CN104181251A - 一种hplc检测胱氨酸中酪氨酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种PHLC检测胱氨酸中酪氨酸含量的方法。所述的方法选用InertSustainC18，4.6×250mm，5μm色谱柱，流动相中水相—乙腈比例为90-97:10-3，水相用高氯酸调节pH值为2.0，流速：1.0mL/min，柱温：25-35℃，检测波长：225-235nm，进样体积：10-50μL。所述的方法具体操作步骤如下：1、配制酪氨酸对照品溶液；2、配制胱氨酸样品溶液；3、设置流动相流速为1.0mL/min，检测波长为225-235nm，柱温为25-35℃；4、分别取步骤1或步骤2配制好的溶液10-50μL，分别注入高效液相色谱仪中，进行色谱分析，并记录色谱图。本发明所述的方法能简便、快速、准确地分析胱氨酸中酪氨酸的含量，更好地控制胱氨酸的质量。
Description
技术领域
本发明涉及到分析化学领域，特别涉及到一种HPLC检测胱氨酸中酪氨酸含量的方法。
背景技术
L-胱氨酸具有促进人体细胞氧化还原、改善肝功能、促进白细胞增生、与毒物结合而起解毒等重要药理作用。临床上主要用于治疗慢性肝炎、膀胱炎、白细胞减少、各种秃发、放射性损伤及药物中毒。也是生产L-半胱氨酸的原料，L-胱氨酸经电解还原制成的半胱氨酸为重要的护肝解毒药， 能参与机体细胞的还原过程，调节人体肝脏内的磷脂代谢，保护已受损的肝实质细胞，促进肝脏生理功能旺盛，预防肝坏死。以L-半胱氨酸衍生的一系列药物，在临床上已得到了广泛的应用。在食品工业L-胱氨酸用于营养补强剂及奶粉的母乳化。电解L-胱氨酸制成的半胱氨酸可作为面包、天然果汁等软饮料的添加剂，肉食品和玉米食品加工用添加剂等。
此外，L-胱氨酸在化妆品、生化及营养学研究等领域也具有广泛的用途。随着科学技术的进步和应用研究的进展, 其应用范围必将越来越广,L-胱氨酸的分析结构如下：
L-胱氨酸
L-胱氨酸的制备过程中，由于酪氨酸与胱氨酸的理化性质接近，胱氨酸和酪氨酸不易分开，因此需要严格控制胱氨酸中酪氨酸的含量，酪氨酸的结构式为：
酪氨酸
目前中国药典、美国药典、欧洲药典中关于胱氨酸中酪氨酸含量的检测方法均为薄层色谱法，该方法检测灵敏度低，微量的酪氨酸很难检出。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HPLC检测胱氨酸中酪氨酸含量的方法，从而保证胱氨酸的纯度，实现胱氨酸产品的质量控制。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种HPLC检测胱氨酸中酪氨酸含量的方法，所述的方法选用InertSustain C18 ，4.6×250mm，5μm色谱柱，流动相中水相—乙腈比例为90-97:10-3，水相用高氯酸调节pH值为2.0，流速：1.0mL/min，柱温：25-35℃，检测波长：225-235nm，进样体积：10-50μL。
所述的方法具体操作步骤如下：
1、配制酪氨酸对照品溶液：取酪氨酸对照品25mg放入25mL的量瓶中，加入浓度为0.5mol/L的盐酸溶液，超声波处理使25mg酪氨酸对照品完全溶解并定容至25mL刻度，摇匀，取0.5mL所配制的酪氨酸对照品盐酸溶液加入到50mL量瓶中，用浓度为0.1mol/L盐酸溶液稀释至50mL刻度，摇匀，配制成10μg /mL的酪氨酸对照品溶液；
2、配制胱氨酸样品溶液：取25-50mg胱氨酸样品放入25mL量瓶中，加入浓度为0.5mol/L盐酸溶液5mL，超声波处理使胱氨酸样品完全溶解，再用浓度为0.1mol/L的盐酸溶液稀释至25mL刻度，摇匀，配制成1-2mg/mL的胱氨酸样品溶液；
3、设置流动相流速为1.0mL/min，检测波长为225-235nm，柱温为25-35℃；
4、分别取步骤1或步骤2配制好的溶液10-50μL，分别注入高效液相色谱仪中，进行色谱分析，并记录色谱图。
本发明的积极效果为：
1、本发明采用新型的ODS/C18键合新型硅胶色谱柱（InertSustain C18，4.6×250mm，5μm），能够有效分离胱氨酸中酪氨酸，准确测定胱氨酸中酪氨酸含量；
2、本发明所述的方法能简便、快速、准确地分析胱氨酸中酪氨酸的含量，更好的控制胱氨酸的质量；
3、本发明的检测方法灵敏度到，相对检测限可以达到0.001%，理论板数在2000以上。
附图说明
图1：水相与乙腈的比例为95:5，柱温为25℃，酪氨酸对照品溶液的HPLC图；
图2：水相与乙腈的比例为95:5，柱温为25℃，胱氨酸样品溶液的HPLC图；
图3：水相与乙腈的比例为90:10，柱温为30℃，酪氨酸对照品溶液的HPLC图；
图4：水相与乙腈的比例为90:10，柱温为30℃，胱氨酸样品溶液的HPLC图；
图5：水相与乙腈的比例为97:3，柱温为35℃，酪氨酸对照品溶液的HPLC图；
图6：水相与乙腈的比例为97:3，柱温为35℃，胱氨酸样品溶液的HPLC图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例一：
1、仪器与条件
高效液相色谱仪：美国戴安UltiMate 3000高效液相色谱系统及工作站
色谱柱：InertSustain C18 ，4.6×250mm，5μm
流动相：水溶液（用高氯酸调节pH值为2.0）-乙腈（95:5）
流速：1.0mL/min 柱温：25℃
检测波长：225nm
进样体积：10μL
2、实验步骤
（1）配制酪氨酸对照品溶液：取25mg酪氨酸对照品加入25mL量瓶中，加浓度为0.5mol/L的盐酸溶液,超声波处理使25mg酪氨酸对照品完全溶解并定容至25mL刻度，摇匀，取0.5mL所配制的酪氨酸对照品盐酸溶液加入到50mL量瓶中，用浓度为0.1mol/L的盐酸溶液稀释至50mL刻度，摇匀，配制成10μL/mL的酪氨酸对照品溶液。
（2）配制胱氨酸样溶液：取25mg胱氨酸样品加入25mL量瓶中，加入浓度为0.5mol/L盐酸溶液5mL超声波处理使25mg胱氨酸溶解，再用浓度为0.1mol/L的盐酸溶液稀释至25mL刻度，摇匀，配制成 1mg/mL的胱氨酸样品溶液。
（3）分别取酪氨酸对照品溶液和供试品溶液10μL，分别按上述1所述的条件和仪器进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
结果见附图1和2，图1为酪氨酸对照品溶液色谱图，图中10.640处为酪氨酸，图2为供试品溶液色谱图，图中10.673处为胱氨酸中残留酪氨酸色谱峰，经计算胱氨酸中酪氨酸的含量为0.086%。
实施例二：
1、仪器与条件
高效液相色谱仪：美国戴安UltiMate 3000高效液相色谱系统及工作站
色谱柱：InertSustain C18 ，4.6×250mm，5μm
流动相：水溶液（用高氯酸调节pH值为2.0）-乙腈（90:10）
流速：1.0mL/min 柱温：30℃
检测波长：230nm
进样体积：30μL
2、实验步骤
（1）配制酪氨酸对照品溶液：取25mg酪氨酸对照品加入25mL量瓶中，加浓度为0.5mol/L的盐酸溶液,超声波处理使25mg酪氨酸对照品完全溶解并定容至25mL刻度，摇匀，取所配制的酪氨酸对照品盐酸溶液0.5mL加入到50mL量瓶中，用浓度为0.1mol/L盐酸溶液稀释至50mL刻度，摇匀，配制成10ug/mL的酪氨酸对照品溶液。
（2）配制胱氨酸样品溶液：取40mg胱氨酸样品加入25mL量瓶中，加入浓度为0.5mol/L盐酸溶液5ml,超声波处理使40mg胱氨酸样品完全溶解，再用浓度为0.1mol/L的盐酸溶液稀释至25mL刻度，摇匀，配制成1.6mg/mL的胱氨酸样品溶液。
（3）分别取酪氨酸对照品溶液和供试品溶液30μL，分别上述1所述的条件和仪器进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
结果见附图3和4，图3为酪氨酸对照品溶液色谱图，图中10.367处为酪氨酸，图4为供试品溶液色谱图，图中10.293处为胱氨酸中残留酪氨酸色谱峰，经计算胱氨酸中酪氨酸的含量为0.041%。
实施例三：
1、仪器与条件
高效液相色谱仪：美国戴安UltiMate 3000高效液相色谱系统及工作站
色谱柱：InertSustain C18 ，4.6×250mm，5μm
流动相：水溶液（用高氯酸调节pH值为2.0）-乙腈（97:3）
流速：1.0mL/min 柱温：35℃
检测波长：235nm
进样体积：50μL
2、实验步骤
（1）配制酪氨酸对照品溶液：取25mg酪氨酸对照品加入25mL量瓶中，加浓度为0.5mol/L盐酸溶液,超声波处理使25mg酪氨酸对照品完全溶解并定容至25mL刻度，摇匀，取0.5mL所配制的酪氨酸对照品盐酸溶液加入到50mL量瓶中，用浓度为0.1mol/L盐酸溶液稀释至50mL刻度，摇匀，配制成10ug/mL的酪氨酸对照品溶液。
（2）配制胱氨酸样品溶液：取50mg胱氨酸样品加入25mL量瓶中，加浓度为0.5mol/L盐酸溶液5mL,超声波处理使50mg胱氨酸样品完全溶解，再用浓度为0.1mol/L盐酸溶液稀释至25mL刻度，摇匀，配制成2mg/mL的胱氨酸样品溶液。
（3）分别取酪氨酸对照品溶液和供试品溶液50μL，分别按上述1所述的条件和仪器进行高效液相色谱分析，记录色谱图。
结果见附图5和6，图5为酪氨酸对照品溶液色谱图，图中11.553处为酪氨酸，图6为供试品溶液色谱图，图中11.640处为胱氨酸中残留酪氨酸色谱峰，经计算胱氨酸中酪氨酸的含量为0.083%。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种HPLC检测胱氨酸中酪氨酸含量的方法，其特征在于：所述的方法选用InertSustain C18 ，4.6×250mm，5μm色谱柱，流动相中水相—乙腈比例为90-97:10-3，水相用高氯酸调节pH值为2.0，流速：1.0ml/min，柱温：25-35℃，检测波长：225-235nm，进样体积：10-50μl。
2.根据权利要求1所述的HPLC检测胱氨酸中酪氨酸含量的方法，其特征在于：所述的方法具体操作步骤如下：
（1）配制酪氨酸对照品溶液：取酪氨酸对照品25mg放入25mL的量瓶中，加入浓度为0.5mol/L的盐酸溶液，超声波处理使25mg酪氨酸对照品完全溶解并定容至25mL刻度，摇匀，取0.5mL所配制的酪氨酸对照品盐酸溶液加入到50mL量瓶中，用浓度为0.1mol/L盐酸溶液稀释至50mL刻度，摇匀，配制成10mg/mL的酪氨酸对照品溶液；
（2）配制胱氨酸样品溶液：取25-50mg胱氨酸样品放入25mL量瓶中，加入浓度为0.5mol/L盐酸溶液5mL，超声波处理使胱氨酸样品完全溶解，再用浓度为0.1mol/L的盐酸溶液稀释至25mL刻度，摇匀，配制成1-2mg/mL的胱氨酸样品溶液；
（3）设置流动相流速为1.0mL/min，检测波长为225-235nm，柱温为25-35℃；
（4）分别取步骤（1）或步骤（2）配制好的溶液10-50μL，分别注入高效液相色谱仪中，进行色谱分析，并记录色谱图。
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