CN106525533B - 高茶氨酸茶树资源快速筛选方法 - Google Patents

高茶氨酸茶树资源快速筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高茶氨酸茶树资源快速筛选的方法。茶树茶氨酸占其氨基酸总量的40%‑70%，高茶氨酸茶树资源其茶氨酸含量大于其干重的2.5%。通过酶标仪利用96孔板筛选茶树氨基酸含量≥3.57%的资源作为候选资源，并利用液相色谱进一步测定其茶氨酸含量来进行快速筛选。本发明具有通量高、快速而准确的优点。

Description

高茶氨酸茶树资源快速筛选方法
技术领域
本发明涉及生化分析领域，具体涉及一种高茶氨酸茶树资源快速筛选方法。
背景技术
茶氨酸是茶树的特征性氨基酸。在茶叶中茶氨酸的含量是其干重的1％-2％，游离氨基酸的40％-70％。由于茶氨酸具有镇静安神等多项生理功能，因此筛选高茶氨酸茶树资源具有重要应用价值。
目前对茶叶中茶氨酸的检测方法主要有分光光度法，纸层析法、气象色谱法、碱式碳酸铜沉淀法、薄层色谱法、核磁共振法、液相色谱法、氨基酸自动分析仪分析法及毛细管电泳法等，其中后3种是最常用的方法。由于茶氨酸无荧光发射特性，且紫外吸收尚未确定，因此在对其进行检测时通常都需要进行显色或者衍生化处理，从而导致检测样品费时费力。高茶氨酸茶树资源在茶树中的比例特别低，通过大规模群体筛选需要花费很大的人力物力，因此不适合大规模筛选。通过96孔板进行氨基酸含量测定，筛选出候选资源再进一步测定可大大缩短时间。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种高茶氨酸茶树资源快速筛选方法。采用本发明的方法，可以快速、精确的定位高茶氨酸茶树资源。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，步骤如下：
S1.候选资源的筛选：利用96孔板酶标仪法，先筛选出氨基酸含量高的茶树资源，将其作为候选资源；
S2.高茶氨酸茶树资源筛选：利用OPA柱前衍生-HPLC法测定候选资源中茶氨酸含量，根据茶氨酸含量高低来筛选出高茶氨酸茶树资源。
进一步地，所述候选资源的筛选，具体步骤如下：
S11.L-谷氨酸标准曲线的绘制：准确称量谷氨酸配置成母液，并配置成不同浓度梯度的工作液用于绘制L-谷氨酸标准曲线；
S12.茶汤的制备：将茶叶研磨成茶粉，准确称量0.1g样品于10ml的离心管中，用移液管加入10ml的100℃水，混匀后置于100℃水浴锅中加热45min，每隔10min混匀一次；冷却至室温，低速离心后用1ml移液器抽取上清过0.22um滤膜至2ml EP管中备用；
S13.测定吸光度：取1ml S12中茶汤或S11中L-谷氨酸工作液、0.5ml pH8.0的磷酸缓冲液及茚三酮溶液于2ml的EP管中混匀，置于100℃水浴锅中加热15min，期间每隔3min混匀一次；冷却后，取20ul反应液于96孔酶标板上，并加入230ul水，利用酶标仪测吸光值；
S14.氨基酸含量的计算：根据茶汤氨基酸的吸光度，对照L-谷氨酸标准曲线推算出氨基酸含量，选出氨基酸含量高的资源即可。
进一步地，所述候选资源中茶树氨基酸含量≥3.57％。
进一步地，所述茶叶为春季采摘一芽二叶茶树品种。
进一步地，所述L-谷氨酸标准溶液浓度分别为：0.1mg/ml、0.12mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml。
进一步地，所述高茶氨酸茶树资源筛选，步骤还包括茶氨酸标准曲线的绘制。
进一步地，所述茶氨酸标准曲线的绘制，具体步骤为准确称取0.1g茶氨酸配置成母液，然后配置成不同浓度的工作液用于绘制标准曲线。
进一步地，所述茶氨酸标准曲线浓度分别为20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、100ug/ml。
进一步地，所述高效液相色谱法，具体色谱条件如下：
色谱柱：4.6mm*250mm，5um的C18柱
流动相：A：40mM Na2HPO4pH8.0盐溶液；
B：乙腈：甲醇：水为45v:45v:10v
流速：2ml/min
波长：338nm
梯度洗脱程序：0-1min，流动相A：90％，流动相B：10％；1-9.8min，流动相A：90％，流动相B：10％；9.8-10min，流动相A：43％，流动相B：57％；10-12min，流动相A：0％，流动相B：100％；12-12.5min，流动相A：0％，流动相B：100％；12.5-14min，流动相A：90％，流动相B：10％。
本发明的有益效果是：与传统的液相色谱检测法相比，本发明的方法可以快速，准确的定位高茶氨酸茶树资源。
附图说明
图1：不同浓度L-谷氨酸标准溶液显色图。
图2：L-谷氨酸吸光度-浓度标准曲线图。
图3:23个样品氨基酸96孔板显色图。
图4：23个样品氨基酸含量测定图。
图5：茶氨酸吸光度-浓度标准曲线图。
图6：HPLC法测定茶氨酸色谱图。
图7：23个品种资源氨基酸总量及茶氨酸含量。
具体实施例方式
下面利用实施例对本发明进行更详细的说明。
一)L-谷氨酸标准曲线的绘制
准确称量0.1g谷氨酸试剂，在烧杯中溶解于70ml的水中，在100ml的容量瓶中定容，配置成1mg/ml的谷氨酸母液。用移液管分别吸取0.5ml、0.75ml、1ml、1.25ml、1.5ml、1.75ml、2ml、2.25ml、2.5ml的母液于5ml容量瓶中并进行定容配置成浓度为0.1mg/ml、0.12mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml。
二)茶汤的制备
春季采集23个茶树品种一芽二叶制备蒸清样，并研磨成茶粉，准确称量0.1g样品于10ml的玻璃离心管中，用移液管加入10ml100℃的双蒸水，盖上螺纹盖并混匀。混匀后置于100℃水浴锅中加热45min，期间每隔10min混匀一次，每个样品4次重复。
三)96孔板法测定样品氨基酸含量
将样品从水浴锅中取出，冷却至室温后低速离心，用注射器抽取上清1ml并用0.22um的滤膜进行过滤，滤液保存在2ml的EP管中。用移液器分别抽取1ml茶汤或L-谷氨酸工作液、0.5mlpH8.0的磷酸缓冲液及茚三酮溶液于2ml的EP管中，混匀。置于100℃水浴锅中加热15min，期间每隔3min混匀一次。取出，在室温下冷却。取20ul反应后产物于96孔酶标板上，并加入230ul水进行稀释。摇匀后，利用酶标仪检测吸光值。
通过96孔板进行标准曲线绘制，不同浓度L-谷氨酸通过显色反应显示出不同深度的颜色，浓度越高，颜色越深，如图1所示，其中1-9孔L-谷氨酸的浓度分别为0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml和0.5mg/ml，10孔为空白对照。通过对23个样品测定后颜色深浅度(如图3所示)，可初步判断氨基酸含量高低，其中23个样品分布于96孔板情况如下表：
L-谷氨酸吸光度-浓度标准曲线如图2所示，从图2得到线性回归方程为Y＝-0.265+3.02143X，样品氨基酸含量则可根据吸光值及推算氨基酸含量公式计算得出，公式如下：
其中，C为氨基酸浓度百分比，OD为吸光度，M/n为样品干重。
四)高茶氨酸茶树候选资源筛选
根据茶树茶氨酸占其氨基酸总量的40％-70％，高茶氨酸茶树资源其茶氨酸含量大于其干重的2.5％，因此通过酶标仪利用96孔板筛选茶树氨基酸含量≥3.57％的资源作为筛选高茶氨酸的候选资源。通过吸光度推算，其中14号和22号样品氨基酸含量大于3.57％，其氨基酸含量分别为3.57％和3.62％，可进一步进行茶氨酸含量测定。
五)高茶氨酸茶树候选资源茶氨酸含量的检测
茶氨酸标准曲线的绘制：准确称量茶氨酸0.1g溶解于80ml水中，并用容量瓶定容到100ml，配置成1mg/ml母液，并分别取20ul、40ul、60ul、80ul及100ul并用水稀释定容到100ml，制备成20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、100ug/ml的工作液。
将候选资源茶汤及茶氨酸工作液进行柱前衍生并进行HPLC检测。衍生条件如下：
从瓶1中吸取2.5ul(硼酸盐缓冲液)吸取0.5u样品，“在空气中”混合3ul，最大速度，2次。等待0.5分钟。从瓶2中吸取0ul水(用未加盖瓶中水清洗针头)。从瓶3中吸取0.5ulOPA。“在空气中”混合3ul，最大速度，6次。从瓶2中吸取0ul水(用未加盖瓶中水清洗针头)。从瓶4中吸取32ul水。“在空气中”混合18ul，最大速度，2次。进样。
色谱条件如下：
色谱柱：4.6mm*250mm，5um的C18柱
流动相：A：40mMNa2HPO4pH8.0盐溶液；B：乙腈：甲醇：水为45v:45v:10v
流速：2ml/min
波长：338nm
梯度洗脱程序：0-1min，流动相A：90％，流动相B：10％；1-9.8min，流动相A：90％，流动相B：10％；9.8-10min，流动相A：43％，流动相B：57％；10-12min，流动相A：0％，流动相B：100％；12-12.5min，流动相A：0％，流动相B：100％；12.5-14min，流动相A：90％，流动相B：10％。
通过筛选获得14号和22号样品氨基酸含量大于3.57％，利用HPLC进行检测其茶氨酸含量分别为2.37％和2.62％。其中22号资源茶氨酸含量大于2.5％，为高茶氨酸资源。同时对其他19份资源也进行了检测，其结果如图7所示。与传统的液相色谱检测法相比，分析23份资源，可节约用时21.5小时，而测定的结果基本一致。因此，本发明比传统方法具有通量高、快速而准确的优势。
六)对照例实施方式
茶汤制备：春季采集23个茶树品种一芽二叶制备蒸清样，并研磨成茶粉，准确称量1g样品于100ml的锥形瓶中，加入90ml沸水，然后将其置于沸水浴中浸提45min，每10min震荡一次。浸提完毕后，趁热过滤，待茶汤冷却至室温后定容至100ml，备用。
将23个茶树品种按照(五)中方法进行HPLC方法检测。

Claims (8)

1.一种高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，其特征在于，步骤如下：
S1.候选资源的筛选：利用96孔板酶标仪法，先筛选出氨基酸含量高的茶树资源，将其作为候选资源；
S2.高茶氨酸茶树资源筛选：利用OPA柱前衍生‐HPLC法测定候选资源中茶氨酸含量，根据茶氨酸含量高低来筛选出高茶氨酸茶树资源；所述候选资源的筛选，具体步骤如下：
S11.L‐谷氨酸标准曲线的绘制：准确称量谷氨酸配制成母液，并配制成不同浓度梯度的工作液用于绘制L‐谷氨酸标准曲线；
S12.茶汤的制备：将茶叶研磨成茶粉，准确称量0.1g样品于10ml的离心管中，用移液管加入10ml的100℃水，混匀后置于100℃水浴锅中加热45min，每隔10min混匀一次；冷却至室温，低速离心后用1ml移液器抽取上清过0.22um滤膜至2mlEP管中备用；
S13.测定吸光值：取1mlS12中备用的茶汤或S11中L‐谷氨酸工作液、0.5mlpH8.0的磷酸缓冲液及茚三酮溶液于2ml的EP管中混匀，置于100℃水浴锅中加热15min，期间每隔3min混匀一次；冷却后，取20ul反应液于96孔酶标板上，并加入230ul水，利用酶标仪测吸光值；
S14.氨基酸含量的计算：根据茶汤氨基酸的吸光值，对照L‐谷氨酸标准曲线推算出氨基酸含量，选出氨基酸含量高的资源即可。
2.根据权利要求1所述高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，其特征在于，所述候选资源中茶树氨基酸含量≥3.57％。
3.根据权利要求1所述高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，其特征在于，所述茶叶为春季采摘一芽二叶茶树品种。
4.根据权利要求1所述高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，其特征在于，所述L‐谷氨酸标准溶液浓度分别为：0.1mg/ml、0.12mg/ml、0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml。
5.根据权利要求1所述高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，其特征在于，所述高茶氨酸茶树资源筛选，具体步骤还包括茶氨酸标准曲线的绘制。
6.根据权利要求5所述高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，其特征在于，所述茶氨酸标准曲线的绘制，具体步骤为准确称取0.1g茶氨酸配制成母液，然后配制成不同浓度梯度的工作液用于绘制标准曲线。
7.根据权利要求6所述高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，其特征在于，所述茶氨酸标准溶液浓度分别为20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、100ug/ml。
8.根据权利要求1所述高茶氨酸茶树资源快速筛选方法，其特征在于，所述高效液相色谱法，具体色谱条件如下：
色谱柱：4.6mm*250mm，5um的C18柱
流动相：A：40mM pH8.0Na2HPO4盐溶液；
B：乙腈：甲醇：水体积比为45:45:10
流速：2ml/min
波长：338nm
梯度洗脱程序：0‐1min，流动相A：90％，流动相B：10％；1‐9.8min，流动相A：90％，流动相B：10％；9.8‐10min，流动相A：43％，流动相B：57％；10‐12min，流动相A：0％，流动相B：100％；12‐12.5min，流动相A：0％，流动相B：100％；12.5‐14min，流动相A：90％，流动相B：10％。
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