CN114113369A - 一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法,属于茶树品种抗虫性鉴定的技术领域。本发明一方面提供了一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法;另一方面提供了儿茶素类化合物在快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种中的应用。上述的一种快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法,设计合理,通过该方法能够快速鉴定灰茶尺蠖抗感茶树品种,可靠性强;并且,儿茶素各组分含量为确定茶叶品质的必检生化指标,兼顾了茶树抗虫性的鉴定,该方法经济便于推广;同时,本发明提供了儿茶素化合物的一种新用途。
Description
技术领域
本发明属于茶树品种抗虫性鉴定的技术领域,具体涉及一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法。
背景技术
茶树起源于中国西南茶区,茶产业是我国传统优势产业和绿色生态产业。灰茶尺蠖(Ectropis grisescens) 隶属于鳞翅目(Lepidoptera),尺蠖蛾科(Geometridae),又名灰茶尺蛾,是茶树上重要的咀嚼式口器害虫,以幼虫取食茶树叶片为害,除浙江杭州和安徽十字镇外,灰茶尺蠖在我国其他产茶区均有分布,是四大茶区重点防控的害虫种类之一。灰茶尺蠖1年发生6-7代,以蛹在茶树根际土壤中越冬,初孵幼虫分布在茶丛顶层,形成发虫中心。暴发成灾时,可将嫩叶、老叶甚至嫩茎等全部吃光,对茶叶产量影响极大。而且,还会导致树势衰弱,降低后续茶叶的产量和品质,以及茶树对其他病虫害和非生物逆境的抗性,对茶树生长极为不利。灰茶尺蠖是茶尺蠖(Ectropis obliqua Prout)的近缘种,与茶尺蠖形态特征极其相似,在生产上难以区分,通常被当成茶尺蠖进行田间防治。茶尺蠖核型多角体病毒(E. obliqua nuclear polyhedrosis viruses)EoNPV是控制茶尺蠖为害的重要生物防治手段,但是EoNPV对灰茶尺蠖幼虫的致病力不强,且至今尚没有灰茶尺蠖核型多角体病毒被分离的相关报道。目前,生产上对灰茶尺蠖的有效防治仍主要依赖于化学农药。化学农药的频繁使用不仅带来严重的环境与生态系统污染,而且还会影响饮茶者的健康。并且,化学农药的频繁使用还导致了农药残留、抗药性以及害虫再猖獗等系列问题的出现。例如,有研究发现信阳市灰茶尺蠖对氯虫苯甲酰胺等新型杀虫剂已产生低水平抗性。因此,如何科学而有效地防治灰茶尺蠖已成为茶树植保工作者的研究热点之一。
寄主植物抗性是公认的最有效和经济的抗虫策略之一,植物抗虫性品种选育是害虫综合治理的重要方面。抗虫性品种在水稻、玉米和棉花等很多作物的多种害虫综合治理方面发挥着重要的作用。茶树是多年生的木本经济作物,基因组杂合度高,生育周期长,目前尚无成熟的遗传转化体系,直接导致茶树抗虫品种选育水平显著滞后于其他作物。目前,不同茶树品种对尺蠖类害虫的抗性评价多采用田间调查、幼虫取食量和生长发育速率测定、成虫雌雄比和后代产卵量调查等多种方法。但是,上述抗虫性性状鉴定方法的研究周期长,且受地理条件、气候因素和人为干扰的影响大。至今,尚无一种尺蠖类害虫抗虫性茶树品种鉴定的高通量方法。大量研究结果表明,植食性昆虫为害可诱导植物产生大量的防御性化合物,这些防御性化合物可通过直接影响植食性昆虫的取食量或产卵量来保护植物遭受为害,也可通过吸引害虫的天敌前来捕食或寄生从而控制害虫的虫口密度。简言之,植物诱导抗虫性在植物的自我保护过程中发挥着重要作用,是植物在遭受植食性昆虫为害后所表现出的抗虫特性。深入的研究发现,植物品种、种类和生育期等因素也会影响植物抗虫性化合物的种类和诱导累积量。例如,有研究发现遭受稻飞虱为害的多个抗虫性水稻品种植株中的总酚含量显著高于感性水稻品种,极大地减少了稻飞虱在抗性品种上的种群繁殖效率,有效地减少了化学农药的使用量;叶蝉抗性茶树品种中顺-3-己烯基醋酸酯的释放量显著低于感性茶树品种,已利用茶树的这一特性建立了茶树对叶蝉抗感能力的快速鉴定技术。
黄酮类化合物是植物体内重要的抗虫物质,其诱导合成受到植物体内JA、SA、 IAA和ABA等多条信号转导途径的协同调控,通过引起害虫拒食、驱避害虫、降低害虫消化能力,甚至直接毒杀害虫等等发挥其抗虫功能。例如,槲皮素对棉铃虫(Helicoverpa zea)和亚洲小车蝗(Oedaleus asiaticus)等害虫的生长和发育具有显著抑制作用,对南部灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)幼虫具有毒杀作用。儿茶素类化合物属于黄烷-3-醇类黄酮化合物,广泛存在于各种植物中,具有多种多样的生物学功能。业已证明,表没食子儿茶素没食子酸酯具有抵御茶炭疽病Colletotrichum fructicola侵染的能力,表儿茶素是病原菌诱导黑杨(Populus nigra)体内产生的抗菌活性成分之一,酯化没食子酸儿茶素是激活植物抗性的重要激发子。我们的最新研究结果显示,灰茶尺蠖幼虫为害可提高茶树儿茶素合成途径的响应强度,提高茶树叶片中没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素等化合物含量的显著积累,揭示了上述三种物质是茶树体内重要的3种诱导防御化合物。深入研究发现,上述茶树中上述三种儿茶素类化合物的诱导响应强度在不同品种之间存在显著性差异;并且,上述3种儿茶素类化合物的含量与茶树品种对灰茶尺蠖的抗性能力之间存在着显著的相关性。鉴于此,本发明提出一种利用茶树叶片中没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明的目的在于设计提供一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法的技术方案。
本发明一方面提供了一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法,其包括以下步骤:
1)样品处理:以活体健康茶树上的芽下第2叶为处理对象,在叶片主脉的左右两侧各滚出两条划痕,随即在每条划痕上分别涂上灰茶尺蠖幼虫口腔分泌物 5μL,处理后的24h~72h采集样品,液氮下研磨成细粉后准确称量茶粉,备用;
2)儿茶素提取与分析:在步骤1)中的茶粉中提取儿茶素,并采用高效液相色谱法结合各化合物对应的标准曲线进行含量分析,从而确定提取液中没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素的相对含量;
3)当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≥3.89mg/g·FW、20.95mg/g·FW和1.76mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的抗性品种;当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≤1.2mg/g·FW、15.86mg/g·FW和0.7mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的感性品种。
进一步,步骤2)中提取儿茶素化合物具体为:将步骤1)得到的茶粉,加入 70%甲醇水溶液v/v,震荡提取,再在室温下超声处理后震荡提取,最后离心,取上清液过滤膜。
进一步,步骤2)中高效液相色谱法的分析条件为:色谱柱为Phenomenex C18 色谱柱4.6mm×250mm,5μm;流动相为1%甲酸水溶液A和乙腈B,线性梯度洗脱0-42min,4.0%-18.7%乙腈,42-43min,18.7%-4.0%乙腈;柱温40℃,流速 1.0mL/min,280nm波长下检测,进样量为10μL。
进一步,步骤2)中标准曲线的制作步骤为:准确称取没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素,用70%色谱级甲醇水溶液(v/v)分别配置成2μg ml-1、5μg ml-1、10μg ml-1、15μg ml-1和20μg ml-1的没食子儿茶素标准溶液,40μg ml-1、80μg ml-1、150μg ml-1、200μg ml-1和250μg ml-1的表没食子儿茶素没食子酸酯标准溶液,以及2μg ml-1、5μg ml-1、10μg ml-1、 15μg ml-1和20μg ml-1的儿茶素标准溶液;每次进样量为10μL。标准溶液经过高效液相分析后,得到峰面积与三种儿茶素类化合物含量的标准曲线方程:①没食子儿茶素y=1794.6x-3308,R2=0.999;②表没食子儿茶素没食子酸酯 y=14444x+27733,R2=0.997;③儿茶素y=9463.7x+2352.3,R2=0.999,其中y为样品峰面积,x为对应儿茶素类化合物的相对含量。
本发明另一方面提供了儿茶素类化合物在快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种中的应用,所述儿茶素类化合物为没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素。
进一步,步骤3)中当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≥3.89mg/g·FW、20.95mg/g·FW和1.76mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的抗性品种;当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≤1.2mg/g·FW、15.86mg/g·FW和0.7mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的感性品种。
上述的一种快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法,设计合理,通过该方法能够快速鉴定灰茶尺蠖抗感茶树品种,可靠性强;并且,儿茶素各组分含量为确定茶叶品质的必检生化指标,兼顾了茶树抗虫性的鉴定,该方法经济便于推广;同时,本发明提供了儿茶素化合物的一种新用途。
附图说明
图1为实施例中的机械损伤用滚轮,滚轮直径为1cm,具有28个齿。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1:试验方法
1)样品处理:以活体健康茶树上的芽下第2叶为处理对象,采用图1所示的机械损伤用滚轮在叶片主脉的左右两侧各滚出两条划痕,随即在每条划痕上分别涂上灰茶尺蠖幼虫口腔分泌物5μL,处理后的24h~72h采集样品,液氮下研磨成细粉后准确称量茶粉,备用;
2)儿茶素提取与分析:在步骤1)中的茶粉中提取儿茶素,并采用高效液相色谱法结合各化合物对应的标准曲线进行含量分析,从而确定提取液中没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素的相对含量;
其中茶粉中提取儿茶素的具体方法为:将步骤1)得到的茶粉,加入70%甲醇水溶液v/v,震荡提取,再在室温下超声处理后震荡提取,最后离心,取上清液过滤膜;
高效液相色谱分析条件为:色谱柱为Phenomenex C18色谱柱4.6mm×250mm, 5μm;流动相为1%甲酸水溶液A和乙腈B,线性梯度洗脱0-42min,4.0%-18.7%乙腈,42-43min,18.7%-4.0%乙腈;柱温40℃,流速1.0mL/min,280nm波长下检测,进样量为10μL;
标准曲线的制作步骤为:准确称取没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素,用70%色谱级甲醇水溶液(v/v)分别配置成2μg ml-1、5μg ml-1、 10μg ml-1、15μgml-1和20μg ml-1的没食子儿茶素标准溶液,40μg ml-1、 80μg ml-1、150μg ml-1、200μg ml-1和250μg ml-1的表没食子儿茶素没食子酸酯标准溶液,以及2μg ml-1、5μg ml-1、10μg ml-1、15μg ml-1和20 μg ml-1的儿茶素标准溶液;每次进样量为10μL。标准溶液经过高效液相分析后,得到峰面积与三种儿茶素类化合物含量的标准曲线方程:①没食子儿茶素 y=1794.6x-3308,R2=0.999;②表没食子儿茶素没食子酸酯y=14444x+27733, R2=0.997;③儿茶素y=9463.7x+2352.3,R2=0.999,其中y为样品峰面积,x为对应儿茶素类化合物的相对含量。
3)当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≥3.89mg/g·FW、20.95mg/g·FW和1.76mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的抗性品种;当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≤1.2mg/g·FW、15.86mg/g·FW和0.7mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的感性品种。
试验例1
采用福鼎大白茶和白毛2作为研究对象,按照实施例1的具体操作步骤,以活体健康茶树上的芽下第2叶为处理对象,在叶片主脉的左右两侧各滚出两条划痕,随即在每条划痕上分别涂上灰茶尺蠖幼虫口腔分泌物5μL,于处理后的48h采集样品,用于3日龄灰茶尺蠖幼虫的饲喂生测和儿茶素含量测定。
测定结果表明,白毛2叶片中没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别为5.11±0.43mg/g·FW、25.39±1.33mg/g·FW和2.61±0.1 mg/g·FW,分别是福鼎大白茶中各成分含量的12.16、1.91和13.74倍。根据实施例1种使用的判断标准可知福鼎大白茶为感性品种,白毛2号为抗性品种。传统抗性鉴定技术中,我们发现取食白毛2号的灰茶尺蠖幼虫体重极显著低于以福鼎大白茶为食的灰茶尺蠖幼虫体重,灰茶尺蠖幼虫在福鼎大白茶上的取食量极显著高于白毛2号,传统生测法鉴定白毛2号为茶尺蠖抗性品种,福鼎大白茶为茶尺蠖感性品种。两种鉴定方法的结果相符。具体结果详见表1。
表1利用儿茶素类化合物含量结合传统抗性鉴定技术判定福鼎大白茶和白毛2号的抗感能力
注:数据为平均值±标准误,t-test,***,P<0.001。
试验例2
采用龙井43和白毛2作为研究对象,按照实施例1的具体操作步骤,以活体健康茶树上的芽下第2叶为处理对象,在叶片主脉的左右两侧各滚出两条划痕,随即在每条划痕上分别涂上灰茶尺蠖幼虫口腔分泌物5μL,于处理后的48h采集样品,用于3日龄灰茶尺蠖幼虫的饲喂生测和儿茶素含量测定。测定结果表明,白毛2叶片中没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别为 5.11±0.43mg/g·FW、25.39±1.33mg/g·FW和2.61±0.1mg/g·FW,分别是龙井43中各成分含量的12.46、2.00和9.67倍。根据实施例1种使用的判断标准可知龙井43为感性品种,白毛2号为抗性品种。传统抗性鉴定技术中,我们发现取食白毛2号的灰茶尺蠖幼虫体重极显著低于以龙井43为食的灰茶尺蠖幼虫体重,灰茶尺蠖幼虫在龙井43上的取食量极显著高于白毛2号,传统生测法鉴定白毛2号为茶尺蠖抗性品种,龙井43为茶尺蠖感性品种。两种鉴定方法的结果相符。具体结果详见表2。
表2利用儿茶素类化合物含量结合传统抗性鉴定技术判定龙井43和白毛2号的抗感能力
注:数据为平均值±标准误,t-test;***,P<0.001,**,P<0.01。
试验例3
采用浙农113和白毛2作为研究对象,按照实施例1的具体操作步骤,以活体健康茶树上的芽下第2叶为处理对象,在叶片主脉的左右两侧各滚出两条划痕,随即在每条划痕上分别涂上灰茶尺蠖幼虫口腔分泌物5μL,于处理后的48h采集样品,用于3日龄灰茶尺蠖幼虫的饲喂生测和儿茶素含量测定。测定结果表明,白毛2叶片中没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别为5.11±0.43mg/g·FW、25.39±1.33mg/g·FW和2.61±0.1mg/g·FW,分别是浙农113中各成分含量的13.81、2.03和14.50倍。根据实施例1种使用的判断标准可知浙农113为感性品种,白毛2号为抗性品种。传统抗性鉴定技术中,我们发现取食白毛2号的灰茶尺蠖幼虫体重极显著低于以浙农113为食的灰茶尺蠖幼虫体重,灰茶尺蠖幼虫在浙农113上的取食量极显著高于白毛2号,传统生测法鉴定白毛2号为茶尺蠖抗性品种,浙农113为茶尺蠖感性品种。两种鉴定方法的结果相符。具体结果详见表2。
表3利用儿茶素类化合物含量结合传统抗性鉴定技术判定浙农113和白毛2号的抗感能力
注:数据为平均值±标准误,t-test;***,P<0.001,**,P<0.01。
Claims (5)
1.一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)样品处理:以活体健康茶树上的芽下第2叶为处理对象,在叶片主脉的左右两侧各滚出两条划痕,随即在每条划痕上分别涂上灰茶尺蠖幼虫口腔分泌物5μL,处理后的24h~72h采集样品,液氮下研磨成细粉后准确称量茶粉,备用;
2)儿茶素提取与分析:在步骤1)中的茶粉中提取儿茶素,并采用高效液相色谱法结合各化合物对应的标准曲线进行含量分析,从而确定提取液中没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素的相对含量;
3)当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≥3.89mg/g·FW、20.95mg/g·FW和1.76mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的抗性品种;当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≤1.2mg/g·FW、15.86mg/g·FW和0.7mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的感性品种。
2.如权利要求1所述的一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法,其特征在于步骤2)中提取儿茶素类化合物具体为:将步骤1)得到的茶粉,加入70%甲醇水溶液v/v,震荡提取,再在室温下超声处理后震荡提取,最后离心,取上清液过滤膜。
3.如权利要求1所述的一种利用儿茶素快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种的方法,其特征在于步骤2)中高效液相色谱分析条件为:色谱柱为Phenomenex C18色谱柱4.6mm×250mm,5μm;流动相为1%甲酸水溶液A和乙腈B,线性梯度洗脱0-42min,4.0%-18.7%乙腈,42-43min,18.7%-4.0%乙腈;柱温40℃,流速1.0mL/min,280nm波长下检测,进样量为10μL。
4.儿茶素化合物在快速鉴定灰茶尺蠖抗性茶树品种中的应用,所述儿茶素化合物为没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≥3.89mg/g·FW、20.95mg/g·FW和1.76mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的抗性品种;当叶片中的没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和儿茶素含量分别≤1.2mg/g·FW、15.86mg/g·FW和0.7mg/g·FW时,茶树品种鉴定为灰茶尺蠖的感性品种。
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