CN102440989B - 复方氨基酸注射液的检测方法 - Google Patents

复方氨基酸注射液的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种复方氨基酸注射液，该注射液由盐酸精氨酸、盐酸组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、盐酸赖氨酸等组成，同时本发明还公开了复方氨基酸注射液(18AA)的制备方法，在保证产品质量的同时，具有节能、增效的特点；本发明通过对精密度、检测限、定量限和线性范围等反复验证，确定了清洗验证简便快速可靠的方法；并且本发明还根据离子色谱法原理，检测复方氨基酸注射液中抗氧剂亚硫酸氢钠的残留量，以及亚硫酸氢钠降解产生的硫酸根离子，从而准确测定原料配比中投入的抗氧剂量，并根据测定结果判断原料配比工艺的稳定性；本发明提供的复方氨基酸注射液检测方法是一种在线衍生氨基酸含量测定方法，速度快，适合大生产的规模检验。

Description

复方氨基酸注射液的检测方法
技术领域
本发明涉及一种注射液及其制备方法、检测方法，特别涉及一种复方氨基酸注射液及其制备方法、检测方法。 
背景技术
复方氨基酸注射液(18AA)为氨基酸输液，在能量供给充足的情况下，参与蛋白质的合成代谢，获得正氮平衡，并生成酶类、激素、抗体和结构蛋白，促进组织愈合，恢复正常生理功能，主要适用于完全肠外营养的蛋白质缺乏症以及手术、烧伤等各种原因引起的严重蛋白质丢失的患者。 
目前复方氨基酸注射液(18AA)的生产工艺大多为根据溶解性，先投难容氨基酸，待其溶解后再投易溶氨基酸；先投稳定性好的氨基酸，再投不稳定氨基酸，这不仅增加了配液时间，而且增加了注射液的安全性风险，同时增加了能耗成本；由于氨基酸注射液组方复杂，稳定性不佳，因此生产工艺大多采用全程充氮保护，包括投料前注射用水的脱氧、原辅料的脱氧、所有配制、灌装罐和管道充氮保护，同时灭菌F0＜12，以确保氨基酸注射液质量质检指标合格。 
复方氨基酸注射液工艺清洗验证测定方法：根据GMP要求，所有生产系统均需进行清洗验证，使残留药物＜10-4，但复方氨基酸注射液残留药物的检测十分刺手，一般采用HPLC和衍生测定各种氨基酸残留量，不仅操作复杂，而且由于浓度差异大，部分药物灵敏度达不到要求，故而测定结果不可靠，不能真实反映清洗效果。 
抗氧剂含量测定方法：抗氧剂是一类能够有效阻止或延缓自动氧化的物质，是药物辅料的一个重要组成部分，主要用于防止药物及其制剂的氧化变质，以及由氧化所导致的变色、产生沉淀及其他方面的不稳定性。药物的氧化反应是引起药物不稳定的主要因素之一。大多数药物的氧化降解是含有自由基的自氧化过程，在这一过程中仅有很少的氧就能引起反应。而空气中的氧气占21％(v/v)，在如此多氧的存在下，药物不需要其他氧化剂的参与，室温就能自发引起“自氧化反应”。这种反应的过程很复杂，属于游离基诱发的“链反应”，光和热能加速这种反应的进行，微量的金属离子或过氧化物也会催化这种反应。分子结构中具有酚羟基或潜在酚羟基等有效成分的制剂中，只要有少量的氧存在，就可能引起药物自氧化反应。药物氧化的结果，不仅使有效物含量降低，而且有可能改变药物的颜色或出现沉淀，甚至产生有毒物质影响制剂的质量。因此，为了抑 制O2对氧化反应的作用，就有必要加入抗氧剂。抗氧剂本身是一种还原剂，与药物同时存在时，抗氧剂遇氧后首先被氧化，对易氧化的药物成分起到保护作用，从而保证药物制剂的稳定性。在自氧化过程中，抗氧剂的作用是提供电子或有效氢离子，供给自由基接受，使自氧化链反应中断。复方氨基酸注射液等不稳定品种，在制备过程中一般都要加入一定的抗氧剂亚硫酸钠、焦亚硫酸钠等，但必须对抗氧剂限量进行控制，以控制不良反应，同时必须保证抗氧剂能够发挥作用。目前文献一般根据氧化还原反应原理，采用显色法测定，但方法的专属性、准确性都较差。未见用离子色谱法专属、准确测定抗氧剂的含量方法。 
复方氨基酸注射液中由于氨基酸种类多，没有吸收，极性强，因此要同时保证所有氨基酸分离检出，并且满足方法的精密、专属、准确一直是分析难题，目前氨基酸分析方法主要有四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯(PITC)法、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)法、邻苯二醛(OPA)和9-芴甲基氯甲酸甲酯(FMOC)法、2，4-二硝基氟苯(DNFB)法，以及一种茚三酮柱后衍生法。PITC法和AQC法需要手动衍生，操作复杂，色谱条件的耐用性很差，几乎每次都要调整流动相，部分氨基酸分离不佳；OPA/FMOC法可以自动衍生，但流动相配制复杂，部分氨基酸分离不佳，特别是组氨酸和甘氨酸，色谱柱做几次样后，分离度就小于1.0，色谱柱寿命很短，连续使用不到一个月就损毁；DNFB法所用的2，4-二硝基氟苯属易爆、剧毒物质，有强致癌性，且该法对色谱柱要求较高，易损坏色谱柱，衍生试剂水解生成的2，4-二硝基苯易干扰丝氨酸的测定；茚三酮法则由于仪器结构复杂、价格贵、灵敏度差、分析时间长、脯氨酸不能检测等诸多不足，日渐少用。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种复方氨基酸注射液及其制备方法，本发明的另一个目的在于提供一种复方氨基酸注射液工艺清洗验证检测方法，第三个目的在于提供一种复方氨基酸注射液中抗氧剂的检测方法，第四个目的在于提供一种复方氨基酸注射液的检测方法。 
本发明的目的是通过如下技术方案实现的： 
本发明复方氨基酸注射液的原料组成为： 
盐酸精氨酸      2.5-3.5重量份 
盐酸组氨酸      1.4-3.5重量份 
亮氨酸          3.5-4.5重量份 
异亮氨酸        0.7-2.7重量份 
盐酸赖氨酸    2.3-4.3重量份 
苯丙氨酸      1.8-3.9重量份 
苏氨酸        1-3重量份 
缬氨酸        0.5-2重量份 
甲硫氨酸      0.5-1.5重量份 
色氨酸        0.2-0.6重量份 
甘氨酸        2.3-4.2重量份 
丙氨酸        0.8-2.9重量份 
脯氨酸        0.5-1.5重量份 
酪氨酸        0.05-0.15重量份 
丝氨酸        0.3-0.9重量份 
盐酸半胱氨酸  0.2-0.6重量份 
门冬氨酸      0.6-1.6重量份 
谷氨酸        0.9-2.8重量份 
亚硫酸氢钠    0.3-0.8重量份 
木糖醇        40-60重量份 
注射用水      适量 
全量          1000体积份 
本发明复方氨基酸注射液的原料组成优选为： 
盐酸精氨酸    2.89重量份 
盐酸组氨酸    2.46重量份 
亮氨酸        3.79重量份 
异亮氨酸      1.70重量份 
盐酸赖氨酸    3.33重量份 
苯丙氨酸      2.83重量份 
苏氨酸        1.97重量份 
缬氨酸        1.36重量份 
甲硫氨酸      1.06重量份 
色氨酸        0.39重量份 
甘氨酸        3.24重量份 
丙氨酸        1.88重量份 
脯氨酸        1.00重量份 
酪氨酸        0.11重量份 
丝氨酸        0.67重量份 
盐酸半胱氨酸  0.44重量份 
门冬氨酸      1.15重量份 
谷氨酸        1.97重量份 
亚硫酸氢钠    0.50重量份 
木糖醇        50.0重量份 
注射用水      适量 
全量          1000体积份。 
取上述原料，按照常规工艺，制成复方氨基酸注射液。 
本发明复方氨基酸注射液的制备方法为： 
按配方量称取各原辅料，其中色氨酸以105～115％标示量投料，其余按100％标示量投料；在配液罐中加注射用水至配制总量的70～85％，控制温度为60～90℃，将称好的各种原辅料投入配液罐中，充分搅拌溶解，充氮，再加0.02～0.1％活性炭搅拌吸附15～30分钟，温度控制在60～90℃；在配液罐中加注射用水稀释至全量，搅拌均匀，用10～30％氢氧化钠溶液调节pH至5.8～6.8，取溶液测定色氨酸含量，色氨酸标示含量应为90％～110％，取溶液适量，加水稀释1000倍，在波长210nm处测定吸收值应为0.25～0.30；经钛棒脱碳、0.22μm微孔滤膜过滤后，灌装、充氮，灌装后输液瓶内残氧量≤5％，于115～130℃灭菌8～20分钟，灯检，包装，即得。 
本发明复方氨基酸注射液的制备方法优选为： 
按配方量称取各原辅料，其中色氨酸以110％标示量投料，其余按100％标示量投料；在配液罐中加注射用水至配制总量的80％，控制温度为80℃，将称好的各种原辅料投入配液罐中，充分搅拌溶解，充氮，再加0.05％活性炭搅拌吸附20分钟，温度控制在80℃；在配液罐中加注射用水稀释至全量，搅拌均匀，用20％氢氧化钠溶液调节pH至6.2～6.4，取溶液测定色氨酸含量，色氨酸标示含量应为95％～105％，取溶液适量，加水稀释1000倍，在波长210nm处测定吸收值应为0.26～0.28；经钛棒脱碳、0.22μm微孔滤膜过滤后，灌装、充氮，灌装后输液瓶内残氧量≤2％，于121℃灭菌12分钟，灯检，包装，即得。 
其中所述的色氨酸的含量测定方法为： 
照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)测定； 
供试品溶液的制备：精密量取本发明复方氨基酸注射液2～6ml(优选精密量取本发明复方氨基酸注射液4m1)，置100ml量瓶中，加0.05～0.15mol/L氢氧化钠溶液(优选0.1mol/L氢氧化钠溶液)稀释到刻度，摇匀，作为供试品溶液； 
对照品溶液的制备：精密称取色氨酸和酪氨酸对照品适量，于100～110℃干燥2～4小时(优选于105℃干燥3小时)，分别加0.05～0.15mol/L氢氧化钠溶液(优选0.1mol/L氢氧化钠溶液)溶解并稀释成每1ml溶液中含色氨酸10～30μg和酪氨酸3～8μg的溶液，摇匀，分别作为对照品溶液(1)与对照品溶液(2)； 
测定法：取对照品溶液(2)，以280nm为测定波长λ2，在303nm波长附近每隔0.2nm选择等吸收点及参比波长λ1，要求ΔA＝Aλ2-Aλ1＝0，再在λ1与λ2处分别测定对照品溶液(1)与供试品溶液的吸收度，求出各自的吸收度差值ΔA，计算。 
本发明氨基酸注射液中色氨酸含量为90％～110％标示量，优选为95～105％标示量。 
本发明复方氨基酸注射液工艺清洗验证检测方法为： 
取清洗液在波长210nm处直接测定吸收度，若吸收度A210nm＜0.03，则残留量＜10-4，若吸收度A210nm＜0.005，则残留量＜10-5。 
本发明复方氨基酸注射液中抗氧剂的检测方法为： 
色谱条件与系统适应性试验：以DIONEX 9HC为色谱柱，流动相为0.01～0.04mol/L氢氧化钾溶液(优选为0.02mol/L氢氧化钾溶液)，柱温为20～40℃(优选为30℃)，电化学检测器，流速为0.5～1.0ml/min(优选为0.7ml/min)。 
对照品溶液的制备：分别称取亚硫酸氢钠和硫酸钠各25mg，加水溶解并稀释至50ml，分别量取0.5～2ml置10～25ml量瓶中(优选精密量取1ml置10ml量瓶中)，加水稀释至刻度，即得； 
供试品溶液的制备：精密量取本发明复方氨基酸注射液0.5～2ml(优选精密量取本发明复方氨基酸注射液1ml)，置10～25ml量瓶(优选10ml量瓶)中，加水稀释至刻度，摇匀，即得； 
测定法：分别取供试品溶液和对照溶液各5～20μl(优选分别取供试品溶液和对照溶液各10μl)，注入离子色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得； 
本发明复方氨基酸注射液中抗氧剂的标示含量应为30％～110％(优选80％～100％)。 
本发明复方氨基酸注射液的检测方法为： 
色谱条件与系统适应性试验：仪器：Agilent 1200 HPLC，色谱柱：Capcell pak C18，MGII，150×4.6mm，流动相A：0.02～0.06mol/L K2HPO4，pH为6.8～7.8，流动相B：60∶40～40∶60的乙腈-甲醇，检测波长：338nm/262nm，柱温：30～50℃，梯度程序为： v0＝0.5-1.5ml/min，时间：0～15-40～20-45～25.5-45.5～27.5-48.5～29.5-49.5～30-50分钟，(优选时间：0～15～20～25.5～27.5～29.5～30分钟，时间：0～40～45～45.5～48.5～49.5～50分钟，时间：0～30～35～35.5～38.5～39.5～40分钟，时间：0～18～22～26.5～28～29.5～30分钟)；流动相B：0～40％-70％～80％-100％～80％-100％～80％-100％～0～0，(优选流动相B：0～40％～80％～80％～80％～0～0，流动相B：0～70％～100％～100％～100％～0～0，流动相B：0～50-60％～100％～100％～100％～0～0)；流速：0.5-1.5～0.5-1.5～0.5-1.5～1.0-2.5～1.0-2.5～1.0-2.5～0.5-1.5ml/min，(优选流速：0.5～0.5～0.5～1.0～1.0～1.0～0.5ml/min，流速：1.5～1.5～1.5～2.5～2.5～2.5～1.5ml/min，流速：1.2～1.2～1.2～2.0～2.0～2.0～1.2ml/min，流速：0.9～0.9～0.9～1.8～1.8～1.8～0.9ml/min) 
梯度程序：v0＝0.5～1.5ml/min 
对照品溶液的制备： 
盐酸精氨酸    25-35mg 
盐酸组氨酸    14-35mg 
亮氨酸        35-45mg 
异亮氨酸      7-27mg 
盐酸赖氨酸    23-43mg 
苯丙氨酸      18-39mg 
苏氨酸        10-30mg 
缬氨酸        5-20mg 
甲硫氨酸      5-15mg 
甘氨酸        23-42mg 
丙氨酸        8-29mg 
脯氨酸        5-15mg 
门冬氨酸      6-16mg 
谷氨酸        9-28mg 
色氨酸        20-60mg 
酪氨酸        5-15mg  
丝氨酸        30-90mg 
盐酸半胱氨酸  20-60mg 
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置50～500ml量瓶A中，其余各氨基酸置50～500ml量瓶B中，分别加水适量，振摇使溶解完全；将量瓶A加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml溶液，置量瓶B中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：取本发明复方氨基酸注射液0.5～2ml，置10～25ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得；当测定胱氨酸或半胱氨酸时，分别取供试品溶液0.2～2.0ml与3，3’-二硫代二丙酸溶液即DTDPA0.2～2.0ml，置进样瓶中混合，密塞，60～90℃加热40～80分钟，即得； 
测定法：先取1～5μl硼酸盐缓冲液与0.2～2.0ul供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛0.2～2.0μl、混合；最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯0.2～2.0μl、混合；再加水10～30μl混合，注入液相色谱仪，测定，即得； 
本发明复方氨基酸注射液中各氨基酸均为标示含量的80％～120％。 
本发明复方氨基酸注射液的检测方法优选为： 
色谱条件与系统适应性试验：仪器：Agilent 1200 HPLC，色谱柱：Capcell pak C18，MGII，150×4.6mm，流动相A：0.05mol/L K2HPO4，pH为7.0，流动相B：50∶50的乙腈-甲醇，检测波长：338nm/262nm，柱温：40℃，梯度程序为：v0＝1.2ml/min，时间：0-30-35-35.5-38.5-39.5-40分钟，流动相B：0～50％-70％～100％～100％～100％～0～0，流速：1.2-1.2-1.2-2.0-2.0-2.0-1.2ml/min， 
梯度程序：v0＝1.2ml/min 
  时间(min)  0   30   35   35.5   38.5   39.5   40
  流动相B(％)  0   50～70   100   100   100   0   0
  流速(ml/min)  1.2   1.2   1.2   2.0   2.0   2.0   1.2
对照品溶液的制备： 
盐酸精氨酸    24mg 
盐酸组氨酸    17mg 
亮氨酸        38mg 
异亮氨酸      17mg 
盐酸赖氨酸    33mg 
苯丙氨酸      28mg 
苏氨酸        20mg 
缬氨酸        14mg 
甲硫氨酸      11mg 
甘氨酸        32mg 
丙氨酸        19mg 
脯氨酸        10mg 
门冬氨酸      12mg 
谷氨酸        20mg 
色氨酸        39mg 
酪氨酸        11mg 
丝氨酸        67mg 
盐酸半胱氨酸  44mg 
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置100ml量瓶A中，其余各氨基酸置100ml量瓶B中，分别加水80ml，振摇使溶解完全；将量瓶A加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml溶液，置量瓶B中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：取本发明复方氨基酸注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得；当测定胱氨酸或半胱氨酸时，取供试品溶液0.5ml与3，3’-二硫代二丙酸溶液即DTDPA溶液0.5ml，置进样瓶中，密塞，80℃加热60分钟，即得； 
测定法；先取2.5μl硼酸盐缓冲液与0.5ul供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛0.5μl、混合，最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯0.5μl、混合，再取水20μl混合，注入液相色谱仪，测定，即得； 
本发明复方氨基酸注射液中各氨基酸含量测定结果均为标示量的90％～110％。 
本发明复方氨基酸注射液的检测方法优选为： 
色谱条件与系统适应性试验：仪器：Agilent 1200 HPLC，色谱柱：waters Symmetry150×3.9mm，流动相A：0.03mol/L K2HPO4，pH为7.0；流动相B：60∶40的乙腈-甲醇；检测波长：338nm/262nm，柱温：45℃，梯度程序为：时间：0-18.0-22-26.5-28.00-29.5-30.00分钟，流动相B：0～70％-100％～100％～100％～0～0，流速：0.9-0.9-0.9-1.8-1.8-1.8-0.9ml/min， 
梯度程序： 
  时间(min)   0   18.0   22   26.5   28.00   29.50   30.00
  流动相B(％)   0   70   100   100   100   0   0
  流速(ml/min)   0.9   0.9   0.9   1.8   1.8   1.8   0.9
[0132]  对照品溶液的制备： 
盐酸精氨酸    24mg 
盐酸组氨酸    17mg 
亮氨酸        38mg 
异亮氨酸      17mg 
盐酸赖氨酸    33mg 
苯丙氨酸      28mg 
苏氨酸        20mg 
缬氨酸        14mg 
甲硫氨酸      11mg 
甘氨酸        32mg 
丙氨酸        19mg 
脯氨酸        10mg 
门冬氨酸      12mg 
谷氨酸        20mg 
色氨酸        39mg 
酪氨酸        11mg 
丝氨酸        67mg 
盐酸半胱氨酸  44mg 
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置250ml量瓶A中，其余各氨基酸置250ml量瓶B中，分别加水80ml，振摇使溶解完全；将量瓶A加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml溶液，置量瓶B中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：取本发明复方氨基酸注射液1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得； 
测定法：先取5.0μl硼酸盐缓冲液与1.0ul供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛1.0μl，最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯1.0μl，再取水30μl混合，注入液相色谱仪，测定，即得； 
本发明复方氨基酸注射液中各氨基酸含量测定结果均为标示量的90％～110％。 
其中所述的重量份与体积份为g/ml的关系。 
本发明复方氨基酸注射液(18AA)制备方法，在保证产品质量的同时，具有节能、增效的特点；本发明通过对精密度、检测限、定量限和线性范围等反复验证，确定了清 洗验证简便快速可靠的方法；并且本发明还根据离子色谱法原理，检测复方氨基酸注射液中抗氧剂亚硫酸氢钠的残留量，以及亚硫酸氢钠降解产生的硫酸根离子，从而准确测定原料配比中投入的抗氧剂量，并根据测定结果判断原料配比工艺的稳定性；本发明提供的复方氨基酸注射液检测方法是一种在线衍生氨基酸含量测定方法，速度快，适合大生产的规模检验，18种氨基酸分离度均大于1.5，能同时检测原料配比中所有氨基酸，快捷、准确、专属；同时本发明的流动相配制简单，色谱柱寿命很长，特别是用CAPCELL PAK C18色谱柱分析，不仅各氨基酸能完全基线分离检测，色谱柱寿命也很长，不仅保证了分析结果的重现可靠，还大大节约了分析成本。 
附图说明：
图1：复方氨基酸注射液浓度-吸收标准曲线 
图2：复方氨基酸注射液抗氧剂测定-SO4 2-对照色谱图 
图3：复方氨基酸注射液抗氧剂测定-SO3 2-和SO4 2-对照色谱图 
图4：复方氨基酸注射液抗氧剂测定-未灭菌样品色谱图 
图5：复方氨基酸注射液抗氧剂测定-121℃/15min灭菌1次样品色谱图 
图6：复方氨基酸注射液抗氧剂测定-121℃/15min灭菌2次样品色谱图 
图7：复方氨基酸注射液抗氧剂测定-121℃/15min灭菌3次样品色谱图 
图8：复方氨基酸注射液抗氧剂测定-亚硫酸氢钠标准曲线 
图9：复方氨基酸注射液含量测定-对照液色谱图(不含半胱氨酸) 
图10：复方氨基酸注射液含量测定-供试液色谱图(不含半胱氨酸) 
图11：复方氨基酸注射液含量测定-对照液色谱图(含半胱氨酸) 
图12：复方氨基酸注射液含量测定-供试液色谱图(含半胱氨酸) 
下述实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。 
实验例1复方氨基酸注射液(18AA)制备方法相关工艺参数筛选试验 
(1)分步投料与一步投料 
A、分步投料 
按原料配比称取各原辅料；在3000ml烧杯中加水约2500ml(30℃)，根据表1的溶解性难易确定氨基酸投料顺序：酪氨酸→门冬氨酸→异亮氨酸→亮氨酸→其余氨基酸→木糖醇和亚硫酸氢钠→色氨酸，溶解完全后，加水至配置总量；加0.1％活性炭吸附30min(55℃)，用氢氧化钠溶液调节pH至6.1，趁热用滤纸过滤脱碳，0.22μm微孔滤膜过滤，分装于100ml玻璃输液瓶，充氮(共30瓶，15瓶充氮，另15瓶不充氮，初步考察充氮效果)，上丁基胶塞、轧盖，灭菌(分别于115℃30min、121℃8min、121℃12min三种条 件灭菌，初步考察不同灭菌条件的差异)。 
表1  18种氨酸酸溶解性 
Figure GSB00000476391100111
结果与分析： 
样品试制过程中，发现各种氨酸酸溶解速度很快，每种氨基酸加入搅拌5～10分钟就溶解完，结果见表2； 
表2  18种氨基酸按原料配比溶解情况 
Figure GSB00000476391100112
通过对充氮与否样品进行强降解后比较分析，认为充氮是工艺必须，而最有效的充氮方式是灌装同时充氮，排除输液瓶内氧气，而之前的配制过程是否充氮、充氮效果影响不大。 
三种条件下灭菌的样品，外观性状、pH、和透光率等关键检测指标均未见明显差异，见表3。 
表3不同条件下灭菌的样品的检测结果 
B：一步投料 
按实施例1的方法配制3000ml样品，称取各原辅料，置3000ml烧杯中，加水至3000ml，搅拌、加热至55℃，溶解完全(20min)，余下配制、灌装、轧盖和灭菌程序同分步投料项。 
实验结果表明，各样品经60℃高温试验10天，充氮样品外观、pH和色氨酸含量均无明显变化，而未充氮样品外观变为微黄色，pH下降明显，色氨酸含量明显下降，详见表4，因此工艺中充氮是必须；两种投料方式比较，各关键指标无显著差异；三种条件的灭菌样品比较，各项指标无明显差异，因此最佳灭菌条件为121℃12分钟过渡杀灭。 
表4两种投料方式样品60℃高温10天检验结果 
Figure GSB00000476391100121
根据氨基酸溶解性分步加入各种原辅料的投料方式，配液耗时长，操作难度大，色氨酸最后降温投料理论上也不具科学性；而一步投入所有原辅料，在加热到50多度即能全部溶解(半小时内)，操作简便、快速，因此配液过程中不必制定投料顺序，可在保证充分搅拌情况下一步投入全部原辅料。 
(2)配液温度 
按原料配比称取1000ml按实施例1方法制备的样品各六份(色氨酸以110％投料)，分别置1000ml烧杯中，加水950ml，搅拌、加热，观察不同温度下溶解情况，待溶解完全后，稀释至刻度，其中将第1份样品编号为1#样品分成三份，分别在95℃加热0、1和2h，各样品再分别加0.05％活性炭吸附，滤纸过滤，用20％的氢氧化钠溶液调节pH至6.5，滤膜过滤，分装于100ml输液瓶，手工充氮20-30s/瓶，轧盖，121℃灭菌12分钟，检查主要质控指标。 
结果显示：当溶液温度高于60℃时，氨基酸在20分钟内很快溶解，见表5，因此认为溶液温度≥60℃，溶解速度快，溶解效率高； 
表5配液温度筛选结果(1) 
Figure GSB00000476391100131
将1份样品分别经95℃加热1～2小时，溶液外观无明显变化，其他关键项目也无显著差异，结果见表6，说明提高溶解温度配液，不影响产品质量。 
GMP要求注射用水应80℃保温或65℃保温循环，因此，本品配液过程中，不必刻意升温或降温投料，而根据注射用水的实际温度就能很好很快溶解各种氨基酸，达到节能增效之目的。考虑到管道传输及误差，确定溶解和吸附温度为60～90℃，为了保证尽快溶出，初始加水量最好为70～85％。 
表6配液温度筛选结果(2) 
Figure GSB00000476391100132
说明：1#-2为1#样溶解后再经95℃加热1h；1#-3为1#样溶解后再经95℃加热2h； 
(3)活性碳用量 
按实施例1方法配制3000ml样品，按原料配比称取原辅料(色氨酸以100％投料)，置烧杯中，加水2800ml，搅拌、加热至70℃使溶解，用20％的氢氧化钠溶液调节pH至6.5，稀释至刻度，分成10份，分别加0、0.002％、0.005％、0.011％、0.016％、0.021％、0.032％、0.043％、0.054％和0.11％活性炭，吸附30min，滤纸过滤脱炭，0.22μm滤膜精滤，分装于100ml输液瓶，充氮，轧盖，121℃灭菌12分钟，检查主要质控指标。 
结果显示：随着活性炭用量增加，色氨酸含量明显下降，表明活性炭对色氨酸存在明显吸附，当活性炭用量为0.1％时，色氨酸含量低于90％，结果见表7；不加活性炭吸附的样品在过滤膜时很困难，表明工艺中加活性炭是必须。 
表7活性炭用量筛选结果 
Figure GSB00000476391100133
上述结果表明，活性炭用量很关键，在平衡吸附效果和色氨酸含量的条件下，活性 炭以0.02～0.1％为宜，同时色氨酸投料量增加5～15％(以105～115％投料)，以保证产品质量。 
实验例2复方氨基酸注射液工艺清洗验证实验 
(1)精密度考察 
精密量取按实施例1方法制备的H080903批样品(规格100ml)0.5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为溶液A；分别精密量取溶液A1.5ml、2.5ml、5.0ml各3份，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别于210nm波长处测定吸收度，结果见表8，实验结果显示本发明工艺清洗验证测定方法的精密度良好。 
表8残留量检测-精密度 
Figure GSB00000476391100141
(2)检测限、定量限和线性范围考察 
精密量取按实施例1方法制备的H080903批样品逐级稀释成不同倍数，分别在210nm测定吸收值结果见表9。 
表9残留量检测-检测限、定量限和线性范围 
Figure GSB00000476391100142
Figure GSB00000476391100151
检测限为稀释6.25万倍，而定量限为稀释2.5万倍，满足残留量稀释1万倍的要求(＜10-4)；稀释倍数在500倍至6.25万倍之间，稀释倍数与吸收值呈良好线性关系，标准曲线见附图1。 
(3)样品测定 
精密量取按实施例1方法制备的3批样品、外购2批样品：宜昌山峡制药股份有限公司，批号：070702-1(500ml)、080116-2(250ml)适量，分别稀释102、103、104、105、106倍，于210nm测定吸收值，结果见表10。 
表10残留量检测-样品测定结果 
Figure GSB00000476391100152
实验结果表明，样品稀释104后，吸收值约0.03，样品批间差差异较小，完全能满足清洗验证要求。 
实验例3复方氨基酸注射液中抗氧剂的含量测定 
(1)样品检验 
仪器：DIONEX ICS-90 Chromatography System； 
色谱柱：DIONEX 9CH(4×250mm)； 
抑制器： 
Figure GSB00000476391100153
ULTRA II 4-mm 
KOH发生器：DIONEX EGG II KOH RFICTM 
色谱条件：以0.02mol/L KOH为流动相，柱温为30℃，流速为0.7ml/min，进样量10μl；分别称取亚硫酸氢钠和硫酸钠各25mg，加水溶解并稀释至50ml，分别量取1ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液；再取按实施例1方法制备的复方氨基酸注射液(18AA)未灭菌、121℃15min*1、121℃15min*2、121℃15min*3各1ml，加水稀释至10ml，分别取供试品溶液和对照溶液各10μl注入离子色谱仪，进样分析，结果见表11和附图2-7。 
表11抗氧剂含量测定结果 
Figure GSB00000476391100161
试验结果表明，在确定的色谱条件下，SO3 2-和SO4 2-能完全分开，峰型对称，因此该色谱条件适合分析抗氧剂亚硫酸氢钠及其氧化产物，能根据色谱信息准确计算原料配比中投入的抗氧剂量、残留的抗氧剂量，并能推知工艺可控性、产品稳定性试验结果见表12。 
表12样品稳定性实验结果 
Figure GSB00000476391100162
样品未灭菌前，色谱图中并无SO4 2-，但灭菌后却产生SO4 2-，随着灭菌次数增加，抗氧剂消耗增加，残留的SO3 2-减少，而SO4 2-增加，因此证明工艺中充氮是必需，同时证明一般专利文献中注射用水、原辅料的脱氧及配置过程的抽真空并不是必须，关键是灌装后的充氮除氧。工艺验证表明当灌装后充氮至残氧量＜5％时，产品质量稳定。 
通过该分析方法的建立，揭示了复方氨基酸注射液生产工艺的关键控制步骤，缩短配液时间，保证产品无菌无热源，减少了操作步骤，达到节能增效保值的目的。 
100ml、250ml和500ml三种规格的抗氧剂残留量水平不相同，其中100ml最低，而250ml和500ml规格的残留量明显高于前者，分析原因为充氮效果不同，在配制过程中的充氮没有区别，但关键的充氮部位应在灌装口，100ml因灌装时间少，充氮时间相应少，充氮效果不及其他两种规格，故抗氧剂损耗也多。 
(2)方法的检测限、定量限和线性范围 
称取亚硫酸氢钠390.74mg，加水溶解并稀释至50ml，并逐渐稀释至不同浓度溶液，进样10ul：试验结果见下表13，标准曲线见说明书附图8。 
表13亚硫酸氢钠测定——检测限、定量限和线性范围 
Figure DEST_PATH_GSB00001013290800011
实验结果表明： 
方法的检测限：0.20132μg/ml(0.002013μg) 
方法的定量限：1.006μg/ml(0.010066μg) 
线性范围：0.002013～5.033μg，回归方程：y＝13.922x-0.0832，r＝1.0000 
(3)方法精密度考察 
分别精密量取按实施例1方法制备的H080909样品0.8ml、1.0ml和1.2ml，加水稀释至10ml，按样品检验项的色谱条件进样分析，结果见表14。 
表14亚硫酸氢钠测定——方法的重复性 
Figure GSB00000476391100172
实验结果表明，9次测定，平均含量：72.3％，RSD：0.9％，本发明方法的精密度良好。 
(4)方法的准确度考察 
按实施例1方法配制不含亚硫酸氢钠的辅料储备液，称取亚硫酸氢钠26.1g，加水溶解并稀释至50ml，即得亚硫酸氢钠对照储备液； 
A：取亚硫酸氢钠对照储备液0.4ml、按实施例1方法制备的080717样品0.2ml和辅 料储备液0.4ml，分别加水稀释至10ml； 
B：取亚硫酸氢钠对照储备液0.8ml、按实施例1方法制备的080717样品0.4ml和辅料储备液0.8ml，分别加水稀释至10ml； 
C：取亚硫酸氢钠对照储备液1.2ml、按实施例1方法制备的080717样品0.6ml和辅料储备液1.2ml，分别加水稀释至10ml； 
进样分析，结果见表15。 
表15亚硫酸氢钠测定——方法的准确度 
Figure GSB00000476391100181
上述结果表明，9次高、中、低三种浓度的测定中，平均回收率为99.3％，RSD为1.9％，本发明方法的准确度良好。 
实验例4复方氨基酸注射液的含量测定实验 
(1)样品测定 
仪器：Agilent 1200 HPLC 
色谱柱：waters Symmetry 150×3.9mm 
流动相A：0.03mol/L K2HPO4(pH7.0)； 
流动相B：乙腈-甲醇(60∶40)； 
梯度程序： 
Figure GSB00000476391100182
检测波长：338nm/262nm；柱温：45℃ 
取按实施例1方法制备的080110A样品1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得供试品溶液； 
对照品溶液的制备： 
盐酸精氨酸    24mg 
盐酸组氨酸    17mg 
亮氨酸        38mg 
异亮氨酸      17mg 
盐酸赖氨酸    33mg 
苯丙氨酸      28mg 
苏氨酸        20mg 
缬氨酸        14mg 
甲硫氨酸      11mg 
甘氨酸        32mg 
丙氨酸        19mg 
脯氨酸        10mg 
门冬氨酸      12mg 
谷氨酸        20mg 
色氨酸        39mg 
酪氨酸        11mg 
丝氨酸        67mg 
盐酸半胱氨酸  44mg 
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置250ml量瓶A中，其余各氨基酸置250ml量瓶B中，分别加水80ml，振摇使溶解完全，将量瓶A加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml溶液，置量瓶B中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
进样程序：先取5.0μl硼酸盐缓冲液与1.0ul供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛1.0μl，最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯1.0μl，再取水30μl混合，注入液相色谱仪，测定结果见表16，色谱图见说明书附图9-10； 
表16六批样品氨基酸注射液含量测定结果 
Figure GSB00000476391100201
上述结果表明，连续6批样品各氨基酸含量测定结果均符合要求。 
其中各氨基酸出峰顺序为： 
门冬氨酸→谷氨酸→丝氨酸→组氨酸→甘氨酸→苏氨酸→精氨酸→丙氨酸→酪氨酸→缬氨酸→蛋氨酸→色氨酸→苯丙氨酸→异亮氨酸→赖氨酸→脯氨酸。各氨基酸分离度均大于1.5。 
当需要测定胱氨酸或半胱氨酸时，供试液需前处理：取供试品溶液0.5ml与DTDPA溶液0.5ml，置进样瓶中，密塞，80℃加热60min，进样，本处理方法不影响其他氨基酸检测，见附图11，12。 
(2)色谱条件优化 
调整各种色谱条件，进样分析，比较相邻氨基酸分离情况，结果见表17。 
表17微调各条件下各氨基酸分离度比较 
Figure GSB00000476391100202
(3)方法的检测限、定量限和线性范围 
根据原料配比量称取各氨基酸对照品，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度， 并逐级稀释至不同浓度的混合标准溶液，进样分析，以信噪比的3倍作为检测限，10倍作为定量限，并建立方法的线性范围，结果见表18。 
表18各氨基酸检测限、定量限和线性范围试验结果 
Figure GSB00000476391100211
上述结果表明，各氨基酸检测灵敏度符合要求，线性范围满足要求。 
(4)方法的准确度考察 
分别取按实施例1方法制备的20080110A样品和步骤(1)中的各种氨基酸对照品溶液适量，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，制得加样回收溶液9份，进样分析、计算，结果见表19。 
表19方法的准确度试验结果 
Figure GSB00000476391100212
上述结果表明，本发明方法的准确度较好。 
下述实施例均能实现上述实验例的效果。 
具体实施方式
实施例1：复方氨基酸注射液的制备 
盐酸精氨酸    2.89g 
盐酸组氨酸    2.46g 
亮氨酸        3.79g 
异亮氨酸      1.70g 
盐酸赖氨酸    3.33g 
苯丙氨酸      2.83g 
苏氨酸        1.97g 
缬氨酸        1.36g 
甲硫氨酸      1.06g 
色氨酸        0.39g 
甘氨酸        3.24g 
丙氨酸        1.88g 
脯氨酸        1.00g 
酪氨酸        0.11g 
丝氨酸        0.67g 
盐酸半胱氨酸  0.44g 
门冬氨酸      1.15g 
谷氨酸        1.97g 
亚硫酸氢钠    0.50g  
木糖醇        50.0g 
注射用水      适量 
全量          1000ml； 
按配方量称取各原辅料，其中色氨酸以110％标示量投料，其余按100％标示量投料；在配液罐中加注射用水至配制总量的80％，控制温度为80℃，将称好的各种原辅料投入配液罐中，充分搅拌溶解，充氮，再加0.05％活性炭搅拌吸附20分钟，温度控制在80℃；在配液罐中加注射用水稀释至全量，搅拌均匀，用20％氢氧化钠溶液调节pH至6.3，取溶液测定色氨酸标示含量为100.8％，取溶液加水稀释1000倍，在波长210nm处测定吸收值为0.273；经钛棒脱碳、0.22μm微孔滤膜过滤后，灌装，充氮，灌装后输液瓶内残氧量为1.9％，于121℃灭菌12分钟，灯检，包装，即得。 
实施例2：复方氨基酸注射液的制备 
盐酸精氨酸    2.65g 
盐酸组氨酸    3.64g 
亮氨酸        4.28g 
异亮氨酸      1.2g 
盐酸赖氨酸    2.84g 
苯丙氨酸      3.63g 
苏氨酸        2.87g 
缬氨酸        0.82g 
甲硫氨酸      0.65g 
色氨酸        0.52g 
甘氨酸        3.84g 
丙氨酸        1.25g 
脯氨酸        0.7g 
酪氨酸        0.14g 
丝氨酸        0.86g 
盐酸半胱氨酸  0.35g 
门冬氨酸      0.83g 
谷氨酸        2.65g 
亚硫酸氢钠    0.7g 
木糖醇        45.0g 
注射用水      适量 
全量          1000ml； 
按配方量称取各原辅料，其中色氨酸以105％标示量投料，其余按100％标示量投料；在配液罐中加注射用水至配制总量的70％，控制温度为90℃，将称好的各种原辅料投入配液罐中，充分搅拌溶解，充氮，再加0.03％活性炭搅拌吸附15分钟，温度控制在90℃；在配液罐中加注射用水稀释至全量，搅拌均匀，用10％氢氧化钠溶液调节pH至5.8，取溶液测定色氨酸标示含量为99.9％，取溶液加水稀释1000倍，在波长210nm处测定吸收值为0.25；经钛棒脱碳、0.22μm微孔滤膜过滤后，灌装，充氮，灌装后输液瓶内残氧量为4.9％，于115℃灭菌30分钟，灯检，包装，即得。 
实施例3：复方氨基酸注射液的制备 
盐酸精氨酸      3.46g 
盐酸组氨酸    1.54g 
亮氨酸        3.52g 
异亮氨酸      2.6g 
盐酸赖氨酸    4.26g 
苯丙氨酸      2.25g 
苏氨酸        1.34g 
缬氨酸        1.84g 
甲硫氨酸      1.45g 
色氨酸        0.28g 
甘氨酸        2.54g 
丙氨酸        2.75g 
脯氨酸        1.4g 
酪氨酸        0.08g 
丝氨酸        0.45g 
盐酸半胱氨酸  0.52g 
门冬氨酸      1.48g 
谷氨酸        1.23g 
亚硫酸氢钠    0.35g 
木糖醇        56.0g 
注射用水      适量 
全量          1000ml； 
按配方量称取各原辅料，其中色氨酸以115％标示量投料，其余按100％标示量投料；在配液罐中加注射用水至配制总量的85％，控制温度为60℃，将称好的各种原辅料投入配液罐中，充分搅拌溶解，充氮，再加0.1％活性炭搅拌吸附30分钟，温度控制在60℃；在配液罐中加注射用水稀释至全量，搅拌均匀，用30％氢氧化钠溶液调节pH至6.8，取溶液测定色氨酸标示含量为101.3％，取溶液加水稀释1000倍，在波长210nm处测定吸收值为0.30；经钛棒脱碳、0.22μm微孔滤膜过滤后，灌装，充氮，灌装后输液瓶内残氧量为3.5％，于121℃灭菌18分钟，灯检，包装，即得。 
实施例4：复方氨基酸注射液中抗氧剂的检测方法 
色谱条件与系统适应性试验：以DIONEX 9HC为色谱柱，流动相为0.02mol/L氢氧化钾，柱温为30℃，电化学检测器，流速为0.7ml/min； 
对照品溶液的制备：分别称取亚硫酸氢钠和硫酸钠各25mg，加水溶解并稀释至50ml，分别量取1ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：精密量取实施例1、2、3制备的本发明复方氨基酸注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液； 
测定法：分别取供试品溶液和对照溶液各10μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。 
测定结果：结果见下表： 
Figure GSB00000476391100251
本发明复方氨基酸注射液中抗氧剂标示含量应为80％～110％。 
实施例5：复方氨基酸注射液中抗氧剂的检测方法 
色谱条件与系统适应性试验：以DIONEX 9HC为色谱柱，流动相为0.01mol/L氢氧化钾，柱温为40℃，电化学检测器，流速为1.0ml/min； 
对照品溶液的制备：分别称取亚硫酸氢钠和硫酸钠各25mg，加水溶解并稀释至50ml，分别量取0.5ml置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：精密量取实施例1、2、3制备的本发明复方氨基酸注射液0.5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液； 
测定法：分别取供试品溶液和对照溶液各5μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。 
测定结果：结果见下表： 
Figure GSB00000476391100252
本发明复方氨基酸注射液中抗氧剂标示含量应为80％～110％。 
实施例6：复方氨基酸注射液中抗氧剂的检测方法 
色谱条件与系统适应性试验：以DIONEX 9HC为色谱柱，流动相为0.04mol/L氢氧化钾，柱温为20℃，电化学检测器，流速为0.5ml/min； 
对照品溶液的制备：分别称取亚硫酸氢钠和硫酸钠各25mg，加水溶解并稀释至50ml，分别量取2ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：精密量取实施例1、2、3制备的本发明复方氨基酸注射液2ml， 置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液； 
测定法：分别取供试品溶液和对照溶液各20μl，注入离子色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。 
测定结果：结果见下表： 
Figure GSB00000476391100261
本发明复方氨基酸注射液中抗氧剂标示含量应为80％～100％。 
实施例7：复方氨基酸注射液的检测方法 
色谱条件与系统适应性试验：仪器：Agilent 1200 HPLC，色谱柱：Capcell PAK C18，MGII，150mm*4.6mm，流动相A：0.05mol/L K2HPO4，pH为7.0，流动相B：50∶50的乙腈-甲醇，检测波长：338nm/262nm，柱温：40℃；梯度程序：v0＝1.2ml/min，时间：0-30-35-35.5-38.5-39.5-40分钟，流动相B：0～50％～100％～100％～100％～0～0，流速：1.2-1.2-1.2-2.0-2.0-2.0-1.2ml/min， 
Figure GSB00000476391100262
对照品溶液的制备： 
盐酸精氨酸    24mg 
盐酸组氨酸    17mg 
亮氨酸        38mg 
异亮氨酸      17mg 
盐酸赖氨酸    33mg 
苯丙氨酸      28mg 
苏氨酸        20mg 
缬氨酸        14mg 
甲硫氨酸      11mg 
甘氨酸        32mg 
丙氨酸        19mg 
脯氨酸        10mg 
门冬氨酸      12mg 
谷氨酸        20mg 
色氨酸        39mg 
酪氨酸        11mg 
丝氨酸        67mg 
盐酸半胱氨酸  44mg 
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置100ml量瓶A中，其余各氨基酸置100ml量瓶B中，分别加水80ml，振摇使溶解完全，将量瓶A加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml溶液，置量瓶B中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：取实施例1、2、3项下制备的本发明复方氨基酸注射液1ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得；当测定胱氨酸或半胱氨酸时，取供试品溶液0.5ml与DTDPA溶液0.5ml，置进样瓶中，密塞，80℃加热60分钟，即得； 
测定法：先取2.5μl硼酸盐缓冲液与0.5ul供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛0.5μl，最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯0.5μl，再取水20μl混合，注入液相色谱仪，测定，即得。 
测定结果见下表： 
Figure GSB00000476391100271
本发明复方氨基酸注射液中各氨基酸含量测定结果均为标示量的90％～110％。 
实施例8：复方氨基酸注射液的检测方法 
色谱条件与系统适应性试验：仪器：Agilent 1200 HPLC，色谱柱：waters Symmetry150×3.9mm，流动相A：0.03mol/L K2HPO4，pH为7.0；流动相B：60∶40的乙腈-甲醇；检测波长：338nm/262nm，柱温：45℃，梯度程序为：时间：0-18.0-22-26.5-28.00-29.5-30.00分钟，流动相B：0～70％-100％～100％～100％～0～0，流速：0.9-0.9-0.9-1.8-1.8-1.8-0.9ml/min， 
梯度程序：梯度程序： 
Figure GSB00000476391100281
对照品溶液的制备： 
盐酸精氨酸    24mg 
盐酸组氨酸    17mg 
亮氨酸        38mg 
异亮氨酸      17mg 
盐酸赖氨酸    33mg 
苯丙氨酸      28mg 
苏氨酸        20mg 
缬氨酸        14mg 
甲硫氨酸      11mg 
甘氨酸        32mg 
丙氨酸        19mg 
脯氨酸        10mg 
门冬氨酸      12mg 
谷氨酸        20mg 
色氨酸        39mg 
酪氨酸        11mg 
丝氨酸        67mg 
盐酸半胱氨酸  44mg 
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置250ml量瓶A中，其余各氨基酸置250ml量瓶B中，分别加水80ml，振摇使溶解完全；将量瓶A加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml溶液，置量瓶B中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：取本发明复方氨基酸注射液1ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得； 
测定法：先取5.0μl硼酸盐缓冲液与1.0ul供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛1.0μl，最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯1.0μl，再取水30μl混合，注入液相色谱仪，测定，即得。 
本发明复方氨基酸注射液中各氨基酸含量测定结果均为标示量的90％～110％。 
实施例9：复方氨基酸注射液的检测方法 
色谱条件与系统适应性试验：仪器：Agilent 1200 HPLC，色谱柱：Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18，100mm*3.5mm，流动相A：0.02mol/L K2HPO4，pH为6.8，流动相B：60∶40的乙腈-甲醇，检测波长：338nm/262nm，柱温：30℃；梯度程序为：v0＝0.5ml/min，时间：0-15-20-25.5-27.5-29.5-30分钟，流动相B：0～40％-80％～80％～80％～0～0，流速：0.5-0.5-0.5-1.0-1.0-1.0-0.5ml/min， 
梯度程序：v0＝0.5ml/min 
  时间(min)   0   15   20   25.5   27.5   29.5   30
  流动相B(％)   0   40   80   80   80   0   0
  流速(ml/min)   0.5   0.5   0.5   1.0   1.0   1.0   0.5
对照品溶液的制备： 
盐酸精氨酸    25mg 
盐酸组氨酸    14mg 
亮氨酸        35mg 
异亮氨酸      7mg 
盐酸赖氨酸    23mg 
苯丙氨酸      18mg 
苏氨酸        10mg 
缬氨酸        5mg 
甲硫氨酸      5mg 
甘氨酸        23mg 
丙氨酸        8mg 
脯氨酸        5mg 
门冬氨酸      6mg 
谷氨酸        9mg 
色氨酸        20mg 
酪氨酸        5mg 
丝氨酸        30mg 
盐酸半胱氨酸  20mg 
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置500ml量瓶A中，其余各氨基酸置500ml量瓶B中，分别加水适量，振摇使溶解完全；将量瓶A加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml溶液，置量瓶B中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：取实施例1、2、3项下的复方氨基酸注射液0.5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得；当测定胱氨酸或半胱氨酸时，分别取供试品溶液0.2ml与3，3’-二硫代二丙酸溶液(DTDPA)0.2ml，置进样瓶中混合，密塞，60℃加热40分钟，即得； 
测定法：先取1μl硼酸盐缓冲液与0.2ul供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛0.2μl、混合；最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯0.2μl、混合；再加水10μl混合，注入液相色谱仪，测定，即得；测定结果见下表： 
Figure GSB00000476391100301
本发明复方氨基酸注射液中各氨基酸均为标示含量的90％～110％。 
实施例10：复方氨基酸注射液的检测方法 
色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：ALLTECH，ATTIMA，ODS，150mm*4.6mm，流动相A：0.06mol/L K2HPO4，pH为7.8，流动相B：40∶60的乙腈-甲醇，检测波长：338nm/262nm， 柱温：50℃；梯度程序为：v0＝1.5ml/min，时间：0～40～45～45.5～48.5～49.5～50分钟，流动相B：0～70％～100％～100％～100％～0～0，流速：1.5～1.5～1.5～2.5～2.5～2.5～1.5ml/min， 
梯度程序：v0＝1.5ml/min 
  时间(min)   0   40   45   45.5   48.5   49.5   50
  流动相B(％)   0   70   100   100   100   0   0
  流速(ml/min)   1.5   1.5   1.5   2.5   2.5   2.5   1.5
对照品溶液的制备： 
盐酸精氨酸    35mg 
盐酸组氨酸    35mg 
亮氨酸        45mg 
异亮氨酸      27mg 
盐酸赖氨酸    43mg 
苯丙氨酸      39mg 
苏氨酸        30mg 
缬氨酸        20mg 
甲硫氨酸      15mg 
甘氨酸        42mg 
丙氨酸        29mg 
脯氨酸        15mg 
门冬氨酸      16mg 
谷氨酸        28mg 
色氨酸        60mg 
酪氨酸        15mg 
丝氨酸        90mg 
盐酸半胱氨酸  60mg 
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置50ml量瓶A中，其余各氨基酸置50ml量瓶B中，分别加水适量，振摇使溶解完全；将量瓶A加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml溶液，置量瓶B中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液； 
供试品溶液的制备：取实施例1、2、3项下的复方氨基酸注射液2ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得；当测定胱氨酸或半胱氨酸时，分别取供试品溶液2.0ml与3，3’-二硫代二丙酸溶液(DTDPA)2.0ml，置进样瓶中混合，密塞，90℃加热80分钟，即得； 
测定法：先取5μl硼酸盐缓冲液与2.0ul供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛2.0μl、混合；最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯2.0μl、混合；再加水30μl混合，注入液相色谱仪，测定，即得；测定结果见下表： 
Figure GSB00000476391100321
本发明复方氨基酸注射液中各氨基酸均为标示含量的90％～110％。 

Claims (2)

1.一种复方氨基酸注射液的检测方法，该注射液的原料组成为：
盐酸精氨酸     2.89重量份
盐酸组氨酸     2.46重量份
亮氨酸         3.79重量份
异亮氨酸       1.70重量份
盐酸赖氨酸     3.33重量份
苯丙氨酸       2.83重量份
苏氨酸         1.97重量份
缬氨酸         1.36重量份
甲硫氨酸       1.06重量份
色氨酸         0.39重量份
甘氨酸         3.24重量份
丙氨酸         1.88重量份
脯氨酸         1.00重量份
酪氨酸         0.11重量份
丝氨酸         0.67重量份
盐酸半胱氨酸   0.44重量份
门冬氨酸       1.15重量份
谷氨酸         1.97重量份
亚硫酸氢钠     0.50重量份
木糖醇         50.0重量份
注射用水适量
全量 1000体积份
其特征在于，该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适应性试验：仪器：Agilent 1200 HPLC，色谱柱：Capcell pak C18，
MGⅡ，150×4.6mm，流动相A：0.05mol/L K2HPO4，pH 为7.0，流动相B：50:50
的乙腈-甲醇，检测波长：338nm/262nm，柱温：40℃，梯度程序为：v0=1.2ml/min，
时间：0-30-35-35.5-38.5-39.5-40分钟，流动相B：0～50%-70%～100%～100%～
100%～0～0，流速：1.2-1.2-1.2-2.0-2.0-2.0-1.2ml/min,
对照品溶液的制备：
盐酸精氨酸       24mg
盐酸组氨酸       17mg
亮氨酸           38mg
异亮氨酸         17mg
盐酸赖氨酸       33mg
苯丙氨酸         28mg
苏氨酸           20mg
缬氨酸           14mg
甲硫氨酸         11mg
甘氨酸           32mg
丙氨酸           19mg
脯氨酸           10mg
门冬氨酸         12mg
谷氨酸           20mg
色氨酸           39mg
酪氨酸           11mg
丝氨酸           67mg
盐酸半胱氨酸     44mg
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置100ml 量瓶A 中，
其余各氨基酸置100ml 量瓶B 中，分别加水80ml，振摇使溶解完全；将量瓶A 加水
稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml 溶液，置量瓶B 中，加水稀释至刻度，作为对照
品溶液；
供试品溶液的制备：取复方氨基酸注射液1ml，置10ml 量瓶中，加水稀释至刻度，
即得；当测定胱氨酸或半胱氨酸时，取供试品溶液0.5ml 与3,3'-二硫代二丙酸溶液即
DTDPA 溶液0.5ml，置进样瓶中，密塞，80℃加热60分钟，即得；
测定法：先取2.5μl 硼酸盐缓冲液与0.5ul 供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛0.5μl、混合，最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯0.5μl、混合，再取水20μl 混合，注入液相色谱仪，测定，即得；
复方氨基酸注射液中各氨基酸含量测定结果均为标示量的90%～110%。
2.一种复方氨基酸注射液的检测方法，该注射液的原料组成为：
盐酸精氨酸     2.89重量份
盐酸组氨酸     2.46重量份
亮氨酸         3.79重量份
异亮氨酸       1.70重量份
盐酸赖氨酸     3.33重量份
苯丙氨酸       2.83重量份
苏氨酸         1.97重量份
缬氨酸         1.36重量份
甲硫氨酸       1.06重量份
色氨酸         0.39重量份
甘氨酸         3.24重量份
丙氨酸         1.88重量份
脯氨酸         1.00重量份
酪氨酸         0.11重量份
丝氨酸         0.67重量份
盐酸半胱氨酸   0.44重量份
门冬氨酸       1.15重量份
谷氨酸         1.97重量份
亚硫酸氢钠     0.50重量份
木糖醇         50.0重量份
注射用水适量
全量 1000体积份
其特征在于该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适应性试验：仪器：Agilent 1200 HPLC，色谱柱：waters Symmetry
150×3.9mm，流动相A：0.03mol/L K2HPO4，pH 为7.0；流动相B：60:40的乙腈-
甲醇； 检测波长：338nm/262nm ，柱温：45℃ ， 梯度程序为：时间：
0-18.0-22-26.5-28.00-29.5-30.00分钟，流动相B：0～70%-100%～100%～100%～0～
0，流速：0.9-0.9-0.9-1.8-1.8-1.8-0.9ml/min,
对照品溶液的制备：
盐酸精氨酸         24mg
盐酸组氨酸         17mg
亮氨酸             38mg
异亮氨酸           17mg
盐酸赖氨酸         33mg
苯丙氨酸           28mg
苏氨酸             20mg
缬氨酸             14mg
甲硫氨酸           11mg
甘氨酸             32mg
丙氨酸             19mg
脯氨酸             10mg
门冬氨酸           12mg
谷氨酸             20mg
色氨酸             39mg
酪氨酸             11mg
丝氨酸             67mg
盐酸半胱氨酸       44mg
称取以上对照品，其中酪氨酸、色氨酸、盐酸半胱氨酸和丝氨酸置250ml 量瓶A 中，
其余各氨基酸置250ml 量瓶B 中，分别加水80ml，振摇使溶解完全；将量瓶A 加水
稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml 溶液，置量瓶B 中，加水稀释至刻度，作为对照
品溶液；
供试品溶液的制备：取复方氨基酸注射液1ml，置25ml 量瓶中，加水稀释至刻度，
即得；
测定法：先取5.0μl 硼酸盐缓冲液与1.0ul 供试品溶液混合，再加入邻苯二甲醛1.0μl，最后加入9-芴甲基氯甲酸甲酯1.0μl，再取水30μl 混合，注入液相色谱仪，测定，即得；
复方氨基酸注射液中各氨基酸含量测定结果均为标示量的90%～110%。
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