CN116407564A - 一种蝉蜕加工方法及其蝉蜕质量检测方法 - Google Patents

一种蝉蜕加工方法及其蝉蜕质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蝉蜕生产方法，所述方法包括如下步骤：(1)取活的蝉的若虫用水清洗；(2)将水洗后的蝉的若虫重新放回树上羽化，羽化后分出蜕壳，收集蜕壳，干燥后即得蝉蜕。本发明通过大量实验筛选出新的蝉蜕生产方法并用UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS方法对蝉蜕品质进行评价，结果表明蜕壳前水洗既能减少有效成分乙酰多巴胺聚体类的含量损失，又能降低总灰分和酸不溶性灰分以达到去除泥沙的目的。

Description

一种蝉蜕加工方法及其蝉蜕质量检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药材的加工方法，特别涉及一种蝉蜕加工方法及其蝉蜕质量检测方法。
背景介绍
蝉蜕为蚱蝉属黑蚱Cryptotympana atrata的若虫羽化时脱落的皮壳，是重要的药用资源，药材性状：略呈椭圆形而弯曲，长约3.5cm，宽约2cm。表面黄棕色，半透明，有光泽。【性味归经】甘，寒。归肺、肝经。【功能主治】散风除热，利咽，透疹，退翳，解痉。用于风热感冒，咽痛，音哑，麻疹不透，风疹瘙痒，目赤翳障，惊风抽搐，破伤风。
蝉隶属于昆虫纲半翅目蝉科蚱蝉属，为不完全变态昆虫，生长经历卵、若虫、成虫三个阶段。
野生蝉的自然生长周期长，一般3～5年才能完成一代。为满足市场需求，蝉的人工养殖兴起。蝉的人工养殖即在选定的养殖林地进行培育，通过人工干预蝉卵的孵化，缩短蝉的生长周期，提高养殖效率，从而增加产量。
故蝉蜕的获得途径有两种，一种是由野生若虫蜕壳后采收得到，另一种是由人工养殖的若虫蜕壳后采收获得。
目前，现有技术中蝉蜕的加工方法为，从树干上采集蝉蜕，采集后去净泥土、杂质，晒干后包装置干燥处，防止压碎和潮湿。
2020版《中国药典》规定，蝉蜕采收后要除去泥沙。通常采取的方法是将若虫蜕壳后采收的蝉蜕进行水洗，这种方法虽然能达到除去泥沙的目的，但与此同时有效成分损失严重，同时蝉蜕易碎，影响品质。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种高品质蝉蜕的加工方法，在除去泥沙的同时，可减少有效成分的损失，保证质量，提高蝉蜕药用价值。本发明另外一个目的是提供蝉蜕的质量检测方法。
技术方案：为实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种蝉蜕生产方法，包括如下步骤：
(1)取活的蝉的若虫用水清洗；
(2)将水洗后的蝉的若虫重新放回树上羽化，羽化后分出蜕壳，收集蜕壳，干燥后即得蝉蜕。
优选的，本发明的蝉蜕生产方法，还包括蝉的若虫捕捉步骤，捕捉方法如下：在人工养殖蝉的林地中，先在树干80～150cm处缠一圈2-10cm宽的塑料胶带，当蝉的若虫爬到塑料胶带下面的树干时，捕捉；其中，捕捉时间可在每年的6月中下旬至8月中旬，优选晚上6点至12点捕捉，优选雨后捕捉。
优选的，本发明的蝉蜕生产方法，其中步骤(1)中所述用水清洗，包括将捕捉的蝉的若虫放入盛有清水的容器中，用清水轻轻荡洗多次，每次将含有泥沙的水倒掉后更换新水直至水澄清。
优选的，本发明的蝉蜕生产方法，步骤(2)中将水洗后的蝉的若虫重新放回树上，若虫沿树干爬行一段后静伏不动，开始羽化。羽化过程历时约90～150分钟。待若虫蜕壳完毕后收集蝉蜕。其中所述干燥是将蝉蜕置于通风干燥处自然晾干。
本发明的方法中，蝉的若虫是野生的或人工养殖的，优选人工养殖的。
有关名称术语定义如下：
蝉的若虫：蝉从卵中孵化出来至蜕变为成虫之间的这一生长阶段的黑蚱蝉。
树：蝉的寄生树种，包括柳树、榆树、苹果树、梨树等。
羽化：蝉由幼虫蜕变为成虫的过程。
蜕壳：蝉的若虫蜕变为成虫的过程中留下外壳变为成虫。
水洗：用清水洗涤。
蜕壳后的蝉的若虫去向：留在树上静待翅膀变干燥后自行飞走，或置于水中暂存，可食用。
本发明的方法是经过筛选得到的，筛选过程如下：
试验分组：
第一组：本发明方法生成的蝉蜕(R-SXT)：捕捉人工养殖的若虫，在其蜕壳前进行水洗，蜕壳后进行收集；
第二组：人工若虫未水洗的蝉蜕(R-WSX)：若虫蜕壳前后均未水洗；
第三组：野生若虫蜕壳后水洗的蝉蜕(Y-TSX)：将蜕壳后收集的蝉蜕，用清水反复荡洗直至水澄清；
第四组：野生若虫未水洗的蝉蜕(Y-WSX)：野生若虫蜕壳后收集的蝉蜕，整个过程均未水洗。
对以上四组不同方法生成的蝉蜕进行有效成份含量检测，以及灰分含量检测，检测结果表明采用本发明方法，即人工养殖的蝉的若虫蜕壳前水洗，既能减少蝉蜕药材中有效成分乙酰多巴胺多聚体的含量损失，又能显著降低总灰分的含量和酸不溶性灰分的含量。具体检测结果以及统计分析见实施例2。
为检测本发明蝉蜕产品的质量，本发明进一步研究出一种新的检测方法，所述方法采用液质联用法，目的是检测蝉蜕产品中的乙酰多巴胺多聚体类成份的含量。
本发明的检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：称取蝉蜕粉末，加入甲醇置于具塞试管中，称定重量，超声提取，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，提取物离心，取上清，用甲醇稀释并定容，即得；
(2)混合对照品溶液的制备：精密称定乙酰多巴胺二聚体A和B的对照品，加甲醇分别制备成对照品储备液A和B；再各取适量对照品储备液A和B混合，加甲醇补足定容，制备得到混合对照品溶液；
(3)分别取步骤(1)的供试品溶液和步骤(2)的混合对照品溶液注入UPLC-Q-TOF-MS/MS进样分析，记录峰面积，通过乙酰多巴胺A绝对定量的结果对各样品蝉蜕中总的二聚体、二聚体侧链异构体、三聚体、三聚体侧链异构体、四聚体、五聚体进行半定量，计算公式如下：A1/A0＝C1/C0；
其中A1是乙酰基多巴胺二聚体A的峰面积，A0是分析物的峰面积，C1是乙酰基多巴胺二聚体A的浓度，C0是分析物的浓度。
作为优选方案，优选的本发明的检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)供试品溶液的制备：称取蝉蜕粉末1g，加入10mL 80％甲醇置于具塞试管中，称定重量，400W，25kHz超声提取1h，再次称定重量，用80％甲醇补足减失重量，提取物置13000rpm离心10min，取上清1mL，用80％甲醇稀释并定容至10mL，即得。
步骤(2)对照品溶液的制备：精密称定乙酰多巴胺二聚体A和B的对照品各1mg，加1mL甲醇分别制备成1mg/mL的对照品储备液A和B；再各取200μL对照品储备液A和B，加甲醇补足至1mL，制备成浓度为200μg/mL的混合对照品储备液A和B，最后逐级稀释至10μg/mL，即得混合对照品溶液。
步骤(3)的UPLC-Q-TOF-MS/MS的色谱条件为：采用Waters ACQUITY UPLC SYSTEM分析蝉蜕中的小分子成分；二极管矩阵检测器；自动进样器；色谱柱：ACQUITY HSS C18column，规格为100mm×2.1mm,Φ＝1.8μm；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液-B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-10min，15-50％B；10-10.5min，50-95％B；10.5-12.5min，95％B；流速0.4mL/min；柱温40℃；进样量2μL；
质谱条件：采用Synapt G2-S Q-TOF Mass Spectrometer系统，获得化合物的质谱信息，电喷雾离子源；正离子扫描模式；质量扫描范围m/z 50-1500；毛细管电压3000V，锥孔电压40V；离子源温度120℃；脱溶剂化温度450℃；脱溶剂气流速800L/h；锥孔气流速50L/h；MS碰撞能：6eV；MS/MS碰撞能：30-60V；采用MassLynx软件分析。
采用本发明的检测方法可同时鉴定出蝉蜕中的39个乙酰多巴胺聚体类化合物，其中4个二聚体；1个二聚体侧链异构体；8个三聚体；7个三聚体侧链异构体；10个四聚体；9个五聚体。可有效的对蝉蜕的品质进行评价。
本发明通过大量实验筛选，提出一种新的蝉蜕加工方法，即若虫蜕壳前先进行水洗，通过捕捉、水洗、蜕壳、干燥等步骤加工得到。并采用本发明专用的检测方法对本发明生产的蝉蜕进行检测，取得了良好的技术效果。
附图说明
图1为人工若虫蜕壳前水洗(R-SXT)在正离子模式下的BPI图。
图2为人工若虫未水洗的蝉蜕(R-WSX)在正离子模式下的BPI图。
图3为野生若虫蜕壳后水洗的蝉蜕(Y-TSX)在正离子模式下的BPI图。
图4为野生若虫未水洗的蝉蜕(Y-WSX)在正离子模式下的BPI图。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例1
一种蝉蜕加工方法，包括如下步骤：
(1)捕捉
6月中下旬至8月中旬是捕捉蝉的适宜时间。雨后是若虫出土的高峰期。在人工养殖蝉的林地中，先在树干100～130cm处缠一圈约5cm宽的塑料胶带，以使若虫出土后不会爬得太高，便于捕捉。再利用手电筒照明，于晚上6点至12点在树干上觅捉。捕捉下来的若虫直接放入盛有清水的容器中。
(2)水洗
用清水轻轻荡洗多次，每次将含有泥沙的水倒掉后更换新水直至水澄清。
(3)蜕壳
将水洗后的蝉的若虫重新放回树上，若虫沿树干爬行一段后静伏不动，开始羽化，羽化过程历时约90～150分钟。待若虫蜕壳完毕后收集蝉蜕。
(4)干燥
将蝉蜕置于通风干燥处自然晾干。
实施例2不同处理方式得到的蝉蜕质量评价
1、小分子成分分析及含量测定
将蝉蜕样品设为四组，分别是人工若虫蜕壳前水洗的蝉蜕(R-SXT)：捕捉人工养殖的若虫，在其蜕壳前进行水洗，蜕壳后进行收集；人工若虫未水洗的蝉蜕(R-WSX)：若虫蜕壳前后均未水洗；野生若虫蜕壳后水洗的蝉蜕(Y-TSX)：将蜕壳后收集的蝉蜕，用清水反复荡洗直至水澄清；野生若虫未水洗的蝉蜕(Y-WSX)：野生若虫蜕壳后收集的蝉蜕，整个过程均未水洗。
样品准备：四组样品置于室温下的通风阴凉处自然干燥一周，粉碎，过三号筛，备用。
采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对蝉蜕中小分子成分进行表征和含量测定。
供试品溶液的制备：称取蝉蜕粉末1g，加入10mL 80％甲醇置于具塞试管中，称定重量，超声(400W，25kHz)提取1h，再次称定重量，用80％甲醇补足减失重量，提取物离心(13000rpm，10min)，取上清1mL，用80％甲醇稀释并定容至10mL，即得。
对照品溶液的制备：精密称定乙酰多巴胺二聚体A和B的对照品各1mg，加1mL甲醇分别制备成1mg/mL的对照品储备液A和B。再各取200μL对照品储备液，加甲醇补足至1mL，制备成浓度为200μg/mL的混合对照品储备液，最后逐级稀释至10μg/mL即得混合对照品溶液。
色谱条件：采用Waters ACQUITY UPLC SYSTEM分析蝉蜕中的小分子成分。二极管矩阵检测器；自动进样器；色谱柱：ACQUITY HSS C18 column(100mm×2.1mm,Φ＝1.8μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸乙腈溶液(B)；洗脱梯度：0-10min，15-50％B；10-10.5min，50-95％B；10.5-12.5min，95％B；流速0.4mL/min；柱温40℃；进样量2μL；
质谱条件：采用Synapt G2-S Q-TOF Mass Spectrometer系统(Waters MSTechnologies,英国)获得化合物的质谱信息。电喷雾离子源；正离子扫描模式；质量扫描范围m/z 50-1500；毛细管电压3000V，锥孔电压40V；离子源温度120℃；脱溶剂化温度450℃；脱溶剂气流速800L/h；锥孔气流速50L/h；MS碰撞能：6eV；MS/MS碰撞能：30-60V；采用MassLynx软件(版本4.1,Waters,美国)分析。
取上述供试品溶液，按以上色谱、质谱条件进样分析，记录峰面积，通过乙酰多巴胺A绝对定量的结果对各样品蝉蜕中总的二聚体、二聚体侧链异构体、三聚体、三聚体侧链异构体、四聚体、五聚体进行半定量，计算公式如下：A1/A0＝C1/C0
其中A1是乙酰基多巴胺二聚体A的峰面积，A0是分析物的峰面积，C1是乙酰基多巴胺二聚体A的浓度，C0是分析物的浓度。
2、总灰分及酸不溶性灰分的测定
总灰分及酸不溶性灰分的测定参照2020版《中国药典》四部通则“2302灰分测定法”项下所述，具体如下：
2.2.1总灰分测定法
将人工若虫蜕壳前水洗(R-SXT)的蝉蜕，人工若虫未水洗的蝉蜕(R-WSX)，野生若虫蜕壳后水洗的蝉蜕(Y-TSX)，野生若虫未水洗的蝉蜕(Y-WSX)四组供试品粉碎，使能通过二号筛，混合均匀。取四组供试品3g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，缓缓炽热至完全炭化时，逐渐升高温度至500～600℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量(％)。
2.2.2酸不溶性灰分测定法
取上项所得的灰分，在坩埚中小心加入稀盐酸约10mL，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10min，表面皿用热水5mL冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移置同一坩埚中，干燥，炽灼至恒重。根据残渣重量，计算供试品中酸不溶性灰分的含量(％)。
3、实验结果
3.1.外观描述
人工若虫蜕壳前水洗的蝉蜕呈褐色，外观较洁净。
3.2小分子成分分析及含量测定
根据图1～图4的四种蝉蜕样品的基峰离子流(BPI)图，共鉴定出39个乙酰多巴胺聚体类化合物，其中4个二聚体；1个二聚体侧链异构体；8个三聚体；7个三聚体侧链异构体；10个四聚体；9个五聚体。四种蝉蜕样品在乙酰多巴胺聚体类成分组成上基本一致。各化合物保留时间、分子量、分子式、碎片离子等详细信息见表1。
表1蝉蜕小分子化合物成分鉴定
Figure BDA0003453033140000071
Figure BDA0003453033140000081
Figure BDA0003453033140000091
Figure BDA0003453033140000101
根据表2的检测结果表明：总乙酰多巴胺聚体类含量在人工若虫水洗后蜕壳的蝉蜕样品中为7.68mg/g，在人工若虫未水洗蝉蜕样品中为6.26mg/g，在野生若虫蜕壳后水洗蝉蜕样品中为5.06mg/g，在野生若虫未水洗蝉蜕样品中为6.08mg/g。其中，人工若虫未水洗(R-WSX)和野生若虫未水洗的蝉蜕(Y-WSX)中总乙酰多巴胺聚体类成分含量和各乙酰多巴胺聚体类总量均无显著性差异，说明二者品质相当。若虫蜕壳后水洗(Y-TSX)和蜕壳前水洗(R-SXT)相比，总乙酰多巴胺聚体类含量显著减少(*p<0.05)，推测由于蜕壳前水洗使泥沙等含量减少，乙酰多巴胺聚体类成分含量相对提高，且蜕壳前水洗只洗了蝉蜕外表面，成分流失程度较小。野生蝉蜕蜕壳后水洗样品与野生蝉蜕未水洗样品相比，总乙酰多巴胺聚体类含量显著减少(**p<0.01)，表明蜕壳后水洗使乙酰多巴胺聚体类成分损失过多，故若虫蜕壳前水洗是一种减少蝉蜕有效成分损失、保证蝉蜕品质的可靠方法。见表2。
表2蝉蜕样品中各乙酰多巴胺聚体总量(
Figure BDA0003453033140000102
n＝3)
Figure BDA0003453033140000103
Figure BDA0003453033140000111
注：与Y-TSX相比，***：p<0.001，**：p<0.01，*：p<0.05；与R-SXT相比，#：p<0.05。3.3总灰分及酸不溶性灰分的测定结果
若虫蜕壳前水洗或蜕壳后水洗泥沙均减少，总灰分和酸不溶性灰分与未水洗蝉蜕样品相比含量均降低。人工若虫水洗后蜕壳蝉蜕样品(R-SXT)与人工若虫未水洗蝉蜕样品(R-WSX)相比，总灰分及酸不溶性灰分含量均显著降低(**p<0.01)；野生若虫蜕壳后水洗蝉蜕样品(Y-TSX)与野生若虫未水洗蝉蜕样品(Y-WSX)相比，总灰分和酸不溶性灰分成分含量也显著降低(**p<0.01，*p<0.05)。故蜕壳前水洗可有效减少泥沙含量，提升蝉蜕品质。见表3。
表3蝉蜕总灰分及酸不溶性灰分测定(
Figure BDA0003453033140000112
n＝3)
组别 总灰分/％ 酸不溶性灰分/％
R-SXT 23.37±1.36 19.69±1.27
R-WSX 31.04±1.70** 26.18±1.61**
Y-TSX 22.95±1.44 19.55±1.23
Y-WSX 30.01±2.17** 25.52±2.17*
注：与R-SXT相比，**：p<0.01；与Y-TSX相比，*：p<0.05。
以上实验结果表明，本发明提供的蝉蜕加工方法，即若虫蜕壳前水洗，通过捕捉、水洗、蜕壳、干燥等加工得到，并对加工后的蝉蜕品质进行UPLC-Q-TOF-MS/MS评价，发现蜕壳前水洗既能减少有效成分乙酰多巴胺聚体类的含量损失，又能显著降低总灰分和酸不溶性灰分以达到去除泥沙的目的，表明此方法能够提升蝉蜕的品质，保证蝉蜕质量，是一种简便可靠、值得推广的加工方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种蝉蜕生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取活的蝉的若虫用水清洗；
(2)将水洗后的蝉的若虫重新放回树上羽化，羽化后分出蜕壳，收集蜕壳，干燥后即得蝉蜕。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括蝉的若虫捕捉步骤，捕捉方法如下：
在人工养殖蝉的林地中，先在树干80～150cm处缠一圈2-10cm宽的塑料胶带，当蝉的若虫爬到塑料胶带下面的树干时，捕捉；其中，捕捉时间可在每年的6月中下旬至8月中旬，优选晚上6点至12点捕捉，优选雨后捕捉。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤(1)中所述用水清洗，包括将捕捉的蝉的若虫放入盛有清水的容器中，用清水轻轻荡洗多次，每次将含有泥沙的水倒掉后更换新水直至水澄清。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤(2)中将水洗后的蝉的若虫重新放回树上，若虫沿树干爬行一段后静伏不动，开始羽化；羽化过程历时约90～150分钟；待若虫蜕壳完毕后收集蝉蜕；其中所述干燥是将蝉蜕置于通风干燥处自然晾干。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，蝉的若虫是野生的或人工养殖的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，蝉的若虫是人工养殖的。
7.一种蝉蜕的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：称取蝉蜕粉末，加入甲醇置于具塞试管中，称定重量，超声提取，再次称定重量，用甲醇补足减失重量，提取物离心，取上清，用甲醇稀释并定容，即得；
(2)混合对照品溶液的制备：精密称定乙酰多巴胺二聚体A和B的对照品，加甲醇分别制备成对照品储备液A和B；再各取适量对照品储备液A和B混合，加甲醇补足定容，制备得到混合对照品溶液；
(3)分别取步骤(1)的供试品溶液和步骤(2)的混合对照品溶液注入UPLC-Q-TOF-MS/MS进样分析，记录峰面积，通过乙酰多巴胺A绝对定量的结果对各样品蝉蜕中总的二聚体、二聚体侧链异构体、三聚体、三聚体侧链异构体、四聚体、五聚体进行半定量，计算公式如下：A1/A0＝C1/C0；
其中A1是乙酰基多巴胺二聚体A的峰面积，A0是分析物的峰面积，C1是乙酰基多巴胺二聚体A的浓度，C0是分析物的浓度。
8.根据权利要求7所述的蝉蜕的质量检测方法，其特征在于，步骤如下：
步骤(1)供试品溶液的制备：称取蝉蜕粉末1g，加入10mL 80％甲醇置于具塞试管中，称定重量，400W，25kHz超声提取1h，再次称定重量，用80％甲醇补足减失重量，提取物置13000rpm离心10min，取上清1mL，用80％甲醇稀释并定容至10mL，即得；
步骤(2)对照品溶液的制备：精密称定乙酰多巴胺二聚体A和B的对照品各1mg，加1mL甲醇分别制备成1mg/mL的对照品储备液A和B；再各取200μL对照品储备液A和B，加甲醇补足至1mL，制备成浓度为200μg/mL的混合对照品储备液A和B，最后逐级稀释至10μg/mL，即得混合对照品溶液；
步骤(3)的UPLC-Q-TOF-MS/MS的色谱条件为：采用Waters ACQUITY UPLC SYSTEM分析蝉蜕中的小分子成分；二极管矩阵检测器；自动进样器；色谱柱：ACQUITY HSS C18 column，规格为100mm×2.1mm,Φ＝1.8μm；流动相：A相为0.1％甲酸水溶液-B相为0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-10min，15-50％B；10-10.5min，50-95％B；10.5-12.5min，95％B；流速0.4mL/min；柱温40℃；进样量2μL；
质谱条件：采用Synapt G2-S Q-TOF Mass Spectrometer系统，获得化合物的质谱信息，电喷雾离子源；正离子扫描模式；质量扫描范围m/z 50-1500；毛细管电压3000V，锥孔电压40V；离子源温度120℃；脱溶剂化温度450℃；脱溶剂气流速800L/h；锥孔气流速50L/h；MS碰撞能：6eV；MS/MS碰撞能：30-60V；采用MassLynx软件分析。
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