CN105004802A - 分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，涉及一种分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用，用于分离测定利伐沙班及其杂质的试剂组合物为：试剂A：加有酸性离子对试剂的无机盐缓冲体系，酸性离子对试剂的浓度为0.2g/L-4.0g/L；试剂B：有机溶剂。采用上述试剂组合物分离测定利伐沙班及其杂质的方法为：取利伐沙班溶于乙腈水溶液得样品溶液；配制流动相；将所述样品溶液注入分离检测系统中，用所述流动相对所述样品溶液进行洗脱分离得洗脱液；所述洗脱液进入检测器测定。本发明能同时将利伐沙班及其杂质完全分离，本方法简单，灵敏度高，分析时间短，专属性强，重现性好，可以同时有效分离及测定利伐沙班原料药及制剂中各有关物质含量。

Description

分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用。

背景技术

利伐沙班(Rivaroxaban，商品名：Xarelto)是德国拜耳制药开发的一种新的口服抗凝药物，主要用于择期髋关节或膝关节置换手术的成年患者，以预防静脉血栓形成。本品具有高度的选择性和竞争性，出血风险低，安全性好。利伐沙班化学名为：5-氯-氮-({(5S)-2-氧-3-[4-(3-氧-4-吗啉基)苯基]-1,3-唑烷-5-基}甲基)-2-噻吩-羧酰胺，分子式为C₁₉H₁₈ClN₃O₅S。利伐沙班结构式为：

通常来说，一种药物杂质总含量应小于1.0％，单个杂质含量应小于0.1％，对于制备利伐沙班过程中产生的杂质或引入的有关物质，不论是在原料药还是制剂中均需要进行严格控制。申请号为CN103558326A的专利公开了一种测定利伐沙班片中利伐沙班含量的方法，在该方法中只能检测产品中利伐沙班的含量，不能达到同时分离及检测利伐沙班及其相关杂质的目的；申请号为WO2012035057的专利公开了一种用液相色谱法分离测定利伐沙班及其相关杂质的方法，检测的杂质为两个相关杂质(结构式参见专利WO2012035057)，其中公开的杂质A与本发明杂质列表中的杂质B结构相同，其余均不同，且在这个专利中，利用高效液相色谱法完全分离利伐沙班的相关杂质需要56分钟。因此到目前为止，还没有公开的方法报道可快速测定同时分离利伐沙班及其10种制剂杂质。因此开发一种快速有效分离分析利伐沙班及其制剂工艺杂质的方法，对于药物的质量控制及降解途径研究都是十分有意义的工作。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时分离测定利伐沙班及其杂质的试剂组合物及方法，该方法可快速同时实现利伐沙班及其杂质的分离和检测，精密度和灵敏度高，为利伐沙班原料药和制剂的质量标准的制定及提高有重要的意义。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

用于分离测定利伐沙班及其杂质的试剂组合物，由以下试剂组成：

试剂A：加有酸性离子对试剂的无机盐缓冲体系，所述酸性离子对试剂的浓度为0.2g/L-4.0g/L；

试剂B：有机溶剂；

所述酸性离子对试剂为：1-戊烷磺酸钠、1-己烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠、1-辛烷磺酸钠和1-癸烷磺酸钠中的一种或多种；

所述有机溶剂为乙腈。

优选离子对试剂的浓度为0.4g/L-2.0g/L。

使用液相色谱法分析电离能力比较强的样品时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂，将分析物上的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子，在选择离子对试剂时，要考虑色谱柱的填料和样品的酸碱性，根据本发明中色谱柱的填料和样品的性质，所以选用了上述酸性离子对试剂。

本发明的目的之二在于提供一种分离测定利伐沙班及其杂质的方法，具体包括以下步骤：

1)取利伐沙班溶于乙腈水溶液得样品溶液；

2)配制流动相：

a配制所述试剂A得流动相A；

b所述试剂B做流动相B；

3)将步骤1)所述样品溶液注入分离检测系统中，用步骤2)所述流动相对步骤1)所述样品溶液进行洗脱分离得洗脱液；

4)步骤3)所述洗脱液进入检测器测定。

所述杂质包括工艺杂质和降解杂质，为杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I和杂质J的一种或多种，具体名称及结构为：

上述方法能快速同时实现上述杂质的分离和检测，精密度和灵敏度高，可在25分钟内将利伐沙班及其10种制剂杂质A-J完全分离并进行检测，提供了现有技术未能解决的利伐沙班及其相关杂质的分离测定问题，从而确保了利伐沙班及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

进一步，步骤1)所述乙腈水溶液中：乙腈和水的体积比为25-30:75-70，优选30:70。

所述样品溶液中每1ml含利伐沙班0.05-0.5mg。进样量会影响色谱柱分离效果和分析结果。进样量影响：进样量过大会造成色谱柱超负荷，多组分色谱峰重叠，分离效果差；进样量过少，又会使含量低的组分因检测器灵敏度不够而不出峰。最大允许的进样量应控制在峰高或峰面积与进样量呈线性关系的范围内。

进一步，步骤2)中所述无机盐缓冲体系的pH值为3-5。优选pH值为3.7-4.2。用氢氧化钠或氢氧化钾溶液调节磷酸-离子对试剂溶液pH值，在此pH值区间内均能很好地分离利伐沙班及其杂质。

进一步，步骤2)中所述无机盐缓冲体系为磷酸缓冲体系，磷酸的浓度为0.005mol/L-0.1mol/L，优选为0.01-0.05mol/L。

进一步，步骤3)所述分离检测系统为高效液相色谱仪，其色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱柱箱温度为25-45℃。十八烷基硅烷键合硅胶，完全球型、表面光滑的多孔硅胶，具有非常高的表面键合覆盖率。一般用在高效液相色谱中的固定相。该硅胶整体柱键合效果良好，具有较好的反相色谱性能，在pH 2-8之间稳定性好，柱压降、柱效受流速影响较小，对多种心血管系统用药可以达到快速、有效的分离。

进一步，步骤3)所述流动相流速为0.5-1.5ml/min。进样速度也会影响色谱柱分离效果和分析结果。进样速度的影响：进样速度慢则会使色谱峰形加宽，影响分离效果。

进一步，所述检测器的检测波长为210-280nm。

本发明的目的还在于提供一种所述试剂组合物在其他药品及其杂质分离测定的应用。

本发明的目的还在于提供一种上述方法在分离测定利伐沙班原料药及制剂中各有关物质含量的应用。提供了现有技术未能解决的利伐沙班及其相关杂质的分离测定问题，从而确保了利伐沙班及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

本发明的有益效果在于：本发明用酸性离子对试剂及有机溶剂为流动相采用高效液相色谱法分离测定利伐沙班及其杂质，该方法在25分钟内可同时将利伐沙班及其杂质完全分离并进行检测；本发明中方法简便可行，灵敏度高，分析时间短，专属性强，重现性好，可以有效测定利伐沙班原料药及制剂中各有关物质含量，提供了现有技术未能解决的利伐沙班及其相关杂质的分离测定问题，从而确保了利伐沙班及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

附图说明

图1为空白溶剂的高效液相色谱图。

图2为利伐沙班及杂质A-J的混合溶液高效液相色谱图。

图3为对比试验的高效液相色谱图。

图4为利伐沙班片辅料空白的高效液相色谱图。

图5为利伐沙班片的高效液相色谱图。

图6为利伐沙班碱降解的高效液相色谱图。

图7为利伐沙班氧化降解的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中，采用的仪器及色谱条件如下：

高效液相色谱仪：岛津LC-20AT

色谱柱：Purospher Star RP-18(55×4mm，3μm)

检测器检测波长：250nm

进样量：10μl

稀释剂(溶解对照品和待测样品的溶剂)：30％乙腈。

实施例1分离测定利伐沙班及其杂质的方法

(1)取利伐沙班及杂质对照品各适量，用30％乙腈水溶液溶解样品得样品溶液；

(2)流动相A的配制：称取戊烷磺酸钠2.0g、移取磷酸2.0ml于1000ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至4.0±0.1；流动相B为乙腈；

(3)取步骤(1)的样品溶液10μl注入型号为岛津LC-20AT的色谱仪，色谱柱型号为Purospher Star RP-18，设置流动相流速为1.0ml/min，检测波长为250nm，色谱柱柱箱温度为30℃；

表1进行线性梯度洗脱流动相A和流动相B的体积

时间(min)	0	1.0	18.0	18.1	25.0
						流动相A(％)	92	92	45	92	92
流动相B(％)	8	8	55	8	8

按表1所示的数据进行线性梯度洗脱，完成利伐沙班有关物质的分离及测定。

实施例2利伐沙班及其杂质的色谱检测

稀释剂作为空白对照样品，用实施例1中步骤1)所述样品溶液为供试样品。分别取稀释剂及样品溶液按实施例1方法的色谱条件进样，记录色谱图，测定结果见表2。高效液相色谱图见图1、图2。

表2试验测定结果

试验结果表明，稀释剂不干扰供试品的检测；各主要杂质峰理论板数均大于10000；各色谱峰之间的分离度均大于1.5；由此可见，本方法柱效高，分离效果好，专属性强。

实施例3不加酸性离子对试剂对比实施例

采用了不加酸性离子对试剂的磷酸缓冲溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为250nm，流速为1.0ml/min，按下表梯度程序进行洗脱：

时间(min)	0	13.0	13.1	18.0
					流动相A(％)	92	49	92	92
流动相B(％)	8	51	8	8

取实施例1中步骤1)所述样品溶液进样，记录色谱图，结果见图3。

试验结果表明，在对比实施例中的色谱条件下，杂质H为分裂变形峰，杂质E和杂质F不能有效分离，影响杂质的准确定量检测。对比实施例结果显示：本发明能够更好地分离检测利伐沙班及其制剂中的10种工艺杂质。

实施例4采用不同离子对试剂对利伐沙班及其杂质进行分离

分别采用戊烷磺酸钠和庚烷磺酸钠为酸性离子对试剂(0.8g/L)，其他色谱条件与实施例1中同，取实施例1中步骤1)所述样品溶液进样，记录色谱图，试验结果如下：

表3不同离子对试剂条件下混合溶液的测定结果

试验结果表明，采用不同的酸性离子对试剂均能很好地分离利伐沙班及其10种工艺杂质。

实施例5不同pH值对利伐沙班及其杂质进行分离的影响

参照实施例1中方法用戊烷磺酸钠离子对试剂配制流动相A，分别调节流动相A的pH为3.6、3.7、4.2，其他色谱条件与实施例1中同，取实施例1中步骤1)所述样品溶液分别进样，记录色谱图，试验结果如下：

表4不同pH值条件下混合溶液的测定结果

测定结果表明，流动相A的pH为3.6时，杂质B与杂质G的分离效果不够理想(分离度小于1.5)，而流动相A的pH为3.7、4.2时，均能很好地分离利伐沙班及其10种工艺杂质。

实施例6利伐沙班片辅料对利伐沙班测定的影响

取利伐沙班片1片(含利伐沙班10mg)，置50ml量瓶中，加30％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

取供试品溶液，按实施例1中色谱条件进样，记录色谱图，并同法进行空白辅料试验，结果见图4、图5。

试验结果表明，空白辅料不干扰本品的测定，说明本发明的方法可以用于利伐沙班片的质量检测。

实施例7利伐沙班降解产物测定

取利伐沙班10mg，精密称定，置50ml量瓶中，用30％乙腈25ml溶解，加入1mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，室温下放置1小时，加1mol/L的盐酸0.5ml中和，用水稀释至刻度，摇匀，过滤，作为碱降解产物测定用溶液。

取利伐沙班10mg，精密称定，置于50ml量瓶中，用60％乙腈25ml溶解，加30％的双氧水0.5ml，在100℃水浴中放置2h后，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，作为氧化降解产物测定用溶液。

取上述降解产物测定用溶液进样，记录色谱图，同时做空白试验，记录色谱图，如图6、图7所示，按面积归一化法计算各杂质含量，并分析试验结果。

试验结果表明，该色谱系统可将样品所有杂质和碱、氧化的剧烈降解条件下产生的杂质均能很好分离，表明本方法的灵敏度及专属性好。

实施例8色谱系统对利伐沙班及其杂质的检测限、定量限基础研究

定量限溶液：精密称取各杂质对照品，配成一定浓度的溶液，并逐级稀释得定量限溶液，如表5所示。

检测限溶液：精密移取定量限溶液17.0ml，置50ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液，如表6所示。

测定方法：

取上述定量限溶液连续进样3次，检测限溶液连续进样2次，计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)。记录色谱图，试验结果见表5和表6。

表5定量限测定结果

表6检测限测定结果

从上表试验数据可知，本色谱系统下，利伐沙班及及其杂质A-J的检测限、定量限均符合要求。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.用于固液分离测定利伐沙班及其杂质的试剂组合物，其特征在于，由以下试剂组成：

试剂A：加有酸性离子对试剂的无机盐缓冲体系，所述酸性离子对试剂的浓度为0.2g/L-4.0g/L；

试剂B：有机溶剂；

所述酸性离子对试剂为：1-戊烷磺酸钠、1-己烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠、1-辛烷磺酸钠和1-癸烷磺酸钠中的一种或多种；

所述有机溶剂为乙腈。

2.用权利要求1-3任一项所述试剂组合物分离测定利伐沙班及其杂质的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)取利伐沙班溶于乙腈水溶液得样品溶液；

2)配制流动相：

a配制所述试剂A得流动相A；

b所述试剂B做流动相B；

3)将步骤1)所述样品溶液注入分离检测系统中，用步骤2)所述流动相对步骤1)所述样品溶液进行洗脱分离得洗脱液；

4)步骤3)所述洗脱液进入检测器测定。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述乙腈水溶液中：乙腈和水的体积比为25-30:75-70。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述无机盐缓冲体系的pH值为3-5。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述无机盐缓冲体系为磷酸缓冲体系，磷酸的浓度为0.005mol/L-0.1mol/L。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述分离检测系统为高效液相色谱仪，其色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱柱箱温度为25-45℃。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述流动相流速为0.5-1.5ml/min。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述检测器的检测波长为210-280nm。

9.权利1所述试剂组合物在其他药品及其杂质分离测定的应用。

10.权利要求2所述的方法在分离测定利伐沙班原料药及制剂中各有关物质含量的应用。