CN1865988A - 检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法 - Google Patents

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Abstract

检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法，涉及中药制剂的质量控制方法，具体是建立指纹图谱以检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法。方法为：(a)参照品溶液的制备(b)供试品溶液的制备(c)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为pH 4.50～5.05的0.05～0.10mol/L醋酸钠缓冲液与20～80％的乙腈水溶液组成的梯度洗脱液；柱温：30～50℃；荧光检测：激发波长为250nm，发射波长为395nm流速：0.5～1.5mL·min－1；时间：30～80min；(d)测定：高效液相色谱法得指纹图谱。本方法能有效表征夏桑菊制剂的质量，有利于监控产品质量；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。

Description

检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法
                        技术领域
本发明涉及中药制剂的质量控制方法，具体地说是采用高效液相色谱法建立指纹图谱以检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的一种方法。
                       背景技术
夏桑菊制剂是国家批准上市的公知产品，它由中药材夏枯草、桑叶、野菊花为原料制成，具有清肝明目、疏风散热、除湿痹、解疮毒的功能，用于风热感冒、目赤头痛、高血压、头晕耳鸣、咽喉肿痛、疗疮肿毒等症。夏桑菊制剂在中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十五册已有收载，是深受欢迎的中药制剂，现已有夏桑菊无糖颗粒剂，夏桑菊口服液，夏桑菊饮料等剂型上市，用公开的夏桑菊制剂处分，一般技术人员很容易用常规的技术制备其它的制剂如胶囊剂、片剂、合剂等。
国家和企业对夏桑菊颗粒的质量控制主要采用薄层色谱法鉴别是否有主药夏枯草的熊果酸的成分；
杨冬梅等在文献“夏桑菊冲剂的质量标准研究”安徽医药，2001，5(3)：218报道了用分光光度法测定夏桑菊制剂中总黄酮的含量；
马稳等在杂志“分析科学学报”2004，20(3)：284公开了用高效液相色谱紫外可见检测夏桑菊中熊果酸的分析方法；黄淑彰在文献“现代中药研究与实践”2004，18(3)：33报道了采用HPLC法测定了夏桑菊颗粒中熊果酸的含量；熊国营等在文献“江西中医学院学报”2004，16(6)：48)中报道了用HPLC法测定颗粒中所含活性成分绿原酸的含量方法。
以上均是针对个别成分进行鉴别或含量测定的方法，难以全面表征复方夏桑菊制剂的物理化学特征，因此，对复方夏桑菊制剂的质量控制方法有待进一步完善。
                         发明内容
本发明的目的是提供一种有效控制夏桑菊制剂质量的检测方法，主要是建立指纹图谱来检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法。
为达到本发明的目的所采用的技术方案：用高效液相色谱法建立指纹图谱，检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法，具体方法包括如下步骤：
(a)参照品溶液的制备：
取天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸17种标准品用纯水配成浓度均为100μmol·L-1的混合氨基酸对照品溶液，取混合氨基酸对照品溶液20μL放入干燥管中，加入160μL硼酸缓冲液，混和并加入20μL 1％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，混和15min，样品管封口，放于60℃烘箱中加热10分钟，冷却，作为参照品溶液。
(b)供试品溶液的制备：精密称取夏桑菊固体制剂0.1～10g或夏桑菊液体制剂0.01～10mL，置1～50mL容量瓶中，加水溶解，并加水至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取过滤液10～100μL放入干燥管中，加入80～500μL硼酸缓冲液，混和并加入10～100μL体积浓度为0.1～5％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯乙腈溶液，混和10～30秒钟，样品管封口，于45～90℃烘箱中加热30～5分钟后放冷，即得供试品溶液；
(c)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为pH为4.50～5.05的0.05～0.10mol/L醋酸钠缓冲液(流动相A)与20～80％的乙腈水溶液(流动相B)组成的梯度洗脱液；柱温：30～50℃；荧光检测：激发波长为250nm，发射波长为395nm；流速：0.5～1.5mL·min-1；时间：30～80min；
(d)测定：精密吸取供试品溶液5～25μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
本发明可优选如下方法检测：(b)供试品溶液的制备：精密称取夏桑菊有糖颗粒剂1.6g或夏桑菊饮料60μL置5mL容量瓶，加水溶解至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取20uL滤液至干燥管中，加入160uL硼酸缓冲液，混和并加入20uL体积浓度为1％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，混和15秒钟，样品管封口，于60℃烘箱中加热10分钟后放冷，即得；
(c)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为pH是5.05的0.05mol/L醋酸钠缓冲液(A相)与60％乙腈组成的梯度洗脱液(B相)；柱温：37℃；流速1.0mL.min-1；分析时间：50min；
在步骤(c)中，所述的梯度洗脱，优选梯度洗脱程序以如下体积浓度配制进行：
0分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液
0.5分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液；
1分钟时，流动相A为99％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为1％的60％乙腈溶液；
10分钟时，流动相A为99％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为1％的60％乙腈溶液；
19分钟时，流动相A为93％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为7％的60％乙腈溶液；
25分钟时，流动相A为90％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为10％的60％乙腈溶液；
38分钟时，流动相A为67％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为33％的60％乙腈溶液；
39分钟时，流动相A为67％的0.05％醋酸钠缓冲液、流动相B为33％的60％乙腈溶液；
40分钟时，流动相A为0％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为100％的60％乙腈溶液；
45分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液；
50分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液。
具体见下表：
流动相 时间   流量mL.min-1   A醋酸钠缓冲液mL   B乙腈溶液mL
  1   0   1   100   0
  2   0.5   1   100   0
  34   110   11   9999   11
  5   19   1   93   7
  6   25   1   90   10
  7   38   1   67   33
  8   39   1   67   33
  9   40   1   0   100
  10   45   1   100   0
  11   50   1   100   0
按照本发明方法测定广州星群(药业)股份有限公司生产的夏桑菊颗粒剂中氨基酸类成分建立的指纹图谱，指纹图谱中主要有有12个特征共有峰。其中4个为人体必需氨基酸，分别为9号峰缬氨酸(Val)、10号峰异亮氨酸(Ile)、11号峰亮氨酸(Leu)、12号峰苯丙氨酸(Phe)，具体如下：
1号峰为天门冬氨酸，平均保留时间RT为19.54min，RSD为0.25％，
2号峰为丝氨酸，平均保留时间RT为20.45min，RSD为0.25％，
3号峰，平均保留时间RT为23.37min，RSD为0.16％，
4号峰，平均保留时间RT为25.61min，RSD为0.17％，
5号峰，平均保留时间RT为26.36min，RSD为0.27％，
6号峰，平均保留时间RT为30.19min，RSD为0.24％，
7号峰为脯氨酸，平均保留时间RT为30.60min，RSD为0.14％，
8号峰，平均保留时间RT为31.69min，RSD为0.14％，
9号峰为缬氨酸，平均保留时间RT为35.35min，RSD为0.13％，
10号峰为异亮氨酸，平均保留时间RT为38.84min，RSD为0.12％，
11号峰为亮氨酸，平均保留时间RT为39.56min，RSD为0.12％，
12号峰为苯丙氨酸，平均保留时间RT为40.08min，RSD为0.12％。
RT为42min以后出现的峰为溶剂峰。
用本发明所提供的方法可测定夏桑菊制剂中氨基酸类成分，所说的制剂包括固体制剂和液体制剂如含糖颗粒剂，无糖颗粒剂、片剂，胶囊剂，饮料，合剂、口服液等。用本方法测定广州星群(药业)股份有限公司所生产的夏桑菊含糖颗粒剂、无糖颗粒剂、片剂、胶囊剂、饮料、口服液等制剂均能得到相同、相近似的指纹图谱。
不同厂商生产的夏桑菊制剂由于原材料的不同，生产工艺不完全相同，用本发明所提供的方法所建立的指纹图谱的特征峰可能不同。
本发明的有益效果如下：
(1)以夏桑菊制剂中氨基酸类组分为指标建立起来的HPLC指纹图谱，能有效地表征夏桑菊制剂的质量，有利于全面监控产品的质量；
(2)本发明显示夏桑菊制剂中含有人体必需氨基酸4个，缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)，并含有其他人体所需的氨基酸，体现了夏桑菊具有“养阴扶正以降火”的功效；
(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点；
(4)该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所列举的实施例及附图对本发明并没有限制，如在使用不同的检测仪器时或所采用的被测样品不同采用本发明的方法所获得的测定结果(指纹图谱)，可能有所不同。
                       附图说明
图1夏桑菊颗粒剂氨基酸类成分的HPLC对照指纹图谱
图2夏桑菊颗粒剂氨基酸类成分的10批次成品指纹图谱(原始图谱)
图3夏桑菊颗粒剂氨基酸类成分的10批次成品指纹图谱(匹配后图谱)
图4夏桑菊颗粒剂氨基酸类成分的HPLC指纹图谱(共有模式)
                         具体实施方式
实施例1检测夏桑菊含糖颗粒剂中氨基酸类成分的指纹图谱
1.仪器与试药
1.1仪器  Waters2695高效液相色谱仪，Waters 2475(荧光检测器)，Empower色谱工作站。瑞士梅特勒公司AE-200型电子分析天平。
1.2试剂  衍生剂：6-氨基酸喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(缩写AQC)、氨基酸对照品：AminoAcid stadard H(Waters公司)；乙腈(色谱纯)、二次重蒸水、醋酸钠(分析纯)、三乙胺(分析纯)
2、高效液相色谱
2.1色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：pH＝5.05的醋酸钠缓冲液-乙腈(梯度洗脱)，柱温：37℃，荧光检测：激发波长(Ex)为250nm，发射波长(Em)为395nm，流速：1.0mL，分析时间：50min；进样量：供试品溶液与参照品溶液各20μL。理论塔板数按脯氨酸计算应不低于5000。梯度洗脱程序如下表：
流动相 时间   流量mL.min-1   A醋酸钠缓冲液mL   B乙腈溶液mL
  12   00.5   11   100100   00
  3   1   1   99   1
  4   10   1   99   1
  5   19   1   93   7
  6   25   1   90   10
  7   38   1   67   33
  8   39   1   67   33
  9   40   1   0   100
  10   45   1   100   0
  11   50   1   100   0
2.2参照品溶液的制备：
2.2.1稀释氨基酸对照品制备：采用Waters公司含17种水解氨基酸的标样[天门冬氨酸(Asp)，丝氨酸(Ser)，谷氨酸(Glu)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，精氨酸(Arg)，苏氨酸(Thr)，丙氨酸(Ala)，脯氨酸(Pro)，半胱氨酸(Cys)，酪氨酸(Tyr)，缬氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)，赖氨酸(Lys)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，苯丙氨酸(Phe)]，每种氨基酸(除Cys2以外)的浓度均为2.5mmol·L-1，取40μL氨基酸标样置于清洁的自动进样瓶中，加入960μL纯水，混匀，备用。此标样含胱氨酸50μmoL·L-1(等价于100umol·L-1半胱氨酸)，含其它各种氨基酸均为100μmol·L-1。
2.2.2参照品溶液的制备  取稀释氨基酸对照品溶液20μL放入衍生管中(干燥)，加入160μL硼酸缓冲液，涡旋混和并加入20μL1％的AQC乙腈溶液，涡旋混和15min，样品管用石腊膜封口，放于60℃烘箱中加热10分钟，冷却，作为参照品溶液。
2.3供试品溶液的制备：精密称取夏桑菊颗粒(含糖)1.6g，置5mL容量瓶中加水摇匀，用超微孔滤膜过滤，备用。取20μL放入衍生管中(干燥)，加入160μL硼酸缓冲液，涡旋混和并加入20μL1％的AQC乙腈溶液，涡旋混和15min。样品管用石腊膜封口，放于60℃烘箱中加热10分钟，冷却，即得夏桑菊颗粒样品的供试液，备用。平行2份。
2.4测定：精密吸取供试品溶液与参照物、对照品溶液各20μL注入相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，如图1所示。
实施例2  检测10批次夏桑菊含糖颗粒剂中氨基酸类成分的指纹图谱
取夏桑菊颗粒10批次，按实施例1条件进行检测，得10批样品的氨基酸HPLC图谱，如图2所示，通过10批HPLC图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰：
指纹图谱中有12个特征共有峰，现将图谱的保留时间、峰面积的平均值以及RSD值汇总，具体如下：
1号峰为天门冬氨酸，平均保留时间RT为19.54min，RSD为0.05％，峰面积为785808，RSD为25.04％，占总峰面积的1.58％。
2号峰为丝氨酸，平均保留时间RT为20.45min，RSD为0.05％，峰面积为721818，RSD为33.86％，占总峰面积的1.46％。
3号峰，平均保留时间RT为23.37min，RSD为0.06％，峰面积为3275018，RSD为47.31％，占总峰面积的5.18％。
4号峰，平均保留时间RT为25.61min，RSD为0.07％，峰面积为4522600，RSD为23.58％，占总峰面积的10.07％。
5号峰，平均保留时间RT为26.36min，RSD为0.07％，峰面积为5918528，RSD为7.48％，占总峰面积的11.98％。
6号峰，平均保留时间RT为30.19min，RSD为0.04％，峰面积为7870364，RSD为5.43％，占总峰面积的15.53％。
7号峰为脯氨酸，平均保留时间RT为30.60min，RSD为0.04％，峰面积为13526273，RSD为5.91％，占总峰面积的26.78％。
8号峰，平均保留时间RT为31.69min，RSD为0.04％，峰面积为7788927，RSD为6.09％，占总峰面积的15.41％。
9号峰为缬氨酸，平均保留时间RT为35.35min，RSD为0.03％，峰面积为734037，RSD为14.75％，占总峰面积的1.39％。
10号峰为异亮氨酸，平均保留时间RT为38.84min，RSD为0.02％，峰面积为539246，RSD为18.32％，占总峰面积的0.94％。
11号峰为亮氨酸，平均保留时间RT为39.56min，RSD为0.02％，峰面积为467307，RSD为13.58％，占总峰面积的0.81％。
12号峰为苯丙氨酸，平均保留时间RT为40.08min，RSD为0.02％，峰面积为250546，RSD为30.37％，占总峰面积的0.38％。
RT为42min以后出现的峰为溶剂峰。
图谱中，夏桑菊颗粒氨基酸类成分有12个特征共有峰，其中单峰面积超总峰面积1％的峰有9个，分别是1号峰(天门冬氨酸)、2号峰(丝氨酸)、3号峰，4号峰、5号峰、6号峰、7号峰(脯氨酸)、8号峰、9号峰(缬氨酸)；
其中单峰面积超总峰面积5％的峰有6个，分别是3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰(脯氨酸)、8号峰；
其中单峰面积超总峰面积10％的峰有5个，分别是4号峰、5号峰、6号峰、7号峰(脯氨酸)、8号峰。
相似度评价：采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)对HPLC图谱进行综合评价，相似度评价结果见表2，经匹配后的图谱与共有模式见图3、图4。
            表2  氨基酸HPLC指纹图谱相似度评价
  相似度(参照)   1.000   0.989   0.991   0.996   0.967   0.981   0.996   0.992   0.985   1.000
  相似度(对照)   0.997   0.995   0.989   0.995   0.980   0.993   0.993   0.997   0.994   0.997
供试品指纹图谱与共有模式图谱经计算机辅助相似度评价软件计算，相似度大于0.90。
实施例3  广州星群夏桑菊含糖颗粒氨基酸类成分指纹图谱的测定方法
(b)供试品溶液的制备：精密称取广州星群(药业)股份有限公司生产的夏桑菊颗粒1.0g，置10mL容量瓶，加水溶解至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取10uL滤液至衍生管中，加入170uL硼酸缓冲液，和加入20uL浓度为0.5％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，涡旋混和15秒钟，样品管封口，放于50℃烘箱中加热20分钟后放冷，即得。
(c)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为pH是5.05的0.05mol/L醋酸钠缓冲液(A相)与60％乙腈组成的梯度洗脱液(B相)；梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液；0.5分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液；1分钟时，流动相A为99％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为1％的60％乙腈溶液；10分钟时，流动相A为99％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为1％的60％乙腈溶液；19分钟时，流动相A为93％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为7％的60％乙腈溶液；25分钟时，流动相A为90％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为10％的60％乙腈溶液；38分钟时，流动相A为67％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为33％的60％乙腈溶液；39分钟时，流动相A为67％的0.05％醋酸钠缓冲液、流动相B为33％的60％乙腈溶液；40分钟时，流动相A为0％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为100％的60％乙腈溶液；45分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液；50分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液；柱温：37℃；流速1.0mL.min-1；分析时间：50min。
(d)测定：精密吸取供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；
实施例4  广州星群夏桑菊含糖颗粒氨基酸类成分指纹图谱的测定方法
(b)供试品溶液的制备：精密称取广州星群(药业)股份有限公司生产的夏桑菊颗粒3.0g，置5mL容量瓶，加水溶解至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取20uL滤液至衍生管中，加入160uL硼酸缓冲液，和加入20uL浓度为4％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，涡旋混和15秒钟，样品管封口，放于70℃烘箱中加热5分钟后放冷，即得。
其它同实施例3操作。
实施例5  广州星群夏桑菊含糖颗粒氨基酸类成分指纹图谱的测定方法
(b)夏桑菊颗粒溶液的制备：精密称取广州星群(药业)股份有限公司生产的夏桑菊颗粒1.6g，置5mL容量瓶，加水溶解至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取20uL滤液至衍生管中，加入160uL硼酸缓冲液，和加入20uL浓度为1％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，涡旋混和15秒钟，样品管封口，放于60℃烘箱中加热10分钟后放冷，即得。
其它同实施例3操作。
实施例6、夏桑菊饮料氨基酸类成分指纹图谱的测定方法
供试品溶液的制备：精密称取广州星群(药业)股份有限公司生产的夏桑菊饮料60uL，置5mL容量瓶，加水溶解至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取20uL滤液至衍生管中，加入160uL硼酸缓冲液，和加入20uL浓度为4％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，涡旋混和15秒钟，样品管封口，放于70℃烘箱中加热5分钟后放冷，即得。
其它同实施例3操作。
实施例7、夏桑菊口服液氨基酸类成分指纹图谱的测定方法
供试品溶液的制备：精密称取广州星群(药业)股份有限公司生产的夏桑菊口服液30uL，置25mL容量瓶，加水溶解至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取20uL滤液至衍生管中，加入160uL硼酸缓冲液，和加入20uL浓度为4％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，涡旋混和15秒钟，样品管封口，放于70℃烘箱中加热5分钟后放冷，即得。
其它同实施例3操作。

Claims (4)

1.一种检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法，其特征在于采用高效液相色谱法建立指纹图谱，具体包括如下步骤：
(a)参照品溶液的制备：
取天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸17种标准品用纯水配成浓度均为100μmol·L-1的混合氨基酸对照品溶液，取混合氨基酸对照品溶液20μL放入干燥管中，加入160μL硼酸缓冲液，混和并加入20μL1％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，混和15min，样品管封口，放于60℃烘箱中加热10分钟，冷却，作为参照品溶液。
(b)供试品溶液的制备：精密称取夏桑菊固体制剂0.1～10g或夏桑菊液体制剂0.01～10mL置1～50mL容量瓶中，加水溶解，并加水至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取过滤液10～100μL放入干燥管中，加入80～500μL硼酸缓冲液，混和并加入10～100μL体积浓度为0.1～5％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，混和10～30秒钟，样品管封口，于45～90℃烘箱中加热30～5分钟后放冷，即得供试品溶液；
(c)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相是pH为4.50～5.05的0.05～0.10mol/L醋酸钠缓冲液与20～80％的乙腈水溶液组成的梯度洗脱液；柱温：30～50℃；荧光检测：激发波长为250nm，发射波长为395nm；流速：0.5～1.5m L·min-1；时间：30～80min；
(d)测定：精密吸取供试品溶液5～25μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2、如权利要求1所述的检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法，其特证在于：所述步骤(b)供试品溶液的制备：精密称取夏桑菊有糖颗粒1.6g或夏桑菊饮料60μL置5mL容量瓶，加水溶解至刻度，摇匀，用超微孔滤膜过滤，取20μL滤液至干燥管中，加入160μL硼酸缓冲液，混和并加入20μL体积浓度为1％的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基-氨基甲酸酯的乙腈溶液，混和15秒钟，样品管封口，放于60℃烘箱中加热10分钟后放冷，即得；(c)色谱条件中流动相为pH是5.05的0.05mol/L醋酸钠缓冲液与60％乙腈组成的梯度洗脱液，柱温：37℃；流速1.0mL.min-1；分析时间：50min。
3、如权利要求2所述的检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法，其特证在于：所述步骤(c)色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配制进行：
0分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液
0.5分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液；
1分钟时，流动相A为99％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为1％的60％乙腈溶液；
10分钟时，流动相A为99％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为1％的60％乙腈溶液；
19分钟时，流动相A为93％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为7％的60％乙腈溶液；
25分钟时，流动相A为90％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为10％的60％乙腈溶液；
38分钟时，流动相A为67％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为33％的60％乙腈溶液；
39分钟时，流动相A为67％的0.05％醋酸钠缓冲液、流动相B为33％的60％乙腈溶液；
40分钟时，流动相A为0％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为100％的60％乙腈溶液；
45分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液；
50分钟时，流动相A为100％的0.05mol/L醋酸钠缓冲液、流动相B为0％的60％乙腈溶液。
4、如权利要求2和3所述的检测夏桑菊制剂中氨基酸类成分的方法，其特证在于其所建立的指纹图谱中主要有12个特征共有峰，具体如下：
1号峰为天门冬氨酸，平均保留时间RT为19.54min，RSD为0.25％，
2号峰为丝氨酸，平均保留时间RT为20.45min，RSD为0.25％，
3号峰，平均保留时间RT为23.37min，RSD为0.16％，
4号峰，平均保留时间RT为25.61min，RSD为0.17％，
5号峰，平均保留时间RT为26.36min，RSD为0.27％，
6号峰，平均保留时间RT为30.19min，RSD为0.24％，
7号峰为脯氨酸，平均保留时间RT为30.60min，RSD为0.14％，
8号峰，平均保留时间RT为31.69min，RSD为0.14％，
9号峰为缬氨酸，平均保留时间RT为35.35min，RSD为0.13％，
10号峰为异亮氨酸，平均保留时间RT为38.84min，RSD为0.12％，
11号峰为亮氨酸，平均保留时间RT为39.56min，RSD为0.12％，
12号峰为苯丙氨酸，平均保留时间RT为40.08min，RSD为0.12％。
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