CN101906150B - 一种比法卢定的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽固相合成比法卢定(Bivalirudin)的制备方法，所述的方法包括步骤：(1)在缩合剂存在下将Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH和如式V所示的多肽树脂缩合，得到如式III所示的多肽树脂；(2)将如式III所示的多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；(3)在缩合剂存在下将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和如式VI所示的多肽树脂缩合，得到如式IV所示的多肽树脂；(4)通过固相合成的方法将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至D-Phe的顺序依次同如式IV所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成如式II所示的多肽树脂；和(5)在切割剂的存在下使式II所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的比法卢定。<tables num="0001">
Description
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域，尤其涉及比法卢定(Bivalirudin)的固相合成方法。
背景技术
在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上；在去保护剂的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过试剂活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。
凝血酶抑制剂被认为是很有前途的抗血栓药：通过凝血酶进行的蛋白水解过程是血液凝结控制的关键所在。抗凝血肽比伐卢定(bivalirudin)，即所谓的“二价水蛭素(hirulog)”。水蛭素是一种获自吸血水蛭-医用水蛭Hirudomedicinalis的有效治疗性凝血酶肽抑制剂，其包含20个氨基酸，属于强有力的凝血酶直接抑制剂。比伐卢定(bivalirudin)是一种近年来应用于临床的直接凝血酶抑制剂，于2000年批准在美国上市，其有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，作用可逆而短暂。比法卢定可以作为普通肝索和血小板糖蛋白II b/lI a拮抗剂的替代药物应用于非高危患者的经皮冠脉介入治疗。
US20070093423A公开了一种多肽固相合成比法卢定的方法，其采用固液相合成方法，将Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly和Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu两个片段耦合反应形成比法卢定。该方法的成本较高，产生的杂质多，产品纯度有限。
US20090062511A公开了一种固相合成比法卢定的方法，其采用固相合成方法，操作繁琐，产生的杂质多。
因此，本领域迫切需要提供一种多肽固相合成比法卢定的新方法，其成本低廉、得到的比法卢定纯度高，可以有效去除HPLC主峰前、后的[Bivalirudin-Gly](即Bivalirudin少一Gly)和[Bivalirudin+Gly](即Bivalirudin多一Gly)杂质。
发明内容
本发明旨在提供一种多肽固相合成比法卢定(Bivalirudin)的制备方法。
本发明提供了一种比法卢定(Bivalirudin)的制备方法，所述的方法包括步骤：
(1)在缩合剂存在下，将Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH和如式V所示的多肽树脂缩合，得到如式III所示的多肽树脂；
(2)将如式III所示的多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；
(3)在缩合剂存在下，将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和如式VI所示的多肽树脂缩合，得到如式IV所示的多肽树脂；
(4)通过固相合成的方法将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的顺序依次同如式IV所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成如式II所示的多肽树脂；和
(5)在切割剂的存在下，使式II所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的比法卢定；
其中，所述的Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH通过下述步骤得到：
(i)将Z-Asn(Trt)-OH和H-Gly-OBzl.TosOH混合，进行液相多肽缩合，得到Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl；
(ii)将Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl进行氢化还原，得到H-Asn(Trt)-Gly-OH；和
(iii)将H-Asn(Trt)-Gly-OH和Fmoc保护基混合，得到Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH。
所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH通过下述步骤得到：
(a)将H-Gly-Gly-OBzl和Z-Gly-Gly-OH混合，进行液相多肽缩合，得到Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl；
(b)将Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl进行氢化还原，得到H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；和
(c)将H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc保护基混合，得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
所述的H-Gly-Gly-OBzl通过将Boc-Gly-OH和H-Gly-OBzl进行液相多肽缩合后脱保护基得到。
所述的Z-Gly-Gly-OH通过将Z-Gly-OH和H-Gly-OMe进行液相多肽缩合后还原得到。
在本发明提供的制备方法中，所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；优选，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-20％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-8％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)
在另一优选例中，所述的去保护剂含有5-15％哌啶和1-7％二环脒(DBU)；优选，所述去保护剂还含有选自下述的一种或多种物质：0.5-10％1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-5％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。
在本发明提供的制备方法的步骤(4)中，Arg同多肽树脂进行缩合时将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚以及缩合剂混合，使Fmoc-Arg(Pbf)-OH和树脂上的多肽进行缩合。
在本发明提供的制备方法中，所述缩合在选自下述的一种或多种缩合剂的存在下进行：N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)/N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鏻六氟磷酸(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)。
在本发明提供的制备方法中，述的缩合用茚三酮显色法(Kaiser)监控。
在另一优选例中，脯氨酸(Pro)之后的缩合反应使用Chloranil and Kaiser测试法进行监控。
在本发明提供的制备方法的步骤(5)中，在各物质配比为95-60三氟乙酸(TFA)∶5-10三异丙基硅烷(TIS)∶5-30水的切割剂存在下进行。
据此，本发明提供了一种多肽固相合成比法卢定的新方法，其成本低廉、得到的比法卢定纯度高，可以有效去除HPLC主峰前、后的[Bivalirudin-Gly](即Bivalirudin少一Gly)和[Bivalirudin+Gly](即Bivalirudin多一Gly)杂质。
附图说明
图1显示了实施例1获得的比法卢定1的HPLC检测图谱。
图2显示了实施例2获得的比法卢定2的HPLC检测图谱。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了在多肽固相合成比法卢定的过程中，将通过多肽液相合成方法得到的Asn(Trt)-Gly和Gly-Gly-Gly-Gly片段进行缩合，可以简化纯化过程，有效去除主峰前后[Bivalirudin-Gly]和[Bivalirudin+Gly]杂峰，并且提高纯化收率。
本发明使用含有DMF、哌啶、DBU、HOBt、HOOBT的去保护剂，针对-Asn-Gly-结构，使用含有哌啶、DBU、HOOBT和HOBt中的一种或多种物质组成的保护剂尤其有效。
另外，发明人还发现，在多肽固相合成比法卢定的过程中，针对缩合步骤，可加入含有HOBt/DIC或TBTU/NMM的缩合剂，并且在缩合过程中进行监测；而针对缩合精氨酸(Arg)的步骤，其中还需含有五氟苯酚，可以有效降低成本。
本发明中所使用的缩写的含义列于下表：
| Fmoc | 9芴甲氧羰基 |
| Z | 和Fmoc一样是保护基，苄氧羰基 |
| Fmoc-Osu | 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| KSCN | 硫氰化钾 |
| DBU | 1，8-二氮杂二环[5，4，0]十一碳-7-烯 |
| HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| DIC | N，N′-二异丙基碳二亚胺 |
| TBTU | 苯并三唑四甲基脲四氟硼酸 |
| NMM | N-甲基吗啉 |
| HBTU | O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸 |
| DIEA | 二异丙基乙胺 |
| Pbf | 2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 |
| Opfp | 五氟苯酯 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| MTBE | 甲基叔丁基醚 |
| HOOBT | 3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮 |
| HATU | O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸 |
| TBTU | O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸 |
| PyBOP | (苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鏻六氟磷酸 |
| EtOAc | 乙酸乙酯 |
| OBzl | 苄酯 |
| TosOH | 对甲苯磺酸 |
| EDC | 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 |
| tBu | 叔丁基，-C(CH3)3 |
| OtBu | -O-C(CH3)3 |
如本文所用，“固相合成”或“多肽固相合成(solid phase peptidesynthesis)”是一种本领域熟知的多肽合成技术，包括但不限于下述方法：将一个氨基被保护的氨基酸共价连接(键合)在固相载体上；在去保护剂存在下，脱掉氨基的保护基，使第一个氨基酸就接到了固相载体上了；然后氨基被封闭(保护)的第二个氨基酸的羧基通过N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应(缩合)形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度；最后脱去氨基的保护基，水解肽链和固相载体之间的酯键(切割)，得到合成好的肽。
如本文所用，“去保护剂”是指可以将连接在氨基酸上的氨基保护剂去除的化学试剂，所述的氨基保护剂可以使本领域熟知的，例如但不限于，Fmoc，Boc；优选地，本发明的去保护剂含有以其总体积计，含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；优选，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-20％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-10％3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。
如本文所用，“缩合剂”是指使一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基缩合形成肽键的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，碳二亚胺、ByPOB、HATU、TBTU。
如本文所用，“切割剂”是指将同树脂键合的多肽和树脂分离的化学试剂，可以使本领域熟知的，例如但不限于，含有TFA的弱酸性溶液、HCl溶液。
在本发明的一个实例中，本发明多肽固相合成比法卢定的制备方法包括以下步骤：
第一步，将Fmoc-亮氨酸(Fmoc-Leu)和树脂键合，得到连接有亮氨酸的树脂；可以使用本领域所熟知的树脂使，优选Wang树脂，更优选Wang树脂的替代率为0.6-1.4mmol/g；
第二步，将本发明的去保护剂和连接有亮氨酸的树脂混合，脱除Fmoc基团；
第三步，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH和树脂上的Leu进行缩合形成肽键，得到Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-树脂；
第四步，使用本发明的去保护剂脱除Fmoc基团；
第五步，重复上述肽键形成步骤，使肽链从C端向N端生长，直至得到Fmoc-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂；(OtBu/tBu是保护基，最后会被脱除)
第六步，使用本发明的去保护剂脱除Fmoc基团；
第七步，将Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH和树脂上的多肽缩合，形成Fmoc-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂；
第八步，使用本发明的去保护剂脱除Fmoc基团；
第九步，将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和树脂上的多肽缩合，形成Fmoc-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂；
第十步，使用本发明的去保护剂脱除Fmoc基团；
第十一步，重复上述肽键形成步骤，使肽链从C端向N端生长，直至得到Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20-树脂；
第十二步，在切割剂存在下，使多肽树脂上的如式I所示多肽和树脂分离，得到比法卢定；所述切割剂中含有TFA、TIS和水。
在本发明的一个优选例中，第一步中将1.0-3.0倍的Fmoc-Leu-OH和Wang树脂反应。
在本发明的一个优选例中，第三、第五、第七、第九、和/或第十一步肽键形成的反应中，将1.5-4.5倍树脂当量的Fmoc-氨基酸(或多肽)，1.5-3.0倍树脂当量的HOBt用1mL/g树脂量的DMF溶解后排加入到树脂中，再加入2.0-6.0倍树脂当量的DIC或TBTU反应90钟后，将上述溶液在10℃下，再用DMF将上述溶液稀释至4mL/g树脂的体积，反应6小时。
在本发明的一个优选实施例中，在上述第十一步肽键形成的反应中，有关Fmoc-Arg(Pbf)-OH的缩合步骤是这样进行的：1.5-6.0当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚，用3毫升每克树脂量的DMF溶解后，再加入1.5-6.0当量的缩合剂，如DIC或HATU或TBTU或PyBOP，搅拌90分钟，将上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到树脂中，搅拌反应12-36小时。
在本发明的一个优选实施例中，所述的缩合(即肽键形成的反应)用茚三酮显色法(Kaiser)监控。更佳地，脯氨酸(Pro)之后的缩合反应(就是Pro后面的一个氨基酸，如1#Boc-D-Phe-OH，3#Fmoc-Arg(pbf)-OH，15#Fmoc-Ile-OH的缩合)使用Chloranil和Kaiser测试法进行监控。
有关茚三酮显色法(Kaiser)、Chloranil和Kaiser测试法，及其监控方法可以参见文献VIRENDER K.SARIN，et al.“Quantitative Monitoring ofSolid-Phase Peptide Synthesis by the Ninhydrin Reaction”ANALYTICALBIOCHEMISTRY 117，147-157(1981)、E.KAISER，et al.“Color Test forDetection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-Phase Synthesis ofPeptides”SHORT COMMUNICATIONS 595-598(Received October 28，1969)、和THORKILD CHRISTENSEN“A Qualitative Test for Monitoring CouplingCompleteness in Solid Phase Peptide Synthesis Using Chloranil”ActaChemica Scandinavica B 33(1979)763-766。
通过本发明提供的制备方法得到的比法卢定，产率可以是90-125％，其纯度可以达到80％-91％。在本发明的一个优选例中，还可以将第十二步得到的比法卢定进行沉降，即将第十二步得到的如式I的多肽和MTBE或乙醚混合，形成多肽沉淀；较佳地，是用冰水浴或本领域熟知的其它致冷剂将MTBE或乙醚冷却至零下10至0℃，用另一种醚洗涤、分离。将沉淀混合物过滤或离心分离沉淀，得到纯化的比法卢定，其纯度可达到80％以上。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、大大节约成本：通过比较树脂、特殊氨基酸的合成等方面的传统工艺和本发明的工艺，可以降低成本约50％。
2、降低杂质，提高纯度：
本发明提供的固液相片段合成方法，消除了由Gly引起的主峰前后杂，前杂含量[Bivalirudin+Gly]＜0.2％，后杂含量[Bivalirudin-Gly]＜0.6％。
3、危险系数降低：
采用少量乙醚，大大提高了生产的安全性。乙醚闪点-45℃，沸点34.6℃，为极易燃化学物品。甲基叔丁基醚闪点-28℃，沸点55.3℃。
4、环保，产生废弃物少：
本发明的生产工艺完全为固相合成法，因此几乎为无水生产，洗涤用的有机溶剂可回收循环再利用，产生废弃物少。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
制备比法卢定1
一、液相法合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH片段
反应式为：
1.Z-Gly-Gly-OMe的合成
将Z-Gly-OH(104.55g)和H-Gly-OMe.HCl(69.05g)溶解在DMF(600mL)中，冷却该溶液至内温0℃。向溶液中加入HOBt(74.32g)和EDC.HCl(105.44g)，加入NMM调节反应液pH值到8，NMM加毕，移除冷浴，在室温下反应。用TLC监测反应，反应毕，反应液用EtOAc(600ml)稀释，用5％H3PO4(600ml)洗涤，水相再用EtOAc(300ml)萃取，合并有机相，依次用5％H3PO4，饱和食盐水洗涤一次，饱和NaHCO3洗涤三次，饱和食盐水洗涤一次。再用无水Na2SO4干燥，过滤、浓缩得到白色固体(Z-Gly-Gly-OMe)。
2.Z-Gly-Gly-OH的合成
将Z-Gly-Gly-OMe(280.34g)溶解在THF(200mL)中，将该溶液冷却至内温低于0℃。向该溶液中滴加1N NaOH溶液(150ml)。加毕，内温升至1℃，继续搅拌反应。用TLC检测反应，反应毕，用EtOAc(200ml)萃取溶液三次，有机相弃除，水相用6NHCl调节pH至3，滤出生成的固体沉淀，用H2O洗涤三次，干燥得到白色固体(Z-Gly-Gly-OH)。
3.Boc-Gly-Gly-OBzl的合成
将Boc-Gly-OH(19.3g)，H-Gly-OBzl.TosOH(44.5g)和HOBt(17.84g)溶解在DMF(500ml)中，将该溶液冷却至0℃，加入EDC.HCl(25.3g)，用NMM调节pH值至8，撤去冷浴，室温反应(20℃)过夜。反应液用EtOAc稀释，用5％H3PO4洗涤，水层用EA萃取。合并有机相，依次用5％H3PO4，饱和食盐水洗涤一次，饱和NaHCO3洗涤三次，饱和食盐水洗涤一次，再用无水Na2SO4干燥，过滤、浓缩得白色固体(Boc-Gly-Gly-OBzl)。
4.H-Gly-Gly-OBzl.TFA的合成
将Boc-Gly-Gly-OBzl(29.02g)溶解在DCM(150ml)中，在0℃下，加入50mlTFA。所得溶液搅拌反应，去除溶剂得到油状物(H-Gly-Gly-OBzl.TFA)。
5.Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl的合成
将H-Gly-Gly-OBzl.TFA(36g)溶解在DMF(500ml)中，在0℃时，加入NMM调节pH值至7。在上述溶液中，加入Z-Gly-Gly-OH(22.64g)，HOBt(12.16g)，EDC.HCl(17.25g)。用NMM调节pH值至8，移除冷浴，在室温下反应。反应完毕，将反应生成的沉淀过滤出，依次用5％H3PO4，饱和NaHCO3溶液，水洗涤，干燥得固体(Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl)。
6.H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的合成
在40℃，将Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl(38.5g)溶解在DMF(1L)中，加入Pd/C(10％，10g)，加氢还原。反应毕，过滤去除固体，滤液弃去。将滤渣用200mL 1N NaHCO3溶液搅拌，过滤得滤液，直接用于下一步。
7.Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的合成
将上一步所得溶液降温，加入Fmoc-OSu的THF溶液，体系浑浊。移除冷浴，在室温下反应。加入1NHCl调节pH值至2至3，过滤出生成沉淀，用水和EA洗涤，干燥得固体。
粗品溶解在70℃的DMF中，加入到4倍体积的水和4倍体积的饱和食盐水混合溶液中，沉淀析出。所得固体用水洗涤，干燥得到产品(Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，纯度为98.54％)。
二、固相法合成
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu
装载：将氨基酸树脂装入一个合适大小的固相合成反应器中。每克树脂用10-15毫升DMF溶胀2-3小时。
Fmoc-亮氨酸键合步骤：2.0 equivalent mol(倍当量的)Fmoc-亮氨酸，经2，6-二氯苯甲酰氯和吡啶活化与Wang树脂(替代率0.6-1.4mmol/g)在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应。
Fmoc脱除步骤：用15％哌啶/5％DBU的DMF溶液30分钟脱除Fmoc基团。再用DMF洗涤树脂1遍；甲醇洗涤树脂3遍；DMF洗涤树脂3遍。
Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH缩合步骤：3.0倍树脂当量的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，3.0当量的HOBT用3mL/g树脂量的DMF溶解后加入到树脂中，再加入3.0倍树脂当量的DIC。用茚三酮显色法(Kaiser)监控。增长的肽链用DMF、甲醇洗涤树脂。
Boc-D-Phe-OH最后一个氨基酸缩合缩合步骤：3.0倍树脂当量的Boc-D-Phe-OH(氨基酸#1)(3.0当量)，3.0倍树脂当量的HOBt用3mL/g树脂量的DMF溶解后加入到树脂中，再加入3.0倍树脂当量的DIC，反应。
Fmoc-Arg(Pbf)-OH缩合步骤：3.0当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚用3毫升每克树脂量的DMF溶解后，再加入3.0当量的DIC，搅拌45分钟，将上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到树脂中，搅拌反应3小时。如果缩合反应在21-24小时仍未完全，重复上述Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp活化酯的缩合。
反应监控/重复缩合：缩合反应用茚三酮显色法(Kaiser)监控，如果是脯氨酸(Pro)之后的缩合反应则用Chloranil and Kaiser测试法监控。
合成完毕洗涤步骤：完成多肽序列的所有氨基酸缩合后，树脂用甲醇、DMF洗涤，干燥直至恒重，并根据树脂增重计算合成产率。
切割液配制：在一个夹套玻璃反应釜里将三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/水，按95∶2.5∶2.5(体积比)(±10％)的配比混合，配制切割液。
切割：将多肽树脂加入到冷却的切割液中，维持混合液温度在0-15℃。然后将反应混合液回温至18-28℃，并在此温度下搅拌反应120-180分钟。接着，用反应釜底过滤板，过滤分离混合液，用三氟乙酸洗涤过滤掉的树脂，每克多肽树脂0.5-1.0mL的三氟乙酸量。收集所有滤液，去除树脂。
沉淀：用冰水浴或者其它致冷剂将甲基叔丁基醚(MTBE)冷却至0-8℃，将浓缩后的多肽溶液加入其中，形成多肽沉淀。将沉淀混合物在0-10℃静置60-80分钟。用离心机分离沉淀。用甲基叔丁基醚洗涤沉淀，然后再次用离心机分离沉淀。
产品干燥：将多肽固体转移到一个合适的容器中，干燥得到比法卢定1。
经测定，杂质[Bivalirudin-Gly]含量为0.17％，杂质[Bivalirudin+Gly]含量为0.07％。
实施例2
制备比法卢定2
一、液相法合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH片段
反应式为：
1.Z-Gly-Gly-OMe的合成
将Z-Gly-OH(104.55g)和H-Gly-OMe.HCl(69.05g)溶解在DMF(600mL)中，冷却该溶液至内温0℃。向溶液中加入HOBt(74.32g)和EDC.HCl(105.44g)，加入NMM调节反应液pH值到8，NMM加毕，移除冷浴，在室温下反应。用TLC监测反应，反应毕，反应液用EtOAc(600ml)稀释，用5％H3PO4(600ml)洗涤，水相再用EA(300ml)萃取，合并有机相，依次用5％H3PO4，饱和食盐水洗涤一次，饱和NaHCO3洗涤三次，饱和食盐水洗涤一次。再用无水Na2SO4干燥，过滤、浓缩得到白色固体(Z-Gly-Gly-OMe)。
2.Z-Gly-Gly-OH的合成
将Z-Gly-Gly-OMe(280.34g)溶解在THF(200mL)中，将该溶液冷却至内温低于0℃。向该溶液中滴加1N NaOH溶液(150ml)。加毕，内温升至1℃，继续搅拌反应。用TLC检测反应，反应毕，用EtOAc(200ml)萃取溶液三次，有机相弃除，水相用6NHCl调节pH至3，滤出生成的固体沉淀，用H2O洗涤三次，干燥得到白色固体(Z-Gly-Gly-OH)。
3.Boc-Gly-Gly-OBzl的合成
将Boc-Gly-OH(19.3g)，H-Gly-OBzl.TosOH(44.5g)和HOBt(17.84g)溶解在DMF(500ml)中，将该溶液冷却至0℃，加入EDC.HCl(25.3g)，用NMM调节pH值至8，撤去冷浴，室温反应(20℃)过夜。反应液用EtOAc稀释，用5％H3PO4洗涤，水层用EA萃取。合并有机相，依次用5％H3PO4，饱和食盐水洗涤一次，饱和NaHCO3洗涤三次，饱和食盐水洗涤一次，再用无水Na2SO4干燥，过滤、浓缩得白色固体(Boc-Gly-Gly-OBzl)。
4.H-Gly-Gly-OBzl.TFA的合成
将Boc-Gly-Gly-OBzl(29.02g)溶解在DCM(150ml)中，在0℃下，加入50mlTFA。所得溶液搅拌反应，去除溶剂得到油状物(H-Gly-Gly-OBzl.TFA)。
5.Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl的合成
将H-Gly-Gly-OBzl.TFA(36g)溶解在DMF(500ml)中，在0℃时，加入NMM调节pH值至7。在上述溶液中，加入Z-Gly-Gly-OH(22.64g)，HOBt(12.16g)，EDC.HCl(17.25g)。用NMM调节pH值至8，移除冷浴，在室温下反应。反应完毕，将反应生成的沉淀过滤出，依次用5％H3PO4，饱和NaHCO3溶液，水洗涤，干燥得固体(Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl)。
6.H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的合成
在40℃，将Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl(38.5g)溶解在DMF(1L)中，加入Pd/C(10％，10g)，加氢还原。反应毕，过滤去除固体，滤液弃去。将滤渣用200mL 1N NaHCO3溶液搅拌，过滤得滤液，直接用于下一步。
7.Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH的合成
将上一步所得溶液降温，加入Fmoc-OSu的THF溶液，体系浑浊。移除冷浴，在室温下反应。加入1NHCl调节pH值至2至3，过滤出生成沉淀，用水和EA洗涤，干燥得固体。
粗品溶解在70℃的DMF中，加入到4倍体积的水和4倍体积的饱和食盐水混合溶液中，沉淀析出。所得固体用水洗涤，干燥得到产品(Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，纯度为98.54％)。
二、液相法合成Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OBzl片段
反应式为：
1.Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl的合成
将Z-Asn(Trt)-OH(10.17g)，H-Gly-OBzl.TosOH(7.42g)，HOBt(2.97g)溶解在DMF中，降温至0℃，加入EDC.HCl(4.22g)。加入NMM调节pH值至8，室温下反应。反应液用EA稀释，用5％H3PO4洗涤，水相用EA萃取，合并有机相用5％H3PO4(80mL)洗涤三次，饱和食盐水洗涤一次。产品从有机相中析出，过滤，干燥得到部分白色产品。浓缩滤液得到粗品，用EA(50ml)重结晶，得到白色产品(Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl，纯度为99.78％)。
2.Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH的合成
将Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl(3.66g)溶解在DMF(35ml)中，加入Pd/C，加氢还原反应。反应液用水(40ml)稀释，搅拌10min，过滤。所得滤液，降温至0℃，加入Fmoc-OSu(1.88g)，用1N NaOH调节pH8，接着用10％Na2CO3调节pH至8-9，反应至反应体系浑浊，冰水浴冷却，调节pH值到2-3。所得固体置入2-8℃冰箱过夜，过滤，用水洗涤固体，干燥得到粗品(纯度75.90％)。
将粗品加热溶解在MeOH(500ml)中，降至室温后，置入冰箱。过滤所得固体，干燥得到产品(纯度98.7％)。
三、固相法合成
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu
装载：将氨基酸树脂装入一个合适大小的固相合成反应器中。每克树脂用10-15毫升DMF溶胀2-3小时。
Fmoc-亮氨酸键合步骤：2.0倍当量的Fmoc-亮氨酸，经2，6-二氯苯甲酰氯和吡啶活化与Wang树脂(替代率0.6-1.4mmol/g)在N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应。
Fmoc脱除步骤：用15％哌啶/5％DBU的DMF溶液30分钟脱除Fmoc基团。再用DMF洗涤树脂1遍；甲醇洗涤树脂3遍；DMF洗涤树脂3遍。
Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH缩合步骤：3.0倍树脂当量的Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH，3.0当量的HOBt用3mL/g树脂量的DMF溶解后加入到树脂中，再加入.3.0倍树脂当量的DIC，反应。用茚三酮显色法(Kaiser)监控。增长的肽链用DMF洗涤树脂；甲醇洗涤树脂。
Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH缩合步骤：3.0倍树脂当量的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH，3.0当量的HOBT用3mL/g树脂量的DMF溶解后加入到树脂中，再加入3.0倍树脂当量的DIC，反应。用茚三酮显色法(Kaiser)监控。增长的肽链用DMF、甲醇洗涤树脂。
Boc-D-Phe-OH最后一个氨基酸缩合缩合步骤：3.0倍树脂当量的Boc-D-Phe-OH(氨基酸#1)(3.0当量)，3.0倍树脂当量的HOBt用3mL/g树脂量的DMF溶解后加入到树脂中，再加入3.0倍树脂当量的DIC，反应。
Fmoc-Arg(Pbf)-OH缩合步骤：3.0当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚用3毫升每克树脂量的DMF溶解后，再加入3.0当量的DIC，搅拌45分钟，将上述活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp酯/DMF溶液加入到树脂中，搅拌反应3小时。如果缩合反应在21-24小时仍未完全，重复上述Fmoc-Arg(Pbf)-OPfp活化酯的缩合。
反应监控/重复缩合：缩合反应用茚三酮显色法(Kaiser)监控，如果是脯氨酸(Pro)之后的缩合反应则用Chloranil and Kaiser测试法监控。
合成完毕洗涤步骤：完成多肽序列的所有氨基酸缩合后，树脂用甲醇、DMF洗涤，干燥直至恒重，并根据树脂增重计算合成产率。
切割液配制：在一个夹套玻璃反应釜里将三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/水，按95∶2.5∶2.5(体积比)(±10％)的配比混合，配制切割液。
切割：将多肽树脂加入到冷却的切割液中，维持混合液温度在0-15℃。然后将反应混合液回温至18-28℃，并在此温度下搅拌反应120-180分钟。接着，用反应釜底过滤板，过滤分离混合液，用三氟乙酸洗涤过滤掉的树脂，每克多肽树脂0.5-1.0mL的三氟乙酸量。收集所有滤液，去除树脂。
沉淀：用冰水浴或者其它致冷剂将甲基叔丁基醚(MTBE)冷却至0-8℃，将浓缩后的多肽溶液加入其中，形成多肽沉淀。将沉淀混合物在0-10℃静置60-80分钟。用离心机分离沉淀。用甲基叔丁基醚洗涤沉淀，然后再次用离心机分离沉淀。
产品干燥：将多肽固体转移到一个合适的容器中，干燥得到比法卢定2。
经测定，杂质[Bivalirudin-Gly]含量为0.19％，杂质[Bivalirudin+Gly]含量为0.42％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (7)
1.一种比法卢定(Bivalirudin)的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)将Fmoc Asn(Trt)-Gly-OH和如式V所示的多肽树脂缩合，得到如式III所示的多肽树脂；
(2)将如式III所示的多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；
(3)将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和如式VI所示的多肽树脂缩合，得到如式IV所示的多肽树脂；
(4)通过固相合成的方法将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的顺序依次同如式IV所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成如式II所示的多肽树脂；和
(5)使式II所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所示的比法卢定；
所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20％哌啶和0.5-10％二环脒(DBU)；
所述缩合在选自下述的一种或多种缩合剂的存在下进行：N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、O-(7-氮杂苯并三唑-1基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)、O-(苯并三唑1基)-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)/N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷鏻六氟磷酸(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)；
步骤(4)中Arg同多肽树脂进行缩合时将Fmoc-Arg(Pbf)-OH和五氟苯酚以及缩合剂混合，使Fmoc-Arg(Pbf)-OH和树脂上的多肽进行缩合；
步骤(5)在各物质配比为95-60三氟乙酸(TFA)∶5-10三异丙基硅烷(TIS)∶5-30水的切割剂存在下进行；
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu 式I
Boc-D-Phe1-Pro2-Arg(Pbf)3-Pro4-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20 式II
-树脂
Fmoc-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20 式
-树脂 III
Fmoc-Gly5-Gly6-Gly7-Gly8-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20 式IV
-树脂
-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20 式V
-树脂
-Asn(Trt)9-Gly10-Asp(OtBu)11-Phe12-Glu(OtBu)13-Glu(OtBu)14-Ile15-Pro16-Glu(OtBu)17-Glu(OtBu)18-Tyr(tBu)19-Leu20 式VI
-树脂
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH通过下述步骤得到：
(i)将Z-Asn(Trt)-OH和H-Gly-OBzl.TosOH混合，进行液相多肽缩合，得到Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl；
(ii)将Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl进行氢化还原，得到H-Asn(Trt)-Gly-OH；和
(iii)将H-Asn(Trt)-Gly-OH和Fmoc保护基混合，得到Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH通过下述步骤得到：
(a)将H-Gly-Gly-OBzl和Z-Gly-Gly-OH混合，进行液相多肽缩合，得到Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl；
(b)将Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl进行氢化还原，得到H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；和
(c)将H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc保护基混合，得到Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的H-Gly-Gly-OBzl通过将Boc-Gly-OH和H-Gly-OBzl进行液相多肽缩合后脱保护基得到。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的Z-Gly-Gly-OH通过将Z-Gly-OH和H-Gly-OMe进行液相多肽缩合后还原得到。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质：0-20％1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-8％ 3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合用茚三酮显色法(Kaiser)监控。
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