CN105388239A - 一种多肽固相合成的监测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽固相合成领域，具体涉及一种多肽固相合成的监测方法。本发明所述多肽固相合成的监测方法，以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产物进行检测，确定多肽固相合成脱保护步骤完成情况；和/或以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检测，确定氨基酸缩合反应的完成情况。本发明所述多肽固相合成的监测方法可对多肽固相合成中脱保护和氨基酸缩合反应的完成情况进行监测，有效判断反应完成情况及实验终点。与传统的茚三酮显色法相比，本发明所述监测方法具有可量化、结果准确度高的特点，利于对多肽产品中缺失肽等工艺杂质进行监控，确保多肽类合成产品的质量。

Description

一种多肽固相合成的监测方法
技术领域
本发明涉及多肽固相合成领域，具体涉及一种多肽固相合成的监测方法，尤其是涉及一种Fmoc策略的多肽固相合成中反应完成情况的监测方法。
背景技术
多肽固相合成技术是由R.B.Merrifield于1963年发明的一项技术，它是将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质的固相合成法。在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础。为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖。自Merrifield创立并发展了固相合成多肽的方法，使多肽合成领域取得了重大突破，对化学、生化、医药、免疫及分子微生物学等领域也都起了巨大的推动作用。随着对连接分子、脱除方法和保护基的不断研究，以及新型树脂的开发，近年来固相方法在多肽合成上的应用更是发展迅速。利用这一方法几乎能够高收率地制备任何多肽。
1978年，changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用弱碱性试剂如哌啶等脱去。与Boc策略的固相合成法相比，Fmoc策略的固相合成法具有反应温和、副反应及副产物少、操作简便等特点。近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。
在现有的技术中，Fmoc策略固相合成法是通过以茚三酮显色法来监测的反应完成情况的：树脂上连接的氨基酸上的Fmoc保护基团以哌啶等试剂脱去后，氨基暴露出来，可与茚三酮发生显色反应；而脱保护后的氨基酸的氨基与被Fmoc保护的氨基酸缩合反应完全后，没有暴露的氨基，以茚三酮显色反应检测不显色。
茚三酮显色法虽然可以监测反应完成情况，但存在技术粗糙、结果不准确、存在观察差异、假阳性和假阴性率高等问题。
发明内容
为了解决现有监测方法中存在的问题，本发明提供了一种多肽固相合成的监测方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种多肽固相合成的监测方法，以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产物进行检测，确定多肽固相合成脱保护步骤完成情况；和/或以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检测，确定氨基酸缩合反应的完成情况。
多肽固相合成的反应包括脱保护步骤和氨基酸缩合步骤。
在一些实施方案中，在多肽固相合成的反应中对多肽固相合成的脱保护步骤进行监测，以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产物进行检测，确定多肽固相合成脱保护步骤完成情况。
在本发明所述监测方法中，以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产物进行检测，若脱保护反应的反应液中检测不到反应产物和/或反应产物的产生量与树脂的载量一致，则说明反应已经完全。
其中，优选的，所述多肽固相合成的反应中的所述脱保护反应为以脱保护试剂对连接在树脂上的Fmoc保护基团进行脱保护。
本发明所述监测方法中，以脱保护试剂进行脱保护，所述脱保护试剂为哌啶、哌嗪、二乙胺中至少一种。
本发明所述监测方法中，所述脱保护次数至少为一次。优选为两次或两次以上。
在一些实施方案中，多肽固相合成的反应中所述脱保护试剂为哌啶，本发明所述监测方法采用Fmoc-Piperidine作为对照品，高效液相色谱法检测脱保护反应的反应液中Fmoc-Piperidine的浓度，进而通过检测二次脱保护反应的反应液中是否存在Fmoc-Piperidine判断脱保护反应的完成情况。
优选的，所述高效液相色谱法检测脱保护反应的反应液中Fmoc-Piperidine的浓度的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.1％TFA-水溶液为流动相A相，0.1％TFA-乙腈溶液为流动相B相，流速为1.0mL/min，25℃，检测波长为220nm，梯度洗脱。
更优选的，所述高效液相色谱法检测的洗脱程序为B相初始浓度为50％，0min～20min，50％线性变化至100％；20min～20.1min，100％线性变化至50％。
在另一些实施方案中，多肽固相合成的反应中所述脱保护试剂为哌嗪、二乙胺中至少一种或哌啶与其他脱保护试剂的混合物，本发明所述监测方法通过检测二次脱保护反应的反应液中是否存在对应的反应产物判断脱保护反应的完成情况。
本发明所述监测方法不仅可以用于多肽固相合成的反应中脱保护步骤的监测，还可以用于氨基酸缩合步骤的监测。
在一些实施方案中，在多肽固相合成的反应中对多肽固相合成的氨基酸缩合步骤进行监测，以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检测，确定氨基酸缩合反应的完成情况。
在本发明所述监测方法中，以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检测，若氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的减少量与树脂的载量值一致且浓度不再降低时，则说明反应已经完全。
其中，优选的，所述氨基酸缩合反应中所述保护氨基酸为Fmoc保护的任意一种氨基酸或氨基酸类似物。
在一些实施方案中，本发明所述监测方法对多肽固相合成的氨基酸缩合步骤进行监测，所述高效液相色谱法具体为以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.1％TFA-水溶液为流动相A相，0.1％TFA-乙腈溶液为流动相B相，流速为1.0mL/min，30～35℃，检测波长为220nm，梯度洗脱。
更优选的，所述高效液相色谱法检测的洗脱程序为B相初始浓度为10％，0min～30min，10％线性变化至100％；30min～40minn，维持100％不变；40min～40.1min，100％线性变化至10％。
有上述技术方案可知，本发明提供了一种多肽固相合成的监测方法，以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产物进行检测，确定多肽固相合成脱保护步骤完成情况；和/或以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检测，确定氨基酸缩合反应的完成情况。本发明所述多肽固相合成的监测方法可对多肽固相合成中脱保护和氨基酸缩合反应的完成情况进行监测，有效判断反应完成情况及实验终点。与传统的茚三酮显色法相比，本发明所述监测方法具有可量化、结果准确度高的特点，利于对多肽产品中缺失肽等工艺杂质进行监控，确保多肽类合成产品的质量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1高效液相色谱法检测Fmoc-Piperidine的线性结果图，其中横坐标为样品浓度，纵坐标为峰面积。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的保护范围。本发明中用到的树脂、保护氨基酸均购自吉尔生化有限公司。说明书和权利要求书中所使用的英文及英文缩写的含义列于下表中。
实施例1：
取Fmoc-Piperidine对照品，以DMF配制成一系列浓度的溶液并以高效液相法进行检测。
高效液相色谱方法如下：
色谱柱:WatersXbridgeC18，3.5μm，4.6x250mm；
柱温:25℃；
流速:1mL/min；
检测波长:220nm；
流动相:0.1％TFAinH2O(A)，0.1％TFAinacetonitrile(B)，洗脱程序如表1。
表1洗脱程序
时间 A％ B％
0 50 50
20 0 100
20.1 50 50
高效液相色谱法检测Fmoc-Piperidine的线性结果如图1所示。
由图1可知，本发明所述高效液相色谱法用于检测Fmoc-Piperidine线性良好。
实施例2：
取载量为0.3mmol/gMBHAResin1g，以哌啶：DMF＝1:4(V/V)进行脱保护两次，分别收集两次的脱保护液，以实施例1所述高效液相色谱法检测其中Fmoc-Piperidine的含量。检测结果如表2。
表2高效液相色谱法检测其中Fmoc-Piperidine的含量
反应次数 Fmoc-Piperidine含量
1 0.2998mmol
2 0
从上述结果可知，第一次脱保护实验产生的Fmoc-Piperidine与树脂上的Fmoc基团数目一致，第二次脱保护实验中未检出Fmoc-Piperidine，即可证明反应在已经完全。
实施例3：
取实施例2中完成脱保护的树脂，加入0.7g的Fmoc-Lys(Boc)-OH、0.57g的HBTU、0.6mlN-甲基吗啉以及10mLDMF，混合均匀并于室温下振摇反应30分钟，收集得反应液1，并取少量树脂以茚三酮显色法检测反应情况；重复上述反应步骤，收集得反应液2，并取少量树脂再次以茚三酮显色法检测反应情况。另取0.7g的Fmoc-Lys(Boc)-OH、0.57g的HBTU、0.6mlN-甲基吗啉以及10mlDMF混合后作为对照溶液，以高效液相色谱法检测反应液1和反应液2中的Fmoc-Lys(Boc)-OH浓度。检测方法如下：
色谱柱:WatersXbridgeC18，3.5μm，4.6x250mm；
柱温:30℃；
流速:1mL/min；
检测波长:220nm；
流动相:0.1％TFAinH2O(A)，0.1％TFAinacetonitrile(B)，洗脱程序如表3。
表3洗脱程序
时间 A％ B％
0 90 10
30 0 100
40 0 100
40.1 90 10
实验结果如表4。
表4反应液中的Fmoc-Lys(Boc)-OH浓度
检测样品 Fmoc-Lys(Boc)-OH浓度 茚三酮显色情况
反应液1 0.043g/mL 树脂不显色
反应液2 0.064g/mL 树脂不显色
对照溶液 0.064g/mL N/A
由上述结果可知，第一次反应时反应液1中消耗的Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数与树脂上游离氨基的摩尔数一致，且第二次的反应液2中未观察到Fmoc-Lys(Boc)-OH消耗，同时茚三酮检测树脂不显色，即可说明反应已完全。
实施例4：
取载量为0.4mmol/gFmoc-Gln(Trt)-Wangresin2.5g，以哌嗪：DMF＝1:4(W/V)进行脱保护两次，分别收集两次的脱保护反应液，同时以哌嗪：DMF＝1:4(W/V)作为空白对照，以实施例1所述高效液相色谱法检测。检测结果如表5。
表5高效液相色谱法检测结果
反应次数 色谱峰
1 观察到空白对照中未出现的色谱峰
2 脱保护反应液与空白对照色谱峰情况一致
由上述结果可知，第一次脱保护后哌嗪与Fmoc形成复合物，在色谱图中产生色谱峰；第二次脱保护实验中未检出新的色谱峰，即可证明反应在第一次反应时已经完全。
实施例5：
取实施例4中完成脱保护的树脂，加入Fmoc-Arg(pbf)-OH3.24g，PyBOP2.60g，HOBt0.68g以及NMP20ml，混合均匀并于室温下振摇反应30分钟，收集获得反应液1，并取少量树脂以茚三酮显色法检测反应情况；重复上述反应步骤2次，收集分别获得反应液2和反应液3，并分别取少量树脂以茚三酮显色法检测反应情况。以实施例3所述高效液相色谱法检测反应液1～3中的Fmoc-Arg(pbf)-OH浓度，并以Fmoc-Arg(pbf)-OH3.24g，PyBOP2.60g，HOBt0.68g溶于20mlNMP的溶液作为对照溶液。实验结果如表6。
表6反应液中Fmoc-Arg(pbf)-OH浓度
检测样品 Fmoc-Arg(pbf)-OH浓度 茚三酮显色情况
反应液1 0.105g/mL 少量树脂显蓝色
反应液2 0.121g/mL 树脂不显色
反应液3 0.129g/mL 树脂不显色
对照溶液 0.130g/mL N/A
由上述结果可知，第一次反应1mmol的树脂中约97％的树脂完成了与Fmoc-Arg(pbf)-OH的连接反应，未完成的3％使得树脂在KaiserTest条件下显蓝色；第二次反应余下的3％的树脂与Fmoc-Arg(pbf)-OH完成连接反应，从而使树脂不显色，且第三次缩合反应Fmoc-Arg(pbf)-OH没有消耗。
实施例6:
取载量为0.2mmol/gFmoc-His(Trt)-HMPB-AM1g，以哌啶：DMF＝1:4(V/V)进行脱保护两次，分别收集两次的脱保护液，以实施例1所述高效液相色谱法检测其中Fmoc-Piperidine的含量。检测结果如表7。
表7高效液相色谱法检测结果
反应次数 Fmoc-Piperidine含量
1 0.1998mmol
2 0
从上述结果可知，第一次脱保护实验产生的Fmoc-Piperidine与树脂上的Fmoc基团数目一致，第二次脱保护实验中未检出Fmoc-Piperidine，即可证明反应在已经完全。
实施例7：
取实施例6中完成脱保护的树脂，加入1.32g的Fmoc-Arg(pbf)-OH、0.76g的HBTU、0.8mLN-甲基吗啉以及15mLDMF，混合均匀并于室温下振摇反应30分钟，收集获得反应液1，并取少量树脂以茚三酮显色法检测反应情况；重复上述反应步骤3次，收集获得反应液2、反应液3、反应液4，并分别取少量树脂以茚三酮显色法检测反应情况。另取1.32g的Fmoc-Arg(pbf)-OH、0.76g的HBTU、0.8mLN-甲基吗啉以及15mLDMF混合后作为对照溶液，以实施例3所述高效液相色谱法检测反应液1-4中的Fmoc-Arg(pbf)-OH浓度。实验结果如表8。
表8反应液中Fmoc-Arg(pbf)-OH浓度
反应次数 反应液中Fmoc-Arg(pbf)-OH浓度 茚三酮显色情况
1 0.705g/mL 部分树脂显蓝色
2 0.769g/mL 少量树脂显蓝色
3 0.771g/mL 树脂不显色
4 0.772g/mL 树脂不显色
对照溶液 0.772g/mL N/A
由上述结果可知，第一次反应0.2mmol的树脂中约95.4％的树脂完成了与Fmoc-Arg(pbf)-OH的连接反应，未完成的4.6％使得树脂在KaiserTest条件下显蓝色；第二次反应余下的4.6％的树脂中有3.5％与Fmoc-Arg(pbf)-OH完成连接反应，余下1.1％在KaiserTest条件下显蓝色；第三次反应余下的1％的树脂与Fmoc-Arg(pbf)-OH完成连接反应，使树脂在KaiserTest条件下不显色，且第四次缩合反应Fmoc-Arg(pbf)-OH没有消耗。即可说明反应完全。
实施例8:
取Fmoc-K-K-T-E-T-Q-WangResin1mmol，脱保护后，加入5mmolFmo-Leu-OH及活化剂进行缩合反应。反应30min后，收集反应液，以实施例3所述高效液相色谱法检测反应中消耗的保护氨基酸量，并以茚三酮显色法检测树脂显色情况。重复上述连接氨基酸步骤，并检测结果，见表9。
表9检测结果比较
反应次数 Fmoc-Leu-OH 茚三酮显色情况
1 1mmol 树脂略显淡蓝色
2 0 树脂略显淡蓝色
由上述结果可知，第一次反应时树脂与Fmoc-Leu-OH的反应已经完成，但树脂由于本底等原因，茚三酮显色出现假阳性的淡蓝色；二次反应中Fmoc-Leu-OH没有消耗，树脂颜色也没有变化。上述结果表明，本发明的方法可有效监测反应终点，避免茚三酮显色假阳性对结果产生的误判。
实施例9:
胸腺肽β4合成感应中，在完成一系列氨基酸的连接后，取Fmoc-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser-WangResin(连接了多个氨基酸的王树脂)1mmol，脱保护后加入10mmolFmoc-Lys(Boc)-OH和活化剂，反应1h后，收集反应液，以实施例3所述高效液相色谱法检测反应中消耗的保护氨基酸量，并以茚三酮显色法检测树脂显色情况。重复上述连接氨基酸步骤三次，并检测结果，见表10。
表10检测结果比较
反应次数 Fmoc-Lys(Boc)-OH 茚三酮显色情况
1 0.97mmol 树脂略显淡红色
2 0.01mmol 树脂略显淡红色
3 0.002mmol 树脂略显淡红色
4 0 树脂略显淡红色
由上述结果可知，在第三次反应时，由于空间位阻的关系，参与反应的Fmoc-Lys(Boc)-OH量非常小，第四次反应时Fmoc-Lys(Boc)-OH没有消耗。几次反应结果以茚三酮显色检测时树脂只是略显淡红色，难以判断是否达到反应终点。而采用本发明的方法可判断反应完成98.2％，树脂上仍有1.8％的游离氨基没有参与反应，需要以醋酐对未反应的氨基进行乙酰化屏蔽。

Claims (10)

1.一种多肽固相合成的监测方法，其特征在于，
以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产物进行检测，确定多肽固相合成脱保护步骤完成情况；
和/或以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检测，确定氨基酸缩合反应的完成情况。
2.根据权利要求1所述的监测方法，其特征在于，若脱保护反应的反应液中检测不到反应产物和/或反应产物的产生量与树脂的载量一致，则说明反应已经完全。
3.根据权利要求1或2所述的监测方法，其特征在于，所述脱保护反应为以脱保护试剂对连接在树脂上的Fmoc保护基团进行脱保护。
4.根据权利要求3所述的监测方法，其特征在于，所述脱保护试剂为哌啶、哌嗪、二乙胺中至少一种，所述脱保护次数至少为一次。
5.根据权利要求4所述的监测方法，其特征在于，脱保护试剂为哌啶，采用Fmoc-Piperidine作为对照品，高效液相色谱法检测脱保护反应的反应液中Fmoc-Piperidine的浓度，进而通过检测二次脱保护反应的反应液中是否存在Fmoc-Piperidine判断脱保护反应的完成情况。
6.根据权利要求5所述的监测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法检测脱保护反应的反应液中Fmoc-Piperidine的浓度的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.1％TFA-水溶液为流动相A相，0.1％TFA-乙腈溶液为流动相B相，流速为1.0mL/min，25℃，检测波长为220nm，梯度洗脱。
7.根据权利要求4所述的监测方法，其特征在于，脱保护试剂为哌嗪、二乙胺中至少一种或哌啶与其他脱保护试剂的混合物，通过检测二次脱保护反应的反应液中是否存在对应的反应产物判断脱保护反应的完成情况。
8.根据权利要求1所述的监测方法，其特征在于，若氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的减少量与树脂的载量值一致且浓度不再降低时，则说明反应已经完全。
9.根据权利要求8所述的监测方法，其特征在于，所述保护氨基酸为Fmoc保护的任意一种氨基酸或氨基酸类似物。
10.根据权利要求8或9所述的监测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法具体为以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0.1％TFA-水溶液为流动相A相，0.1％TFA-乙腈溶液为流动相B相，流速为1.0mL/min，30～35℃检测波长为220nm，梯度洗脱。
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