CN110849994A - 一种利伐沙班中有关物质的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利伐沙班中有关物质的分离方法,该方法采用高效液相色谱法,色谱柱为C18柱,使用磷酸溶液和乙腈的混合溶液为流动相进行梯度洗脱。该方法可以同时对利伐沙班片中利伐沙班及其有关物质进行分离检测,所述有关物质包括原料合成当中带入的工艺杂质,制剂制备工艺当中产生的工艺降解杂质。与现有技术相比,本发明杂质研究更加全面,且分离方法操作简单、方便、杂质分离度好、灵敏度高、环境友好。
Description
技术领域
本发明属于医药分析领域,特别涉及一种高效液相色谱法分离检测利伐沙班中有关物质的方法。
背景技术
利伐沙班(rivaroxban)全球首个口服生物可利用的Xa因子抑制剂,由强生和拜耳合作开发。商品名为拜瑞妥,已获全球120多个国家批准上市。用于预防和治疗静脉血栓形成。与常用华法林药物相比,利伐沙班吸收好,血药浓度稳定,受药物、食物的干扰少,起效快,排泄也快,而且不需要定期到医院化验凝血功能,一般不需要调整剂量,病人使用方便。利伐沙班的化学名为:5-氯-氮-({(5S)-2-氧-3-[-4-(3-氧-4-吗啉基)苯基]-1,3-唑烷-5-基}甲基)-2-噻吩-羧酰胺,结构式如下:
有关物质研究是制剂质量研究的关键问题之一,国内外对利伐沙班有关物质研究有诸多报道。利伐沙班有关物质检测的难度在于,利伐沙班原料药合成过程中产生工艺杂质、制剂在生产过程当中产生制剂降解杂质,药物的储存和运输过程中也会产生降解杂质,已公开确定的利伐沙班杂质包括乙酰草酰胺、二草酰胺脲、脱氯化合物、氧代邻苯二甲酰、4,5-二氯化合物、二酰胺、三酰胺、氧代邻苯二甲酰亚胺等十余种。杂质多,不易分离,而且有些杂质极性大,有些杂质极性小,很难在同一个色谱体系检出。
CN108152412A专利研究了一种用液相色谱法分离测定利伐沙班及其有关物质的方法,该方法采用高效液相色谱法对利伐沙班及其13个杂质分离检测,色谱柱为十八烷基硅烷基键合硅胶色谱柱,流动相为乙腈、甲醇、缓冲盐、离子对试剂和磷酸水溶液。该方法检测的杂质为工艺杂质诸多,未含有降解杂质检出,且该方法流动相成分复杂,配制麻烦,且需要使用表面活性剂类的离子对试剂,环境不友好。
CN105651871A专利研究了一种用高效液相色谱法分离检测利伐沙班有关物质的方法,该方法采用缓冲盐水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱分离有关物质。该方法分离的有关物质较少,且未含有降解杂质检出。
CN105259282A专利研究了一种用高效液相色谱法分离检索利伐沙班有关物质的方法,该方法采用缓冲盐溶液、有机相加离子对为流动相进行梯度洗脱分离有关物质。该方法分离检测的有关物质较少且未含有降解杂质检出,而且需要使用表面活性剂类的离子对试剂,环境不友好。
CN110057942A专利研究了用高效液相色谱法检测利伐沙班及其制剂有关物质的方法,该方法采用缓冲盐水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱分离有关物质。该方法检出有关物质较多,但仅检测出一种碱降解杂质,且梯度程序设计复杂。
因此研究出一种操作方法简单、方便、杂质分离度好、灵敏度高、环境友好的利伐沙班有关物质检测方法十分有必要,特别是对降解杂质的研究,能为利伐沙班制剂的质量和进一步制定合理的质量标准提供指导,为利伐沙班制剂的储存、运输和使用等各个环节的条件提供依据,保证制剂的质量和稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利伐沙班片有关物质的分离方法,该方法能对准确高效的检测和分离利伐沙班片中的有关物质,特别包括酸降解杂质和碱降解杂质,且操作简单、环境友好。
本发明的技术方案是:采用高效液相色谱法检测和分离利伐沙班片中的利伐沙班及其有关物质。利伐沙班及有关物质结构式如下:
色谱条件:色谱柱为C18柱, 0.01mol/L的磷酸溶液为流动相A,流动相A的pH值为1.5-2.0,乙腈为流动相B。
十八烷基键合硅胶颗粒粒径为4μm,柱长为55mm,色谱柱温度为45±5℃,流速为0.9~1.1ml/min,进样量为3~8μl,洗脱时间30~60min,波长范围230~270nm,洗脱程序为梯度洗脱。
梯度洗脱的程序设置如下:
时间(min) | A | B |
0 | 90%~98% | 10%~2% |
23 | 49%~82% | 51%~18% |
30 | 90%~98% | 10%~2% |
进一步,优选梯度洗脱的程序设置如下:
时间(min) | A | B |
0 | 92% | 8% |
23 | 49% | 51% |
25 | 92% | 8% |
30 | 92% | 8% |
进一步,优选色谱条件为流动相A的pH值为1.8,色谱柱温度45℃,流速为1.0ml/min,进样量为5μl,洗脱时间为30min,波长为250nm。
采用本发明检测和分离利伐沙班片中有关物质的优势为:
1、采用本发明分离利伐沙班中有关物质,利伐沙班及其有关物质各成分分离度好、峰形好、灵敏度高、重现性强、检测结果更接近真实结果;
2、采用本发明分离利伐沙班有关物质,不仅能分离中间体杂质,工艺杂质,还能分离对制剂质量标准影响重大的酸和碱降解杂质。
3、与现有技术相比,本发明方法操作简单、方便,流动相成分简单,环境友好。
附图说明
图1为实施例1供试品色谱图;
图2为实施例1混合溶液色谱图;
图3为实施例2供试品色谱图
图4为实施例2混合溶液色谱图;
图5为实施例3供试品色谱图;
图6为实施例3混合溶液色谱图;
图7为实施例4供试品色谱图;
图8为实施例4混合溶液色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明,不应理解为对本申请的限制。
本发明所用的试剂和原料均市售可得。
除特别说明外,以下实施例仪器为高效液相色谱仪为:Agilent(1260 InfinityⅡ),色谱柱均为Purospher Star RP-18 Endcapped(55*4.0mm,3μm)。
实施例1
供试品配制:取利伐沙班片5片置100ml 量瓶中,加适量稀释剂(流动相A:流动相B=40:60)约70ml,超声15min使溶解,冷却至室温,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,滤过,取续虑液。
混合溶液:称取利伐沙班约25mg,置25ml量瓶中,加适量稀释剂溶解后,分别加入乙酰草酰胺、二草酰胺-脲、脱氯化合物、4,5-二氯化合物、氧代邻苯二甲酰亚胺、二酰胺、三酰胺、中间体1、中间体3、杂质K和杂质M等杂质溶液各适量,用稀释剂稀释至刻度,即得。
色谱条件:流动相A为0.01mol/L磷酸溶液,流动相B为乙腈,流动相A的pH值为1.8,流速为1.0ml/min,柱温45℃,波长:250nm;
梯度洗脱程序为:
时间(min) | A | B |
0 | 92% | 8% |
23 | 49% | 51% |
25 | 92% | 8% |
30 | 92% | 8% |
取供试品溶液、混合溶液各5ul注入高效液相色谱仪,并记录色谱图,得附图1和2。
表1:附图1检测图谱的相关参数
峰号 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 拖尾因子 | 分离度USP | 理论塔板数USP |
1 | 6.944 | 0.234 | 1.677 | 0.983 | / | 21796.8 |
2 | 7.377 | 0.067 | 0.500 | 0.913 | 2.043 | 25222.9 |
3 | 8.404 | 0.138 | 0.837 | 1.002 | 5.878 | 42298.3 |
4 | 8.763 | 0.326 | 1.928 | 1.178 | 2.229 | 50111.9 |
5 | 10.702 | 0.075 | 0.792 | 1.289 | 9.203 | 26086.5 |
6 | 11.163 | 0.297 | 2.625 | 0.939 | 1.878 | 39437.2 |
7 | 11.526 | 0.114 | 1.028 | 1.426 | 1.568 | 37310.2 |
8 | 12.000 | 0.172 | 1.351 | 1.12 | 2.099 | 49631.1 |
9 | 12.343 | 1113.432 | 7813.585 | 1.054 | 1.714 | 71095.1 |
10 | 13.847 | 0.064 | 0.527 | 0.757 | 7.664 | 72101.9 |
11 | 16.308 | 0.071 | 0.531 | 1.446 | 12.398 | 116489.4 |
12 | 18.098 | 0.083 | 0.761 | 1.656 | 8.393 | 94573.9 |
总计 | 7826.143 |
表2:附图2检测图谱的相关参数
峰号 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 拖尾因子 | 分离度USP | 理论塔板数USP |
1 | 3.585 | 1.447 | 17.253 | 0.652 | / | 3751.0 |
2 | 4.912 | 0.080 | 0.800 | 0.877 | 5.265 | 5302.0 |
3 | 5.598 | 0.324 | 2.812 | 1.039 | 2.863 | 11375.9 |
4 | 6.978 | 0.323 | 2.368 | 1.282 | 6.968 | 22480.2 |
5 | 7.352 | 1.448 | 13.161 | 1.437 | 1.684 | 13064.5 |
6 | 8.370 | 2.945 | 18.931 | 1.203 | 4.793 | 40206.5 |
7 | 8.732 | 1.288 | 7.510 | 1.221 | 2.287 | 53640.9 |
8 | 9.295 | 1.075 | 7.188 | 1.260 | 3.469 | 45675.6 |
9 | 9.620 | 0.267 | 1.796 | 1.288 | 1.879 | 51071.4 |
10 | 10.069 | 2.004 | 26.240 | 1.807 | 1.810 | 15175.0 |
11 | 11.124 | 2.685 | 18.788 | 1.207 | 4.152 | 59769.0 |
12 | 11.484 | 0.056 | 0.566 | 1.296 | 1.704 | 36462.5 |
13 | 11.942 | 4.077 | 29.685 | 1.235 | 2.113 | 62148.1 |
14 | 12.300 | 2431.030 | 17428.913 | 1.111 | 1.906 | 69918.6 |
15 | 13.804 | 0.081 | 0.541 | 0.900 | 8.193 | 93203.9 |
16 | 15.516 | 2.197 | 17.472 | 1.228 | 8.927 | 94160.4 |
17 | 18.692 | 2.045 | 15.306 | 1.229 | 16.063 | 149580.8 |
18 | 19.314 | 2.137 | 15.125 | 1.235 | 3.309 | 177503.7 |
总计 | 17624.455 |
经过实验可知,保留时间为12.343min的峰为利伐沙班峰,其与前杂分离度为1.714;混合溶液中保留时间为18.692min、19.314min的峰为二酰胺和三酰胺的峰,其分离度为3.309,能达到很好的分离;保留时间为9.295min、10.069min的峰为降解杂质K和降解杂质M的峰,其与利伐沙班已知杂质、未知杂质间均能有效的分离。
实施例2
供试品溶液和混合溶液配制与实施例1一致。
色谱条件:流动相A为0.01mol/L磷酸溶液,流动相B为乙腈,流动相A的pH值为1.8,流速为1.0ml/min,柱温45℃,波长:250nm;
梯度洗脱程序为:
时间(min) | A | B |
0 | 95% | 5% |
3 | 95% | 5% |
20 | 49% | 51% |
25 | 95% | 5% |
30 | 95% | 5% |
取供试品溶液、混合溶液各5ul注入高效液相色谱仪,并记录色谱图,得附图3和4。
表3:附图3检测图谱的相关参数
峰号 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 拖尾因子 | 分离度USP | 理论塔板数USP |
1 | 10.122 | 0.272 | 1.552 | 1.068 | / | 71558.3 |
2 | 11.202 | 0.169 | 0.807 | 0.840 | 7.379 | 100504.5 |
3 | 11.323 | 0.393 | 1.899 | 1.134 | 0.887 | 123007.9 |
4 | 12.860 | 0.086 | 0.795 | 1.060 | 7.869 | 38713.0 |
5 | 13.184 | 0.343 | 2.603 | 0.847 | 1.506 | 98466.0 |
6 | 13.476 | 0.168 | 0.912 | 1.162 | 1.858 | 133136.8 |
7 | 13.786 | 0.191 | 1.156 | 0.844 | 2.042 | 125153.3 |
8 | 14.017 | 1362.300 | 7810.266 | 1.113 | 1.503 | 139450.0 |
9 | 16.759 | 0.088 | 0.515 | 1.232 | 18.128 | 193159.3 |
10 | 17.976 | 0.107 | 0.863 | 1.915 | 6.995 | 135502.6 |
总计 | 7821.366 |
表4:附图4检测图谱的相关参数
峰号 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 拖尾因子 | 分离度USP | 理论塔板数USP |
1 | 7.477 | 1.940 | 18.069 | 0.724 | / | 22107.6 |
2 | 9.142 | 0.479 | 2.945 | 1.059 | 9.344 | 55711.2 |
3 | 10.090 | 0.368 | 2.139 | 1.251 | 6.171 | 69581.6 |
4 | 10.339 | 1.829 | 13.119 | 1.462 | 1.456 | 47137.2 |
5 | 11.168 | 3.549 | 18.232 | 1.034 | 5.009 | 102422.2 |
6 | 11.291 | 1.632 | 8.283 | 1.811 | 0.841 | 86342.6 |
7 | 11.819 | 1.310 | 7.321 | 1.250 | 3.550 | 106456.1 |
8 | 12.046 | 0.319 | 1.754 | 1.297 | 1.588 | 117659.1 |
9 | 12.347 | 2.052 | 10.870 | 1.032 | 2.108 | 117384.2 |
10 | 12.518 | 1.921 | 15.191 | 1.276 | 0.963 | 53797.2 |
11 | 13.141 | 3.219 | 18.717 | 1.281 | 3.395 | 123871.8 |
12 | 13.420 | 0.100 | 0.551 | 1.066 | 1.877 | 129708.6 |
13 | 13.744 | 4.933 | 27.865 | 0.991 | 2.123 | 124932.9 |
14 | 13.975 | 2870.885 | 17170.117 | 1.163 | 1.510 | 132466.8 |
15 | 16.252 | 2.753 | 17.606 | 1.253 | 14.462 | 162548.8 |
16 | 17.766 | 0.076 | 0.746 | 1.300 | 7.239 | 76558.1 |
17 | 18.393 | 2.471 | 15.131 | 1.293 | 3.028 | 219256.6 |
18 | 18.762 | 2.628 | 15.963 | 1.338 | 2.391 | 242501.8 |
总计 | 17364.620 |
经过实验可知,保留时间为14.017min的峰为利伐沙班峰,其与前杂分离度为1.503,能达到基本分离要求。混合溶液中保留时间为18.393min、18.762min的峰为二酰胺和三酰胺的峰,其分离度为2.391,能达到很好的分离;保留时间为11.819min、12.347min的峰为降解杂质K和降解杂质M的峰,其与利伐沙班已知杂质、未知杂质间均能达到基本的分离
实施例3
供试品溶液和混合溶液配制与实施例1一致。
色谱条件:流动相A为0.01mol/L磷酸溶液,流动相B为乙腈,流动相A的pH值为2.0,流速为1.0ml/min,柱温45℃,波长:250nm;
梯度洗脱程序为:
时间(min) | A | B |
0 | 92% | 8% |
12 | 65% | 35% |
20 | 49% | 51% |
24 | 92% | 8% |
30 | 92% | 8% |
取供试品溶液、混合溶液各5ul注入高效液相色谱仪,并记录色谱图,得附图5和6。
表5:附图5检测图谱的相关参数
峰号 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 拖尾因子 | 分离度USP | 理论塔板数USP |
1 | 6.546 | 0.247 | 1.503 | 1.057 | / | 25413.0 |
2 | 7.705 | 0.154 | 0.853 | 0.982 | 7.403 | 43229.2 |
3 | 7.925 | 0.346 | 1.797 | 1.099 | 1.527 | 51313.6 |
4 | 9.657 | 0.076 | 0.710 | 1.296 | 8.937 | 24265.9 |
5 | 10.042 | 0.326 | 2.534 | 0.842 | 1.762 | 44299.8 |
6 | 10.380 | 0.137 | 0.975 | 1.154 | 1.747 | 45586.9 |
7 | 10.760 | 0.224 | 1.497 | 1.049 | 1.969 | 50505.6 |
8 | 11.040 | 1240.098 | 7806.548 | 1.078 | 1.571 | 71599.0 |
9 | 14.337 | 0.080 | 0.514 | 1.104 | 19.618 | 112413.4 |
10 | 15.874 | 0.062 | 0.563 | 2.089 | 7.858 | 83236.4 |
总计 | 7817.495 |
表6:附图6检测图谱的相关参数
峰号 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 拖尾因子 | 分离度USP | 理论塔板数USP |
1 | 3.546 | 1.550 | 17.306 | 0.654 | / | 4045.3 |
2 | 4.745 | 0.096 | 0.734 | 0.943 | 5.585 | 8523.4 |
3 | 5.304 | 0.380 | 2.794 | 0.931 | 2.880 | 13375.8 |
4 | 6.547 | 0.343 | 2.078 | 1.035 | 7.157 | 25483.2 |
5 | 6.753 | 1.603 | 13.105 | 1.285 | 1.054 | 14013.7 |
6 | 7.687 | 3.232 | 18.793 | 1.221 | 4.909 | 40876.3 |
7 | 7.911 | 1.409 | 7.628 | 1.176 | 1.532 | 51395.9 |
8 | 8.473 | 1.192 | 7.194 | 1.245 | 3.810 | 47113.2 |
9 | 8.745 | 0.295 | 1.759 | 1.091 | 1.763 | 51685.6 |
10 | 9.106 | 1.863 | 11.172 | 1.278 | 2.329 | 55037.7 |
11 | 9.368 | 1.775 | 15.291 | 1.149 | 1.389 | 29241.0 |
12 | 10.021 | 2.964 | 18.811 | 1.264 | 3.421 | 60559.9 |
13 | 10.346 | 0.094 | 0.624 | 1.126 | 1.903 | 52560.5 |
14 | 10.726 | 4.530 | 28.832 | 1.122 | 2.173 | 64224.4 |
15 | 11.013 | 2665.716 | 17282.177 | 1.150 | 1.706 | 69727.4 |
16 | 13.716 | 2.472 | 17.543 | 1.228 | 15.571 | 92491.5 |
17 | 16.418 | 2.148 | 14.776 | 1.285 | 15.000 | 133697.0 |
18 | 16.944 | 2.251 | 15.178 | 1.241 | 2.984 | 152747.4 |
总计 | 17475.794 |
经过实验可知,保留时间为11.040min的峰为利伐沙班峰,其与前杂分离度为1.571,能达到基本分离要求。混合溶液中保留时间为16.418min、16.944min的峰为二酰胺和三酰胺的峰,其分离度为2.984,能达到很好的分离;保留时间为8.473min、9.106min的峰为降解杂质K和降解杂质M的峰,其与利伐沙班已知杂质、未知杂质间均能有效的分离
实施例4 进口注册标准JX20160225的检测条件
供试品配制:取利伐沙班片5片置100ml 量瓶中,加适量稀释剂(流动相A:流动相B=40:60)约70ml,超声15min使溶解,冷却至室温,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,滤过,取续虑液。
混合溶液:称取利伐沙班约10mg,置50ml量瓶中,加适量稀释剂溶解后,分别加入乙酰草酰胺、脱氯化合物、4,5-二氯化合物、氧代邻苯二甲酰亚胺、中间体1、杂质K和杂质M等杂质溶液各适量,用稀释剂稀释至刻度,即得。。
色谱条件:流速为1.0ml/min,柱温45℃,波长:250nm;
梯度洗脱程序为:
时间(min) | A | B |
0 | 92% | 8% |
13 | 49% | 51% |
13.1 | 92% | 8% |
18 | 92% | 8% |
取供试品溶液混合溶液各5ul分别注入液相色谱仪,记录色谱图,得附图7和8。
表7:附图7检测图谱的相关参数
峰号 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 拖尾因子 | 分离度USP | 理论塔板数USP |
1 | 5.560 | 0.384 | 2.229 | 1.120 | / | 21773.8 |
2 | 6.397 | 0.425 | 2.710 | 0.820 | 5.669 | 31349.4 |
3 | 7.674 | 0.100 | 0.813 | 1.152 | 6.852 | 18099.1 |
4 | 7.954 | 0.377 | 2.637 | 0.818 | 1.466 | 42706.8 |
5 | 8.194 | 0.182 | 0.996 | 1.567 | 1.638 | 55467.4 |
6 | 8.471 | 0.234 | 1.181 | 0.720 | 1.983 | 55974.4 |
7 | 8.660 | 1487.865 | 7782.083 | 1.140 | 1.333 | 64055.4 |
8 | 10.916 | 0.094 | 0.503 | 1.151 | 16.352 | 98460.5 |
9 | 14.957 | 0.633 | 12.038 | 1.116 | 12.416 | 13671.7 |
总计 | 7805.191 |
表8:附图8检测图谱的相关参数
峰号 | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 | 拖尾因子 | 分离度USP | 理论塔板数USP |
1 | 2.857 | 9.242 | 91.496 | 0.676 | / | 4411.2 |
2 | 4.016 | 0.184 | 1.507 | 0.925 | 6.176 | 6228.2 |
3 | 5.855 | 24.749 | 130.323 | 1.229 | 10.790 | 29270.6 |
4 | 6.307 | 11.484 | 56.750 | 1.055 | 3.363 | 36111.0 |
5 | 6.472 | 26.757 | 142.991 | 1.118 | 1.231 | 35202.1 |
6 | 6.938 | 26.934 | 140.334 | 1.185 | 3.415 | 42102.4 |
7 | 7.490 | 1.555 | 5.513 | 0.621 | 2.101 | 5957.4 |
8 | 7.602 | 17.403 | 96.331 | 1.055 | 0.427 | 45496.1 |
9 | 8.140 | 0.295 | 1.422 | 0.868 | 3.744 | 51084.4 |
10 | 8.331 | 382.604 | 2107.877 | 1.205 | 1.326 | 54704.1 |
11 | 9.566 | 0.218 | 1.333 | 1.233 | 8.765 | 75018.6 |
12 | 10.298 | 17.787 | 102.672 | 1.223 | 5.044 | 75644.5 |
根据结果可知,保留时间为8.660min的峰为利伐沙班峰,其与前杂分离度为1.333,低于1.5,未能达到有效分离,分离效果差,检测结果小于真实结果;保留时间为6.472min、6.938min的峰为降解杂质K和降解杂质M的峰,其中降解杂质K和工艺杂质中间体1保留时间极为接近,分离度同样低于1.5,分离效果较差。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明,不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本申请的保护范围。
Claims (6)
1.一种利伐沙班中有关物质的分离方法,所述方法为高效液相色谱法,其中,色谱柱为C18色谱柱,其特征在于,以0.01mol/L的磷酸溶液为流动相A,乙腈为流动相B,进行梯度洗脱,流动相A的pH值为1.5-2.0。
4.如权利要求1所述的分离方法,其特征在于,流动相A的pH值为1.8。
5.如权利要求1~4任一项所述的分离方法,其特征在于,其中液相色谱的分析条件为以下(ⅰ)至(ⅷ)中的一项或者多项:
(ⅰ)色谱柱的规格为4.0*55mm,3um,
(ⅱ)色谱柱的型号为Purospher Star RP-18 Endcapped,
(ⅲ)色谱柱温度为45±5℃,
(ⅳ)流动相比例的变换范围:±2%,
(ⅴ)流速为0.9~1.1ml/min,
(ⅵ)进样量为3~8μl,
(ⅶ)洗脱时间30~60min,
(ⅷ)波长范围230~270nm。
6.如权利要求1~4任一项所述的分离方法在药物杂质分离当中的应用。
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