CN108760931A - 一种酪胺的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酪胺的高效液相色谱检测方法,涉及柱色谱法技术领域。色谱条件为:色谱柱:氨基键合硅胶柱;流动相:0.05mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为35:65;其中,磷酸盐缓冲液的pH值为2.5‑6.0;流速:0.7‑1.0mL/min;检测波长:205‑225nm;色谱柱柱温:25‑40℃;进行高效液相色谱分析,测定转化液中酪胺含量。本发明方法可快速,准确测定出酪胺的含量,确保其质量可控,减小误差,节约成本,操作简单,出峰时间快,缩短生产过程中的检测时间,准确度高,大大提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及柱色谱法技术领域,尤其涉及一种酪胺的高效液相色谱检测方法。
背景技术
酪胺是自然界中存在于一些檞寄生树,腐败的动物组织,裂开的干酪以及麦角菌中。它对子宫和血压的作用同肾上腺素相似,虽毒性和活性都比较小,但作用时间长为他的特点。
现有的文献中,测定酪胺转化液中酪胺的含量为柱前衍生后,用C8柱进行液相检测,此方法需预先处理样品,步骤较为复杂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酪胺的高效液相色谱检测方法,该方法可快速,准确测定出酪胺的含量,确保其质量可控,减小误差,节约成本,操作简单,出峰时间快,缩短生产过程中的检测时间,准确度高,大大提高了生产效率。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:一种酪胺的高效液相色谱检测方法:
色谱条件为:
色谱柱:氨基键合硅胶柱;
流动相:0.05mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为35:65;其中,磷酸盐缓冲液的pH值为2.5-6.0;
流动相流速:0.7-1.0mL/min;
检测波长:205-225nm;
色谱柱柱温:25-40℃;
检测步骤为:
(1)配制流动相,过滤,脱气;
(2)调节高效液相色谱仪条件,平衡色谱柱;
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制:称取酪胺对照品和酪胺供试品,分别用流动相溶解定容,即得;
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪,记录色谱图及峰面积,采用外标法计算酪胺的含量。
优选的,磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液。
优选的,流动相流速为0.7mL/min。
优选的,检测波长为215nm。
优选的,色谱柱柱温为30℃。
优选的,磷酸盐缓冲液的pH值为4.0。
优选的,步骤(3)中,对照品溶液的浓度为0.02mg/mL。
优选的,步骤(3)中,供试品溶液的配制为:将含有酪胺的生物转化液0.5ml,用流动相稀释至25ml,再将摇匀后的溶液稀释50倍体积。
优选的,色谱柱长度为250mm,内径为4.6mm,其填料粒径为5μm。
优选的,步骤(4)中,对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
(1)本发明方法可快速,准确测定出酪胺的含量,确保其质量可控,减小误差,节约成本,操作简单,出峰时间快,缩短生产过程中的检测时间,准确度高,大大提高了生产效率。
(2)本发明方法可通过一次高效液相检测,准确测定出转化液中酪胺的含量,且与其他杂质峰达到很好的分离效果,节省了人工、时间和溶剂等成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中酪胺对照品溶液的色谱图;
图2是本发明实施例2中酪胺供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种酪胺的高效液相色谱检测方法,步骤如下:
步骤1、酪胺对照品溶于流动相中,按比例稀释,分别相当于每1ml中含18.9776μg、21.3498μg、23.722μg、26.0942μg、28.4664μg的标准溶液;
步骤2、采用液相色谱仪分别对不同浓度的标准溶液进行液相色谱分析,记录分析得到的峰面积,并采用外标法绘制酪胺含量-峰面积的标准曲线,得出标准曲线回归方程为y=72264965.0114x+41605.4,R2=0.9999;
步骤3、将含有酪胺的生物转化液0.5ml,用流动相稀释至25ml,再将摇匀后的溶液稀释50倍体积,利用液相色谱仪进行液相色谱分析,采用与标准溶液完全相同的测定条件,并记录峰面积,根据步骤2的标准曲线回归方程y=72264965.0114x+41605.4,R2=0.9999计算得出所述酪胺的含量为60.06g/L(外标法测得含量为59.91g/L)。
检测方法的检测参数为:
色谱柱:氨基键合硅胶柱;
流动相:0.05mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为35:65;其中,磷酸盐缓冲液的pH值为2.5-6.0;
流动相流速:0.7-1.0mL/min;
检测波长:205-225nm;
色谱柱柱温:25-40℃。
本发明实施例提供的一种酪胺的高效液相检测方法,可通过一次高效液相检测,准确测定出转化液中酪胺的含量,且与其他杂质峰达到很好的分离效果,节省了人工、时间和溶剂等成本。
以下实施例中,采用的高效液相色谱仪为日本岛津:LC-15C;色谱柱为安捷伦氨基键合硅胶柱5μm 4.6*250mm;进样体积为20μl(定量环)。也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪、其他粒径和长度的氨基键合硅胶柱以及其他进样体积,都能达到本发明的目的。
实施例1-3
1.色谱条件:
流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH4.0):乙腈=35:65;(其中,磷酸二氢钾缓冲液的配制为:磷酸二氢钾4.76g溶于700ml超纯水中,用50%磷酸调pH值为4.0);
流动相流速:0.7ml/min;
检测波长:215nm;
色谱柱柱温:30℃。
2.实验步骤
(1)配制流动相,过滤,脱气;
(2)调节高效液相色谱仪,平衡色谱柱;
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制,称取酪胺对照品51.93mg于25ml容量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度摇匀后再稀释100倍;实施例1-3分别吸取不同生产批次含有酪胺的生物转化液0.5ml,用流动相稀释至25ml,再将摇匀后的溶液稀释50倍体积。
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪,记录色谱图及峰面积,采用外标法计算结果。
外标法计算酪胺生物转化液中酪胺的含量:
X=C供试品×对照品的稀释倍数=(C对照品×A供试品/A对照品)×待测样品的稀释倍数;
式中:C对照品为对照品溶液中酪胺的浓度,单位为mg/ml;
A对照品为对照品溶液色谱图的峰面积或峰高;
A供试品为供试品溶液色谱图的峰面积或峰高;
C供试品为供试品溶液中酪胺的浓度,单位为mg/ml。
具体数值见下表所示,
3.实施例2供试品溶液色谱图见图2所示:5.572min为酪胺的峰,其余的为杂峰,主峰的出峰时间适宜、理论塔板数大于5000,且与杂峰分离度良好。对照品溶液色谱图见图1所示,5.564min为酪胺的峰。
4.本发明的方法学考察
(1)线性关系实验
标准溶液的稀释步骤、浓度、峰面积见下表:
由标准浓度及其对应的峰面积得出标准曲线回归方程为:y=72264965.0114x+41605.4,R2=0.9999。
(2)重复性试验
取标准溶液20μl注入高效液相色谱仪,重复6针,峰面积分别为1555197、1541136、1542358、1547220、1545632、1544277,平均值为1545970,RSD为0.32%。
(3)转化液稳定性试验
取一份酪胺转化液,于配制后6h、12h、24h进样,其峰面积分别为1939191、1961352、1951460,平均值为1950668,RSD为0.57%。
Claims (10)
1.一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:
色谱条件为:
色谱柱:氨基键合硅胶柱;
流动相:0.05mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为35:65;其中,磷酸盐缓冲液的pH值为2.5-6.0;
流动相流速:0.7-1.0mL/min;
检测波长:205-225nm;
色谱柱柱温:25-40℃;
检测步骤为:
(1)配制流动相,过滤,脱气;
(2)调节高效液相色谱仪条件,平衡色谱柱;
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制:称取酪胺对照品和酪胺供试品,分别用流动相溶解定容,即得;
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪,记录色谱图及峰面积,采用外标法计算酪胺的含量。
2.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:流动相流速为0.7mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:检测波长为215nm。
5.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:色谱柱柱温为30℃。
6.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:磷酸盐缓冲液的pH值为4.0。
7.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:步骤(3)中,对照品溶液的浓度为0.02mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:步骤(3)中,供试品溶液的配制为:将含有酪胺的生物转化液0.5ml,用流动相稀释至25ml,再将摇匀后的溶液稀释50倍体积。
9.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:色谱柱长度为250mm,内径为4.6mm,其填料粒径为5μm。
10.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法,其特征在于:步骤(4)中,对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。
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