CN110412172A - 一种酪胺的高效液相检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及柱色谱技术领域，尤其涉及一种酪胺的高效液相检测方法色谱柱：C18色谱柱；流动相：体积比为18‑20:1的高氯酸水溶液与乙腈的混合液，且所述高氯酸水溶液的pH值为1.0‑2.4；流动相流速：0.3‑0.7mL/min；检测波长：210nm；色谱柱柱温：25‑35℃。本发明通过一次高效液相检测，准确测定出溶液中酪胺的含量，且与其他杂质峰达到很好的分离效果，节省了人工、时间和溶剂等成本。

Description

一种酪胺的高效液相检测方法
技术领域
本发明涉及柱色谱法技术领域，尤其涉及一种酪胺的高效液相检测方法。
背景技术
酪胺又名干酪胺，学名为4-羟基苯乙胺，白色和类白色固体，是合成药物的重要中间体。在自然界中，酪胺存在于一些檞寄生树、腐败的动物组织、裂开的干酪以及麦角菌种中。早在酪胺发现之初，就发现其与肾上腺素相似，能升高血压和兴奋子宫，具有毒性和活性小、作用时间长的特点，因此酪胺可作为一种原料药。药物生产过程中需要对质量进行把控，所以生产前需对酪胺进行质量检测，现有技术中酪胺含量检测方法有气相色谱-串联质谱法、离子色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等，这些方法的前处理步骤都较为繁琐，不易操作，甚至需要柱前衍生，用时长，且准确度低。
发明内容
针对现有酪胺含量检测方法前处理步骤繁琐、不易操作、用时长、准确度低等问题，本发明提供一种酪胺的高效液相检测方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种酪胺的高效液相检测方法，色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：体积比为18-20:1的高氯酸水溶液与乙腈的混合液，且所述高氯酸水溶液的pH值为1.0-2.4；
流动相流速：0.3-0.7mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱柱温：25-35℃；
进行高效液相色谱分析，测定含有酪胺的溶液中酪胺的含量。
相对于现有技术，本发明提供的酪胺的高效液相检测方法具有以下优势：
本申请以非极性固定相C18为色谱柱，以高氯酸水溶液和乙腈为流动相，利用其在固定相发生疏水或氢键作用后，产生差速迁移，从而分离得到酪胺，并调节酪胺出峰的保留时间，由于酪胺是一种生物胺，所以以高氯酸水溶液作为流动相，使得酪胺质子化后进行分离，并防止固定相溶解；两者结合使检测结果更准确，且保留能力强，保留时间在5min左右，分离效果好。
相对于现有技术，本发明提供的酪胺的高效液相色谱检测方法，具有准确度高，稳定性好的特点。在本发明提供的检测条件下，酪胺与各杂质以及各杂质之间的分离均较好，出峰时间较为合适，而且本发明提供的方法具有较高的灵敏度，因此本发明提供的方法能够较好地实现对酪胺品质的测定，而且有利于指导生产过程中对杂质的控制，得到高品质的酪胺。
优选地，所述流动相为体积比为19:1的高氯酸水溶液与乙腈的混合液，且所述高氯酸水溶液的pH值为2-2.4。
优选地，所述高氯酸水溶液的pH值为2.3。
本申请采用反相色谱法，并优选地控制流动相的比例即pH值，增加流动相的洗脱能力，并防止出现不对称色谱峰，并有利于酪胺的质子化，使得酪胺与其他杂质分离效果更佳。
优选地，所述流动相流速为0.4-0.6mL/min。
进一步优选地，所述流动相流速为0.5mL/min。
优选地的流动相流速保证含有酪胺的溶液中酪胺以及各种杂质具有优异的分离效果，若是流速过快，分析时间短，溶液中酪胺与杂质不能完全分离，若是速度过慢，延长了分析时间，可能改善组分间的分离效果，并且增加时间成本，不利于工艺化生产。
优选地，所述色谱柱柱温为28-32℃。
进一步优选地，所述色谱柱柱温为30℃。
优选的色谱柱柱温改善流动相的黏度，提高酪胺与杂质的分离效果，若是柱温过高可降低流动相黏度，有利于传质速率，但是会降低色谱峰分辨率。
优选地，所述色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。
优选地，所述检测方法至少包括以下步骤：
步骤a、配制不同浓度的酪胺标准溶液；
步骤b、采用液相色谱仪对所述酪胺标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法绘制酪胺含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程；
步骤c、将待测液稀释，采用与步骤b相同的色谱条件，利用液相色谱仪进行液相色谱分析，并同时记录峰面积，根据步骤b的标准曲线回归方程计算得出所述待测液中酪胺的含量。
本发明采用高效液相色谱的检测方法与外标法配合，使得酪胺的检测速度快、准确率高，有利于工业化推广。
优选地，步骤a中，所述酪胺标准溶液的浓度分别为10.320μg/mL、16.512μg/mL、20.640μg/mL、25.800μg/mL和33.024μg/mL。
优选地，步骤c中，将所述待测液采用45-55倍体积的流动相稀释。
优选地将含有酪胺的溶液进行稀释，降低其溶度，有利于酪胺与杂质分离，若是溶液的浓度过高，酪胺的分离效果会受到影响，影响检测的准确度和精确度。
优选地，进样体积为20μL。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的酪胺标准溶液的液相色谱图；
图2是本发明实施例1提供的含有酪胺的溶液的液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供一种酪胺的高效液相检测方法，包括以下步骤：
步骤a、将酪胺对照品溶于流动相中，配制浓度为浓度分别为10.320μg/mL、16.512μg/mL、20.640μg/mL、25.800μg/mL和33.024μg/mL的酪胺标准溶液；
步骤b、采用液相色谱仪对所述酪胺标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，色谱图如图1所示，图中保留时间为5.482min处为酪胺的峰，其余为杂质峰，峰面积如下表1所示，并采用外标法绘制酪胺含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程，y＝38861772.1424x+8242.2765，R2＝0.9999；
色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：体积比为19:1的高氯酸水溶液与乙腈的混合液，且所述高氯酸水溶液的pH值为2.3；
流动相流速：0.5mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱柱温：30℃；
表1标准溶液浓度μg/L与峰面积数值记录表
标准浓度μg/mL 峰面积
10.320 405956.313
16.512 654940.563
20.640 810186.5
25.800 1010192.81
33.024 1290786.13
步骤c、将含有酪胺的溶液0.5mL稀释，采用流动相稀释至50mL，采用与所述标准溶液完全相同的色谱条件，利用液相色谱仪进行液相色谱分析，并同时记录峰面积，色谱图如图2所示，根据步骤b的标准曲线回归方程计算得出所述含有酪胺的溶液中酪胺的含量。
从图2中可以看出，保留时间5.482min为酪胺的峰，其余的为杂峰，主峰的出峰时间适宜、理论塔板数大于5000，且与杂峰分离度良好。
实施例2
将酪胺对照品溶于流动相中，配制浓度为20.18μg/mL的酪胺溶液，为验证上述实施例1的可行性和准确性，进行精密度试验，试验采用浓度为20.18μg/mL的酪胺溶液，连续进样6次，采用与实施例1完全相同的色谱条件，测定结果表2所示。
表2
序号 酪胺峰面积
1 792634.5
2 791795.188
3 791829.875
4 791553.000
5 792731.375
6 792346.488
平均值 792148.4043
RSD％ 0.062
由表2可以得出峰面积的RSD小于2％，因此仪器稳定性良好，且本申请提供的高效液相检测方法可行性高。
将所得酪胺的峰面积根据标准曲线回归方程，y＝38861772.1424x+8242.2765，计算得到酪胺的浓度分别为20.18μg/mL、20.16μg/mL、20.16μg/mL、20.16μg/mL、20.19μg/mL、20.18μg/mL，平均值为20.17μg/mL。说明本申请提供的高效液相检测方法的准确性高。
实施例3
将含有酪胺的生物转化液分别静置6h、12h和24h后，采用与实施例1完全相同的色谱条件进行色谱分析，测定结果表3所示。
表3
时间/h 酪胺峰面积
6 887750.64
12 890102.36
24 889453.27
平均值 889102.10
RSD％ 0.14
从表3中可以看出，含有酪胺的生物转化液经过静置后对色谱分析结果基本无影响，说明含有酪胺的溶液采取高效液相的检测方法适用于工业化推广，简单方便快捷，且准确度高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：体积比为18-20:1的高氯酸水溶液与乙腈的混合液，且所述高氯酸水溶液的pH值为1.0-2.4；
流动相流速：0.3-0.7mL/min；
检测波长：210nm；
色谱柱柱温：25-35℃。
2.如权利要求1所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：所述流动相为体积比为19:1的高氯酸水溶液与乙腈的混合液，且所述高氯酸水溶液的pH值为2-2.4。
3.如权利要求2所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：所述高氯酸水溶液的pH值为2.3。
4.如权利要求1所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：所述流动相流速为0.4-0.6mL/min；和/或
所述色谱柱柱温为28-32℃。
5.如权利要求4所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：所述流动相流速为0.5mL/min；和/或
所述色谱柱柱温为30℃。
6.如权利要求1所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：所述色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。
7.如权利要求1-6任一项所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：所述检测方法至少包括以下步骤：
步骤a、配制不同浓度的酪胺标准溶液；
步骤b、采用液相色谱仪对所述酪胺标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法绘制酪胺含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程；
步骤c、将待测液稀释，采用与步骤b相同的色谱条件进行液相色谱分析，并同时记录峰面积，根据步骤b的标准曲线回归方程计算得出所述待测液中酪胺的含量。
8.如权利要求7所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：步骤a中，所述酪胺标准溶液的浓度分别为10.320μg/mL、16.512μg/mL、20.640μg/mL、25.800μg/mL和33.024μg/mL。
9.如权利要求7所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：步骤c中，将所述待测液采用45-55倍体积的流动相稀释。
10.如权利要求7所述的酪胺的高效液相检测方法，其特征在于：进样体积为20μL。
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