CN102590428A - 抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的测定方法 - Google Patents

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吴笛
杨冬
罗靖雄
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Abstract

本发明涉及一种抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的测定方法，该方法首先对样品进行预处理，除去了大分子物质，再用异硫氰酸苯酯对甘氨酸进行柱前衍生化处理，配制衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液，然后进行反相高效液相色谱法分析（RP-HPLC）。本发明能准确，快速、简便测定出抗毒素/抗血清中甘氨酸的含量，从而评价制品质量。

Description

抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的测定方法
 
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的测定方法。
背景技术
抗毒素/抗血清（Antitoxin/Antiserum）是指采用特定的抗原免疫动物后，再收集高效价免疫血清，并经过提取、纯化后，制备出含完整抗体（IgG）或抗体片段[F(ab’)2]的免疫球蛋白制品。以用于预防和治疗各相应疾病引起的感染。1890年Behring和Kitasato发现用注射过破伤风毒素的豚鼠或家兔的血清，注射给其它动物后可抵抗破伤风的感染和发病。1891年在德国柏林利用抗血清成功抢救白喉感染的女孩是抗血清用于临床治疗的开始。此后，许多新品种的动物免疫血清陆续问世，20世纪前半叶曾一度出现血清疗法时代，抗血清治疗达到顶峰。
随着历史的发展，抗毒素/抗血清制品范围从早期的单纯治疗细菌外毒素疾病扩展至现在的抗病毒制品，如抗狂犬和天花血清。目前，马免疫球蛋白在难治病种（狂犬、天花，破伤风、肉毒中毒）、含多种致病成分（蛇毒）、防止生物恐怖和病原学研究不清的疾病等方面具有重要作用。随着历史及技术的发展，该制品也从最早的抗血清、抗毒素发展为现在安全性很高的纯化动物（马）特种免疫球蛋白，其活性成分也从血清发展到抗体，进而又发展为免疫球蛋白的F(ab’)2片段，产品的过敏反应显著降低。
由于抗毒素/抗血清纯度的提高，其中蛋白的含量相应降低，抗毒素/抗血清的稳定性有所下降，因此需向其中添加甘氨酸做为稳定剂，以保持抗毒素/抗血清的稳定。目前，国内外报道的氨基酸测定方法主要有高液相色谱法（HPLC），因HPLC具有较高的灵敏度和特异性，操作较简易，仪器设备要求适中，但抗血清/抗毒素中甘氨酸测定的相关方法未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的测定方法，该方法能准确地测定抗毒素/抗血清中甘氨酸含量，并且方法准简便、快速。
本发明通过下列技术方案实现：一种抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的测定方法，包括分别吸取衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，再按常规方法测定甘氨酸和正缬氨酸的峰面积，以内标法计算，即得到抗毒素/抗血清中甘氨酸的含量，其特征在于所述衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液的制备经过下列各步骤：
（1）将内标物用水溶解，制成浓度为3～5mg/mL的内标物溶液；
（2）将对照品甘氨酸用水溶解，制成浓度为20～30mg/mL的对照品贮备液；在1.0mL对照品贮备液中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后至少静置2小时，在3000转/分的转速下离心分离10min，取分离后的上清液0.4mL，用水稀释至10mL，即得到对照品溶液；
（3）取供试品抗毒素、抗血清1.0mL，向其中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后至少静置2小时，在3000转/分的转速下离心分离10min，取分离后的上清液1.0mL，用水稀释至10mL，即得到供试品溶液；
（4）分别取步骤（2）所得对照品溶液和步骤（3）所得供试品溶液各0.4mL，在各溶液中分别加水1.6mL，再分别加步骤（1）所得内标物溶液0.08mL后，涡旋混合15s，再分别加入1.0mL含三乙胺的乙腈溶液，三乙胺的浓度为1mol/L，混匀，接着分别加入1.0mL含异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液，异硫氰酸苯酯（PITC）的浓度为0.1mol/L，涡旋混合30s，室温放置1小时，最后分别加入正己烷4mL，振摇后放置10min，取下层溶液进行过滤，滤液即为衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液。
所述步骤（1）的内标物为α-氨基丁酸或缬氨酸。
所述采用高效液相色谱法的色谱条件为：反相液相色谱柱，以浓度为0.01～0.1mol/L 、pH为6.5的醋酸钠溶液为流动相A，以乙腈︰水的体积比为90︰10～70︰30的乙腈-水溶液为流动相B，用流速为1mL/min的洗脱液进行梯度洗脱，并且采用紫外检测器，检测波长为245～265nm。
所述梯度洗脱的程序见下表：
时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%) 曲线
0~11.00 100→93 0→7 线性
11.00~13.90 93→88 7→12 线性
13.90~14.00 88→85 12→15 线性
14.00~29.00 85→66 15→34 线性
29~29.02 66→0 34→100 瞬时
29.02~37.00 0 100 线性
37.00~37.02 0→100 100→0 瞬时
37.02~45.00 100 0 线性
本发明能对破伤风抗毒素、抗狂犬病血清、抗蛇毒血清等抗毒素/抗血清制品中的甘氨酸含量进行测定。
本发明首先对样品进行预处理，以除去影响高效液体系统的大分子物质，然后通过衍生试验异硫氰酸苯酯（PITC）对甘氨酸进行柱前衍生化处理，进行反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析。
本发明达到的效果：通过高效液相测定抗毒素/抗血清中甘氨酸的含量，由于甘氨酸无紫外吸收基团，因此在测定中采用了PITC柱前衍生化法，样品经酸沉淀后，离心收集上清液，在碱性条件下，异硫氰酸苯酯（PITC）与甘氨酸于室温发生反应，生成有强烈紫外吸收的苯氨基酸硫甲酰衍生物（PTC-AA），用高效液相色谱法测定衍生产物，根据衍生产物的含量计算抗毒素/抗血清中甘氨酸含量，该方法稳定性好，衍生简便、快速。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明，但保护范围不仅限于实施例所述范围。
实施例1
破伤风抗毒素中甘氨酸含量的测定：
仪器：1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站。
2、Mettler AE 240电子天平。
试剂与试药：对照品甘氨酸（中国药品生物制品检定所，批号：140689-200802，含量：100%）；内标物正缬氨酸（Aladdin Chemistry，批号：17094，含量：99%）；异硫氰酸苯酯（DE，批号：A0293365，含量：98%）；三乙胺为色谱纯（TEDIA，批号：407145，含量：99.5%）；正己烷为分析纯；水为超纯水；醋酸钠为分析纯。
经过下列各步骤：
（1）将内标物正缬氨酸用水溶解，制成浓度为3mg/mL的内标物溶液；
（2）将对照品甘氨酸用水溶解，制成浓度为20mg/mL的对照品贮备液；在1.0mL对照品贮备液中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后静置3小时，在3000转/分的转速下离心分离10min；然后取分离后的上清液0.4mL，用水稀释至10mL，即得到对照品溶液；
（3）取供试品破伤风抗毒素1.0mL，向其中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后静置3小时，在3000转/分的转速下离心分离10min；然后取分离后的上清液1.0mL，用水稀释至10mL，即得到供试品溶液；
（4）分别量取步骤（2）所得对照品溶液和步骤（3）所得供试品溶液各0.4mL，在各溶液中分别加水1.6mL，再加步骤（1）所得内标物溶液0.08mL后，涡旋混合15s，再分别加入1.0mL含三乙胺的乙腈溶液，三乙胺的浓度为1mol/L，混匀，接着分别加入1.0mL含异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液，异硫氰酸苯酯（PITC）的浓度为0.1mol/L，涡旋混合30s后，室温放置1小时，最后分别加入正己烷4mL，振摇后放置10min，分别取下层溶液进行过滤，滤液即为衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液；
（5）分别吸取步骤（4）所得衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，高效液相色谱法的色谱条件为：反相液相色谱柱SepaxGp-*C18柱（4.6×250mm，5-Micron），柱温为37℃，以浓度为0.01mol/L、pH为6.5的醋酸钠溶液为流动相A，以乙腈︰水的体积比为90︰10的乙腈-水溶液为流动相B，用流速为1mL/min的洗脱液进行梯度洗脱45min，并且采用紫外检测器，检测波长为245nm，进样量为10μL；再按常规方法测定甘氨酸和正缬氨酸的峰面积，以内标法计算，即得到破伤风抗毒素中甘氨酸的含量为9.8mg/mL，其中梯度洗脱的程序见下表：
时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%) 曲线
0~11.00 100→93 0→7 线性
11.00~13.90 93→88 7→12 线性
13.90~14.00 88→85 12→15 线性
14.00~29.00 85→66 15→34 线性
29~29.02 66→0 34→100 瞬时
29.02~37.00 0 100 线性
37.00~37.02 0→100 100→0 瞬时
37.02~45.00 100 0 线性
实施例2
抗狂犬病血清中甘氨酸含量的测定：
仪器：1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站。
2、Mettler AE 240电子天平。
试剂与试药：甘氨酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：140689-200802，含量：100%）；内标物正缬氨酸（Aladdin Chemistry，批号：17094，含量：99%）；异硫氰酸苯酯（DE，批号：A0293365，含量：98%）；三乙胺为色谱纯（TEDIA，批号：407145，含量：99.5%）；正己烷为分析纯；水为超纯水；醋酸钠为分析纯。
经过下列各步骤：
（1）将内标物正缬氨酸用水溶解，制成浓度为4mg/mL的内标物溶液；
（2）将对照品甘氨酸用水溶解，制成浓度为25mg/mL的对照品贮备液；在1.0mL对照品贮备液中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后静置3小时，在3000转/分的转速下离心分离10min；然后取分离后的上清液0.4mL，用水稀释至10mL，即得到对照品溶液；
（3）取供试品抗狂犬病血清1.0mL，向其中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后静置3小时，在3000转/分的转速下离心分离10min；然后取分离后的上清液1.0mL，用水稀释至10mL，即得到供试品溶液；
（4）分别量取步骤（2）所得对照品溶液和步骤（3）所得供试品溶液各0.4mL，在各溶液中分别加水1.6mL，再加步骤（1）所得内标溶液0.08mL后，涡旋混合15s，再分别加入1.0mL含三乙胺的乙腈溶液，三乙胺的浓度为1mol/L，混匀，接着分别加入1.0mL含异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液，异硫氰酸苯酯（PITC）的浓度为0.1mol/L，涡旋混合30s后，室温放置1小时，最后分别加入正己烷4mL，振摇后放置10min，分别取下层溶液进行过滤，滤液即为衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液；
（5）分别吸取步骤（4）所得衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，高效液相色谱法的色谱条件为：反相液相色谱柱SepaxGp-*C18柱（4.6×250mm，5-Micron），柱温为37℃，以浓度为0.05mol/L的醋酸钠溶液（用醋酸调节pH为6.5）为流动相A，以乙腈︰水的体积比为80︰20的乙腈-水溶液为流动相B，用流速为1mL/min的洗脱液进行梯度洗脱45min，并且采用紫外检测器，检测波长为254nm；进样量为10μL；再按常规方法测定甘氨酸和正缬氨酸的峰面积，以内标法计算，即得到抗狂犬病血清中甘氨酸的含量为10.1mg/mL。
其中，梯度洗脱的程序同实施例1。
实施例3
抗蛇毒血清中甘氨酸含量的测定：
仪器：1、Aglient 1200高效液相色谱仪及ChemStations工作站。
2、Mettler AE 240电子天平。
试剂与试药：甘氨酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：140689-200802，含量：100%）；内标物α-氨基丁酸（SIGMA，A2536，含量：≥99%）；异硫氰酸苯酯（DE，批号：A0293365，含量：98%）；三乙胺为色谱纯（TEDIA，批号：407145，含量：99.5%）；正己烷为分析纯；水为超纯水；醋酸钠为分析纯。
经过下列各步骤：
（1）将内标物α-氨基丁酸用水溶解，制成浓度为5mg/mL的内标物溶液；
（2）将对照品甘氨酸用水溶解，制成浓度为30mg/mL的对照品贮备液；在1.0mL对照品贮备液中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后静置4小时，在3000转/分的转速下离心分离10min；然后取分离后的上清液0.4mL，用水稀释至10mL，即得到对照品溶液；
（3）取供试品抗蛇毒血清1.0mL，向其中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后静置4小时，在3000转/分的转速下离心分离10min；然后取分离后的上清液1.0mL，用水稀释至10mL，即得到供试品溶液；
（4）分别量取步骤（2）所得对照品溶液和步骤（3）所得供试品溶液各0.4mL，在各溶液中分别加水1.6mL、加步骤（1）所得内标物溶液0.08mL后，涡旋混合15s，再分别加入1.0mL含三乙胺的乙腈溶液，三乙胺的浓度为1mol/L，混匀，接着分别加入1.0mL含异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液，异硫氰酸苯酯（PITC）的浓度为0.1mol/L，涡旋混合30s后，室温放置1小时，最后分别加入正己烷4mL，振摇后放置10min，分别取下层溶液进行过滤，滤液即为衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液；
（5）分别吸取步骤（4）所得衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液，采用高效液相色谱法进行测定，高效液相色谱法的色谱条件为：反相液相色谱柱SepaxGp-*C18柱（4.6×250mm，5-Micron），柱温为37℃，以浓度为0.1mol/L的醋酸钠溶液（用醋酸调节pH为6.5）为流动相A，以乙腈︰水的体积比为70︰30的乙腈-水溶液为流动相B，用流速为1mL/min的洗脱液进行梯度洗脱45min，并且采用紫外检测器，检测波长为265nm，进样量为10μL；再按常规方法测定甘氨酸和正缬氨酸的峰面积，以内标法计算，即得到抗蛇毒血清中甘氨酸的含量为10.5mg/mL。
其中，梯度洗脱的程序同实施例1。

Claims (3)

1.一种抗毒素/抗血清中甘氨酸含量的测定方法，包括分别吸取衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液，采用常规高效液相色谱法进行测定，再按常规方法测定甘氨酸和正缬氨酸的峰面积，以内标法计算，即得到抗毒素/抗血清中甘氨酸的含量，其特征在于所述衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液的制备经过下列各步骤：
（1）将内标物用水溶解，制成浓度为3～5mg/mL的内标物溶液；
（2）将对照品甘氨酸用水溶解，制成浓度为20～30mg/mL的对照品贮备液；在1.0mL对照品贮备液中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后至少静置2小时，在3000转/分的转速下离心分离10min，取分离后的上清液0.4mL，用水稀释至10mL，即得到对照品溶液；
（3）取供试品抗毒素、抗血清1.0mL，向其中加入9.0mL质量浓度为1.5%的磺基水杨酸，混匀后至少静置2小时，在3000转/分的转速下离心分离10min，取分离后的上清液1.0mL，用水稀释至10mL，即得到供试品溶液；
（4）分别取步骤（2）所得对照品溶液和步骤（3）所得供试品溶液各0.4mL，在各溶液中分别加水1.6mL，再分别加步骤（1）所得内标物溶液0.08mL，涡旋混合15s，再分别加入1.0mL含三乙胺的乙腈溶液，三乙胺的浓度为1mol/L，混匀，接着分别加入1.0mL含异硫氰酸苯酯的乙腈溶液，异硫氰酸苯酯的浓度为0.1mol/L，涡旋混合30s，室温放置1小时，最后分别加入正己烷4mL，振摇后放置10min，取下层溶液进行过滤，滤液即为衍生化后的对照品溶液和衍生化后的供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）的内标物为α-氨基丁酸或缬氨酸。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述采用高效液相色谱法的色谱条件为：反相液相色谱柱，以浓度为0.01～0.1mol/L、pH为6.5的醋酸钠溶液为流动相A，以乙腈︰水的体积比为90︰10～70︰30的乙腈-水溶液为流动相B，用流速为1mL/min的洗脱液进行梯度洗脱，并采用紫外检测器，其检测波长为245～265nm。
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