CN113349203B - 苯甲酸在防治植物线虫病害中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及防治植物病害的技术领域，更具体地说，它涉及苯甲酸在防治植物线虫病害中的应用，其包括将苯甲酸作为杀线剂中的有效成分进行使用。基于本发明的研究结果，苯甲酸对根结线虫(Meloidogyne)、孢囊线虫(Heterodera)及松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)等多种线虫均有强毒杀活性，能用于植物线虫病害的有效防治，且苯甲酸具有低人体危害性、低毒低残留、易于降解和绿色环保等优点，在防治植物线虫及相关药剂产品开发方面具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害防治技术领域，更具体地说，它涉及苯甲酸在防治植物线虫病害中的应用。
背景技术
植物线虫是植物重要病原生物之一，随着农业向产业化，基地化发展，长期大面积种植单一农作物，常年连作及土地重复利用率的提高，线虫在土壤中的数量迅速累积，导致线虫病害问题日益突出。比如：在我国南方地区的蔬菜、果树上根结线虫(Meloidogyne)普遍发生且危害严重，其中广东地区由于处于珠江三角洲地带，土壤多为沙壤土，特别适合植物线虫的生长发育，因此线虫病害问题更加突出。而在北方地区，小麦孢囊线虫(Heterodera.avenarea,H.filipjevi)、大豆孢囊线虫(Heteroderaglycines)普遍发生且危害严重，对我国小麦和大豆的生产造成重大损失和影响(彭德良等，1993，2008，2012；冯志新，2001)。特别的，北方地区现在采用大棚生产蔬菜，根结线虫病害也相当普遍而严重。
杀线剂是目前防治线虫病害的有效措施之一，但当前的化学杀线剂均为高毒高残留农药，极易造成对农作物及生态环境的污染，如阿维菌素，是目前主要使用的毒性相对较低、药效最好的杀线剂。然而，阿维菌素仍有着不低的生物危害性，当其用于农业生产时，得到的农作物有概率使食用者出现人体中毒危害，包括侵犯神经系统造成震颤麻痹，意识丧失、谵妄、神志不清甚至昏迷和抽搐肌肉颤动等。同时，过多、单一使用阿维菌素也使得其在生产上出现了抗药性问题。
因此寻求新的多种类型的杀线剂，是目前防治农作物线虫病害的研究热点之一。
发明内容
本发明的目的是为提供一种新的、具有较强杀线活性的活性物质。
本发明提供了苯甲酸(C7H6O2)在作为或制备杀线剂中的应用。
本发明提供了苯甲酸在防治植物线虫病害中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
根据本发明研究，苯甲酸具有较强的杀线活性，其能有效地抑制多种植物线虫的生长与繁殖，包括南方根结线虫和爪哇根结线虫在内的植物根结线虫、孢囊线虫、松材线虫等，从而实现防治植物线虫病害的效果。此外，苯甲酸作为成熟的工业产品，生产方法繁多、价格低廉，是一种结构单一且可确定的小分子化合物，具有良好的推广前景。再者，苯甲酸在食品工业中通常用作防腐剂，其摄入对人体安全危害低。当苯甲酸用作杀线剂时，除了能减缓杀线剂的腐败以外，同时也能降低使用该杀线剂得到的农作物对人体健康的危害，也缓解了长期单一使用阿维菌素而出现抗药性问题。
因此，本发明要求保护：
苯甲酸在作为或制备杀线剂中的应用。
苯甲酸在防治植物线虫病害中的应用。
苯甲酸在制备防治植物线虫病害的药剂中的应用，具体是以苯甲酸作为杀线剂中的有效成分。
作为具体可选择的实施方案：
优选的，可将苯甲酸添加到农药用载体或农药组合物中制成农药制剂。
农药制剂一般具有多种有效成分，例如可以是杀线剂、抑菌剂和抗病毒剂的组合制剂，使得农药制剂能同时具有多种效果。此外，农药制剂可做成缓释制剂等特殊剂型以便于农药内有效成分的持续释放，避免农药快速流失而导致的农药失效。
优选的，还可将含有苯甲酸的植物提取物、部位提取物、分离部位和有机合成产物中的一种或多种组合物制成杀线剂，并添加到农药用载体或农药组合物中制成农药制剂。
由于部分天然植物(如紫斑牡丹(Paeoniarockii)内含有苯甲酸，其晒干后的根和茎干使用95％乙醇浸提后得到的提取物同样具有杀线活性，因为此类含有苯甲酸的天然植物，或其植物提取物、或其部位提取物、分离部位和有机合成产物的杀线应用，均应视作落入本发明要求保护的范围内。
可选的，所述农药制剂可用于投放至农作物的生长体系中。
通过采用上述技术方案，农药制剂投放至农作物的生长体系中后能实现植物线虫病害的防治效果。
所述生长体系包括土壤和营养水体等，所述农作物包括感染或未感染植物线虫病害的植株。
对于已感染植物线虫病害的植株而言，苯甲酸可抑制植物线虫的生长于繁殖，从而达到治疗病害的效果；对于未感染植物线虫病害的植物而言，苯甲酸可降低植株感染植物线虫病害的风险，从而达到预防病害的效果。
特别的，所述植物线虫病害包括感染根结线虫及其虫卵。
发明人研究发现，苯甲酸溶液能灭杀根结线虫二龄幼虫以及抑制根结线虫卵的孵化过程，因此苯甲酸具有防治根结线虫及其虫卵感染的能力。
另外，基于研究，苯甲酸对包括南方根结线虫和爪哇根结线虫在内的植物根结线虫，孢囊线虫，以及松材线虫具有很好的杀虫活性。此外，发明人基于研究发现，苯甲酸杀虫作用的机理是苯甲酸破坏了植物线虫的膜透性，造成体内空泡状。基于植物线虫具有的共同角质膜特性，苯甲酸对其它植物线虫都会有较好的杀线虫活性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)苯甲酸对包括南方根结线虫和爪哇根结线虫在内的植物根结线虫、孢囊线虫、松材线虫均有强毒杀活性，强抑制繁殖活性，对线虫卵孵化有强抑制活性，说明苯甲酸具有较强的杀线活性，能用于防治多种植物线虫病害。
(2)苯甲酸来源广泛、价格低廉、结构单一，具有良好的推广前景。
(3)苯甲酸被广泛应用于食品防腐剂，多年以来被证实对人体具有较高的安全性，因此当其用于杀线剂时，培育得到的农作物对人体也具有较高的安全性。
(4)苯甲酸来源于天然植物中，在环境中易于降解，因此与现有化学杀线剂相比，具有低毒低残留的特性，更加环保，符合绿色植保和可持续农业生产和发展的需要。
附图说明
图1为苯甲酸防治空心菜南方根结线虫病害盆栽试验(地上部长势)。
图2为苯甲酸防治空心菜南方根结线虫病害盆栽试验(地下部根系情况)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
苯甲酸(C7H6O2)：
申请人通过杀线虫活性生测追踪，从天然植物紫斑牡丹植物干燥后的根及茎的干燥粉末中，经过乙醇浸提得到粗提物，再用不同极性溶剂萃取分部，测定各分部提取物的杀线虫活性强弱，发现在乙酸乙酯提取部位活性强，再将乙酸乙酯部位通过硅胶柱层析分离，测定各流份杀线虫活性(活性追踪)，对活性强的流份再用硅胶柱层析分离，得到了一个杀线虫活性化合物，通过测定各种光谱数据，并与已知化合物光谱数据比对，确定该化合物为苯甲酸(分子式C7H6O2)。并继续对苯甲酸杀线虫活性进行了确定研究实验。部分实验及结果展示如下：
实施例1：苯甲酸对根结线虫、孢囊线虫及松材线虫的毒杀活性及卵孵化抑制活性测定
1、苯甲酸对根结线虫的毒杀活性及卵孵化抑制活性测定，方法如下：
S1.1、待测溶液样品配置：
取0.05g苯甲酸加200μL丙酮溶解，再加10mL无菌蒸馏水，过孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜，配成5mg/mL的待测溶液样品，再将待测溶液样品分别稀释至所需测试浓度，得到一系列不同的待测溶液样品。
S1.2、南方根结线虫及爪哇根结线虫的二龄幼虫悬浮液配制：
将木耳菜根结线虫病根(同时感染有南方根结线虫和爪哇根结线虫)冲洗干净，挑取色泽和大小一致的卵囊，将卵囊放入垫有三层维达纸巾的筛网上，置于6cm培养皿里，在26℃培养箱孵化3～5d，待卵囊孵化大量二龄幼虫时，收集置于4℃冰箱中，配成浓度为60条/250μL的根结线虫二龄幼虫悬浮液。
S1.3、南方根结线虫及爪哇根结线虫生测(采用浸泡法)：
用48孔生物培养板，每孔加入250μL的不同浓度的待测溶液样品，再加入250μL的二龄幼虫悬浮液，每个处理设4次重复，以无菌水和2％丙酮溶液做对照，置26℃恒温箱中，分别在24h、48h、72h、96h(清水复苏24h)，观察计数，在倒置显微镜下记录线虫死活数据，并计算死亡率。
S1.4、卵粒悬浮液配制：
用镊子摘取木耳菜病根上根结线虫卵囊，用1％的次氯酸钠溶液破碎卵囊2min，期间不断在50mL的小烧杯中震荡，然后将含有卵粒的悬浮液过200目和500目的网筛，用大量无菌水冲洗，冲洗时间稍微长些，然后再用无菌水多次冲洗500目网筛，用小烧杯收集500目网筛上的卵粒，吸取250μL的卵粒悬浮液，在解剖镜下观察计数，使卵粒悬浮液浓度为400粒/mL。
S1.5、卵孵化生测(采用浸泡法)：
用48孔生物培养板(在底部画好线)，每孔加入250μL浓度为400粒/mL的卵液，再加入250μL的不同浓度的待测溶液样品，每处理设4次重复，以无菌水和2％丙酮溶液为对照。置于26℃恒温箱，分别于第3、6、9、12d在倒置显微镜下记录孵出的二龄幼虫数并计算卵孵化率和卵孵化抑制率。
生测结果表明，苯甲酸对南方根结线虫和爪哇根结线虫均有较强杀线活性，用0.1～1.5mg/mL的苯甲酸处理爪哇根结线虫J2，24h～96h(清水复苏24h)死亡率为19.75％～100％；苯甲酸显示极强卵孵化抑制活性，用浓度为0.1～1.5mg/mL处理南方根结线虫的卵粒，3～12d对南方根结线虫卵孵化抑制率由25.50％至99.00％；苯甲酸处理南方根结线虫J2 24h、48h、72h、96h(清水复苏24h)的LC50分别为0.574mg/mL、0.429mg/mL、0.353mg/mL、0.405mg/mL。
2、苯甲酸对孢囊线虫的毒杀活性测定，通过以下步骤进行：
S2.1、孢囊线虫材料准备及收集方法：
将实验室的温室盆栽病土捣碎，加水搅拌，静置后过30、80目网筛，重复多次冲洗网筛上的土粒，待冲下的水清澈时，在漏斗上放置直径为18cm的滤纸，用洗瓶将土粒收集在滤纸内，待水滴干后，在解剖镜下用挑针，毛笔挑取孢囊，4℃冰箱保存。
S2.2、孢囊线虫卵粒的制备：
经过筛法收集的水稻土样，在体视镜下挑选饱满的孢囊，用橡皮擦轻轻磨破，500目网筛收取卵粒，供试验用。
S2.3、孢囊线虫的孵化：
将孢囊线虫的卵粒放入垫有三层维达纸巾的筛网上，置于6cm培养皿里，在26℃培养箱孵化6～8d，待孵化出大量孢囊线虫二龄幼虫时，收集备用。
S2.4、孢囊线虫生测方法同上
结果表明：苯甲酸对孢囊线虫二龄幼虫有较强杀线活性，苯甲酸处理孢囊线虫24h、48h、72h、96h、120h(清水复苏24h)的LC50分别为0.42mg/mL、0.428mg/mL、0.414mg/mL、0.356mg/mL、0.354mg/mL。
3、苯甲酸对松材线虫的繁殖抑制活性测定，通过以下步骤进行：
S3.1、松材线虫悬浮液的配置：
利用盘多毛孢菌培养松材线虫，用无菌水冲洗收集松材线虫，配成松材线虫悬浮液浓度为10000条/mL(混合龄期)。
S3.2、生测(采用真菌培养法)：
于直径6cm的培养皿内，用PDA培养基接种盘多毛孢菌，在26℃下恒温培养6d，待菌丝长满皿底。在培养基中间放置一小块长1cm，厚约0.5cm的小正方形棉块。取0.5mL待测溶液样品，注入棉块中，再加入0.1mL(约1000条，混合龄期)松材线虫悬浮液于棉块中，每处理设4次重复，以2％丙酮溶液作为对照。培养基小棉块上待测溶液样品终浓度为0.83mg/mL，在26℃恒温培养箱中培养5d，将培养基用改良贝曼漏斗法分离收集松材线虫并计数。按以下公式计算线虫的繁殖抑制率。
生测结果表明，苯甲酸对松材线虫有繁殖抑制活性，以0.83mg/mL的浓度处理松材线虫，其繁殖抑制率为34.75％。
实施例2：苯甲酸、阿维菌素对空心菜根结线虫的盆栽防治试验
1、实验方法通过以下步骤进行：
基质土拌匀装盆(直径7cm×高7cm)，每盆装土250mL，将空心菜苗(4-5子叶)移栽于盆中，移苗一周后进行第一次灌根处理，每盆浇药120mL(苯甲酸：0.3mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL；阿维菌素：0.05mg/mL)，每组设置4个重复，以丙酮和清水为对照组，2天后每盆接360条南方根结线虫二龄幼虫和480粒卵，接虫后4天进行第二次灌根处理，每盆浇药80mL，接虫后10天进行第三次灌根处理，每盆浇药100mL，30天扣盆取样，记录空心菜地上部鲜重、根重和根结数，并计算根结防效。
2、实验结果
盆栽试验结果如图1-2和表1所示。结果表明，苯甲酸对南方根结线虫病具有较好的防治效果，且对空心菜地上部鲜重和根重(即空心菜的生长)无明显影响。用浓度为0.3mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL的苯甲酸溶液灌根处理空心菜盆栽，对南方根结线虫病的根结防效分别达到0.5％、30.75％和51.25％，即使与阿维菌素相比，也有较好的根结防效效果(详见表1)。
表1苯甲酸和阿维菌素灌根处理防治盆栽空心菜南方根结线虫病
注：1)表中数据格式为：
代表4次重复平均值，S.E为标准误；
2)表中数据4次重复平均值，同列数据后标有相同字母表示在5％差异不显著(DMRT)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.苯甲酸在抑制南方根结线虫卵孵化中的应用，其特征在于，用浓度为0.1～1.5mg/mL的苯甲酸处理南方根结线虫的卵粒，3～12d对南方根结线虫卵孵化抑制率由25.50％至99.00％。
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