛄蜕；特征离子的质荷比误差在±0.005以内。
进一步地，步骤（1）中待检测样品溶液的制备方法为：将待检测样品粉末10mg，加4ml水105℃处理4h，取出放冷，取0.8ml加入0.8ml 1% 碳酸氢铵溶液，加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃酶解30min，然后105℃处理5min，13000rpm离心5min，取上清液，即为待检测样品溶液。
进一步地，所述的胰蛋白酶溶液的浓度为10mg/ml。
进一步地，液相色谱条件为：Thermo Hypersil GOLD C18 色谱柱，100mm×2.1mm，3μm；柱温30℃；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱；进样量为2μl，流速0.3ml/min；高分辨质谱条件为：QE-Plus高分辨质谱仪，电喷雾离子源，以正离子模式进行采集，喷雾电压为3.2kV，离子传输毛细管温度为350℃，S-Lens传输效率设置为50%，采集范围为350～2000Th，鞘气流速35L/min，辅助气流速15L/min，辅助气加热温度300℃。
进一步地，所述的梯度洗脱的条件为：0～3 min，3％B；3～10min，3％B～9％B；10～32min，9％B～18％B；32～98min，18％B～32％B；98～104min，32％B～90％B；104～105min，90％B～100％B；105～111min，100％B；111～112min，100％B～3％B；112～120min，3％B。
本发明中，上述所述的蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法在控制蝉蜕质量中的应用。
现有技术中，一般的液相、气相或低分辨质谱的鉴别方法都需要对照物质，但很多中药有关的对照物质不易获取，导致对照物质价格高昂，部分每支几千元到上万元。本发明采用高分辨质谱不需要对照物质，可以充分利用高分辨质谱的优势，采用本发明蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法，不需要价格不菲的对照物质，仅需要对采集的总离子流图提取特征离子，利用特征离子的有无进行定性判断。
本发明试验过程中共收集了蝉蜕10个批次，蟪蛄蜕5个批次，采用本发明蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法，均可保证蝉蜕待检测样品溶液在总离子流图中同时提取到m/z=395.699（双电荷）、m/z=559.380（单电荷）和m/z=720.824（双电荷）的特征离子，蟪蛄蜕待检测样品溶液在总离子流图中同时提取到m/z=1021.871（三电荷）、m/z=803.878（四电荷）和m/z=887.932（双电荷）的特征离子；为保证试验结果的准确性，各特征离子质荷比控制在±0.005以内，超出该范围，视为未检出，判定不是正品。待检测样品溶液中三个特征离子应同时检出，缺少任何特征离子，则判定不是正品。
为了进一步验证结果的准确性，对市场上常用的一些动物类药材进行了验证，包括蜈蚣、全蝎、水蛭、猪蹄甲、僵蚕、地龙、土元、干蟾、九香虫、龟甲、鸡内金、壁钱、燕窝、鹿茸、鹿角胶、鳖甲、乌梢蛇、蕲蛇、炒僵蚕、醋鸡内金、阿胶21种动物药材制成混合动物药材阴性样品溶液，结果仅检出m/z=887.932（双电荷）一个特征离子，没有同时检出蝉蜕或蟪蛄蜕中的三个特征离子，说明该混合动物样品不含蝉蜕或蟪蛄蜕，结果准确。
本发明取得的有益效果为：
本发明采用液相色谱-高分辨质谱联用的方法，获得总离子流图，并在总离子流图中提取特征离子，分别通过三个特征离子检测实现了对蝉蜕和蟪蛄蜕的准确定性鉴别，蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法高效，成本低，重现性好，可用于蝉蜕的质量控制；
本发明通过特征离子的精准质荷比进行定性，对整个色谱条件要求很低，更换不同厂家色谱柱对实验结果无影响，在中国药典规定的范围内对液相色谱条件进行适当调整也不影响检测结果，因为该检验结果不依赖色谱保留时间和分离度，而依靠被测物质的精准分子量即待检测的特征离子进行定性。
附图说明
图1为蝉蜕的总离子流图及提取的6个特征离子图；
图2为蟪蛄蜕的总离子流图及提取的6个特征离子图；
图3为混合动物药材阳性样品总离子流图及提取的6个特征离子图；
图4为混合动物药材阴性样品总离子流图及提取的6个特征离子图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
仪器与试药
仪器：Thermo Ultimate 3000 和QE-Plus液相色谱-高分辨质谱联用仪， MettlerToledo XSE205电子天平；
试药：蝉蜕10个批次均为市售样品，蟪蛄蜕5个批次均为不同产地采集；甲酸、乙腈为色谱纯。
实施例1
（1）取待检测样品蝉蜕粉末10mg，加4ml水105℃处理4h，取出放冷，取0.8ml加入0.8ml 1% 碳酸氢铵溶液，加入10μl胰蛋白酶（10mg/ml），37℃酶解30min，然后105℃处理5min，13000rpm离心5min，取上清液，作为待检测样品溶液；
（2）步骤（1）中待检测样品溶液使用液相色谱-高分辨质谱联用仪检测，获得总离子流图；
（3）步骤（2）获得的总离子流图在特定质荷比范围内提取离子图；
液相色谱-高分辨质谱联用仪的检测条件：
液相色谱条件为：Thermo Hypersil GOLD C18 色谱柱，100mm×2.1mm，3μm；柱温30℃；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱：0～3 min，3％B；3～10min，3％B～9％B；10～32min，9％B～18％B；32～98min，18％B～32％B；98～104min，32％B～90％B；104～105min，90％B～100％B；105～111min，100％B；111～112min，100％B～3％B；112～120min，3％B；进样量为2μl，流速0.3ml/min；
高分辨质谱条件为：QE-Plus高分辨质谱仪，电喷雾离子源，以正离子模式进行采集，喷雾电压为3.2kV，离子传输毛细管温度为350℃，S-Lens传输效率设置为50%，采集范围为350～2000Th，鞘气流速35L/min，辅助气流速15L/min，辅助气加热温度300℃。
按照上述条件检测的蝉蜕的总离子流图及提取的6个特征离子图如图1所示，由图1可知，从蝉蜕的总离子流图中可以提取到m/z=395.699（双电荷）、m/z=559.380（单电荷）和m/z=720.824（双电荷）的特征离子，而无法提取到m/z=1021.871（三电荷）、m/z=803.878（四电荷）和m/z=887.932（双电荷）的特征离子，对10个批次的蝉蜕进行检测，结果相同，各特征离子质荷比控制在±0.005以内。
实施例2
实施例2中待检测样品为蟪蛄蜕，其余检测方法和色谱条件与实施例1相同，蟪蛄蜕的总离子流图及提取的6个特征离子图如图2所示，由图2可知，从蟪蛄蜕的总离子流图中可以提取到m/z=1021.871（三电荷）、m/z=803.878（四电荷）和m/z=887.932（双电荷）的特征离子，而无法提取到m/z=395.699（双电荷）、m/z=559.380（单电荷）和m/z=720.824（双电荷）的特征离子，对5个批次的蟪蛄蜕进行检测，结果相同，各特征离子质荷比控制在±0.005以内。
实施例3
（1）混合动物药材阳性样品溶液的制备：取蜈蚣、全蝎、水蛭、猪蹄甲、僵蚕、地龙、土元、干蟾、九香虫、龟甲、鸡内金、壁钱、燕窝、鹿茸、鹿角胶、鳖甲、乌梢蛇、蕲蛇、炒僵蚕、醋鸡内金、阿胶、蝉蜕和蟪蛄蜕23种动物药材粉末各10mg，按照实施例1待检测样品溶液的制备方法，制得混合动物药材阳性样品溶液；
（2）混合动物药材阴性样品溶液的制备：取蜈蚣、全蝎、水蛭、猪蹄甲、僵蚕、地龙、土元、干蟾、九香虫、龟甲、鸡内金、壁钱、燕窝、鹿茸、鹿角胶、鳖甲、乌梢蛇、蕲蛇、炒僵蚕、醋鸡内金和阿胶21种动物药材粉末（缺蝉蜕、蟪蛄蜕）各10mg，按照实施例1待检测样品溶液的制备方法，制得混合动物药材阴性样品溶液；
（3）分别对混合动物药材阳性样品溶液和混合动物药材阴性样品溶液使用液相色谱-高分辨质谱联用仪检测，获得总离子流图；
（4）步骤（3）获得的总离子流图在特定质荷比范围内提取离子图；
按照实施例1色谱条件，混合动物药材阴性样品总离子流图及提取的6个特征离子图如图3所示，混合动物药材阴性样品总离子流图及提取的6个特征离子图如图4所示，由图3和图4可知，23种混合动物药材阳性样品（包括蜈蚣、全蝎、水蛭、猪蹄甲、僵蚕、地龙、土元、干蟾、九香虫、龟甲、鸡内金、壁钱、燕窝、鹿茸、鹿角胶、鳖甲、乌梢蛇、蕲蛇、炒僵蚕、醋鸡内金、阿胶、蝉蜕和蟪蛄蜕等）能从总离子流图中同时提取到蝉蜕的m/z=395.699（双电荷）、m/ z=559.380（单电荷）和m/z=720.824（双电荷）的3个特征离子，也能从总离子流图中同时提取到蟪蛄蜕的m/z=1021.871（三电荷）、m/z=803.878（四电荷）和m/z=887.932（双电荷）的3个特征离子；而混合动物药材阴性样品（含蜈蚣、全蝎、水蛭、猪蹄甲、僵蚕、地龙、土元、干蟾、九香虫、龟甲、鸡内金、壁钱、燕窝、鹿茸、鹿角胶、鳖甲、乌梢蛇、蕲蛇、炒僵蚕、醋鸡内金和阿胶，不含蝉蜕和蟪蛄蜕）从总离子流图中仅能够提取到m/z=887.932（双电荷）的特征离子。
因此，本发明提供的蟪蛄蜕和蝉蜕的鉴别方法能够准确定性蝉蜕和蟪蛄蜕，实现准确鉴别，应用于控制蝉蜕的质量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）待检测样品溶液使用液相色谱-高分辨质谱联用仪检测，获得总离子流图；
（2）步骤（1）获得的总离子流图在特定质荷比范围内提取离子图；
若在总离子流图中同时提取到m/z=395.699双电荷、m/z=559.380单电荷和m/z=720.824双电荷的特征离子，则判断待检测样品为蝉蜕；若在总离子流图中同时提取到m/z=1021.871三电荷、m/z=803.878四电荷和m/z=887.932双电荷的特征离子，则判断待检测样品为蟪蛄蜕；特征离子的质荷比误差在±0.005以内；
步骤（1）中待检测样品溶液的制备方法为：将待检测样品粉末10mg，加4ml水105℃处理4h，取出放冷，取0.8ml加入0.8ml 1% 碳酸氢铵溶液，加入10μl胰蛋白酶溶液，37℃酶解30min，然后105℃处理5min，13000rpm离心5min，取上清液，即为待检测样品溶液；
液相色谱条件为：Thermo Hypersil GOLD C18 色谱柱，100mm×2.1mm，3μm；柱温30℃；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱；进样量为2μl，流速0.3ml/min；高分辨质谱条件为：QE-Plus高分辨质谱仪，电喷雾离子源，以正离子模式进行采集，喷雾电压为3.2kV，离子传输毛细管温度为350℃，S-Lens传输效率设置为50%，采集范围为350～2000Th，鞘气流速35L/min，辅助气流速15L/min，辅助气加热温度300℃。
2.根据权利要求1所述的蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶溶液的浓度为10mg/ml。
3.根据权利要求1所述的蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法，其特征在于，所述的梯度洗脱的条件为：0～3 min，3％B；3～10min，3％B～9％B；10～32min，9％B～18％B；32～98min，18％B～32％B；98～104min，32％B～90％B；104～105min，90％B～100％B；105～111min，100％B；111～112min，100％B～3％B；112～120min，3％B。
4.一种权利要求1~3任一项所述的蟪蛄蜕与蝉蜕的鉴别方法在控制蝉蜕质量中的应用。
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