CN105273062A

CN105273062A - 片段缩合制备比伐卢定的方法

Info

Publication number: CN105273062A
Application number: CN201510776607.3A
Authority: CN
Inventors: 彭雅丽; 王锐; 常民; 薛宏祥
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2015-11-13
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2035-11-13
Also published as: CN105273062B

Abstract

本发明公开了一种片段缩合制备比伐卢定的方法，分别合成3个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段在液相体系中与第20位氨基酸逐步偶联得到全保护比伐卢定，然后裂解脱除保护基得到比伐卢定粗肽，纯化换盐得到比伐卢定；其中，所述的3个肽片段序列为：第一肽片段序列为比伐卢定序列中的第1-2位氨基酸，第二肽片段序列为比伐卢定序列中的第3-8位氨基酸，第三肽片段序列为比伐卢定序列中的第9-19位氨基酸。本发明方法，提高了产率，减少杂质，大幅降低了合成成本，利于大规模、产业化生产。

Description

片段缩合制备比伐卢定的方法

技术领域

本发明涉及制药领域，具体地说，涉及片段缩合制备比伐卢定的方法。

背景技术

比伐卢定，英文名bivalirudin，是凝血酶特异性抑制剂，来源于水蛭素衍生物，是一种合成的含20个氨基酸的多肽，序列为：D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH，分子式：C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃，分子量：2178.99。它能够同时降低肝素临时抗凝时带来的出血和缺血并发症几率。

目前比伐卢定的合成方法如专利CN101094867、专利CN101033249、专利CN101555274、专利CN101538317、专利CN103965293和专利CN103319570是利用Fmoc策略固相法依次连接合成比伐卢定。该方法氨基酸逐个偶联合成周期长，逐步偶联时树脂反应不完全，易产生缺陷肽，固相载体选用的取代值限制，总收率较低，同时杂质较多，纯化困难。

专利CN102225966、专利CN101906150、专利CN102260323、专利CN102286076、专利CN102532274、专利CN102731624、专利CN102702325、专利CN102924575、专利CN103242431和专利CN104031127采用固相片段缩合的方法合成，固相片段缩合投入的每个片段都是1.5-5倍过量，严重浪费肽片段，造成合成成本很高；同时固相片段缩合的树脂取代值限制，物料通量降低，浪费溶剂，产生大量废液。

专利CN101475631、专利CN102164609、专利CN102264757、专利CN102816208、专利CN103864894和专利CN103864895采用纯液相法合成，但是液相合成产生较多废液，反应时间长，每偶联一个氨基酸都需要进行纯化，后处理繁琐，收率低，不利于产业化生产。

所以本领域技术人员仍然期待以高产品收率、低合成成本获得具有良好品质产品的方法，尤其是降低成本、减少废液产生的新方法，对于大规模、产业化生产是非常必要和重要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有方法合成收率低、生产成本高、产生废液多、产品纯化难、不能低成本高效率得到高纯度的比伐卢定的缺点，提供一种片段缩合制备比伐卢定的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种片段缩合制备比伐卢定的方法，分别合成侧链保护的第一肽片段序列、侧链保护的第二肽片段序列和侧链保护的第三肽片段序列，在液相体系中将侧链保护的第三肽片段序列与侧链保护的比伐卢定序列中的第20位氨基酸偶联得到侧链保护的第四肽片段序列，再在液相体系中将侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第五肽片段序列，最后在液相体系中将侧链保护的第五肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的比伐卢定，经裂解脱除保护基得到比伐卢定粗肽，纯化换盐得到比伐卢定；

其中，所述的5个肽片段序列为：

第一肽片段序列为比伐卢定序列中的第1-2位氨基酸，

第二肽片段序列为比伐卢定序列中的第3-8位氨基酸，

第三肽片段序列为比伐卢定序列中的第9-19位氨基酸，

第四肽片段序列为比伐卢定序列中的第9-20位氨基酸，

第五肽片段序列为比伐卢定序列中的第3-20位氨基酸。

上述片段缩合制备比伐卢定的方法，优选包括以下步骤：

(1)合成侧链保护的第一肽片段序列；

所述的侧链保护的第一肽片段序列为：Boc-D-Phe-Pro-OH；

(2)分别固相合成侧链保护的第二肽片段序列和侧链保护的第三肽片段序列，并从树脂上裂解；

所述的侧链保护的第二肽片段序列为：Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH；

所述的侧链保护的第三肽片段序列为：Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-OH；

(3)将侧链保护的第三肽片段序列与H-Leu-OtBu偶联得到侧链保护的第四肽片段序列，并脱去其氨基保护基；

所述的侧链保护的第四肽片段序列为：Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；

(4)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第五肽片段序列，并脱去其氨基保护基；

所述的侧链保护的第五肽片段序列为：Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；

(5)将脱去氨基保护基的侧链保护的第五肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的比伐卢定；

所述的权保护的比伐卢定序列为：Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；

(6)将全保护的比伐卢定裂解脱除保护基得到比伐卢定粗肽；

(7)比伐卢定粗肽经纯化换盐得到比伐卢定。

步骤(1)中，侧链保护的第一肽片段序列由氨基酸依次在液相体系中偶联获得；由Boc-D-Phe-OSu与H-Pro-OH反应得到Boc-D-Phe-Pro-OH。

步骤(2)中，侧链保护的第二肽片段序列、侧链保护的第三肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。

侧链保护的第二肽片段序列、侧链保护的第三肽片段序列固相合成中，

所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20％哌啶的DMF溶液。

所使用的偶联剂为DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1:1。

所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物，优选体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液。

步骤(2)中，具体的固相合成方法，为本领域技术人员的常规技术手段。

步骤(3)、(4)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液，优选体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液。

步骤(3)、(4)、(5)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1:1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1:1:2的组合。待偶联的羧基端与氨基端的摩尔比是0.95～1.05:1。待偶联的羧基端与HOBt的摩尔比是1:1。偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。

步骤(6)中，全保护比伐卢定裂解的裂解液为TFA与H₂O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H₂O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液，优选TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。

步骤(7)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐；即色谱柱为C18柱；流动相为体积百分比0.25％醋酸的水溶液和乙腈。

本发明使用酸敏感树脂进行各个肽片段的固相合成，树脂取代值高，氨基酸1.5-2倍投量，物料成本低。合成的肽片段纯度高，不必进行HPLC纯化，即可进行液相反应，减少了后处理的步骤，减少了废液产生。多个片段可以同时合成，节约合成时间，缩短合成周期。片段缩合采用液相体系，羧基端片段的投量仅为氨基端片段0.95-1.05倍，不会造成片段的浪费，大大降低了成本，而未反应的片段均可通过合适的反应体系通过萃取清除，后处理简单、快捷。并且液相片段缩合没有了固相片段缩合存在的树脂取代值限制的问题，物料通量增加，减少了废液产生。在最终的液相色谱纯化步骤中，杂质不是缺少一个或几个氨基酸的缺陷肽，而是未缩合的片段，不会造成纯化困难的问题。所以本发明的特点是高通量、低成本、废液少、效率高、纯化易，非常适合大规模、产业化生产。

本发明所涉及的目标肽(比伐卢定)及中间体的各个肽片段的氨基酸序列见表l。本发明中所使用的物料缩写的含义见表2。

表1比伐卢定相应的编码氨基酸序列

肽序号

氨基酸序列

相应目标肽的

		编码氨基酸
			目标肽	H-(D-F)PRPGGGGNGDFEEIPEEYL-OH	1-20
第一肽片段序列	H-(D-F)P-OH	1-2
			第二肽片段序列	H-RPGGGG-OH	3-8
第三肽片段序列	H-NGDFEEIPEEY-OH	9-19
			第四肽片段序列	H-NGDFEEIPEEYL-OH	9-20
第五肽片段序列	H-RPGGGGNGDFEEIPEEYL-OH	3-20

表2本发明所使用的物料缩写含义

英文缩写	全称
		Fmoc-	9-芴甲氧羰基
2-CTC Resin	2-氯-三苯甲基氯树脂
		RP-HPLC	反相高效液相色谱
DMF	N,N-二甲基甲酰胺
		NMP	N-甲基吡咯烷酮
DMSO	二甲基亚砜
		DCM	二氯甲烷
THF	四氢呋喃
		DBU	1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯
DIEA	N,N-二异丙基乙胺
		HOBt	1-羟基苯并三氮唑
HOAt	1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
		PyBOP	六氟磷酸苯并三氮唑-1-基-氧基三吡咯烷基
HATU	2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
		HBTU	苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐
DIC	N,N-二异丙基碳二亚胺
		EDC	1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
DCC	N,N-二环己基碳二亚胺

TFA	三氟乙酸
		TFE	三氟乙醇
EDT	1,2-乙二硫醇
		TIS	三异丙基硅烷
DCU	N,N'-二环己基脲
		HOSu	N-羟基琥珀酰亚胺
Boc-	叔丁氧羰基
		-Pbf	2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基
-tBu	叔丁基
		-Trt	三苯甲基
MTBE	甲基叔丁基醚

有益效果：本发明相对现有技术具有以下优点：

1、本发明利用较高荷载量的酸敏感树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成技术合成选定结构的高纯度肽片段，再采用液相偶联技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(≥99.5％)、高收率(≥58％)的目标肽。

2、相比较连续固相合成比伐卢定的工艺，本发明每个片段可使用高荷载量的固相载体，没有逐个缩合氨基酸数目过多造成的树脂取代值限制，物料通量增加，废液排放减少；片段缩合，各个肽片段合成可以同时进行，大大缩短了合成时间。

3、相比较固相片段缩合合成比伐卢定的工艺，本发明利用液相片段缩合，片段摩尔比为0.95-1.05倍量，远低于固相片段缩合合成片段的1.5-5倍过量，节约物料成本；而未反应的片段均可通过合适的反应体系通过萃取清除，后处理简单、快捷。

4、采用超酸敏感型树脂合成的10个左右氨基酸的侧链保护肽片段序列纯度非常高，不必用色谱技术纯化，只需要进行沉淀、研磨即可使用；片段液相偶合，其杂质主要为未偶合的片段，而不是缺少一个或数个氨基酸的缺陷肽，并且未偶合的片段可以通过合适的溶剂体系萃取去除，在最终高效液相色谱纯化中容易得多，从而减少制备次数，降低了比伐卢定的制备成本。

5、第19位Tyr在常规固相缩合的过程中极易产生很难除去的杂质[D-Tyr¹⁹]Bivalirudin，所以我们选择比伐卢定序列中的第9-19位氨基酸作为第三肽片段序列和第20位的Leu在液相中缩合；同时第2位Pro在常规固相缩合的过程中容易产生缺陷肽杂质[des-Pro²]Bivalirudin，所以我们选择比伐卢定序列中的第1、2位氨基酸作为第一肽片段序列和3-20肽片段在液相中缩合。这样的合成路线避免了以上杂质的出现，使得最终的纯化更加容易，降低了纯化成本。

本发明具有高通量、低成本、废液少、效率高、纯化易的特点，有利于实现规模化、产业化生产。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

1.树脂制备

1.1制备Fmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入多肽合成器，用60mLDCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Gly-OH(1.5eq)和DIEA(2.5eq)的30mLDCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×50mLDMF、3×50mLDCM、3×50mLMeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得5.85gFmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.65mmol/g。

1.2制备Fmoc-Tyr(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(5g，取代值0.84mmol/g树脂，1eq)加入多肽合成器，用60mLDCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(1.3eq)和DIEA(2.5eq)的30mLDCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇10mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×50mLDMF、3×50mLDCM、3×50mLMeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得6.06gFmoc-Tyr(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.5mmol/g。

2.片段制备

2.1肽片段Boc-AA(1-2)-OH的制备：

圆底烧瓶中加入Boc-D-Phe-OH(0.8mmol)、HOSu(0.88mmol)溶于无水THF中，冰浴搅拌10分钟后加入0.96mmol的DCC，冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应3-5小时，布氏漏斗过滤，除去反应生成的DCU得到Boc-D-Phe-OSu的THF溶液。1mmol的H-Pro-OH溶于4nmol/LNaOH/H₂O/THF，pH值调节到9，冰浴搅拌10分钟后，加入Boc-D-Phe-OSu的THF溶液，冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应过夜。抽干THF，溶于乙酸乙酯，依次用5％的柠檬酸，饱和氯化钠洗涤，并用无水硫酸钠干燥。过滤，减压蒸发掉溶剂，结晶，得290mgBoc-AA(1-2)-OH。

2.2肽片段Fmoc-AA(3-8)-OH的制备：

向肽反应室中加入5gFmoc-Gly-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mLDCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Gly-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mLDMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mLDCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mLDMF洗涤树脂。

依次用Fmoc-保护的氨基酸Gly、Gly、Pro和Arg(Pbf)各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用3×50mLDMF、3×50mLDCM、3×50mLMeOH洗涤，真空干燥至恒重。

用150mLl％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约20mL体积，然后用10mLDMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得3.04g纯度98％Fmoc-AA(3-8)-OH。

2.3肽片段Fmoc-AA(9-19)-OH的制备：

向肽反应室中加入5gFmoc-Tyr(tBu)-2-氯-三苯甲基树脂。加入60mLDCM搅拌溶胀树脂，抽干。用2×50mL20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用50mLDMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Glu(OtBu)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于25mLDMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用5mLDCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×50mLDMF洗涤树脂。

依次用Fmoc-保护的氨基酸Glu(OtBu)、Pro、Ile、Glu(OtBu)、Glu(OtBu)、Phe、Asp(OtBu)、Gly和Asn(Trt)各2eq，对所述肽片段后续单体重复该操作过程。在最后一个偶合反应后，用3×50mLDMF、3×50mLDCM、3×50mLMeOH洗涤，真空干燥至恒重。

用200mLl％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶(与TFA体积比1:1)上。合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约20mL体积，然后用10mLDMF重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约10mL。加入100mL水沉淀产物。室温下搅拌该淤浆30分钟。真空过滤收集所述固体，用约100mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得4.92g纯度97％Fmoc-AA(9-19)-OH。

3.液相片段缩合过程

3.1制备H-AA(9-20)-OtBu

圆底烧瓶中加入1.28gFmoc-AA(9-19)-OH(0.6mmol)、671mgH-Leu-OtBu·HCl(3mmol)和81mgHOBt(0.6mmol)。将所述固体溶解于30mLDMF，加入695μLDIEA(4.2mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入228mgHBTU(0.6mmol)。在0℃搅拌反应混合物1小时，然后升至室温，再搅拌2小时。加入250mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×250mL水洗涤，在室温下用250mLMTBE研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得Fmoc-AA(9-20)-OtBu。然后加入30mLDMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应2小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，加入200mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到1.23gH-AA(9-20)-OtBu，收率98％。

3.2制备H-AA(3-20)-OtBu

圆底烧瓶中加入584mgFmoc-AA(3-8)-OH(0.6mmol)、1.21gH-AA(9-20)-OtBu(0.58mmol)和81mgHOBt(0.6mmol)。将所述固体溶解于30mLDMF，加入199μLDIEA(1.2mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入228mgHBTU(0.6mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌4小时。加入200mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×200mL水洗涤，在室温下用200mL95％乙醇研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得Fmoc-AA(3-20)-OtBu。再加入30mLDMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应2小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，加入200mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到1.57gH-AA(3-20)-OtBu，收率96％。

3.3制备全保护比伐卢定

圆底烧瓶中加入206mgBoc-AA(1-2)-OH(0.57mmol)、1.55gH-AA(3-20)-OtBu(0.55mmol)和77mgHOBt(0.57mmol)。将所述固体溶解于30mLDMF，加入189μLDIEA(1.14mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入216mgHBTU(0.57mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌4小时。加入200mL水从所述溶液中沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×200mL水洗涤，2×200mLMTBE洗涤，在室温下用200mL乙腈研磨3小时，真空过滤收集，干燥获得1.69gBoc-AA(1-20)-OtBu，收率97％。

4.比伐卢定的裂解及纯化

4.1通过去除侧链保护制备比伐卢定粗肽

圆底烧瓶中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/1,2-乙二硫醇(92.5:2.5:2.5:2.5)溶液60mL，并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入1.58g全保护比伐卢定。在0℃搅拌所述淤浆直到所述固体溶解(约5分钟)，然后升至室温，搅拌3小时。旋转浓缩，将该溶液加入0℃乙醚200mL沉淀所述肽。离心，沉淀2×200mL乙醚洗涤，然后将固体溶解于含有1％乙酸的1:1水/乙腈50mL中，冷冻干燥获得1.07g比伐卢定粗肽，产率98％。

4.2HPLC纯化比伐卢定粗肽

50mg比伐卢定粗肽经制备型HPLC纯化产生比伐卢定纯品32.5mg，纯度99.5％，产率65％。

HPLC纯化条件：色谱柱：WatersC18250×19,5u,130A；流速：8mL/min；检测：UV，220nm；流动相：A.乙腈；B.0.25％醋酸/水；方法：20％-30％A，10min；30-60％A，40min。

Claims

1.一种片段缩合制备比伐卢定的方法，其特征在于，分别合成侧链保护的第一肽片段序列、侧链保护的第二肽片段序列和侧链保护的第三肽片段序列，在液相体系中将侧链保护的第三肽片段序列与侧链保护的比伐卢定序列中的第20位氨基酸偶联得到侧链保护的第四肽片段序列，再在液相体系中将侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第五肽片段序列，最后在液相体系中将侧链保护的第五肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的比伐卢定，经裂解脱除保护基得到比伐卢定粗肽，纯化换盐得到比伐卢定；

其中，所述的5个肽片段序列为：

第一肽片段序列为比伐卢定序列中的第1-2位氨基酸，

第二肽片段序列为比伐卢定序列中的第3-8位氨基酸，

第三肽片段序列为比伐卢定序列中的第9-19位氨基酸，

第四肽片段序列为比伐卢定序列中的第9-20位氨基酸，

第五肽片段序列为比伐卢定序列中的第3-20位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的片段缩合制备比伐卢定的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(1)合成侧链保护的第一肽片段序列；

所述的侧链保护的第一肽片段序列为：Boc-D-Phe-Pro-OH；

所述的全保护的比伐卢定序列为：Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu；

(6)将全保护的比伐卢定裂解脱除保护基得到比伐卢定粗肽；

(7)比伐卢定粗肽经纯化换盐得到比伐卢定。

3.根据权利要求2所述的片段缩合制备比伐卢定的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第一肽片段序列由氨基酸依次在液相体系中偶联获得。

4.根据权利要求2所述的片段缩合制备比伐卢定的方法，其特征在于，步骤(2)中，侧链保护的第二肽片段序列、侧链保护的第三肽片段序列分别由氨基酸依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂；

侧链保护的第二肽片段序列、侧链保护的第三肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂为DIC与HOBt的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1:2:7的混合物。

5.根据权利要求2所述的片段缩合制备比伐卢定的方法，其特征在于，步骤(3)、(4)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液。

6.根据权利要求2所述的片段缩合制备比伐卢定的方法，其特征在于，步骤(3)、(4)、(5)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一种或几种的组合。

7.根据权利要求2所述的片段缩合制备比伐卢定的方法，其特征在于，步骤(6)中，全保护比伐卢定裂解的裂解液为TFA与H₂O按体积比95:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H₂O按体积比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5:2.5:2.5:2.5的混合溶液。

8.根据权利要求2所述的片段缩合制备比伐卢定的方法，其特征在于，步骤(7)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐；流动相为醋酸水溶液和乙腈溶液。