CN112326855A - 一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及茶叶水浸出成分测定方法技术领域，且公开了一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，包括以下步骤：1)称取1.00g粉碎茶样(过40目筛网)于100mL锥形瓶中，加入100mL90℃的超纯水；2)立即放入90℃水浴中超声提取20min，提取完成后，静置，冷却室温；该快速测定茶叶12种水浸出物的方法，茶叶水浸出成分中多种成分同时测定，简化了检测方法，缩短检测时间，提高检测效率，以茶叶12种水浸出成分为代表建立了UPLC分析方法，可以同时快速对茶氨酸、茶多酚和生物碱进行测定；所述测方法所述测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，为茶叶品质鉴定、质量控制和茶水浸出物分析提供科学依据。

Description

一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法
技术领域
本发明涉及茶叶水浸出成分测定方法技术领域，具体为一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法。
背景技术
茶叶中含有多种多酚类物质、氨基酸和生物碱等活性成分。茶叶中多酚类物质含量较高，占其质量的15％～30％，多酚类物质中又儿茶素类化合物含量最高，占茶多酚总量的60％～80％，具有抗氧化和清除自由基的作用。茶叶中氨基酸以茶氨酸含量最高，占整个游离氨基酸的70％，是茶叶中生津润甜的主要成份。生物碱是茶树重要的代谢产物，其中咖啡碱和可可碱含量较高。
目前对茶主成份测定报导较多，但对茶叶水浸出成分测定较少，已有的文献报道主要分为两大类，一类是总量测定，主要有分光光度法、氧化滴定法和近红外光谱法等，这些方法只能测定一类物质量的总和，不能分别定量。另一类组分定量，主要是高效液相色谱法(HPLC)，该方法存在分析速度慢，结构相似的组分分离度低，一次进样分离的组分少等不足。
超高效液相色谱法(UPLC)检测的优越性体现在UPLC在分析速度、分离度、灵敏度方面与传统的高效液相色谱(HPLC)有明显提高，因此需要开发一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，具备可快速测定茶叶水浸出成分的优点，解决了传统测定方法存在的分析速度慢，结构相似的组分分离度低，一次进样分离的组分少等问题。
(二)技术方案
为实现上述可快速测定茶叶水浸出成分的目的，本发明提供如下技术方案：一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，包括以下步骤：
1)称取1.00g粉碎茶样(过40目筛网)于100mL锥形瓶中，加入100mL 90℃的超纯水；
2)立即放入90℃水浴中超声提取20min，提取完成后，静置，冷却室温；
3)用超纯水定溶100ml，4500r/min离心5min后取上层清液，过0.22μm滤膜，备用；
4)取3)中过滤后的清液采用超高效液相色谱二级管阵列检测法同时快速测定茶叶12种水浸出成分；
5)根据所述12种浸出成分各自的标准曲线得到茶叶样品水浸出成分中的12种物质的含量。
优选的，所述1)中超高效液相色谱二级管阵列检测法的色谱条件为：
a)采用waters ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱，柱温为30℃，
b)以乙腈和0.01％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，进样量为2μL，流动相流速为0.3mL/min，检测波长为210nm。
优选的，所述茶叶12种水浸出成分为：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子酸(GA)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、没食子儿茶素(GC)、茶氨酸(L-Theanine)、咖啡因(CAF)、可可碱(THE)。
优选的，所述梯度洗脱过程中，流动相中乙腈的浓度分别为0～1min，0％乙腈；1～10min，0％～15％乙腈；10-15min，15％乙腈；15-16min，15％～0％乙腈。
优选的，所述色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.7μm。
优选的，所述b)中乙腈和0.01％磷酸水为流动相，通过比较以有机相(甲醇、乙腈)，水相(甲酸水、乙酸水和磷酸水)的不同搭配，最终选出最适流动相，实验过程中发现采用甲醇流动相时，成分没食子儿茶素(GC)与可可碱(THE)出现部分重叠，即使优化洗脱条件仍无法实现两个峰的有效分离，因此有机相选择乙腈，在考察乙腈与不同酸型水相以及不同浓度的流动相对12种目标物分离度影响时，发现采用乙腈-甲酸水、乙腈-乙酸水，表儿茶素没食子酸酯(ECG)和儿茶素没食子酸酯(CG)较难分离，而采用乙腈和0.01％磷酸水作为流动相对表儿茶素没食子酸酯(ECG)和儿茶素没食子酸酯(CG)分离度有显的改善，因此，本发明优选乙腈和0.01％磷酸水为流动相。
优选的，所述b)中提高流动相磷酸水的初始比例，有助茶氨酸保留，当磷酸水小于95％时，茶氨酸不能与溶剂峰分离，当磷酸水初始比例提高100％时，茶氨酸与溶剂峰有效分离。
优选的，所述色谱为最优的色谱组合条件，在上述色谱条件下检出限：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)3.2mg/kg、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)8.3mg/kg、表儿茶素没食子酸酯(ECG)8.2mg/kg、没食子酸(GA)5.6mg/kg、儿茶素没食子酸酯(CG)8.9mg/kg、表儿茶素(EC)5.1mg/kg、表没食子儿茶素(EGC)10.1mg/kg、儿茶素(C)7.6mg/kg、没食子儿茶素(GC)7.5mg/kg、茶氨酸(L-Theanine)15.6mg/kg、咖啡因(CAF)4.7mg/kg、可可碱(THE)7.9mg/kg。
优选的，所述所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682-2008的要求，乙腈：色谱纯，磷酸:分析纯，0.01％磷酸溶液(体积分数)：量取40μL磷酸，加入400mL超纯水中，纯水相孔滤膜(0.22μm)过滤，测试仪器：超高效液相色谱仪(配有四元泵、二极管阵列检测器)，天平：感量为0.0001g，超声波清洗仪，粉碎机，离心机。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，具备以下有益效果：
该快速测定茶叶12种水浸出物的方法，茶叶水浸出成分中多种成分同时测定，简化了检测方法，缩短检测时间，提高检测效率，以茶叶12种水浸出成分为代表建立了UPLC分析方法，可以同时快速对茶氨酸、茶多酚和生物碱进行测定；所述测方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，为茶叶品质鉴定、质量控制和茶水浸出物分析提供科学依据。
附图说明
图1是12种混合标准溶液的UPLC图；
其中：1、茶氨酸(L-Theanine)；2、没食子酸GA；3、没食子儿茶素GC；4、可可碱(THE)；5、表没食子儿茶素(EGC)；6、儿茶素(C)；7、咖啡因(CAF)；8、表儿茶素(EC)；9、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)；10、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)；11、表儿茶素没食子酸酯(ECG)；12、儿茶素没食子酸酯(CG)。
图2是茶样品的UPLC图(色谱峰对应的成分名称与图1一致)；
图3-1～图3-12是12种标准物质标准曲线图(其中，图3-1～3-12与图1中1～12一一对应)。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，包括以下步骤：
1)称取1.00g粉碎茶样(过40目筛网)于100mL锥形瓶中，加入100mL90℃的超纯水；
2)立即放入90℃水浴中超声提取20min，提取完成后，静置，冷却室温；
3)用超纯水定溶100ml，4500r/min离心5min后取上层清液，过0.22μm滤膜，备用；
4)取3)中过滤后的清液采用超高效液相色谱二级管阵列检测法同时快速测定茶叶12种水浸出成分；
5)根据所述12种浸出成分各自的标准曲线得到茶叶样品中12种浸出成分物质的含量。
优选的，所述1)中超高效液相色谱二级管阵列检测法的色谱条件为：
a)采用waters ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱，柱温为30℃，
b)以乙腈和0.01％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，进样量为2μL，流动相流速为0.3mL/min，检测波长为210nm。
优选的，所述茶叶12种水浸出成分为：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子酸(GA)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、没食子儿茶素(GC)、茶氨酸(L-Theanine)、咖啡因(CAF)、可可碱(THE)。
优选的，所述梯度洗脱过程中如表1所示，流动相中乙腈的浓度分别为0～1min，0％乙腈；1～10min，0％～15％乙腈、10～15min，15％乙腈、15～16min，15％～0％乙腈。
优选的，所述色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.7μm。
表1 UPLC梯度洗脱程序
Figure BDA0002769902880000061
Figure BDA0002769902880000071
优选的，所述b)中乙腈和0.01％磷酸水为流动相，通过比较以有机相(甲醇、乙腈)，水相(甲酸水、乙酸水和磷酸水)的不同搭配，最终选出最适流动相，实验过程中发现采用甲醇流动相时，成分没食子儿茶素(GC)与可可碱(THE)出现部分重叠，即使优化洗脱条件仍无法实现两个峰的有效分离，因此有机相选择乙腈，在考察乙腈与不同酸型水相以及不同浓度的流动相对12种目标物分离度影响时，发现采用乙腈-甲酸水、乙腈-乙酸水，表儿茶素没食子酸酯(ECG)和儿茶素没食子酸酯(CG)较难分离，而采用乙腈和0.01％磷酸水作为流动相对表儿茶素没食子酸酯(ECG)和儿茶素没食子酸酯(CG)分离度有显的改善，因此，本发明优选乙腈和0.01％磷酸水为流动相。
优选的，所述b)中提高流动相磷酸水的初始比例，有助茶氨酸保留，当磷酸水小于95％时，茶氨酸不能与溶剂峰分离，当磷酸水初始比例提高100％时，茶氨酸与溶剂峰有效分离。
优选的，所述色谱为最优的色谱组合条件，在上述色谱条件下检出限：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)3.2mg/kg、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)8.3mg/kg、表儿茶素没食子酸酯(ECG)8.2mg/kg、没食子酸(GA)5.6mg/kg、儿茶素没食子酸酯(CG)8.9mg/kg、表儿茶素(EC)5.1mg/kg、表没食子儿茶素(EGC)10.1mg/kg、儿茶素(C)7.6mg/kg、没食子儿茶素(GC)7.5mg/kg、茶氨酸(L-Theanine)15.6mg/kg、咖啡因(CAF)4.7mg/kg、可可碱(THE)7.9mg/kg。
优选的，所述所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682-2008的要求，乙腈：色谱纯，磷酸:分析纯，0.01％磷酸溶液(体积分数)：量取40μL磷酸，加入400mL超纯水中，纯水相孔滤膜(0.22μm)过滤，测试仪器：超高效液相色谱仪(配有四元泵、二极管阵列检测器)，天平：感量为0.0001g，超声波清洗仪，粉碎机，离心机。
实施例一：
标准溶液的配制：
(1)标准品(进口)：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，纯度98.96％)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG，纯度99.35％)、表儿茶素没食子酸酯(ECG，纯度98.58％)、没食子酸(GA，纯度99.42％)、儿茶素没食子酸酯(CG，纯度99.51％)、表儿茶素(EC，纯度99.63％)、表没食子儿茶素(EGC，纯度99.90％)、儿茶素(C，纯度98.33％)、没食子儿茶素(GC，纯度98.82％)、茶氨酸(L-Theanine，纯度98.61％)、咖啡因(CAF，纯度99.99％)、可可碱(THE，纯度99.90％)。
准确称取适量标准品用纯水溶解，配制成质量浓度为2.00mg/mL的储备溶液。分别准确移取上述储备液，用纯水稀释、配制成不同浓度的标准工作液。
混标工作液：精密量取单标储备注液适量，于10ml容量瓶中，纯水定容至刻度，摇匀，分别配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/mL的混合标准溶液，按如下色谱条进行分析测，得到相应的图谱，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标作图绘标准曲线，12种成的标准曲线如图3-1～3-12所示，各成分的线性方程和相系数如表2所示。
色谱柱：waters ACQUITYUPLC BEH C18(2.1mm×100mm×1.7μm)
流动相：乙腈+0.01％磷酸水溶液；
梯度洗脱程序(如表1所示)：0～1min，0％乙腈；1～10min，0％～15％乙腈、10～15min，15％乙腈、15～16min，15％～0％乙腈；
检测波长：210nm
柱温：30℃
流速：0.3ml/min
进样量：2μL
混合标准工作液的UPLC图如图1所示。
样品处理：称取1.00g粉碎茶样(过40目筛网)于100mL锥形瓶中，加入100mL90℃的超纯水，立即放入90℃水浴中超声提取20min，提取完成后，静置，冷却室温，用超纯水定溶100ml，4500r/min离心5min后取上层清液，过0.22μm滤膜上机测度。
超效液相色谱标
色谱柱：waters ACQUITYUPLC BEH C18(2.1mm×100mm×1.7μm)
流动相：乙腈+0.01％磷酸水溶液；
梯度洗脱程序(如表1所示)：0～1min，0％乙腈；1～10min，0％～15％乙腈、10～15min，15％乙腈、15～16min，15％～0％乙腈；
检测波长：210nm
柱温：30℃
流速：0.3ml/min
进样量：2μL
测定：
按上述色谱条件对处理液和混合标准工作液进行上机测定，以标准溶液保留时间为依据定性，以峰面积求出样液中被测物质含量。
结果计算：
样品中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子酸(GA)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、没食子儿茶素(GC)、茶氨酸(L-Theanine)、咖啡因(CAF)、可可碱(THE)的含量按下式计算：
Figure BDA0002769902880000101
式中：
X、样品中待测组分含量，单位为克每千克(g/kg)；
C、由对应标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；
V、样品定容体积，单位为毫升(mL)；
m、样品质量，单位为克(g)。
各种物质的回归方程、相关系数和检出限，如表2所示：
表2中12种混标的回归方程、相关系数及检出限
Figure BDA0002769902880000102
Figure BDA0002769902880000111
精密度、稳定性与回收率实验
精密度实验：取同一样品按上述样品处理方法制备样液，连续进样6次，记录目标成分色谱峰的保留时间和峰面积，计算相对标准偏差RSD值，实验结果得出茶样中12成分的保留时间和峰面积RSD分别是0.13～0.23％和0.56～3.9％(详见表3)，表明精密度良好。
稳定性试验：取刚制备好的样液，分别放置0、2、4、8、16、24h后，进行测定，连续进样6次，根据样液中检出成分的峰面积，计算其RSD值，茶样中12种成分含量的RSD值均小于3.4％(详见表3)。结果表明，供试品溶液在24h内测定的色谱结果是稳定的。
回收率实验：对茶叶水浸出物中12种有效成分进行3水平，6平行的加标回收分析，结果显示12种有效成分回收率在89.3～112.6％之间，相对标准偏差(RSD)在1.0～3.7％之间(详见表3)。
表3精密度、稳定性与回收率实验结果(n＝6)
Figure BDA0002769902880000112
Figure BDA0002769902880000121
实施例二：
按照实施例一的测定方法，制备3个平行样品放进行测定，得到的茶样12种水浸出成分物质含量，具体测定结果如表4所示：
表4绿茶12种水浸出成份的测定结果(n＝3)
Figure BDA0002769902880000122
综上所述，该快速测定茶叶12种水浸出物的方法，茶叶水浸出成分中多种成分同时测定，简化了检测方法，缩短检测时间，提高检测效率。以茶叶12种水浸出成分为代表建立了UPLC分析方法，可以同时快速对茶氨酸、茶多酚和生物碱进行测定；所述测方法所述测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，为茶叶品质鉴定、质量控制和茶水浸出物分析提供科学依据。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)称取1.00g粉碎茶样(过40目筛网)于100mL锥形瓶中，加入100mL90℃的超纯水；
2)立即放入90℃水浴中超声提取20min，提取完成后，静置，冷却室温；
3)用超纯水定溶100ml，4500r/min离心5min后取上层清液，过0.22μm滤膜，备用；
4)取3)中过滤后的清液采用超高效液相色谱二级管阵列检测法同时快速测定茶叶12种浸出成分；
5)根据所述12种浸出成分各自的标准曲线得到茶叶样品水浸出成分中12种物质的含量。
2.根据权利要求1所述的一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，所述1)中超高效液相色谱二级管阵列检测法的色谱条件为：
a)采用waters ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱，柱温为30℃；
b)以乙腈和0.01％磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，进样量为2μL，流动相流速为0.3mL/min，检测波长为210nm。
3.根据权利要求1所述的一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，所述茶叶12种水浸出成分为：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子酸(GA)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、没食子儿茶素(GC)、茶氨酸(L-Theanine)、咖啡因(CAF)、可可碱(THE)。
4.根据权利要求2所述的一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程中，流动相中乙腈的浓度分别为0～1min，0％乙腈；1～10min，0％～15％乙腈；10～15min，15％乙腈；15～16min，15％～0％乙腈。
5.根据权利要求2所述的一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，所述色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.7μm。
6.根据权利要求2所述的一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，所述b)中乙腈和0.01％磷酸水为流动相。
7.根据权利要求2所述的一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，所述b)中提高流动相磷酸水的初始比例，有助茶氨酸保留，当磷酸水小于95％时，茶氨酸不能与溶剂峰分离，当磷酸水初始比例提高100％时，茶氨酸与溶剂峰有效分离。
8.根据权利要求2所述的一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，所述色谱为最优的色谱组合条件，在上述色谱条件下检出限：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)3.2mg/kg、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)8.3mg/kg、表儿茶素没食子酸酯(ECG)8.2mg/kg、没食子酸(GA)5.6mg/kg、儿茶素没食子酸酯(CG)8.9mg/kg、表儿茶素(EC)5.1mg/kg、表没食子儿茶素(EGC)10.1mg/kg、儿茶素(C)7.6mg/kg、没食子儿茶素(GC)7.5mg/kg、茶氨酸(L-Theanine)15.6mg/kg、咖啡因(CAF)4.7mg/kg、可可碱(THE)7.9mg/kg。
9.根据权利要求2所述的一种快速测定茶叶12种水浸出物的方法，其特征在于，所述所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682-2008的要求，乙腈：色谱纯，磷酸:分析纯，0.01％磷酸溶液(体积分数)：量取40μL磷酸，加入400mL超纯水中，纯水相孔滤膜(0.22μm)过滤，测试仪器：超高效液相色谱仪(配有四元泵、二极管阵列检测器)，天平：感量为0.0001g，超声波清洗仪，粉碎机，离心机。
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