CN109575109A

CN109575109A - 片段缩合制备地加瑞克的方法

Info

Publication number: CN109575109A
Application number: CN201811617676.XA
Authority: CN
Inventors: 彭雅丽; 王锐; 贺真; 方泉; 许兆青
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109575109B

Abstract

本发明公开了一种片段缩合制备地加瑞克的方法，分别合成3个侧链保护的肽片段序列，将各肽片段逐步偶联得到全保护地加瑞克，然后裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽，纯化换盐得到地加瑞克；其中，所述的3个肽片段序列为：第一肽片段序列为地加瑞克序列中的第1‑4位氨基酸，第二肽片段序列为地加瑞克序列中的第5‑8位氨基酸，第三肽片段序列为地加瑞克序列中的第9‑10位氨基酸。本发明方法，减少了杂质，提高了产率，大幅降低了合成成本，有利于大规模、产业化生产。

Description

片段缩合制备地加瑞克的方法

技术领域

本发明涉及制药领域，具体涉及片段缩合制备地加瑞克的方法。

背景技术

地加瑞克，英文名：Degarelix，是一个十肽，其中含有七个非天然氨基酸，序列为：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-AIa-NH₂。地加瑞克是第三代促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂，用于治疗前列腺癌，可迅速起效，抑制促性腺素、睾酮和前列腺特异性抗原。

地加瑞克的合成方法如专利US5925730，优选的α-氨基保护基是叔丁氧羰基(Boc)，Boc基团在酸性条件下通过三氟乙酸(TFA)的标准处理脱除。缺点在于，TFA毒性高，对环境有污染，后处理成本高；而且高比例的TFA会造成肽从树脂上脱落，反复使用TFA使该效果叠加，损失增加，收率降低。同时肽树脂需要HF裂解，HF剧毒，有强腐蚀性，对人和环境有较大的危害，对于大规模工业生产来说，有较大的安全隐患。所以产业化生产更多使用的是芴甲氧羰基(Fmoc)来进行α-氨基保护。

地加瑞克中5位氨基酸Aph(Hor)。在碱性条件下，包含二氢尿嘧啶部分的化合物会发生重排而成为包含乙内酰脲部分的化合物。所以在地加瑞克的合成过程中，中间体Fmoc-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH-树脂在碱性条件下脱保护的过程中发生部分重排而成为Fmoc-X-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH-树脂，X为4-([2-(5-乙内酰脲基)]-乙酰基氨基)-苯丙氨酸。因此，在采用保护基Fmoc的药物级地加瑞克的制造工艺中，应当尽量避免碱性条件。专利CN102428097采用Fmoc策略固相法依次连接合成地加瑞克，该方法使用哌啶脱除Fmoc，但是反复脱保护过程接触碱性条件，只能降低该杂质的出现(0.1-0.3％)，并不能解决该问题。

专利CN102329373采用Fmoc策略固相法依次连接合成地加瑞克，5位氨基酸采用Trt或者Alloc保护，直链肽合成完成后，脱除侧链保护，偶联Hor。然而脱除氨基酸残基4Aph(Trt)的保护基Trt时采用5-10％TFA/DCM，会导致第3个氨基酸残基Lys(ipr，Boc)的保护基Boc的部分脱落，从而裸露的氨基会与L-4，5-二氢乳清酸反应生成新的杂质；另外，脱除氨基酸残基4Aph(Alloc)的保护基Alloc时采用Pd(Ph₃P)₄/苯硅烷/DCM，Pd(Ph₃P)₄的价格比较昂贵，会增加规模化生产的成本。同时液相合成Trt或Alloc保护的氨基酸，包括Cbm保护的6位氨基酸时收率很低，较多的杂质在液相合成中极大的增大了纯化的难度和成本。固相载体的取代值限制造成总收率较低；氨基酸投量高，合成成本高；杂质较多，纯化成本高。

专利CN102952174、专利CN103992378、专利CN103992392、专利CN104177478、专利CN105085634、专利CN105524143和专利CN107344960是采用Fmoc策略固相法依次连接合成地加瑞克，固相载体的取代值限制造成总收率较低；氨基酸投量高，合成成本高；杂质较多，纯化成本高。

专利CN103351428和专利CN107022002采用固相片段缩合的方法合成，固相片段缩合投入的每个片段都是2倍过量，严重浪费肽片段，造成合成成本很高；同时固相片段缩合的树脂取代值限制，物料通量降低，浪费溶剂，产生大量废液。

专利CN103180335采用3+4+3、专利CN106589071采用6+4的液相片段缩合的方法合成，其中每个片段也是液相合成，可以看到其中每一步偶合反应都涉及了繁琐的N末端以及C末端的保护和脱保护过程，以及适宜的pH条件的配合，这产生了很大的工作量和废液的排放，耗费时间很长，而且液相合成肽片段的效率远低于固相合成肽片段，分离也有很大难度。

可以看到，对地加瑞克的合成方法研究大部分集中在减少杂质和提高纯度上，但实际上现有工艺通过一次或多次制备，都可以得到药物级要求的纯肽。而单纯的为了提高纯度使用更加昂贵的氨基酸保护基或者缩合剂对于规模化和产业化生产的实际需求是没有意义的。如前所述，在地加瑞克的序列中包含了七个非天然氨基酸，其单价是天然氨基酸的数倍甚至几十倍，所以地加瑞克的合成成本是非常高昂的，所以我们认为，在保证产品收率和产品纯度的基础上降低合成成本，甚至牺牲部分收率而大幅降低合成成本、并减少废液产生的新合成方法，对于大规模、产业化生产是非常必要和重要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有方法合成收率低、产品杂质多，特别是生产成本高，不能低成本高效率得到高纯度的地加瑞克的缺点，提供一种片段缩合制备地加瑞克的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

片段缩合制备地加瑞克的方法，固相合成侧链保护的第一肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列，液相合成合成侧链保护的第三肽片段序列，将各肽片段逐步偶联得到全保护的地加瑞克，然后裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽，纯化换盐得到地加瑞克；

其中，

所述的第一肽片段序列为地加瑞克序列中的第1-4位氨基酸，

所述的第二肽片段序列为地加瑞克序列中的第5-8位氨基酸，

所述的第三肽片段序列为地加瑞克序列中的第9-10位氨基酸。

上述片段缩合制备地加瑞克的方法，优选包括以下步骤：

(1)固相分别合成侧链保护的第一肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列，并从树脂上裂解；

(2)液相合成侧链保护的第三肽片段序列；

(3)将脱去氨基保护基的第三肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列偶联得到侧链保护的第四肽片段序列，并脱去其氨基保护基；

(4)将脱去氨基保护基的侧链保护的第四肽片段序列和侧链保护的第一肽片段序列偶联得到全保护的地加瑞克；

(5)将全保护的地加瑞克裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽；

(6)地加瑞克粗肽经纯化换盐得到地加瑞克。

步骤(1)中，侧链保护的第一肽片段序列由Fmoc-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-OH、Fmoc-D-Phe(4-C1)-OH和Ac-D-Nal-OH依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。

侧链保护的第一肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20％哌啶的DMF溶液。

所使用的偶联剂为DIC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合；优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合；待偶联的氨基酸与HOBt的摩尔比是1∶1。

所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、或者体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物，优选体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液。

步骤(1)中，侧链保护的第二肽片段序列由Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-D-Phe(4-NO₂)-OH依次偶联在固相载体上，然后肽树脂还原、接侧链保护得到肽树脂Fmoc-D-4Aph(Cbm-tBu)-Leu-ILys(Boc)-Resin；接下来肽树脂脱除Fmoc保护、氨基端偶联Fmoc-Phe(4-NO₂)-OH，然后肽树脂还原、接侧链保护得到Fmoc-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm-tBu)-Leu-ILys(Boc)-Resin；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂，优选为2-氯-三苯甲基氯树脂。

侧链保护的第二肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；优选体积百分含量为20％哌啶的DMF溶液。

步骤(2)中，侧链保护的第三肽片段序列Fmoc-Pro-D-Ala-NH₂由Fmoc-Pro-OH和D-Ala-NH₂在液相中偶联得到；所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合。待偶联的羧基端与氨基端的摩尔比是0.95～1.05∶1。待偶联的羧基端与HOBt的摩尔比是1∶1。偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。

步骤(3)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液。优选体积百分含量为16％哌啶的DMF溶液。

步骤(3)、(4)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合、或者DIC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者EDC与HOBt按摩尔比1∶1的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合。优选HBTU与HOBt与DIEA按摩尔比1∶1∶2的组合。待偶联的羧基端与氨基端的摩尔比是0.95～1.05∶1。待偶联的羧基端与HOBt的摩尔比是1∶1。偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一种或几种的组合，优选DMF。

步骤(5)中，全保护地加瑞克裂解的裂解液为TFA与H₂O按体积比95∶5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H₂O按体积比80∶5∶5∶5∶5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5∶2.5∶2.5∶2.5的混合溶液，优选TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5∶2.5∶2.5∶2.5的混合溶液。

步骤(6)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐，即色谱柱为C18柱；流动相为体积百分比0.25％醋酸的水溶液和乙腈。

有益效果：

本发明相对现有技术具有以下优点：

1、本发明使用高荷载量的酸敏感树脂为起始原料，先采用标准的固相肽合成技术合成高纯度肽片段，再采用液相偶联技术使肽片段缩合，从而获得高纯度(＞99.89％)、高收率(≥70.3％)的目标肽。

2、相比较逐个缩合固相合成地加瑞克的工艺，本发明每个片段可使用高荷载量的固相载体，树脂取代值高，没有逐个缩合氨基酸数目过多造成的树脂取代值限制，物料通量增加，废液排放减少。分片段后，各个肽片段合成可以同时进行，大大缩短了合成时间。片段偶合，其杂质主要为未偶合的片段，而不是缺少一个或数个氨基酸的缺陷肽，在最终高效液相色谱纯化中容易得多，从而减少制备次数，降低制备成本。

3、相比较固相片段缩合合成地加瑞克的工艺，本发明利用液相片段缩合，片段摩尔比为0.95-1.05倍量，远低于固相片段缩合合成片段的2倍过量，节约物料成本；而未反应的片段均可通过合适的反应体系萃取清除，后处理简单、快捷。并且液相片段缩合没有了固相片段缩合存在的树脂取代值限制的问题，物料通量增加，减少了废液产生。

4、在实验中我们发现，地加瑞克4位氨基酸Ser或者5位Aph(Hor)作为片段缩合的羧基端会产生消旋副产物，这是氨基酸本身的性质造成的，所以我们尝试采用Fmoc-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-OH来消除消旋副产物。实验结果显示，本发明合理的分段方案和保护策略，很好的解决了这个问题，收率没有降低的情况下，避免了消旋的出现，降低了副产物，提高了粗肽的纯度。

5、地加瑞克中5位氨基酸Aph(Hor)，在碱性条件下，包含二氢尿嘧啶部分的化合物会发生重排而成为包含乙内酰脲部分的化合物，这是地加瑞克的主要杂质。本发明通过合理的片段分段，使得该杂质出现的可能降到了最低，提高了肽纯度；而采用了片段缩合后，还进一步提高了物料通量，减少了废液产生，降低了合成成本，这是意料之外的结果。

6、本发明成本只需现有工艺的1/3～1/2，极大的降低了成本。现有工艺采用氨基树脂，本发明采用超酸敏感型树脂，其价格是氨基树脂的1/4。在第一肽片段的合成中，连接固相载体的是Fmoc-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-OH，其中Fmoc-D-3Pal-OH价格昂贵，作为树脂偶联的第一个氨基酸只需要投1倍当量，而不是通常需要的2倍甚至3倍当量，成本减少了1/2～2/3。在第二肽片段的合成中，连接固相载体的Fmoc-ILys(Boc)-OH价格昂贵，作为树脂偶联的第一个氨基酸只需要投1倍当量，而不是通常需要的2倍甚至3倍当量，成本减少了1/2～2/3。地加瑞克序列中，5位Fmoc-4Aph(Hor)-OH和6位Fmoc-D-4Aph(Cbm-tBu)-OH非常价格昂贵，可以占到氨基酸成本的一半，本发明采用Fmoc-Phe(4-NO₂)-OH和Fmoc-D-Phe(4-NO₂)-OH作为起始原料，完成固载化的还原和侧链修饰，而Fmoc-Phe(4-NO₂)-OH和Fmoc-D-Phe(4-NO₂)-OH的价格仅为Fmoc-4Aph(Hor)-OH和Fmoc-D-4Aph(Cbm-tBu)-OH价格的1/10，这极大的降低了成本；相比较液相合成氨基酸，提高了产率和纯度，节约了时间，也减少了后处理的废液；而得到的肽片段纯度很高，这是意料之外的结果。

本发明具有高通量、废液少、杂质少、纯化易、收率高的特点，避免了直接购买或者液相合成昂贵的非天然氨基酸，有效地降低了生产成本。本发明的初衷是降低合成成本，甚至预期可以牺牲部分合成收率，但令人惊喜的是，本发明在有效降低成本的基础上，出乎意料地得到了高收率、高纯度的地加瑞克生产工艺，非常适合规模化、产业化生产。

本发明所涉及的目标肽(地加瑞克)及中间体的各个肽片段的氨基酸序列见表1。

本发明中所使用的物料缩写的含义见表2。

表1地加瑞克相应的编码氨基酸序列

表2本发明所使用的物料缩写含义

附图说明

图1为本发明制备的地加瑞克质谱图。

图2为本发明制备的地加瑞克色谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

1.树脂制备

1.1制备Fmoc-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(10g，取代值1.03mmol/g树脂，leq)加入多肽合成器，用100mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-OH(1.1eq)和DIEA(2.5eq)的50mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇20mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×80mL DMF、3×80mL DCM、3×80mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得14.7g Fmoc-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-2-氯-三苯甲基树脂。使用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.98mmol/g。

1.2制备Fmoc-ILys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂：将2-氯-三苯甲基氯树脂(10g，取代值1.03mmol/g树脂，leq)加入多肽合成器，用100mL DCM洗涤树脂。抽干溶剂，加入Fmoc-ILys(Boc)-OH(1.1eq)和DIEA(2.5eq)的50mL DCM溶液。氩气保护机械搅拌该混合物1小时。加入色谱甲醇20mL(2ml/g树脂)对树脂上的活性部分进行30分钟封闭。抽干溶剂，用3×80mL DMF、3×80mL DCM、3×80mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得14.71g Fmoc-ILys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。利用紫外分光光度法测量哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的荷载量为0.99mmol/g。

2.片段制备

2.1第一肽片段序列Ac-D-2Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-OH(即Ac-AA(1-4)-OH)的制备：

向肽反应室中加入14.7g Fmoc-D-3-Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-2-氯-三苯甲基树脂。加入150mL DCM溶胀树脂，抽干。用2×150mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用100mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于50mL DMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用10mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，抽干树脂，用3×100mL DMF洗涤树脂。

重复该操作过程，脱除Fmoc，加入Ac-D-2Nal-OH 2eq，缩合完成后，用3×100mLDCM、3×100mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得16.75g肽树脂。

用400mL 1％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶上，合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约30mL体积，然后用20mL DMF重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约20mL，加入500mL水沉淀产物。真空过滤收集所述固体，用约500mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得6.86g纯度99％的肽片段。

2.2第二肽片段序列Fmoc-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm-tBu)-Leu-ILys(Boc)-OH(即Fmoc-AA(5-8)-OH)的制备：

向肽反应室中加入14.7g Fmoc-ILys(Boc)-2-氯-三苯甲基树脂。加入150mL DCM溶胀树脂，抽干。用2×150mL 20％哌啶/DMF溶液分别5，15分钟处理树脂，去除Fmoc。用100mL DMF冼涤所述树脂4次，去除Fmoc副产物(二苯并富烯和其哌啶加合物)和残余哌啶，茚三酮试验测定。

同时活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Leu-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于50mL DMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用10mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×100mL DMF洗涤树脂。

重复该操作过程，脱除Fmoc，活化序列中的后续氨基酸Fmoc-D-Phe(4-NO₂)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于50mL DMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用10mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×100mL DMF洗涤树脂。随后将树脂转移至250ml圆底烧瓶中，依次加入活化完全的Zn粉(15eq)、CaCl₂(0.8eq)、80％乙醇溶液，回流，反应完成后，浓缩，加入DCM溶液，收集上层树脂悬浮液转移至多肽反应器中，用3×100mL DMF洗涤树脂，加入叔丁基异氰酸酯(6eq)和DIEA(6eq)，反应完全后用3×100mL DMF洗涤树脂。

重复该操作过程，脱除Fmoc，活化序列中的后续氨基酸Fmoc-Phe(4-NO₂)-OH，以在其羧基末端反应。将Fmoc-保护的氨基酸(2eq)、HOBt(2eq)和DIEA(4eq)在室温下溶解于50mL DMF中。氩气保护下把该溶液冷却至0℃，然后加入HBTU(2eq)，搅拌5分钟溶解。将活化的氨基酸溶液加入到抽干的树脂中，用10mL DCM洗涤。机械搅拌所述反应物1小时。用定性茚三酮试验监测缩合完成情况。在判定所述缩合反应完成后，则抽干树脂，用3×100mL DMF洗涤树脂。随后将树脂转移至250ml圆底烧瓶中，依次加入活化完全的Zn粉(15eq)、CaCl₂(0.8eq)、80％乙醇溶液，回流，反应完成后，浓缩，加入DCM溶液，收集上层树脂悬浮液转移至多肽反应器中，用3×100mL DMF洗涤树脂。加入二氢乳清酸(3eq)、HOBt(3eq)和DIC(3eq)，反应完全后用3×100mL DMF、3×100mL DCM、3×100mL MeOH洗涤，真空干燥至恒重，获得21.49g肽树脂。

用500mL 1％TFA/DCM处理约1小时，然后用2×50mL 0.5％TFA/DCM各洗涤5分钟，从树脂裂解所述肽。将裂解部分收集到吡啶上，合并裂解洗涤液，真空下浓缩至约30mL体积，然后用20mL DMSO重构，同时继续浓缩以去除残余DCM至终体积约20mL。加入500mL水沉淀产物。真空过滤收集所述固体，用约500mL水洗涤。真空干燥所述产物，获得11.28g纯度98％的肽片段。

3.液相片段缩合过程

3.1第三肽片段序列H-Pro-D-Ala-NH₂(即H-AA(9-10)-NH₂)的制备：

称取Fmoc-Pro-OH 10mmol，HoBt(2eq)，置于圆底烧瓶中，DMF溶解，加DIEA(4eq)，活化后，加HBTU(2eq)，H-D-Ala-NH₂·HCl 10.5mmol，TLC监测至反应完全。加入500mL水沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×500mL水，2×500mL MTBE洗涤，干燥得Fmoc-Pro-D-Ala-NH₂。然后加入DMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应2小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，加入500mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到1.8gH-Pro-D-Ala-NH₂。

3.2第四肽片段序列H-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm-tBu)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-NH₂(即H-AA(5-10)-NH₂)的制备

圆底烧瓶中加入H-Pro-D-Ala-NH₂(5.25mmol)和6.3mmol碳酸钠溶于水，低温下缓慢加入Fmoc-AA(5-8)-OSu(5mmol)的丙酮溶液，在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌4小时。反应完全后，旋蒸除去丙酮，加入10％柠檬酸调pH值，然后乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和NaCl洗，无水硫酸钠干燥，浓缩重结晶得Fmoc-AA(5-10)-NH₂。再加入DMF溶解，滴加哌啶至最终浓度16％，反应2小时，加入冰水沉淀产物，冰水洗涤2遍，加入500mL冷MTBE搅拌2小时去除脱除Fmoc的富烯产物，过滤沉淀，干燥，得到5.6g H-AA(5-10)-NH₂。

3.3全保护地加瑞克Ac-D-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm-tBu)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-NH₂的制备

圆底烧瓶中加入Ac-D-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-OH(5mmol)、H-AA(5-10)-NH₂(4.8mmol)和HOBt(5mmol)，溶于DMF，加入DIEA(10mmol)，然后在氩气保护下冷却至0℃。向冷却的溶液中加入HBTU(5mmol)。在0℃搅拌反应混合物30分钟，然后升至室温，再搅拌8小时。加入500mL水沉淀肽。真空过滤收集固体，用2×500mL水洗涤，2×500mL MTBE洗涤，在室温下用500mL乙腈研磨所述固体3小时，真空过滤收集，干燥获得8.63g全保护地加瑞克。

4.地加瑞克的裂解及纯化

4.1通过去除侧链保护制备地加瑞克粗肽

圆底烧瓶中加入三氟乙酸/水/三异丙基硅烷/1，2-乙二硫醇(92.5∶2.5∶2.5∶2.5)溶液150mL，并冷却至0℃。向该冷却溶液中加入8.6g全保护地加瑞克。在0℃搅拌溶解，然后升至室温，搅拌3小时。旋转浓缩，将该溶液加入0℃乙醚500mL沉淀所述肽。离心，沉淀2×500mL乙醚洗涤，然后将固体溶解于含有1％乙酸的1∶1水/乙腈中，冷冻干燥获得7.58g地加瑞克粗肽。

4.2 HPLC纯化地加瑞克粗肽

地加瑞克粗肽经制备型HPLC纯化产生地加瑞克纯品，纯度99.896％，总收率70.3％。

HPLC纯化条件：色谱柱：C18250×19，10u，130A；流速：8mL/min；检测：UV，220nm；流动相：A.乙腈；B.0.25％醋酸/水；方法：5％-25％A，10min；25-50％A，50min。

Claims

1.片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，固相合成侧链保护的第一肽片段序列和侧链保护的第二肽片段序列，液相合成侧链保护的第三肽片段序列，将各肽片段逐步偶联得到全保护的地加瑞克，然后裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽，纯化换盐得到地加瑞克；

其中，

所述的第一肽片段序列为地加瑞克序列中的第1-4位氨基酸，

所述的第二肽片段序列为地加瑞克序列中的第5-8位氨基酸，

所述的第三肽片段序列为地加瑞克序列中的第9-10位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(2)液相合成侧链保护的第三肽片段序列；

(5)将全保护的地加瑞克裂解脱除保护基得到地加瑞克粗肽；

(6)地加瑞克粗肽经纯化换盐得到地加瑞克。

3.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第一肽片段序列由Fmoc-D-3Pal-Ser(ψ^Me，Me)Pro-OH、Fmoc-D-Phe(4-C1)-OH和Ac-D-Nal-OH依次偶联在固相载体上获得；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂；

侧链保护的第一肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂为DIC与HOBt的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物。

4.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(1)中，侧链保护的第二肽片段序列由氨基酸Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-D-Phe(4-NO₂)-OH依次偶联在固相载体上，然后肽树脂还原、接侧链保护得到肽树脂Fmoc-D-4Aph(Cbm-tBu)-Leu-ILys(Boc)-Resin；接下来肽树脂脱除Fmoc保护、氨基端偶联Fmoc-Phe(4-NO₂)-OH，然后肽树脂还原、接侧链保护得到Fmoc-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm-tBu)-Leu-ILys(Boc)-Resin；其中，所述的固相载体为酸敏感树脂；

侧链保护的第二肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为20％的哌啶的DMF溶液、或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液；所使用的偶联剂为DIC与HOBt的组合、或者HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；所使用的裂解剂为体积百分含量为0.5～1％的TFA的DCM溶液、体积百分含量为20％的TFE的DCM溶液、或者TFE与AcOH与DCM按照体积比1∶2∶7的混合物。

5.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(2)中，侧链保护的第三肽片段序列Fmoc-Pro-D-AIa-NH₂由Fmoc-Pro-OH和D-Ala-NH₂在液相中偶联得到；

所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一种或几种的组合。

6.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(3)中，所使用的氨基脱保护试剂为体积百分含量为16％的哌啶的DMF溶液，或者体积百分含量为1％的DBU的DMF溶液。

7.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(3)、(4)中，所使用的偶联剂为HBTU与HOBt与DIEA的组合、或者HBTU与HOAt与DIEA的组合、或者DIC与HOBt的组合、或者EDC与HOBt的组合、或者PyBOP与HOBt与DIEA的组合；偶联反应的溶剂为DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一种或几种的组合。

8.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(5)中，全保护地加瑞克裂解的裂解液为TFA与H₂O按体积比95∶5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与PhOH与H₂O按体积比80∶5∶5∶5∶5的混合溶液、或者TFA与EDT与TIS与H₂O按体积比92.5∶2.5∶2.5∶2.5的混合溶液。

9.根据权利要求2所述的片段缩合制备地加瑞克的方法，其特征在于，步骤(6)中，纯化为反相高效液相色谱纯化换盐；流动相为醋酸水溶液和乙腈溶液。