WO2023101490A1 - 가니렐릭스의 신규한 제조방법 - Google Patents

가니렐릭스의 신규한 제조방법 Download PDF

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WO2023101490A1
WO2023101490A1 PCT/KR2022/019416 KR2022019416W WO2023101490A1 WO 2023101490 A1 WO2023101490 A1 WO 2023101490A1 KR 2022019416 W KR2022019416 W KR 2022019416W WO 2023101490 A1 WO2023101490 A1 WO 2023101490A1
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WO
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resin
formula
tetrafluoroborate
dmf
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PCT/KR2022/019416
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김재일
황국상
이주영
김동민
조은진
이슬기
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애니젠 주식회사
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for preparing ganirelix.
  • Ganirelix Acetate Injection (trade name: ORGAOJTRAN ® ) was researched, developed and produced by MSD (Merck in the US and Canada) and released in China after obtaining approval from the State Administration for Food and Drug Administration of China in 2013. ) is used to prevent the peak from being stimulated too early. Worldwide, the prevalence of infertility is as high as 9%. In vitro fertilization and embryo transfer process control The use of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist modulation during hyperovulation therapy (COH) is already routinely adopted.
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • COH hyperovulation therapy
  • Ganirelix acetate injection is a third-generation GnRH antagonist that can rapidly and reversibly suppress the release of follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) in the body by competitive binding with the GnRH receptor in the anterior pituitary gland.
  • FSH follicle stimulating hormone
  • LH luteinizing hormone
  • Ganirelix Acetate Injection offers a newer drug option for preventing premature luteinizing hormone (LH) peaks in infertility patients undergoing assisted reproductive technology (ART) controlled hyperovulation (COH) therapy.
  • ART assisted reproductive technology
  • COH controlled hyperovulation
  • An object of the present invention is to provide an optimal mass synthesis method capable of obtaining ganirelix containing a large number of non-natural amino acids in high purity and in high yield.
  • GNA Ganirelix acetate
  • GNA C5 Ganirelix acetate C-term 5mer
  • GNA N5 Ganirelix acetate N-term 5mer
  • DEPBT (3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one)
  • HATU Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate
  • HCTU O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • TPTU 2-(2-Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate
  • the obtaining of the intermediate A may include obtaining a peptide represented by the following formula (18); and removing the protecting group and the resin from the obtained peptide represented by Chemical Formula 18:
  • R 1 is hydrogen or a hydroxy protecting group
  • R 1 is hydrogen, a tert-butyl group (t-Butyl), a triphenylmethyl group, a 2-chlorotriphenylmethyl group, a benzyl group, a phenyl group, Allyl, methyl, benzyl phospho, SO 3 nP (2,2-dimethylpropylsulfo), phosphor, Clt (2-chlorotrityl), DMAE (dimethylaminoethyl) , a propargyl group or a PO(NMe 2 ) 2 ) group (bis-dimethylamino-phosphono), and according to a preferred embodiment, a tert-butyl group, but is not limited thereto.
  • the resin is 2-chlorotrityl resin (2-Chlorotrityl), trityl resin (Trityl), 4-methyltrityl resin (4-Methyltrityl), 4-methoxytrityl resin (4- methoxytrityl) or MBHA resin (4-Methylbenzhydrylamine), and according to a preferred embodiment, it may be 2-chlorotrityl resin or MBHA resin, but is not limited thereto.
  • the step of removing the protecting group and the resin may be performed under an acidic condition according to a preferred embodiment, but depending on which protecting group and the resin are used, basic, acidic, or neutral conditions, or their It may be performed by adjusting the degree, but is not limited thereto.
  • the peptide represented by Chemical Formula 18 is treated with trifluoroacetic acid (TFA), triisopropylsilane (TIS), dichloromethane (DCM), ethylenedioxydiesic acid
  • TSA trifluoroacetic acid
  • TIS triisopropylsilane
  • DCM dichloromethane
  • ethylenedioxydiesic acid It may include the step of reacting with a mixed solution containing a combination of those selected from the group consisting of thiol (DODT), dimethyl sulfide (DMS) and ammonium iodide (NH 4 I), and in a preferred embodiment When pouring, it may include, but is not limited to, reacting with a mixed solution containing trifluoroacetic acid, triisopropylsilane, or a combination thereof.
  • DODT thiol
  • DMS dimethyl sulfide
  • NH 4 I ammonium iodide
  • the step of removing the protecting group and the resin is to convert the peptide represented by Formula 18 to TFA and TIS (35 to 45): (1), (35 to 44): (1), (35 to 43): (1), (35 to 42): (1), (35 to 41): (1) or (35 to 40): (1) in a volume ratio (v / v)
  • It may include a step of reacting, and according to a preferred embodiment, it may include a step of reacting with a mixed solution containing a volume ratio (v / v) of (35 to 40): (1), but It is not limited.
  • the peptide represented by Chemical Formula 18 is treated with trifluoroacetic acid (TFA), triisopropylsilane (TIS), dichloromethane (DCM), ethylenedioxydiesic acid reacting with a mixed solution containing a combination of those selected from the group consisting of thiol (DODT), dimethyl sulfide (DMS) and ammonium iodide (NH 4 I); And it may include the step of solidifying by mixing Et 2 O, MTBE or a combination thereof in the reaction solution, but is not limited thereto.
  • TSA trifluoroacetic acid
  • TIS triisopropylsilane
  • DCM dichloromethane
  • ethylenedioxydiesic acid reacting with a mixed solution containing a combination of those selected from the group consisting of thiol (DODT), dimethyl sulfide (DMS) and ammonium iodide (NH 4 I);
  • DODT thiol
  • DMS dimethyl
  • the reaction solution is 20 to 40, 20 to 39, 20 to 38, 20 to 37, 20 to 36, 20 to 35, 20 to 34, 20 to 33, 20 to 32, 20 to 31, 20 to 30, 21 to 30, 22 to 30, 23 to 30, 24 to 30 or 25 to 30% may further comprise the step of concentrating, preferably According to the embodiment, it may further include a step of concentrating to 25 to 30%, but is not limited thereto.
  • the solidifying step may be performed under a nitrogen stream, but is not limited thereto.
  • the solidifying step is 5 to 30, 5 to 29, 5 to 28, 5 to 27, 5 to 26, 5 to 25, 5 to 24, 5 to 23, 5 to 22, 5 to 21 . It may be, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate A is 2,4,6-collidine (2,4,6-collidine), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), ethyl hydroxy Roxyiminocyanoacetate (Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide hydrochloride (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride (EDC HCl), 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), 3 -(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4-(3H)-one (3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT) , Bis (dimethylaminotriazole
  • Tyr in the step of obtaining the intermediate A, Tyr may be selected and loaded as the first amino acid, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate A is 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4 or 2 to 4 equivalents of the first amino acid. It may include the step of loading, and according to a preferred embodiment, it may include the step of loading with 2 to 4 equivalents, but is not limited thereto.
  • Ser may be selected and coupled as the second amino acid, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate A may include 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, or 1 to 3 equivalents of the second amino acid. It may include a step of coupling to, and according to a preferred embodiment, it may include a step of coupling with 1 to 3 equivalents, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate A may include, but is not limited to, coupling the second amino acid in the presence of the following base reagent:
  • 2,4,6-Collidine Pyridine, Imidazole, Pyrrolidine, Cyclohexylamine, Morpholine, Blood Piperidine, 4-Methoxypyridine, 2-Chloropyridine, 4-Dimethylaminopyridine, Aniline, 4-Methoxyaniline -Methoxyaniline), 4-Phenylenediamine, Ethylamine, Diethylamine, Triethylamine, DIEA (N,N-Diisopropylethylamine), DBU (1,8- Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene) or combinations thereof.
  • the step of obtaining the intermediate A is coupling the second amino acid in the presence of 0.5 to 4, 0.5 to 3.5, 0.5 to 3, 0.5 to 2.5, 0.5 to 2 or 1 to 2 equivalents of the base reagent. It may include the step of doing, and according to a preferred embodiment, it may include the step of coupling in the presence of 1 to 2 equivalents of the base reagent, but is not limited thereto.
  • D-3-Pal, D-Phe (4-Cl) and D-2-Nal are selected and coupled as the third, fourth and fifth amino acids, respectively. It may be, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate A is, the third, fourth and fifth amino acids 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4 Alternatively, it may include a step of coupling with 1 to 3 equivalents, and according to a preferred embodiment, it may include a step of coupling with 1 to 3 equivalents, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate A is 5 to 40, 6 to 40, 7 to 40, 8 to 40, 9 to 40, 10 to 40, 10 to 39, 10 to 38, 10 to 37 . It may be performed under a temperature condition of, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate A is carried out under conditions of a reaction solvent volume of 5 to 30, 5 to 29, 5 to 28, 5 to 27, 5 to 26 or 5 to 25 L / mol It may be carried out under a reaction solvent volume condition of 5 to 25 L/mol according to a preferred embodiment, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate B may include: obtaining a peptide represented by Formula 20; removing the resin from the obtained peptide represented by Chemical Formula 20; And purifying the resin-removed peptide to obtain the intermediate B, but is not limited thereto:
  • the resin is 2-chlorotrityl resin (2-Chlorotrityl), trityl resin (Trityl), 4-methyltrityl resin (4-Methyltrityl), 4-methoxytrityl resin (4- methoxytrityl) or MBHA resin (4-Methylbenzhydrylamine), and according to a preferred embodiment, it may be 2-chlorotrityl resin or MBHA resin, but is not limited thereto.
  • the step of removing the resin may be performed under acidic conditions according to a preferred embodiment, but depending on which resin is used, basic, acidic or neutral conditions, or by adjusting the degree thereof It may be performed, but is not limited thereto.
  • the peptide represented by Formula 20 is trifluoroacetic acid (TFA), triisopropylsilane (TIS), dichloromethane (DCM), ethylenedioxydiesioic acid thiol (DODT), dimethyl sulfide (DMS) and ammonium iodide (NH 4 I)
  • TSA trifluoroacetic acid
  • TIS triisopropylsilane
  • DCM dichloromethane
  • DODT ethylenedioxydiesioic acid thiol
  • DMS dimethyl sulfide
  • NH 4 I ammonium iodide
  • the step of removing the resin is performed by mixing the peptide represented by Formula 20 with TFA and DCM (0.1 to 5): (1), (0.2 to 5): (1), (0.3 to 5 ):(1), (0.4 to 5):(1), (0.5 to 5):(1), (0.6 to 5):(1), (0.7 to 5):(1), (0.8 to 5 ):(1), (0.9 to 5):(1), (1 to 5):(1), (1.1 to 5):(1), (1.2 to 5):(1), (1.3 to 5 ):(1), (1.4 to 5):(1), (1.5 to 5):(1), (1.5 to 4.5):(1), (1.5 to 4):(1), (1.5 to 3.5 ): (1), (1.5 to 3): (1) or (2 to 3): may include the step of reacting with a mixed solution containing a volume ratio (v / v) of (1), preferably According to the embodiment, (1.5 to 3.5): It may include the step of reacting with a mixed solution containing a volume ratio (v / v
  • the peptide represented by Formula 20 is trifluoroacetic acid (TFA), triisopropylsilane (TIS), dichloromethane (DCM), ethylenedioxydiesioic acid thiol reacting with a mixed solution containing a combination of those selected from the group consisting of (DODT), dimethyl sulfide (DMS) and ammonium iodide (NH 4 I); And it may include the step of solidifying by mixing Et 2 O, MTBE or a combination thereof in the reaction solution, but is not limited thereto.
  • TSA trifluoroacetic acid
  • TIS triisopropylsilane
  • DCM dichloromethane
  • NH 4 I ammonium iodide
  • the solidifying step may be performed under a nitrogen stream, but is not limited thereto.
  • the solidifying step is 5 to 30, 5 to 29, 5 to 28, 5 to 27, 5 to 26, 5 to 25, 5 to 24, 5 to 23, 5 to 22, 5 to 21 . It may be, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate B is 2,4,6-collidine (2,4,6-collidine), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), ethyl hydroxy Roxyiminocyanoacetate (Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide hydrochloride (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride (EDC HCl), 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), 3 -(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4-(3H)-one (3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT) , Bis (dimethylamin
  • the step of obtaining the intermediate B each amino acid 1 to 5, 1.1 to 5, 1.2 to 5, 1.3 to 5, 1.4 to 5, 1.5 to 5, 1.6 to 5, 1.7 to 5, 1.8 to 5, 1.9 to 5, 2 to 5, 2 to 4.9, 2 to 4.8, 2 to 4.7, 2 to 4.6, 2 to 4.5, 2 to 4.4, 2 to 4.3, 2 to 4.2, 2 to 4.1 or 2 to It may include the step of loading or coupling with 4 equivalents, and according to a preferred embodiment, it may include the step of loading or coupling with 2 to 4 equivalents, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate B is carried out under conditions of a reaction solvent volume of 5 to 30, 5 to 29, 5 to 28, 5 to 27, 5 to 26 or 5 to 25 L / mol It may be carried out under a reaction solvent volume condition of 5 to 25 L/mol according to a preferred embodiment, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the intermediate B is 5 to 40, 6 to 40, 7 to 40, 8 to 40, 9 to 40, 10 to 40, 10 to 39, 10 to 38, 10 to 37 . It may be performed under a temperature condition of, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the ganirelix is 2,4,6-collidine (2,4,6-collidine), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), ethyl Hydroxyiminocyanoacetate (Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) ) Carbodiimide hydrochloride (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) hydrochloride (EDC HCl), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), 3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT ), bis (dimethylamino) methylene] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridinium 3-oxide he
  • the step of obtaining the ganirelix is 0.5 to 4, 0.5 to 3.9, 0.5 to 3.8, 0.5 to 3.7, 0.5 to 3.6, 0.5 to 3.5, 0.5 to 3.4, 0.5 to 3.3, 0.5 to 3.2 , 0.5 to 3.1, 0.5 to 3, 0.5 to 2.9, 0.5 to 2.8, 0.5 to 2.7, 0.5 to 2.6, 0.5 to 2.5, 1 to 4, 1 to 3.9, 1 to 3.8, 1 to 3.7, 1 to 3.6, 1 to 3.5, 1 to 3.4, 1 to 3.3, 1 to 3.2, 1 to 3.1, 1 to 3, 1 to 2.9, 1 to 2.8, 1 to 2.7, 1 to 2.6 or 1 to 2.5 equivalents of EDC HCl. It may be, and according to a preferred embodiment, it may be performed in the presence of 1 to 2.5 equivalents of EDC ⁇ HCl, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining ganirelix is 0.2 to 3, 0.3 to 3, 0.4 to 3, 0.5 to 3, 0.5 to 2.9, 0.5 to 2.8, 0.5 to 2.7, 0.5 to 2.6, 0.5 to 2.5 , 0.5 to 2.4, 0.5 to 2.3, 0.5 to 2.2, 0.5 to 2.1 or 0.5 to 2 equivalents of HOAt may be carried out, and according to a preferred embodiment, it may be performed in the presence of 0.5 to 2 equivalents of HOAt. However, it is not limited thereto.
  • the step of obtaining the ganirelix is 1 to 10, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3 or 1 to 10 with the intermediate A It may include the step of convergent synthesis of 2 equivalents of intermediate B, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the ganirelix is to mix the intermediate A and the intermediate B at 1.5 to 10, 1.5 to 9.5, 1.5 to 9, 1.5 to 8.5, 1.5 to 8, 1.5 to 7.5, 1.5 to 7 , 1.5 to 6.5, 1.5 to 6, 1.5 to 5.5, 1.5 to 5, 1.5 to 4.5, 1.5 to 4, 1.5 to 3.5, 1.5 to 3 or 1.5 to 2.5 equivalents of a coupling reagent in the presence of a convergent synthesis comprising the step of It may be, and according to a preferred embodiment, it may include a step of convergent synthesis in the presence of 1.5 to 2.5 equivalents of a coupling reagent, but is not limited thereto.
  • the step of obtaining the ganirelix may include subjecting the intermediate A and intermediate B to a convergent synthesis reaction in the presence of the coupling reagent; And it may include, but is not limited to, a step of solidifying by mixing DCM, MTBE or a combination thereof in the reaction solution.
  • the solidifying step may be performed under a nitrogen stream, but is not limited thereto.
  • the solidifying step is 5 to 30, 5 to 29, 5 to 28, 5 to 27, 5 to 26, 5 to 25, 5 to 24, 5 to 23, 5 to 22, 5 to 21 . It may be, but is not limited thereto.
  • ganirelix can be obtained in high purity and high yield, and its commercial mass production process is possible, as well as providing an economic effect of reducing production costs compared to the prior art, and more safely than the prior art Large quantities of ganirelix can be obtained.
  • FIG. 1 is a diagram showing a manufacturing process flow chart of linear synthesis of ganirelix (GNA, TFA form) based on solid phase synthesis according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a manufacturing process flow chart of a method for convergent synthesis of ganirelix (GNA, TFA form) with GNA N4 and GNA C6 according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a manufacturing process flow chart of a method for convergent synthesis of ganirelix (GNA, TFA form) with GNA N5 and GNA C5 according to the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the established manufacturing process flow chart of the convergent synthesis method of ganirelix acetate (GNA ⁇ 2AcOH) with GNA N5 and GNA C5 according to the present invention.
  • Figure 5 It is a diagram showing the related substance change curve according to the increase in DIEA equivalent upon coupling the second amino acid of GNA N5 (Fmoc-Ser(tBu)-OH).
  • Figure 6 A diagram showing a purity change curve according to a change in amino acid equivalent from the third amino acid coupling step to the acetylation step of GNA N5.
  • FIG. 7 is a diagram showing the MALDI-TOF mass of GNA N5.
  • FIG. 9 is a diagram showing the MALDI-TOF mass of GNA.
  • reaction solution was removed and washed with 400 mL of DMF for 2 minutes. Repeat the wash once more.
  • 400 mL of 20% piperidine in DMF was added to the reactor and stirred at 20 ⁇ 5 °C for 10 minutes. Repeat 1 more time.
  • GNA N4 synthetic scale: 2.55 mmol, 1.72 g, 1.0 eq
  • DMF 15.5 mL
  • GNA C6 3.0 g, 1.29 eq
  • HOAt 0.55 g, 1.58 eq
  • DIEA 0.66 g, 2.0 eq
  • EDC ⁇ HCl 0.77 g, 1.58 eq
  • DMF 4.5 mL
  • DIEA 0.66 g, 2.0 eq.
  • Rink amide MBHA resin (10 mmol, Loading capacity: 0.631 mmol/g) into the reactor. 200 mL of DCM was added thereto, stirred at 20 - 30 °C for 30 minutes, and then the solvent was removed.
  • reaction solution was removed and washed with 100 mL of DMF for 2 minutes. Repeat the wash once more.
  • 100 mL of 20% piperidine in DMF was added to the reactor and stirred at 20 ⁇ 5 °C for 15 minutes. Repeat 1 more time.
  • a DCM solution in which EDC ⁇ HCl is dissolved is slowly added to the reaction solution at 0 - 3 °C, and stirred at 10 - 25 °C for 1 hour or more.
  • Example 1 The experimental results of Examples 1 to 3 are summarized in Table 1 below. Among them, the experimental results of Example 3 were judged to be the best, and follow-up studies were conducted.
  • reaction solution was removed and washed with 2.0 L of DMF for 2 minutes. Repeat the wash once more.
  • 2.0 L of 20% piperidine in DMF was added to the reactor and stirred at 20 ⁇ 5 °C for 15 minutes. Repeat 1 more time.
  • GNA C5 crude to purified water at a concentration of 0.1 g/mL and dissolve completely. After filtering with a GF/C filter and a 0.45 ⁇ m HVHP membrane filter, it is injected into a column for purification. Yield (49.3 g, 47.2 g, 48.5 g), purification yield (55.1%, 57.6%, 55.7%) and purity (99.1%, 99.0%, 99.0%) for 3 batches of GNA C5 after purification and lyophilization ( see Table 5 below).
  • the step of loading the first amino acid onto the solid support (2-Chlorotrityl chloride resin, CTC resin) affects the synthesis yield of GNA N5 because it is related to productivity (synthetic yield). Therefore, as a way to increase the loading ratio of the first amino acid (Fmoc-Tyr(tBu)-OH), the equivalent of the first amino acid was screened from 1.5 to 5.0 eq.
  • the substitution rate of the CTC resin used in the synthesis was 1.48 mmol/g and the scale was 10 mmol.
  • the synthesis was reacted for 4 hours at room temperature (25 °C).
  • GNA N5 was evaluated according to the volume of the reaction solvent. 2.5 equivalents of amino acids and activators were used. When 10 L/mol or 20 L/mol of the reaction solution was used, the purity was 96.7% and 96.8%, and there was no difference.
  • Global cleavage and solidification processes are major processes that can affect the purity and yield of GNA N5.
  • Optimization studies of global cleavage and solidification processes used 10 mmol, 1.5 times the amount of cleavage liquid based on the volume of the reaction solution (20 L / mol), and the reaction time was 3 hours, and then the purity and yield were compared.
  • Table 12 summarizes the results of the experiment by changing the ratio of TFA from 70% to 95% during global cleavage. It was confirmed that the highest yield (94.4%) was obtained when the purity of GNA N5 was 94.0% or more when the TFA ratio was 90% or more and the TFA concentration was 95%. Therefore, the concentration of TFA in the global cleavage process was selected as 95%.
  • the solidification reaction proceeded by adding a cleavage reaction solution to the anti-solvent.
  • the volume of the anti-solvent was 5 times the volume of the cleavage reaction solution.
  • Diethyl ether which was used as an anti-solvent in the solidification process, has a low boiling point and is highly volatile and flammable. Research was conducted to replace it with MTBE, which is relatively safe. When MTBE was used, the particle size of solids generated in the filtration process after solidification was very small, and it was observed that the solids passed through the filter paper as they were (Table 13, Experiment 5; the filtrate through which the solids permeated was re-filtered to prevent a decrease in yield ). In order to improve the filterability problem, solidification was performed by concentrating the cleavage solution. The solidification reaction proceeded by adding MTBE to the concentrated cleavage reaction solution.
  • the reaction temperature could not be controlled with a reaction volume of 10 L/mol, so the reaction was conducted by increasing the volume to 20 L/mol, which is an easy-to-control volume (DIC/Oxyma was used as the activator).
  • the purity decreased to 83.9% (yield: 118.7%) due to 4.4% of related substances on HPLC.
  • the molecular weight of GNA C5 was 226.05 lower than the 3rd amino acid (Fmoc-hArg(Et)2-OH) or 5th amino acid (Fmoc-D-hArg(Et)2 -OH) is assumed to be deleted. Therefore, it was assumed that the deletion occurred due to an increase in reaction volume (decrease in reaction concentration), so the amino acid equivalent was increased to 3.0 eq. As a result, no decrease in purity due to deletion occurred (purity: 91.5%, yield: 114.7%). Therefore, 3.0 eq was selected as the equivalent of amino acid suitable for the reaction solution volume of 20 L/mol.
  • the synthesis was performed at 15, 20, 25, and 30 ° C. and the purity was compared (see Table 15 below). Although the pattern of related materials in the temperature range of 15 - 30 °C was the same and did not significantly affect the purity, the optimum synthesis temperature range was set to 20 ⁇ 5 °C as in GNA N5.
  • GNA C5 Global cleavage and solidification processes are major processes that can affect the purity and yield of GNA C5. In the case of GNA C5, since there is no protecting group, only GNA C5 needs to be removed from the resin. In order to optimize the global cleavage and solidification process, studies were conducted on TFA concentration, temperature, and anti-solvent. Optimization studies of global cleavage and solidification processes were performed using 10 mmol and 1.5 times the amount of cleavage solution based on the volume of the reaction solution (20 L/mol), and the purity and yield were compared after reaction for 3 hours.
  • the ratio of TFA varied from 10% to 80%, and the experimental results are summarized in Table 16 below.
  • the optimal concentration of TFA in the global cleavage process was selected as 40% in consideration of the mass manufacturing process.
  • the solidification reaction proceeded by adding a cleavage reaction solution to the anti-solvent.
  • the anti-solvents used in the solidification reaction were diethyl ether and MTBE, and it was confirmed that both solvents could be used without problems in solidification, and MTBE, which was relatively safe, was selected.
  • initial temperature 4.4 ° C to -5.5 ° C
  • MTBE which was relatively safe
  • the volume of MTBE was 7 to 10 times the cleavage reaction solution, and there were no specifics on purity, yield, and filtration.
  • GNA C5, EDC ⁇ HCl, and Collidine equivalents were set as process variables through Design of Experiments (DOE), and optimization studies were conducted on the interaction of reagents and intermediates and each process variable.
  • DOE Design of Experiments
  • the design space is derived to derive the process operation range.
  • DOE professional software Fusion pro
  • the ranges of each equivalent change of GNA C5, EDC ⁇ HCl, and Collidine are 1.28 ⁇ 1.92 eq, 0.88 ⁇ 2.64 eq, and 0.88 ⁇ 2.64 eq.
  • the synthetic scale was 0.57 mmol and the experimental sequence and results (purity) are shown in Table 21 below.
  • the synthesis scale is 1.14 mmol and the results are shown in Table 22 below. As shown in the experimental results, it was higher than the target purity (94%) at all points. Therefore, it was verified that it was properly set to the optimal operating range for GNA C5 and collidine.

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Abstract

본 발명의 제조방법에 따를 때, 가니렐릭스를 고순도 및 고수율로 수득할 수 있고, 이의 상업적 대량 생산 공정이 가능할 뿐만 아니라 종래기술 대비 생산 비용 절감의 경제적 효과를 제공하며, 종래기술 대비 보다 안전하게 대량의 가니렐릭스를 수득할 수 있다.

Description

가니렐릭스의 신규한 제조방법
본 발명은 가니렐릭스의 신규한 제조방법에 관한 것이다.
가니렐릭스 아세테이트 주사액(상품명: ORGAOJTRAN®)은 MSD사(미국 및 캐나다 명칭은 Merck)가 연구개발 및 생산하여 2013년 중국국가식품약품감독관리총국의 승인을 얻어 중국에서 출시하였으며, 황체호르몬(LH) 피크가 과도하게 이르게 자극되는 것을 예방하는 용도로 사용된다. 세계적으로 불임증의 발병률은 9%에 이른다. 체외 수정 및 배아 이식 과정 제어 과배란 요법(COH) 중에 생식선자극호르몬-방출 호르몬(GnRH) 작용제(agonist) 조절을 이용하는 것은 이미 통상적으로 채택되고 있는 실정이다. 가니렐릭스 아세테이트 주사액은 3세대 GnRH 길항제로서, 뇌하수체 전엽의 GnRH 수용체와의 경쟁적 결합에 의해 체내의 난포 자극 호르몬(FSH) 및 황체 자극 호르몬(LH)의 방출을 신속하고 가역적으로 억제할 수 있다. 가니렐릭스 아세테이트 주사액은 보조생식기술(ART) 통제성 과배란(COH) 요법을 받는 불임증 환자에게 황체 자극 호르몬(LH) 피크가 이르게 나타나는 것을 예방하기 위한 최신 약물 옵션을 제공한다.
본 발명은 비천연 아미노산을 다수 포함하고 있는 가니렐릭스를 고순도 및 고수율로 수득할 수 있는 최적의 대량 합성방법을 제공함에 그 목적이 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업계 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회 (Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다 (Biochemistry, 11:1726-1732(1972); Pure & Appl. Chem., Vol. 56, No. 5, pp. 595-624, 1984).
CTC resin: 2-Chlorotrityl chloride resin
SPPS: Solid Phase Peptide Synthesis
Fmoc: 9-Fluorenyloxycarbonyl
tBu: tert-Butyl
Tyr: Tyrosine
Ser: Serine
D-3-Pal: 3-(3-Pyridyl)-D-Alanine
D-Phe(4-Cl): 4-choro-D-Phenylalanine
D-2-Nal: 3-(2-Naphthyl)-D-Alanine
Ala: Alanine
Pro: Proline
Leu: Leucine
hArg: homoarginine
D-hArg: D-homoarginine
Et: Ethyl
GNA: Ganirelix acetate
GNA C5: Ganirelix acetate C-term 5mer
GNA N5: Ganirelix acetate N-term 5mer
HCl: Hydrochloric acid
DEPBT: (3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one)
DIEA: N,N-Diisopropylethylamine
DIC: N,N'-Diisopropylcarbodiimide
Oxyma: Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate
HATU: Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate
HCTU: O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
HOBt: 1-Hydroxybenzotriazole
HOAt: 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole
TBTU: 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate
TCTU: 1-[Bis(dimethylamino)methylen]-5-chlorobenzotriazolium 3-oxide tetrafluoroborate
TOTU: N-[[[(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy](dimethylamino)methylene]-N-methyl-methanaminium tetrafluoroborate
TPTU: 2-(2-Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate
HBTU: N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate
EDC·HCl: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride
TEA: Triethylamine
TFA: Trifluoroacetic acid
TIS: Triisopropylsilane
NH4OAc: Ammonium acetate
AcOH: Acetic acid
MeOH: Methanol
DCM: Dichloromethane
DMF: N,N-Dimethylformamide
MTBE: Tert-Butyl methyl ether
ACN: Acetonitrile
본 발명의 일 양태로서, 하기 화학식 19로 표시되는 펩타이드 중간체 A를 수득하는 단계; 하기 화학식 21로 표시되는 펩타이드 중간체 B를 수득하는 단계; 및 상기 중간체 A와 중간체 B의 수렴합성을 통해 하기 화학식 13으로 표시되는 가니렐릭스를 수득하는 단계를 포함하는, 가니렐릭스(Ganirelix)의 제조방법을 제공한다:
[화학식 19]
Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-OH
[화학식 21]
H2N-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2
[화학식 13]
Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-Arg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2.
본 발명의 일 양태로서, 하기 화학식 19로 표시되는 펩타이드 중간체 A를 수득하는 단계; 하기 화학식 21로 표시되는 펩타이드 중간체 B를 수득하는 단계; 상기 중간체 A와 중간체 B의 수렴합성을 통해 하기 화학식 13으로 표시되는 가니렐릭스를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 가니렐릭스를 정제하고, 아세트산 염으로 치환하여 하기 화학식 22로 표시되는 초산 가니렐릭스를 수득하는 단계를 포함하는, 초산 가니렐릭스(Ganirelix Acetate)의 제조방법을 제공한다:
[화학식 19]
Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-OH
[화학식 21]
H2N-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2
[화학식 13]
Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-Arg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2
[화학식 22]
Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2·2AcOH.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 하기 화학식 18로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 화학식 18로 표시되는 펩타이드로부터 보호기와 레진을 제거하는 단계를 포함하는 것일 수 있다:
[화학식 18]
Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(R1)-Tyr(R1)-O-Resin
(상기 화학식 18에 있어서, 상기 R1은 수소 또는 히드록시기 보호기임).
상기 R1은 보다 구체적인 예로서, 수소, 터트-부틸기(t-Butyl), 트리페닐메틸기(triphenylmethyl), 2-클로로트리페닐메틸기(2-chlorotriphenylmethyl) 벤질기(Benzyl), 페닐기(phenyl), 알릴기(allyl), 메틸기(methyl), 벤질포스포기(benzyl phospho), SO3nP기(2,2-dimethylpropylsulfo), 포스포기(phosphor), Clt기(2-chlorotrityl), DMAE기(dimethylaminoethyl), 프로파질기(propargyl) 또는 PO(NMe2)2)기(bis-dimethylamino-phosphono)일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 터트-부틸기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 레진은 2-클로로트리틸 레진(2-Chlorotrityl), 트리틸 레진(Trityl), 4-메틸트리틸 레진(4-Methyltrityl), 4-메톡시트리틸 레진(4-Methoxytrityl) 또는 MBHA 레진(4-Methylbenzhydrylamine)일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 2-클로로트리틸 레진 또는 MBHA 레진일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 보호기와 레진을 제거하는 단계는 바람직한 일 실시예에 따를 때, 산성 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 어떠한 보호기와 레진을 사용하는지에 따라 염기성, 산성 또는 중성 조건, 또는 이의 정도를 조절하여 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 보호기와 레진을 제거하는 단계는, 상기 화학식 18로 표시되는 펩타이드를 삼불화초산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 디클로로메탄(DCM), 에틸렌디옥시디에산싸이올(DODT), 디메틸설파이드(DMS) 및 아이오딘화암모늄(NH4I)으로 이루어진 군에서 선택된 것들의 조합을 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 삼불화초산, 트리이소프로필실란 또는 이의 조합을 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 보호기와 레진을 제거하는 단계는, 상기 화학식 18로 표시되는 펩타이드를 TFA과 TIS를 (35 내지 45):(1), (35 내지 44):(1), (35 내지 43):(1), (35 내지 42):(1), (35 내지 41):(1) 또는 (35 내지 40):(1)의 부피비(v/v)로 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 (35 내지 40):(1)의 부피비(v/v)로 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 보호기와 레진을 제거하는 단계는, 상기 화학식 18로 표시되는 펩타이드를 삼불화초산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 디클로로메탄(DCM), 에틸렌디옥시디에산싸이올(DODT), 디메틸설파이드(DMS) 및 아이오딘화암모늄(NH4I)으로 이루어진 군에서 선택된 것들의 조합을 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계; 및 이의 반응용액에 Et2O, MTBE 또는 이들의 조합을 혼합하여 고체화하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 혼합용액과 반응시키는 단계 후 고체화하는 단계 전, 반응용액을 20 내지 40, 20 내지 39, 20 내지 38, 20 내지 37, 20 내지 36, 20 내지 35, 20 내지 34, 20 내지 33, 20 내지 32, 20 내지 31, 20 내지 30, 21 내지 30, 22 내지 30, 23 내지 30, 24 내지 30 또는 25 내지 30%로 농축하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 25 내지 30%로 농축하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 고체화하는 단계는 질소기류 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 고체화하는 단계는 5 내지 30, 5 내지 29, 5 내지 28, 5 내지 27, 5 내지 26, 5 내지 25, 5 내지 24, 5 내지 23, 5 내지 22, 5 내지 21, 5 내지 20, 6 내지 20, 7 내지 20, 8 내지 20, 9 내지 20 또는 10 내지 20℃ 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 10 내지 20℃ 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt), 에틸하이드록시이미노시아노아세테이트(Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-디이소프로필카보디이미드(N,N'-Diisopropylcarbodiimide, DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride, EDC·HCl), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4-(3H)-원(3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT), 비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridinium-3-oxidde hexafluorophosphate, HATU), O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플르오로포스페이트(O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HCTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오르보레이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate, TBTU), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로벤조트리아조륨-3-옥사이드-테트라플루오로보레이트(1-[Bis(dimethylamino)methylen]-5-chlorobenzotriazolium 3-oxide tetrafluoroborate, TCTU), N-[[[1-시아노-2-에톡시-2-오소에틸아이덴]아미노]옥시](다메틸아미노)메틸렌]-N-메틸-메탄아미늄 테트라플루오로보레이트(N-[[[(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy](dimethylamino)methylene]-N-methyl-methanaminium tetrafluoroborate, TOTU), 2-(2-피리돈-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(2-(2-Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TPTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트(N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate, HBTU) 또는 이들의 조합을 포함하는 활성화제 존재 하에 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 첫번째 아미노산으로서 Tyr을 선택하여 로딩할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 첫번째 아미노산을 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4 또는 2 내지 4 당량으로 로딩하는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 2 내지 4 당량으로 로딩하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 두번째 아미노산으로서 Ser을 선택하여 커플링할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 두번째 아미노산을 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4 또는 1 내지 3 당량으로 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 1 내지 3 당량으로 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 두번째 아미노산을 하기 염기시약 존재 하에 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine), 피리딘(Pyridine), 이미다졸(Imidazole), 피롤리딘(Pyrrolidine), 사이클로헥실아민(Cyclohexylamine), 몰포린(Morpholine), 피페리딘(Piperidine), 4-메톡시피리딘(4-Methoxypyridine), 2-클로로피리딘(2-Chloropyridine), 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine), 아닐린(Aniline), 4-메톡시아닐린(4-Methoxyaniline), 4-페닐렌디아민(4-Phenylenediamine), 에틸아민(Ethylamine), 디에틸아민(Diethylamine), 트리에틸아민(Triethylamine), DIEA(N,N-Diisopropylethylamine), DBU(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene) 또는 이들의 조합.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 두번째 아미노산을 0.5 내지 4, 0.5 내지 3.5, 0.5 내지 3, 0.5 내지 2.5, 0.5 내지 2 또는 1 내지 2당량의 상기 염기시약 존재 하에 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 1 내지 2당량의 상기 염기시약 존재 하에 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 세번째, 네번째 및 다섯번째 아미노산으로서 각각 D-3-Pal, D-Phe(4-Cl) 및 D-2-Nal을 선택하여 커플링할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 세번째, 네번째 및 다섯번째 아미노산을 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4 또는 1 내지 3 당량으로 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 1 내지 3 당량으로 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 5 내지 40, 6 내지 40, 7 내지 40, 8 내지 40, 9 내지 40, 10 내지 40, 10 내지 39, 10 내지 38, 10 내지 37, 10 내지 36, 10 내지 35, 10 내지 34, 10 내지 33, 10 내지 32, 10 내지 31 또는 10 내지 30℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 10 내지 30℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 5 내지 30, 5 내지 29, 5 내지 28, 5 내지 27, 5 내지 26 또는 5 내지 25 L/mol의 반응 용매 부피 조건 하에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 5 내지 25 L/mol의 반응 용매 부피 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 B를 수득하는 단계는, 하기 화학식 20으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계; 상기 수득한 화학식 20으로 표시되는 펩타이드로부터 레진을 제거하는 단계; 및 상기 레진이 제거된 펩타이드를 정제하여 상기 중간체 B를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 20]
H2N-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin.
상기 제조방법에 있어서, 상기 레진은 2-클로로트리틸 레진(2-Chlorotrityl), 트리틸 레진(Trityl), 4-메틸트리틸 레진(4-Methyltrityl), 4-메톡시트리틸 레진(4-Methoxytrityl) 또는 MBHA 레진(4-Methylbenzhydrylamine)일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 2-클로로트리틸 레진 또는 MBHA 레진일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 레진을 제거하는 단계는 바람직한 일 실시예에 따를 때, 산성 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 어떠한 레진을 사용하는지에 따라 염기성, 산성 또는 중성 조건, 또는 이의 정도를 조절하여 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 레진을 제거하는 단계는, 상기 화학식 20으로 표시되는 펩타이드를 삼불화초산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 디클로로메탄(DCM), 에틸렌디옥시디에산싸이올(DODT), 디메틸설파이드(DMS) 및 아이오딘화암모늄(NH4I)으로 이루어진 군에서 선택된 것들의 조합을 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 삼불화초산, 디클로로메탄 또는 이들의 조합을 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 레진을 제거하는 단계는, 상기 화학식 20으로 표시되는 펩타이드를 TFA과 DCM을 (0.1 내지 5):(1), (0.2 내지 5):(1), (0.3 내지 5):(1), (0.4 내지 5):(1), (0.5 내지 5):(1), (0.6 내지 5):(1), (0.7 내지 5):(1), (0.8 내지 5):(1), (0.9 내지 5):(1), (1 내지 5):(1), (1.1 내지 5):(1), (1.2 내지 5):(1), (1.3 내지 5):(1), (1.4 내지 5):(1), (1.5 내지 5):(1), (1.5 내지 4.5):(1), (1.5 내지 4):(1), (1.5 내지 3.5):(1), (1.5 내지 3):(1) 또는 (2 내지 3):(1)의 부피비(v/v)로 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 (1.5 내지 3.5):(1)의 부피비(v/v)로 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 레진을 제거하는 단계는, 상기 화학식 20으로 표시되는 펩타이드를 삼불화초산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 디클로로메탄(DCM), 에틸렌디옥시디에산싸이올(DODT), 디메틸설파이드(DMS) 및 아이오딘화암모늄(NH4I)으로 이루어진 군에서 선택된 것들의 조합을 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계; 및 이의 반응용액에 Et2O, MTBE 또는 이들의 조합을 혼합하여 고체화하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 고체화하는 단계는 질소기류 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 고체화하는 단계는 5 내지 30, 5 내지 29, 5 내지 28, 5 내지 27, 5 내지 26, 5 내지 25, 5 내지 24, 5 내지 23, 5 내지 22, 5 내지 21, 5 내지 20, 6 내지 20, 7 내지 20, 8 내지 20, 9 내지 20 또는 10 내지 20℃ 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 10 내지 20℃ 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 B를 수득하는 단계는, 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt), 에틸하이드록시이미노시아노아세테이트(Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-디이소프로필카보디이미드(N,N'-Diisopropylcarbodiimide, DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride, EDC·HCl), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4-(3H)-원(3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT), 비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridinium-3-oxidde hexafluorophosphate, HATU), O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플르오로포스페이트(O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HCTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오르보레이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate, TBTU), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로벤조트리아조륨-3-옥사이드-테트라플루오로보레이트(1-[Bis(dimethylamino)methylen]-5-chlorobenzotriazolium 3-oxide tetrafluoroborate, TCTU), N-[[[1-시아노-2-에톡시-2-오소에틸아이덴]아미노]옥시](다메틸아미노)메틸렌]-N-메틸-메탄아미늄 테트라플루오로보레이트(N-[[[(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy](dimethylamino)methylene]-N-methyl-methanaminium tetrafluoroborate, TOTU), 2-(2-피리돈-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(2-(2-Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TPTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트(N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate, HBTU) 또는 이들의 조합을 포함하는 활성화제 존재 하에 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 B를 수득하는 단계는, 각 아미노산을 1 내지 5, 1.1 내지 5, 1.2 내지 5, 1.3 내지 5, 1.4 내지 5, 1.5 내지 5, 1.6 내지 5, 1.7 내지 5, 1.8 내지 5, 1.9 내지 5, 2 내지 5, 2 내지 4.9, 2 내지 4.8, 2 내지 4.7, 2 내지 4.6, 2 내지 4.5, 2 내지 4.4, 2 내지 4.3, 2 내지 4.2, 2 내지 4.1 또는 2 내지 4 당량으로 로딩 또는 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 2 내지 4 당량으로 로딩 또는 커플링하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 B를 수득하는 단계는, 5 내지 30, 5 내지 29, 5 내지 28, 5 내지 27, 5 내지 26 또는 5 내지 25 L/mol의 반응 용매 부피 조건 하에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 5 내지 25 L/mol의 반응 용매 부피 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 중간체 B를 수득하는 단계는, 5 내지 40, 6 내지 40, 7 내지 40, 8 내지 40, 9 내지 40, 10 내지 40, 10 내지 39, 10 내지 38, 10 내지 37, 10 내지 36, 10 내지 35, 10 내지 34, 10 내지 33, 10 내지 32, 10 내지 31 또는 10 내지 30℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 10 내지 30℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는, 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt), 에틸하이드록시이미노시아노아세테이트(Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-디이소프로필카보디이미드(N,N'-Diisopropylcarbodiimide, DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride, EDC·HCl), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4-(3H)-원(3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT), 비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridinium-3-oxidde hexafluorophosphate, HATU), O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플르오로포스페이트(O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HCTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오르보레이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate, TBTU), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로벤조트리아조륨-3-옥사이드-테트라플루오로보레이트(1-[Bis(dimethylamino)methylen]-5-chlorobenzotriazolium 3-oxide tetrafluoroborate, TCTU), N-[[[1-시아노-2-에톡시-2-오소에틸아이덴]아미노]옥시](다메틸아미노)메틸렌]-N-메틸-메탄아미늄 테트라플루오로보레이트(N-[[[(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy](dimethylamino)methylene]-N-methyl-methanaminium tetrafluoroborate, TOTU), 2-(2-피리돈-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(2-(2-Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TPTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트(N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate, HBTU) 또는 이들의 조합을 포함하는 커플링 시약 존재 하에 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는 0.5 내지 4, 0.5 내지 3.9, 0.5 내지 3.8, 0.5 내지 3.7, 0.5 내지 3.6, 0.5 내지 3.5, 0.5 내지 3.4, 0.5 내지 3.3, 0.5 내지 3.2, 0.5 내지 3.1, 0.5 내지 3, 0.5 내지 2.9, 0.5 내지 2.8, 0.5 내지 2.7, 0.5 내지 2.6, 0.5 내지 2.5, 1 내지 4, 1 내지 3.9, 1 내지 3.8, 1 내지 3.7, 1 내지 3.6, 1 내지 3.5, 1 내지 3.4, 1 내지 3.3, 1 내지 3.2, 1 내지 3.1, 1 내지 3, 1 내지 2.9, 1 내지 2.8, 1 내지 2.7, 1 내지 2.6 또는 1 내지 2.5 당량의 EDC·HCl 존재 하에 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 1 내지 2.5 당량의 EDC·HCl 존재 하에 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는 0.2 내지 3, 0.3 내지 3, 0.4 내지 3, 0.5 내지 3, 0.5 내지 2.9, 0.5 내지 2.8, 0.5 내지 2.7, 0.5 내지 2.6, 0.5 내지 2.5, 0.5 내지 2.4, 0.5 내지 2.3, 0.5 내지 2.2, 0.5 내지 2.1 또는 0.5 내지 2 당량의 HOAt 존재 하에 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 0.5 내지 2 당량의 HOAt 존재 하에 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는, 상기 중간체 A와 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2 당량의 중간체 B를 수렴합성하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는, 상기 중간체 A와 중간체 B를 1.5 내지 10, 1.5 내지 9.5, 1.5 내지 9, 1.5 내지 8.5, 1.5 내지 8, 1.5 내지 7.5, 1.5 내지 7, 1.5 내지 6.5, 1.5 내지 6, 1.5 내지 5.5, 1.5 내지 5, 1.5 내지 4.5, 1.5 내지 4, 1.5 내지 3.5, 1.5 내지 3 또는 1.5 내지 2.5 당량의 커플링 시약 존재 하에서 수렴합성하는 단계를 포함하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 1.5 내지 2.5 당량의 커플링 시약 존재 하에서 수렴합성하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는, 상기 중간체 A와 중간체 B를 상기 커플링 시약 존재 하에서 수렴합성 반응시키는 단계; 및 이의 반응용액에 DCM, MTBE 또는 이들의 조합을 혼합하여 고체화하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 고체화하는 단계는 질소기류 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 고체화하는 단계는 상기 반응용액에 DCM과 MTBE를 1:10 내지 10:1, 1:9 내지 9:1, 1:8 내지 8:1, 1:7 내지 7:1, 1:6 내지 6:1, 1:5 내지 5:1, 1:4 내지 4:1, 1:3 내지 3:1 또는 1:2 내지 2:1의 부피비(v/v)로 혼합하여 고체화하는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 1:2 내지 2:1의 부피비(v/v)로 혼합하여 고체화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법에 있어서, 상기 고체화하는 단계는 5 내지 30, 5 내지 29, 5 내지 28, 5 내지 27, 5 내지 26, 5 내지 25, 5 내지 24, 5 내지 23, 5 내지 22, 5 내지 21, 5 내지 20, 6 내지 20, 7 내지 20, 8 내지 20, 9 내지 20 또는 10 내지 20℃ 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 10 내지 20℃ 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 따를 때, 가니렐릭스를 고순도 및 고수율로 수득할 수 있고, 이의 상업적 대량 생산 공정이 가능할 뿐만 아니라 종래기술 대비 생산 비용 절감의 경제적 효과를 제공하며, 종래기술 대비 보다 안전하게 대량의 가니렐릭스를 수득할 수 있다.
다만, 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명에 따른 고상합성법 기반의 가니렐릭스(GNA, TFA form)의 선형 합성법(Linear synthesis)의 제조 공정 흐름도를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 GNA N4와 GNA C6와의 가니렐릭스(GNA, TFA form)의 수렴 합성법의 제조 공정 흐름도를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 GNA N5와 GNA C5와의 가니렐릭스(GNA, TFA form)의 수렴 합성법의 제조 공정 흐름도를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 GNA N5와 GNA C5와의 초산 가니렐릭스(GNA·2AcOH)의 수렴 합성법의 확립된 제조 공정 흐름도를 나타낸 도면이다.
도 5. GNA N5의 두번째 아미노산(Fmoc-Ser(tBu)-OH) 커플링 시 DIEA 당량 증가에 따른 유연물질 변화 곡선을 나타낸 도면이다.
도 6. GNA N5의 3번째 아미노산 커플링 단계에서 아세틸화 단계까지의 아미노산 당량 변화에 따른 순도 변화 곡선을 나타낸 도면이다.
도 7은 GNA N5의 MALDI-TOF Mass를 나타낸 도면이다.
도 8은 GNA C5의 MALDI-TOF Mass를 나타낸 도면이다.
도 9은 GNA의 MALDI-TOF Mass를 나타낸 도면이다.
이하, 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 하기 실시예는 예시적인 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 선형합성에 의한 가니렐릭스의 제조
1. 불림(Swelling)
반응기에 15.9 g의 Rink amide MBHA resin(4-Methylbenzhydrylamine resin; 10 mmol, Loading capacity: 0.631 mmol/g)을 넣는다. 여기에 DCM 200 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 30 분 동안 교반 한 다음 용매를 제거한다.
2. Fmoc-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-Ala-OH(6.3 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
3. Fmoc-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Pro-OH(6.8 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
4. Fmoc-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-hArg(Et)2-OH(10.1 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
5. Fmoc-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Leu-OH(7.1 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
6. Fmoc-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-hArg(Et)2-OH(10.1 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
7. Fmoc-Tyr(tBu)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Tyr(tBu)-OH(9.3 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
8. Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH(7.7 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
9. Fmoc-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-3-Pal-OH(7.8 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
10. Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH(8.5 g, 2.0 eq)과 HOBt(3.0 g, 2.2 eq)를 DMF 100 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(2.5 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
11. Fmoc-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-2-Nal-OH(13.2 g, 3.0 eq)과 HOBt(4.5 g, 3.3 eq)를 DMF 150 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(4.5 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 150 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
12. Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 150 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 150 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. DIEA(3.9g, 3.0 eq)를 DMF 150 mL에 용해하여 반응기에 투입하고 무수 아세트산(Acetic anhydride; 3.1 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF(150 mL)로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DCM(150 mL)으로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. 진공 하에서 레진을 건조한 후, 하기 화학식 1(또는 화학식 12)로 표시되는 펩타이드를 수득한다(화학식 12: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(R1)-Tyr(R1)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin).
[화학식 1]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000001
13. Global cleavage
건조된 레진에 냉각된 cleavage 용액(TFA : TIS : H2O = 95% : 2.5% : 2.5%, v/v) 350 mL를 서서히 가하고 15 - 30 ℃에서 5시간 동안 교반한다. Global cleavage 반응 3시간 후 HPLC 분석을 통해 반응 종결을 확인 후 cleavage 용액을 drain하여 회수한다. 회수한 cleavage 용액을 냉각된 디에틸에터(diethyl ether; cleavage 용액 : diethyl ether = 1 : 5 (300 mL : 1500 mL))에 서서히 적가하여 고체화하고 30분 동안 교반한다. 상기 현탁액을 감압 여과하고 MTBE 1500 mL로 세척(500 mL x 3회) 후 건조한다. 화학식 2(또는 화학식 13)의 GNA(TFA salt form, 분자량: 1570.35, 순도: 46.7%, 수율: 90.1%) 14.15 g을 수득하였다(화학식 13: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2). 전체 공정 흐름도는 도 1에 나타내었다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000002
실시예 2. [4+6] 수렴합성에 의한 가니렐릭스의 제조
1. GNA N4의 합성
(1) 불림(Swelling)
반응기에 85.7 g의 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(2-Chlorotrityl chloride resin; 120 mmol, Loading capacity: 1.4 mmol/g)을 넣는다. 여기에 DCM 1.2 L(10 L/mol)을 넣고 20 - 30 ℃에서 30분 동안 교반한 다음 용매를 제거한다.
(2) Fmoc-Ser(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc-Ser(tBu)-OH(92.0 g, 2.0 eq)과 DIEA(62.0 g, 4.0 eq)을 DCM 1.2L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(31.6 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 이 용액을 반응기에 첨가한 후 20 - 30 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DCM 1.0L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. 반응기에 캡핑(capping) 용액(DCM : MeOH : DIEA = 85 : 10 : 5, v/v) 1.0L을 넣고 20 - 30 ℃에서 10분간 교반 한다. 캡핑을 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DCM 1.0 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(3) Fmoc-D-3-Pal-Ser(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF)를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 1.1 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 1.1 L으로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. Fmoc-D-3-Pal-OH(87.8 g, 2.0 eq)과 HOBt(30.5 g, 2.0 eq), DIEA(37.6 g, eq)를 DMF 1.1L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(31.0 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 1.1 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(4) Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF)를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 1.1 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 1.1 L으로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH(95.3 g, 2.0 eq)과 HOBt(30.5 g, 2.0 eq)를 DMF 1.1 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(31.0 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 1.1 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(5) Fmoc-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF)를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 1.1 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 1.1 L으로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. Fmoc-D-2-Nal-OH(148.3 g, 3.0 eq)과 HOBt(45.8 g, 3.0 eq)를 DMF 1.1 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(46.4 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반 한다. 반응액을 제거하고 DMF 1.1 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(6) Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF)를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 1.1 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 1.1 L으로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. 무수 아세트산(35.2 g, 3.0 eq)를 DMF 1.1 L에 용해하여 반응기에 투입하고 DIEA(43.6 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 1.1 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DCM 1.1 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. 진공 하에서 레진을 건조하여, 하기 화학식 3(또는 화학식 14)로 표시되는 펩타이드를 수득한다(화학식 14: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(R1)-O-resin)
[화학식 3]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000003
(7) GNA N4(TFA salt) 제조를 위한 global cleavage 반응
건조된 레진에 냉각된 cleavage 용액(TFA : DCM : H2O = 70 : 29 : 1, v/v) 3.0 L를 서서히 가하고 15 - 30 ℃에서 3시간 동안 교반한다. Global cleavage 반응 3시간 후 HPLC 분석을 통해 반응 종결을 확인 후 cleavage 용액을 drain하여 회수한다. 반응액을 냉각된 디에틸 에터 15 L(Cleavage 반응액 : diethyl ether = 1 : 5)를 적가하여 고체화하고 30분 동안 교반한다. 상기 현탁액을 감압 여과하고 디에틸 에터로 세척(5.0 L x 3 회) 후 15시간 이상 질소 진공 건조하여 화학식 4의 GNA N4(TFA salt form, 분자량: 674.15 g/mol, 순도: 95.5%, 수율: 94.6 %) 76.5 g을 수득하였다(화학식 15: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-OH).
[화학식 4]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000004
2. GNA C6
(1) 불림(Swelling)
반응기에 31.3 g의 Rink amide MBHA 레진(20 mmol, Loading capacity: 0.64 mmol/g)을 넣는다. 여기에 DCM 400 mL를 넣고 20 - 30 ℃에서 30분 동안 교반한 다음 용매를 제거한다.
(2) Fmoc-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 400 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 400 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-Ala-OH(12.4 g, 2.0 eq)과 HOBt(5.9 g, 2.2 eq)를 DMF 400 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(6.3 mL, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 400 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(3) Fmoc-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 400 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 400 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Pro-OH(13.5 g, 2.0 eq)과 HOBt(5.9 g, 2.2 eq)를 DMF 400 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(5.0 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 400 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(4) Fmoc-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 400 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 400 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-hArg(Et)2-OH(20.1 g, 2.0 eq)과 HOBt(5.9 g, 2.2 eq)를 DMF 400 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(5.0 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 400 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(5) Fmoc-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 400 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 400 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Leu-OH(14.1 g, 2.0 eq)과 HOBt(5.9 g, 2.2 eq)를 DMF 400 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(5.0 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 400 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(6) Fmoc-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 400 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 400 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-hArg(Et)2-OH(20.1 g, 2.0 eq)과 HOBt(5.9 g, 2.2 eq)를 DMF 400 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(5.0 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 400 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(7) Fmoc-Tyr(tBu)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 400 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 400 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Tyr(tBu)-OH(18.4 g, 2.0 eq)과 HOBt(5.9 g, 2.2 eq)를 DMF 400 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(5.0 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 400 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 400 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 10분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 400 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 400 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. 레진을 질소 건조한 후, 화학식 5(또는 화학식 16)로 표시되는 펩타이드를 수득한다(화학식 16: H2N-Tyr(R1)-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin).
[화학식 5]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000005
(8) Global cleavage 반응
건조된 레진에 냉각된 cleavage 용액(TFA : DCM : H2O= 70% : 29% : 1%, v/v) 600 mL를 서서히 가하고 15 - 30 ℃에서 3시간 동안 교반한다. Global cleavage 반응 3시간 후 반응 종결을 HPLC로 확인 후 cleavage 용액을 drain하여 회수한다. 회수한 cleavage 용액을 냉각된 디에틸 에터 2.5 L 서서히 적가하여 고체화하고 30분 동안 교반한다. 상기 현탁액을 원심분리기로 고체를 분리하고 건조하여 화학식 6의 GNA C6(TFA salt form, 분자량: 914.2 g/mol, 순도: 82.9%, 수율: 98.4%) 18 g을 수득하였다(화학식 17: H2N-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2).
[화학식 6]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000006
3. GNA 수렴합성
반응기에 GNA N4(합성 scale: 2.55 mmol, 1.72 g, 1.0 eq)을 DMF(15.5 mL)에 교반하여 완전히 용해한다. GNA C6(3.0 g, 1.29 eq)와 HOAt(0.55 g, 1.58 eq)를 넣고 완전히 용해한다. 반응액 내부 온도를 Ice bath로 0℃로 냉각시킨 후, DIEA(0.66 g, 2.0 eq)을 첨가한다. EDC·HCl(0.77 g, 1.58 eq)를 DMF(4.5 mL)에 넣고 DIEA(0.66 g, 2.0 eq.)를 넣어 완전히 용해한다. EDC·HCl가 용해된 용액을 천천히 적가한 후, Ice bath를 제거하고 3시간 동안 교반한다. 반응액을 drain하여 회수하고 혼합 용매(200.0 mL, diethyl ether : DCM = 1 : 1, v/v)에 서서히 첨가하여 0-3 ℃에서 30분 동안 교반 한다(반응액 : 혼합 용매 = 1 : 10). 석출된 고체를 얻기 위해 필터 및 세척(diethyl ether, 1000 mL x 2) 한 후 진공 건조(4 h)하여 화학식 2의 GNA(TFA salt form, 분자량: 1570.35 g/mol, 순도: 77.3%, 수율: 112.5%) 4.5 g을 수득하였다(화학식 13: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2). 전체 공정 흐름도는 도 2에 나타내었다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000007
실시예 3. [5+5] 수렴합성에 의한 가니렐릭스의 제조
1. GNA N5
(1) 불림(Swelling)
반응기에 67.6 g의 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(2-Chlorotrityl chloride resin; 100 mmol, Loading capacity: 1.48 mmol/g)을 넣는다. 여기에 DCM 1.25 L을 넣고 20 - 30 ℃에서 30분 동안 교반한 다음 용매를 제거한다.
(2) Fmoc-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc-Tyr(tBu)-OH(114.9 g, 2.5 eq)과 DIEA(51.7 g, 4.0 eq)를 DCM 1.25 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 첨가한 후 20 - 30 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DCM 1.25 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1 회 더 반복한다. 반응기에 캡핑 용액(DCM : MeOH : DIEA = 85 : 10 : 5, v/v) 1.25 L을 넣고 20 - 30 ℃에서 15분간 교반한다. 캡핑을 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DCM 1.25 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DMF 1.25 L으로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(3) Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 1.25 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 1.25 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 1.25 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DMF 1.25 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH(64.8 g, 2.5 eq)과 HOBt(25.1 g, 2.75 eq), DIEA(8.7 g, 1.0 eq)을 DMF 845 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(21.3 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 845 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(4) Fmoc-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 845 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 845 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 845 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DMF 845 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. Fmoc-D-3-Pal-OH(52.5 g, 2.0 eq)과 HOBt(20.1 g, 2.2 eq)를 DMF 675 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(17.1 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 675 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(5) Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 675 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DMF 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH(57.0 g, 2.0 eq)과 HOBt(20.1 g, 2.2 eq)를 DMF 675 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(17.1 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 675 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(6) Fmoc-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 675 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DMF 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. Fmoc-D-2-Nal-OH(59.1 g, 2.0 eq)과 HOBt(20.1 g, 2.2 eq)를 DMF 675 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(17.1 g, 2.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 675 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(7) Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 675 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DMF 675 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. DIEA(25.9 g, 2.0 eq)를 DMF 675 mL에 용해하여 반응기에 투입하고 무수 아세트산(20.4 g, 2.0 eq)을 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 2시간 동안 교반 한다. 반응액을 제거하고 DMF(675 mL)로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM(675 mL)으로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. 레진을 질소 건조한 후, 화학식 7(또는 화학식 18)로 표시되는 펩타이드를 수득한다(화학식 18: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(R1)-Tyr(R1)-O-Resin).
[화학식 7]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000008
(8) GNA N5(TFA salt) 제조를 위한 global cleavage 반응
건조된 레진에 냉각된 cleavage 용액(TFA : TIS : H2O = 95% : 2.5% : 2.5%, v/v) 3.0 L를 서서히 가하고 15 - 30 ℃에서 3시간 동안 교반한다. Global cleavage 반응 2시간 후 HPLC 분석을 통해 반응 종결을 확인 후 cleavage 용액을 drain하여 회수한다. 회수한 cleavage 용액을 1 L까지 감압 농축한다. 10 ℃로 냉각된 디에틸 에터 10 L(Cleavage 반응 농축액 : diethyl ether = 1 : 10)에 농축된 cleavage 용액을 천천히 적가하여 고체화하고 1시간 동안 교반한다. 상기 현탁액을 감압 여과하고 디에틸 에터 5 L로 세척 후 24시간 이상 질소 건조하여 화학식 8의 GNA N5(TFA salt form, 분자량: 837.33 g/mol, 순도: 94.7%, 수율: 124.7%) 104.4 g을 수득하였다(화학식 19: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-OH).
[화학식 8]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000009
2. GNA C5
(1) 불림(Swelling)
반응기에 15.9 g의 Rink amide MBHA 레진(10 mmol, Loading capacity: 0.631 mmol/g)을 넣는다. 여기에 DCM 200 mL을 넣고 20 - 30 ℃에서 30분 동안 교반한 다음 용매를 제거한다.
(2) Fmoc-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-Ala-OH(7.9 g, 2.5 eq)과 HOBt(3.8 g, 2.75 eq)를 DMF 250 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(3.2 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응 4시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(3) Fmoc-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Pro-OH(8.5 g, 2.5 eq)과 HOBt(3.8 g, 2.75 eq)를 DMF 250 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(3.2 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(4) Fmoc-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-hArg(Et)2-OH(12.7 g, 2.5 eq)과 HOBt(3.8 g, 2.75 eq)를 DMF 250 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(3.2 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(5) Fmoc-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Leu-OH(8.9 g, 2.5 eq)과 HOBt(3.8 g, 2.75 eq)를 DMF 250 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(3.2 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
(6) Fmoc-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-hArg(Et)2-OH(12.7 g, 2.5 eq)과 HOBt(3.8 g, 2.75 eq)를 DMF 250 mL에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(3.2 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반 한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 100 mL로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 100 mL를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. DCM 100 mL로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. 레진을 질소 건조한 후, 화학식 9(또는 화학식 20)로 표시되는 펩타이드를 수득한다(화학식 20: H2N-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin).
[화학식 9]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000010
(7) GNA C5(TFA salt) 제조를 위한 global cleavage 반응
건조된 레진에 냉각된 cleavage 용액(TFA : DCM : H2O= 70 : 27.5 : 2.5, v/v) 300 mL를 서서히 가하고 15 - 30 ℃에서 3시간 동안 교반한다. Global cleavage 반응 3시간 후 반응 종결을 HPLC로 확인 후 cleavage 용액을 drain하여 회수한다. 회수한 cleavage 용액을 30 mL까지 감압 농축한다. -5 ℃로 냉각된 디에틸 에터 600 mL(Cleavage 반응 농축액 : diethyl ether = 1 : 20)에 농축된 cleavage 용액을 천천히 적가하여 고체화하고 30분 동안 교반한다. 상기 현탁액을 감압 여과하고 디에틸 에터 200 mL로 2회 세척 후 건조하여 화학식 10의 GNA C5(TFA salt form, 분자량: 751.04 g/mol, 순도: 82.9%, 수율: 149.3%) 11.2 g을 수득하였다(화학식 21: H2N-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2).
[화학식 10]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000011
3. GNA 수렴합성
GNA N5(합성 scale: 3.7 mmol, 3.1 g, 1.0 eq)과 HOAt(0.67 g, 1.33 eq)을 DMF 26 mL에 용해한다. GNA C5(4.28 g, 1.54 eq)를 넣어 녹인 후 DIEA(0.42 g, 0.88 eq)을 천천히 넣어주고 Ice bath 하여 반응액 내부의 온도를 0 - 3 ℃로 냉각시킨다. EDC·HCl(1.25 g, 1.76 eq)와 DIEA(0.84 g, 1.76 eq)을 DCM 6.5 mL에 완전히 용해하고 Ice bath 하여 용액 내부의 온도를 0 - 3 ℃로 냉각시킨다. 0 - 3 ℃에서 반응액에 EDC·HCl가 용해된 DCM 용액을 천천히 첨가한 후 10 - 25 ℃에서 1시간 이상 교반한다. 반응액을 drain하여 회수하고 10 ℃ 이하로 냉각된 MTBE : DCM = 1 : 1(v/v) 용액 325 mL에 반응액을 첨가하고 30분 동안 교반한다. 석출된 고체를 얻기 위해 상기 용액을 감압 여과하고 MTBE : DCM = 1 : 1(v/v) 용액 160 mL로 세척 후 15시간 이상 질소 건조하여 화학식 2의 GNA(TFA salt form, 분자량: 1570.35 g/mol, 순도: 84.4%, 수율: 108.6%) 6.3 g을 수득하였다(화학식 13: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2). 전체 공정 흐름도는 도 3에 나타내었다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000012
상기 실시예 1 내지 3의 실험결과를 하기 표 1에 정리하여 나타내었다. 이 중, 실시예 3의 실험결과가 가장 우수하다고 판단하여, 이에 대한 후속연구를 진행하였다.
합성법 Scale 비정제품
합성 수율 순도
1 선형합성 10 mmol 90.1% 46.7%
2 [4+6] 수렴합성 2.55 mmol 112.5% 77.3%
3 [5+5] 수렴합성 3.7 mmol 108.6% 84.4%
실험예 1. 중간체 형태에 대한 연구
중간체(GNA N5, GNA C5)의 정제 여부에 따라 수렴 합성 시 가니렐릭스(GNA, TFA form)의 순도를 평가하여 각 중간체의 형태를 결정하였다. GNA N5의 경우, 비정제품 또는 정제품을 사용하는 경우 비슷한 순도의 가니렐릭스(GNA, TFA form)를 수득하였다(하기 표 2, 실험 1, 2/실험 3, 4). 반면 GNA C5의 경우, 정제품을 사용하는 경우 보다 높은 순도의 가니렐릭스(GNA, TFA form)를 수득하였다(하기 표 2, 실험 1, 3/실험 2, 4). 따라서, 이하 후속연구에 있어서, GNA N5는 비정제품으로, GNA C5는 정제품으로 수렴합성에 의한 제조 공정을 확립하였으며, 이에 대한 공정 흐름도는 도 4에 나타내었다.
실험 중간체 가니렐릭스
합성 수율 순도
1 GNA C5(정제품; 순도 99.5%)
GNA N5(정제품; 순도 98.8%)		 125.0% 96.6%
2 GNA C5(정제품; 순도 99.5%)
GNA N5(비정제품; 순도 96.4%)		 118.8% 97.2%
3 GNA C5(비정제품; 순도 92.3%)
GNA N5(정제품; 98.8%)		 131.3% 93.8%
4 GNA C5(비정제품; 90.4%)
GNA N5(비정제품; 순도 96.7%)		 127.7% 92.1%
실험예 2. GNA N5의 대량합성 가능성 확인
1. 불림(Swelling)
반응기에 68.5 g의 2-클로로트리틸 클로라이드 레진(2-Chlorotrityl chloride resin; 100 mmol, Loading capacity: 1.46 mmol/g)을 넣는다. 여기에 DCM 2.0 L(20 L/mol)을 넣고 20 - 30 ℃에서 30분 동안 교반한 다음 용매를 제거한다.
2. Fmoc-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc-Tyr(tBu)-OH(160.8 g, 3.5 eq)과 DIEA(90.5 g, 7.0 eq)를 DCM 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 첨가한 후 20 - 30 ℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DCM 2.0 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. 반응기에 캡핑 용액(DCM : MeOH : DIEA = 85 : 10 : 5, v/v) 2.0 L을 넣고 20 - 30 ℃에서 15분 간 교반한다. 캡핑을 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DCM 2.0 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. DMF 2.0 L으로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
3. Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분 간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Ser(tBu)-OH(95.9 g, 2.5 eq)과 Oxyma(39.1 g, 2.75 eq), DIEA(19.4 g, 1.5 eq)을 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(31.6 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
4. Fmoc-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분 간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-3-Pal-OH(97.1 g, 2.5 eq)과 Oxyma(39.1 g, 2.75 eq)를 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(31.6 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
5. Fmoc-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분 간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH(105.5 g, 2.5 eq)과 Oxyma(39.1 g, 2.75 eq)를 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(31.6 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1 회 더 반복한다.
6. Fmoc-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-2-Nal-OH(109.4 g, 2.5 eq)과 Oxyma(39.1 g, 2.75 eq)를 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(31.6 g, 2.5 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
7. Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-O-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. DIEA(32.3 g, 2.5 eq)를 DMF 2.0 L에 용해하여 반응기에 투입하고 무수 아세트산(25.5 g, 2.5 eq)을 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 제거하고 DMF(2.0 L)로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM(2.0 L)으로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. 진공 하에서 레진을 건조한다.
8. GNA N5(TFA salt) 제조를 위한 global cleavage 반응
건조된 레진에 냉각된 cleavage 용액(TFA : TIS : H2O = 95 : 2.5 : 2.5, v/v) 3.0 L를 서서히 가하고 15 - 30 ℃에서 3시간 동안 교반한다. Global cleavage 반응 3시간 후 HPLC 분석을 통해 반응 종결을 확인 후 cleavage 용액을 drain하여 회수한다. 회수한 cleavage 용액을 30% 이하로 감압 농축한다. 농축된 cleavage 용액에 냉각된 MTBE 15 L(Cleavage 반응액 : MTBE = 1 : 5)를 적가 하여 고체화하고 30분 동안 교반한다. 상기 현탁액을 감압 여과하고 MTBE 5.0 L로 세척(5.0 L x 3회) 후 15시간 이상 질소 건조한다. GNA N5 3 batch에 대한 수득량(96.8 g, 98.0 g, 83.6 g), 합성 수율(115.7%, 117.1%, 99.9%) 및 crude의 순도(96.3%, 96.4%, 94.8%)는 모두 재현성 있게 제조됨을 확인하였다(하기 표 3 참조). 이때, 합성된 GNA N5의 분자량은 837.33 g/mol(monoisotopic mass: 836.29 g/mol)이다. MALDI-TOF Mass 장비로 측정된 분자량 [M+H]+은 837.22 g/mol이다(도 7 참조).
합성 수득량 합성 수율 순도
1st batch 96.8 g 115.7% 96.3%
2nd batch 98.0 g 117.1% 96.4%
3rd batch 83.6 g 99.9% 94.8%
** 합성 scale: 100 mmol
실험예 3. GNA C5의 대량합성 가능성 확인
1. 불림(Swelling)
반응기에 153.8 g의 Rink amide MBHA 레진(100 mmol, Loading capacity: 0.65 mmol/g)을 넣는다. 여기에 DCM 2.0 L(20 L/mol)을 넣고 20 - 30 ℃에서 30분 동안 교반한 다음 용매를 제거한다.
2. Fmoc-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-Ala-OH(93.4 g, 3.0 eq)과 Oxyma(46.9 g, 3.3 eq)를 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(37.9 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
3. Fmoc-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반 한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 - 30 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Pro-OH(101.2 g, 3.0 eq)과 Oxyma(46.9 g, 3.3 eq)를 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(37.9 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
4. Fmoc-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-hArg(Et)2-OH(150.9 g, 3.0 eq)과 Oxyma(46.9 g, 3.3 eq)를 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(37.9 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
5. Fmoc-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-Leu-OH(106.0 g, 3.0 eq)과 Oxyma(46.9 g, 3.3 eq)를 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(37.9 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다.
6. Fmoc-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin의 제조
Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 레진을 DMF 2.0 L로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 5회 더 반복한다. Fmoc-D-hArg(Et)2-OH(150.9 g, 3.0 eq)과 Oxyma(46.9 g, 3.3 eq)를 DMF 2.0 L에 용해한다. 이 용액을 반응기에 투입하고 DIC(37.9 g, 3.0 eq)를 첨가한 후 20 ± 5 ℃에서 3시간 동안 교반한다. 반응 3시간 후 반응액을 제거하고 DMF 2.0 L로 2분 동안 세척한다. 세척을 1회 더 반복한다. Fmoc을 제거하기 위해 반응기에 20% 피페리딘(piperidine in DMF) 2.0 L를 넣고 20 ± 5 ℃에서 15분간 교반한다. 1회 더 반복한다. 반응액을 제거하고 DMF(2.0 L)로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. DCM(2.0 L)으로 20 ± 5 ℃에서 2분 동안 세척한다. 세척을 2회 더 반복한다. 진공 하에서 레진을 건조한다.
7. GNA C5(TFA salt) 제조를 위한 global cleavage 반응
건조된 레진에 냉각된 cleavage 용액(TFA : DCM = 4 : 6, v/v) 3.0 L를 서서히 가하고 15 - 30 ℃에서 3시간 동안 교반한다. Global cleavage 반응 2시간 후 반응 종결을 HPLC로 확인 후 cleavage 용액을 drain하여 회수한다. Cleavage 반응액 3.0 L를 5℃로 냉각된 MTBE 30 L(Cleavage 반응액 : MTBE = 1: 10)에 cleavage액을 서서히 첨가하고 30분 동안 교반한다. 석출된 고체를 얻기 위해 상기 용액을 감압 여과하고 MTBE 3.5 L로 3회 세척 후 15 시간 이상 질소 건조한다. GNA C5 3 batch에 대한 수득량(89.4 g, 82.0 g, 87.1 g), 합성 수율(119.0%, 109.2%, 116.0%) 및 crude의 순도(90.3%, 89.4%, 89.4%) 모두 재현성 있게 제조됨을 확인하였다(하기 표 4 참조). 이때, 합성된 GNA C5의 분자량은 751.04 g/mol(monoisotopic mass: 750.56 g/mol)이다. MALDI-TOF 장비로 측정된 분자량[M+H]+은 751.62 g/mol이다(도 8 참조).
합성 수득량 합성 수율 순도
1st batch 89.4 g 119.0% 90.3%
2nd batch 82.0 g 109.2% 89.4%
3rd batch 87.1 g 116.0% 89.4%
** 합성 scale: 100 mmol
8. GNA C5의 정제
GNA C5 crude를 0.1 g/mL 농도로 정제수에 넣고 완전히 용해한다. GF/C 필터 및 0.45 μm HVHP 멤브레인 필터로 여과한 후 컬럼에 주입하여 정제한다. 정제 및 동결건조 후 GNA C5 3 batch에 대한 수득량(49.3 g, 47.2 g, 48.5 g), 정제 수율(55.1%, 57.6%, 55.7%) 및 순도(99.1%, 99.0%, 99.0%)이다(하기 표 5 참조).
정제 수득량 정제 수율 순도
1st batch 49.3 g 55.1% 99.1%
2nd batch 47.2 g 57.6% 99.0%
3rd batch 48.5 g 55.7% 99.0%
실험예 4. 초산 가니렐릭스의 대량 합성 가능성 확인
1. GNA 수렴 합성
GNA C5(합성 scale: 34.04 mmol, 39.4 g, 1.54 eq)과 HOAt(6.1 g, 1.32 eq)을 DMF 480 mL에 용해한다. 반응액에 GNA N5(28.5 g, 1.0 eq)를 천천히 넣어 용해하고 콜리딘(Collidine 8.0 g, 1.94 eq)을 첨가한다. EDC·HCl(11.5 g, 1.76 eq)와 DIEA(7.8 g, 1.76 eq)을 DCM 120 mL에 완전히 용해한다. 0 - 10 ℃에서 반응액에 EDC·HCl가 용해된 DCM 용액을 넣어 10분간 교반 후 10 - 25 ℃에서 1시간 이상 교반한다. 반응액을 drain하여 회수하고 10℃ 이하로 냉각된 MTBE : DCM = 1 : 1(v/v) 용액 6.0 L에 반응액을 첨가하고 30분 동안 교반한다. 석출된 고체를 얻기 위해 상기 용액을 감압 여과하고 MTBE : DCM = 1 : 1(v/v) 용액 3.0 L로 세척 후 15시간 이상 질소 건조하고 GNA crude를 수득하였다. GNA crude(3 batch)에 대한 수득량(52.3 g, 48.6 g, 51.5 g), 합성 수율(97.8%, 90.9%, 96.4%)과 순도(96.8%, 96.2%, 97.1%)이다(하기 표 6 참조). 이때, 합성된 GNA의 분자량은 1570.35 g/mol(monoisotopic mass: 1568.84 g/mol)이다. MALDI-TOF 장비로 측정된 분자량[M +H]+은 1570.039 g/mol이다(도 9 참조).
합성 수득량 합성 수율 순도
1st batch 52.3 g 97.8% 96.8%
2nd batch 48.6 g 90.9% 96.2%
3rd batch 51.5 g 96.4% 97.1%
** 합성 scale: 34.04 mmol
2. Crude GNA의 정제, 염 치환 및 동결건조
GNA crude 12.5 mg/mL 농도로 20% 아세토나이트릴(ACN)에 완전히 용해한다. GF/C 필터 및 0.45 μm HVHP 멤브레인 필터로 여과한 후, 정제 컬럼에 주입하여 정제한다. 정제, 염 치환 및 동결건조 후 GNA(GNA·2AcOH; 화학식 11 또는 22로 표시되는 펩타이드; 3 batch)에 대한 수득량(19.6 g, 26.1 g, 19.3 g), 수율(39.2%, 58.0%, 57.6%) 및 순도(99.8%, 99.8%, 99.7%)이다(하기 표 7 참조)(화학식 22: Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2·2AcOH).
[화학식 11]
Figure PCTKR2022019416-appb-img-000013
정제 수득량 정제 수율 순도
1st batch 19.6 g 39.2% 99.8%
2nd batch 26.1 g 58.0% 99.8%
3rd batch 19.3 g 57.6% 99.7%
실험예 5. 실시예 3-1의 GNA N5 합성공정 최적화
1. 첫번째 아미노산 로딩 조건
고상 지지체(2-Chlorotrityl chloride resin, CTC resin)에 첫번째 아미노산을 로딩 하는 단계는 생산성(합성 수율)과 관계가 있기 때문에 GNA N5의 합성 수율에 영향을 미친다. 따라서 첫번째 아미노산(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)의 로딩 비율를 높이기 위한 방안으로 첫번째 아미노산 당량을 1.5 ~ 5.0 eq까지 스크리닝 하였다. 합성에 사용된 CTC 레진의 치환률은 1.48 mmol/g이고 스케일은 10 mmol이다. 합성은 상온(25℃)에서 4시간 동안 반응하였다.
아미노산의 당량이 1.5 당량에서 3.0 ~ 4.0 당량까지 증가할수록 로딩 비율이 0.75 mmol/g에서 0.84 mmol/g으로 증가하고, 5.0 eq일 때는 0.78 mmol/g으로 감소하는 경향을 보인다(하기 표 8 참조). 따라서 첫번째 아미노산인 Fmoc-Tyr(tBu)-OH의 당량은 3.5 eq으로 최적화하였다.
아미노산 당량
1.5 eq 2.0 eq 2.5 eq 3.0 eq 4.0 eq 5.0 eq
로딩비율
(mmol/g) 		0.75 0.76 0.79 0.84 0.84 0.78
2. 두번째 아미노산 커플링 조건
두번째 아미노산(Fmoc-Ser(tBu)-OH) 커플링 시 HPLC 분석을 통해 RRT 1.45(RT 10.8 min)에서 미지의 유연물질이 11.2%로 생성되는 것을 확인되었다. 이는 최종 GNA N5 및 GNA 품질(순도)에 영향을 미칠 수 있으므로 임퓨리티(impurity)를 최소화하기 위한 최적화 연구를 진행하였다.
두번째 아미노산 커플링 시 base를 첨가하여 유연물질 발생을 최소화하고자 하였다. 몇 가지 base를 사용하여 순도에 미치는 영향을 관찰하였다. 이때 사용한 base의 종류는 2,4,6-collidine, DIEA, TEA이다(Basicity: 2,4,6-collidine < DIEA < TEA).
실험 결과는 하기 표 9에 정리하였다. DIEA (2.0 eq)를 사용했을 경우 순도가 93.6%로 가장 높았으며, 미지의 유연물질도 11.2%에서 0.7% 감소하였다.
Base Amino acid HOBt DIC Purity RRT 1.45 impurity
No Base 2.0 eq 2.2 eq 2.0 eq 86.3% 11.2%
Collidine (2.0eq) 83.5% 6.2%
DIEA (2.0 eq) 93.6% 0.7%
TEA (2.0 eq) 90.2% 0.6%
추가적으로 DIEA의 당량 및 두번째 아미노산 당량에 대해서도 최적화 연구를 진행하였다. DIEA는 0 ~ 4.0 당량 범위에서, 두번째 아미노산은 2.0, 2.5, 3.0 당량 범위에서 순도 변화를 관찰하였다. 도 5는 DIEA 당량 증가에 따른 유연물질 변화 곡선을 도시한 것이다. DIEA의 당량이 증가할수록 미지의 유연물질은 감소(도 5, 네모 표시 선 참조)하나 미반응물(출발물질, 1mer)이 13.6%까지 증가로 인해 두번째 아미노산 순도가 감소함을 확인하였다(도 5, 세모 표시 선 참조). 따라서 미지의 유연물질이 최소화되는 DIEA 사용량은 1.5 당량으로 확인되었다.
DIEA 당량의 최적점(1.5 당량)에서도 출발물질이 1.3% 존재하므로 이를 최소화하기 위해 두번째 아미노산의 당량에 대한 최적화 실험을 진행하였다(하기 표 10 참조). 두번째 아미노산이 2.0 당량인 경우 미반응물인 출발물질 잔량이 있었으며 3.0 당량의 경우는 기타 임퓨리티가 증가하여 순도가 낮다. 반면, 두번째 아미노산이 2.5 당량(DIEA: 1.5 당량)일 때는 출발물질의 잔량이 없고 순도가 가장 높기 때문에 두번째 아미노산 커플링 시 사용량은 2.5 당량으로 선정하였다.
Amico acid DIEA HOBt DIC purity RRT 1.45
impurity 		RRT 0.86
Impurity (SM)
2.0 eq 1.5 eq 2.2 eq 2.0 eq 93.2% 0.9% 1.3%
94.2% 1.0% 1.7%
2.5 eq 2.75 eq 2.5 eq 95.9% 1.2% -
95.9% 1.2% -
3.0 eq 3.3 eq 3.0 eq 94.8% 0.8% 0.1%
94.5% 0.9% 0.1%
3. 세번째 이후 아미노산 커플링 조건
세번째 아미노산 내지 다섯번째 아미노산 커플링 단계에서는 특이적인 유연물질이 생성되지 않음을 확인하였다. 하지만 각 아미노산의 당량 부족으로 출발물질(아미노산의 deletion)이 존재할 가능성이 있으므로 아미노산의 당량 최적화 연구를 진행하였다. 이 때의 반응 용매의 사용량은 10 L/mol(반응액 부피/반응 scale)이다. 도 6에서 세번째 아미노산 커플링 단계부터 아세틸화 단계까지 아미노산 당량을 최적화하기 위해 스크리닝을 진행한 결과를 도시하였다. 아미노산 2.0 eq 이하에서는 GNA N5의 순도 저하가 관찰되었으며 2.5 당량 이상에서부터 GNA N5 순도에 차이가 없었다. 따라서 최적화된 아미노산의 당량은 2.5 eq로 선정하였다.
추가적으로 반응 용매 부피에 따른 GNA N5의 순도 평가를 진행하였다. 아미노산과 활성화제(activator)는 2.5 당량을 사용하였다. 반응액을 10 L/mol 또는 20 L/mol을 사용했을 시 순도는 96.7%, 96.8%로 차이가 없었다.
4. 활성화제의 선정
GNA N5 합성 시 활성화제(activator)는 DIC/HOBt를 사용하였다. 그러나 첨가제로 사용된 HOBt는 폭발성 물질로 사용을 지양하는 추세이기 때문에 Oxyma로 대체하기 위한 연구를 진행하였다. 실험 결과, DIC/HOBt와 DIC/Oxyma를 사용하여 각각 합성했을 때의 순도는 95.2%(수율: 128.6%), 94.6%(수율: 133.8%)로 유의미한 차이가 없었다. 따라서 HOBt보다 안전한 활성화제인 Oxyma로 선정하였다.
5. 반응 온도 조건
합성 시 반응 온도에 대한 기준을 설정하기 위해 15, 20, 25, 30 ℃에서 합성하여 순도를 비교하였다(하기 표 11 참조). 온도에 따라 임퓨리티 패턴이 동일하지만 30 ℃에서 주 피크 주변의 3, 5 임퓨리티가 각 0.2%, 2.7%로 다른 온도에 비해 상대적으로 커지는 것을 확인되었다. 따라서 합성 온도 범위를 20 ± 5 ℃로 설정하였다.
Temperature purity Impurity
1 2 3 4 5 6
15 oC 95.3% 0.4% 0.3 0.06 0.3 0.2 0.4
10 oC 94.7% 0.7% 0.3 0.09 0.5 0.4 0.06
25 oC 94.7% 0.6% 0.3 0.09 0.4 0.8 0.06
30 oC 92.7% 0.5% 0.3 0.2 0.3 2.7 0.1
6. Global cleavage 및 고체화 공정 조건
글로벌 클리비지(Global cleavage)와 고체화 공정은 GNA N5의 순도와 수율에 영향을 미칠 수 있는 주요 공정이다. GNA N5의 보호화 그룹은 2개가 있으며 이를 제거하는 CTC 레진에서 펩타이드를 분리하는 단계인 global cleavage와 고체화 공정을 위한 TFA 농도, 온도, anti-solvent에 대해서 최적화 연구를 진행하였다. Global cleavage와 고체화 공정의 최적화 연구는 10 mmol, cleavage 액의 사용양은 반응 용액 부피(20 L/mol)기준으로 1.5배 사용하고, 반응 시간은 3시간 동안 진행 후 순도와 수율을 비교하였다.
Global cleavage 진행시 TFA의 비율을 70%에서 95%까지 변화시켜 실험한 결과를 하기 표 12에 정리하였다. TFA의 비율이 90% 이상일 때 GNA N5의 순도가 94.0% 이상이고 TFA의 농도가 95%일 때 가장 높은 수율(94.4%)이 얻어지는 것을 확인하였다. 따라서 global cleavage 공정 시 TFA의 농도는 95%로 선정하였다.
TFA DCM TIS H2O Total vol. Yield Purity
1 70% 25% 2.5% 2.5% 300 mL 68.1% 91.9%
2 80% 15% 86.0% 92.0%
3 90% 5% 90.8% 94.9%
4 95% - 94.4% 94.3%
고체화 반응은 anti-solvent에 cleavage 반응액을 첨가하는 방식으로 진행하였다. Anti-solvent의 부피는 cleavage 반응액의 5배를 사용하였다. 고체화 공정 시 온도 변화에 의한 순도 변화에는 큰 차이가 없었지만 낮은 온도(하기 표 13, 실험 1: 초기 -7 ℃; △23 ℃)에서 anti-solvent인 디에틸 에터를 사용하여 고체화를 한 경우 고체 상태가 끈끈(sticky)하여 여과가 잘 되지 않아 GNA N5를 수득하기까지 많은 시간이 소요되는 경향이 있다. 이와 반대로 초기 온도 및 고체화 온도가 상승할수록 고체가 잘 형성되어 여과가 잘 되었다(하기 표 13, 실험 3, 4 참조). 초기 온도 20 ℃(하기 표 13, 실험 4)에서 고체화를 진행하는 경우 순간적인 발열로 인해 온도가 38℃까지 상승하였다. 순도에는 영향을 미치지 않았으나 급격한 온도 상승으로 인한 유연물질 발생 가능성이 있을 것으로 판단된다.
고체화 공정에서 사용하던 anti-solvent로 사용하던 디에틸 에터는 끓는점이 낮아 휘발성과 인화성이 강한 물질로 상대적으로 안전한 MTBE로 대체하기 위한 연구를 진행하였다. MTBE를 사용하였을 때 고체화 후 여과 과정에서 생성된 고체의 입자 크기가 매우 작아 여과지를 그대로 통과하는 현상이 관찰되었다(하기 표 13, 실험 5; 고체가 투과된 여과액을 재 필터하여 수율 감소를 막음). 상기 여과성 문제점 개선을 위해 cleavage 용액을 농축하여 고체화를 진행하였다. 고체화 반응은 농축된 cleavage 반응액에 MTBE를 첨가하는 방식으로 진행하였다. 전체 부피의 40% 정도로 농축하여 고체화한 경우 일부는 여과지에 걸러지지만 여전히 여과지를 그대로 통과하는 고체가 존재하였다(하기 표 13, 실험 6; 고체가 투과된 여과액을 재 필터하여 수율 감소를 막음). 27%로 농축한 경우에는 이러한 문제점 없이 여과가 잘 되는 것을 확인하였다. 따라서 농축 정도는 30% 이하로 결정하였다(하기 표 13, 실험 7). 또한 온도는 20℃ 이하로 조절하면서 MTBE를 투입하였다. 고체의 입자가 커져 여과지를 통과하는 현상을 개선되었다. 따라서 고체화 공정 시 anti-solvent는 MTBE로 선정하였다.
Temp. Solvent Concentration Yield Purity Filtration
1 -7℃→16℃
(△23℃)		 Et2O - 113.7% 94.3% Poor
2 4℃→20℃
(△16℃)		 Et2O - 154.9% 93.8% Good
3 10℃→28℃
(△18℃)		 Et2O - 131.0% 96.8% Very good
4 20℃→38℃
(△18℃)		 Et2O - 105.9% 97.2% Very good
5 4℃→30℃
(△26℃)		 MTBE - 98.0% 96.7% Very poor
6 -11℃→3℃
(△14℃)		 MTBE 300 mL →
120 mL (40%)		 102.2% 96.4% Poor
7 -4℃→7℃
(△11℃)		 MTBE 1400 mL →
380 mL (27%)		 99.3% 95.9% Good
실험예 6. 실시예 3-2의 GNA C5 합성공정 최적화
1. 활성화제의 선정
GNA C5의 합성 공정은 하기 표 14의 조건으로 수행하였다. 합성 과정에서 특이적인 유연물질이 생성되지 않음을 확인하였다. 이때, 첨가제로 사용된 HOBt는 폭발성 물질로 사용을 지양하는 추세이기 때문에 Oxyma로 대체하기 위한 연구를 진행하였다. 실험 결과, DIC/HOBt와 DIC/Oxyma를 사용하여 각각 합성했을 때의 순도는 91.5%(수율: 114.7%), 91.3%(수율: 129.3%)로 유의미한 차이가 없으므로 HOBt보다 안전한 첨가제인 Oxyma로 선정하였다.
step Amino Acid AA
(eq) 		Additive
(eq) 		DIC
(eq) 		Time
(h) 		Rxn
Vol.
1 Fmoc-D-Ala-OH 2.0 2.2 2.0 3.0 10 L/mol
2 Fmoc-Pro-OH 2.0 2.2 2.0
3 Fmoc-hArg(Et)2-OH·HCl 2.0 2.2 2.0
4 Fmoc-Leu-OH 2.0 2.2 2.0
5 Fmoc-D-hArg(Et)2-OH·HCl 2.0 2.2 2.0
2. 아미노산의 로딩과 커플링 조건
대량 생산 시 반응기 구조로 인해 10 L/mol의 반응액 부피로는 반응 온도 조절이 안될 수가 있기 때문에 온도 조절이 용이한 부피인 20 L/mol로 증가시켜서 반응하였다(활성화제는 DIC/Oxyma 사용). 반응액 부피 20 L/mol에서 아미노산 2.0 eq(20 L/mol)으로 합성을 했을 경우 HPLC 상에서 4.4%의 유연물질로 인해 순도가 83.9%(수율: 118.7%)로 감소하였다. 상기 유연물질을 Maldi-TOF mass로 분석한 결과 GNA C5의 분자량에서 226.05가 작은 물질로 3번째 아미노산(Fmoc-hArg(Et)2-OH) 또는 5번째 아미노산(Fmoc-D-hArg(Et)2-OH)의 deletion으로 추정된다. 따라서 반응 부피 증가(반응 농도 감소)로 인해 deletion이 발생한 것으로 추정되어 아미노산 당량을 3.0 eq으로 증가시켰다. 그 결과 deletion으로 인한 순도 감소는 발생하지 않았다(순도: 91.5%, 수율: 114.7%). 따라서 반응액 부피 20 L/mol에 적합한 아미노산의 당량으로 3.0 eq을 선정하였다.
3. 반응 온도 조건
최적의 반응 온도를 설정하기 위해 15, 20, 25, 30 ℃에서 합성하여 순도를 비교하였다(하기 표 15 참조). 15 - 30 ℃의 온도 구간에서의 유연물질의 패턴이 동일하고 순도에 크게 영향을 주지 않았지만 GNA N5와 동일하게 최적의 합성 온도 범위를 20 ± 5 ℃로 설정하였다.
Temperature purity Impurity
1 2 3 4 5 6
15℃ 89.5% 0.7% 1.5% 0.2% 0.4% 1.0% 1.4%
10℃ 89.7% 0.5% 1.5% 0.3% 0.5% 0.9% 1.2%
25℃ 91.0% 0.6% 1.5% 0.2% 0.5% 0.8% 1.0%
30℃ 89.4% 0.5% 1.5% 0.3% 0.5% 0.9% 1.2%
4. Global cleavage 및 고체화 공정 조건
Global cleavage와 고체화 공정은 GNA C5의 순도와 수율에 영향을 미칠 수 있는 주요 공정이다. GNA C5의 경우 보호화 그룹이 없기 때문에 레진에서 GNA C5만 탈거하면 된다. Global cleavage 및 고체화 공정의 최적화를 위해 TFA 농도, 온도, anti-solvent에 대해서 연구를 진행하였다. Global cleavage와 고체화 공정의 최적화 연구는 10 mmol, cleavage 액의 사용양은 반응 용액 부피(20 L/mol)기준으로 1.5배 사용하여 3시간 동안 반응 후 순도와 수율을 비교하였다.
Global cleavage 진행 시 TFA의 비율은 10%에서 80%까지 변화하여 실험 한 결과를 하기 표 16에 정리하였다. GNA C5의 경우 보호화 그룹이 없기 때문에 TFA의 농도에 따른 순도 변화는 거의 없다. TFA의 농도가 30% 이상일 때 수율은 107% 이상 수득 되었지만 TFA 30% 이하의 농도에서는 레진에서 GNA C5가 완전히 탈거되지 못해서 수율이 상대적으로 작게 나오는 것이 확인되었다. 따라서 global cleavage 공정 시 TFA의 최적 농도는 대량 제조 공정을 고려하여 40%로 선정하였다.
TFA DCM Total vol. Yield Purity
1 80% 20% 300 mL 110.5% 89.6%
2 50% 50% 110.5% 89.1%
3 30% 70% 107.8% 89.1%
4 25% 75% 87.9% 90.9%
5 20% 80% 87.9% 89.3%
6 10% 90% 65.2% 89.1%
고체화 반응은 anti-solvent에 cleavage 반응액을 첨가하는 방식으로 진행하였다. 고체화 반응에 사용한 anti-solvent는 디에틸 에터와 MTBE로 두 용매 모두 고체화에 문제없이 사용할 수 있음을 확인되어 상대적으로 안전한 MTBE로 선정하였다. 고체화 공정 시 초기 온도(4.4℃ ~ -5.5℃)에 의한 순도 및 여과성에 편차는 크지 않았다(하기 표 17, 실험 1, 2, 3 참조). 하지만 GNA C5는 높은 흡습성으로 인해 여과 후 수득한 고체를 상온에서 건조할 경우 시간이 지남에 따라 끈적한 덩어리가 되는 것이 관찰되었다. 이를 방지하기 위해서는 고체 수득 후 질소 하에서 건조하면 이런 현상을 피할 수 있다. 또한 MTBE의 부피는 cleavage 반응액의 7배 ~ 10배를 사용하여도 순도, 수율 및 여과에 대한 특이 사항이 없었다.
Temp. Solvent Volume Yield Purity Filtration
1 4.4℃→11.1℃
(△6.7℃)		 Et2O 10 folds 111.8% 88.4% Good
2 -0.6℃→6.8℃
(△7.4℃)		 Et2O 10 folds 102.5% 90.3% Good
3 -5.5℃→2.4℃
(△7.9℃)		 Et2O 10 folds 107.8% 89.6% Good
4 -5.3℃→3.2℃
(△8.5℃)		 MTBE 10 folds 105.2% 89.8% Good
5 -5.0℃→7.0℃
(△12.0℃)		 MTBE 7 folds 121.3% 91.1% Good
실험예 7. 실시예 3-3의 GNA 수렴합성 공정 최적화
1. 활성화제의 선정 및 조건
GNA 수렴 합성 시 생성되는 유연물질을 최소화하기 위해 활성화제에 대한 스크리닝 연구를 진행하였다. 합성 스케일은 1.14 mmol이며 결과는 하기 표 18에 정리하였다. RRT 1.04의 유연 물질은 주 피크 바로 뒤에 위치하여 정제 시 제거에 상당한 어려움이 있어 이 유연물질이 최소로 생성될 수 있는 활성화제를 선정하고자 하였다. 다양한 활성화제 중 EDC·HCl/DEPBT, TOTU, EDC·HCl/HOAt를 사용한 실험에서 유연물질(RRT 1.04)이 2.0% 이하로 생성되어 후보 물질로 선정하였다. TOTU의 경우 GNA crude의 유연 물질의 1.2%로 가장 낮았지만 crude의 용해도 좋지 않고 가격이 고가이기에 제외하였다. DEPBT의 경우도 가격이 고가이고 수급이 어려워 제외하였다. 따라서 상대적으로 저가이면서 수급이 용이하며 유연물질(RRT 1.04)가 적게 생기는 EDC·HCl/HOAt를 가장 적합한 활성화제로 선정하였다.
Activator Yield Purity Impurity
RRT 1.04
1 EDC·HCl/HOBt 101.1% (1.81 g) 94.9% 3.7%
2 EDC·HCl/Oxyma 95.0% (1.70 g) 95.5% 2.8%
3 EDC·HCl/DEPBT 97.8% (1.75 g) 95.3% 1.8%
4 HATU 96.6% (1.73 g) 96.4% 2.2%
5 HCTU 97.2% (1.74 g) 92.7% 5.3%
6 TBTU 112.8% (2.02 g) 86.0% 9.8%
7 TCTU 110.1% (1.97 g) 93.6% 5.1%
8 TOTU 92.7% (1.66 g) 97.1% 1.2%
9 TPTU 95.0% (1.70 g) 74.8% 18.0%
10 EDC·HCl/HOAt 92.7% (1.66 g) 95.7% 1.9%
11 HBTU 106.1% (1.90 g) 85.7% 10.5%
EDC·HCl의 당량(0.88, 1.32, 1.76, 2.20 eq) 최적화 연구를 진행하였다. 합성 스케일은 0.57 mmol이다. EDC·HCl의 당량이 0.88 eq에서 1.76 eq로 증가할수록 GNA crude의 순도가 64.9%에서 97.4%로 증가하였으며 출발물질인 GNA N5의 잔량은 33.1%에서 0.1%로 감소하였다. EDC·HCl 당량은 2.20 eq일 경우에는 순도는 96.9%로 소폭 감소하였지만, GNA 잔량은 0.03%였다(하기 표 19 참조). 상기 결과를 바탕으로 EDC·HCl 당량은 1.76 eq으로 최적화하였다.
EDC·HCl (eq.) 수율 순도 GNA N5 잔량
1 0.88 108.9% (0.86 g) 64.9% 33.1%
2 1.32 107.6% (0.85 g) 96.5% 0.7%
3 1.76 103.8% (0.82 g) 97.4% 0.1%
4 2.20 105.1% (0.83 g) 96.9% 0.03%
HOAt의 당량 최적화를 위한 연구를 진행하였다. 합성 스케일은 1.14 mmol이다. HOAt가 0.44 당량에서 1.32 당량으로 증가함에 따라 유연 물질(RRT 1.04)이 2.4%에서 1.8%로 감소하였고 1.32 당량에서 1.76 당량으로 증가하였을 때는 1.7%로 감소하는 정도가 크지 않았다(하기 표 20 참조). 따라서 HOAt는 1.32 당량으로 최적화하였다.
HOAt (eq.) 수율 순도 유연물질
RRT 1.04
1 0.44 106.4% (1.67 g) 96.4% 2.4%
2 0.88 104.5% (1.64 g) 96.8% 2.0%
3 1.32 108.9% (1.71 g) 96.8% 1.8%
4 1.76 106.4% (1.67 g) 96.9% 1.7%
2. DOE에 의한 최적화
수렴 합성법은 실험 설계법(Design of Experiments, DOE)을 통해 GNA C5, EDC·HCl, Collidine 당량을 공정 변수로 설정하여 시약과 중간체의 상호작용 및 각 공정 변수에 대해 최적화 연구를 진행하였다. 또한 Design space를 도출하여 공정 운영 범위를 도출하고자 한다. DOE 전문 소프트웨어(Fusion pro)를 사용하여 각 변수의 당량 변화(중심점 포함) 및 실험 시퀀스를 설계하여 순서대로 실험을 진행하였다. GNA C5, EDC·HCl, Collidine의 각 당량 변화 범위는 1.28 ~ 1.92 eq, 0.88 ~ 2.64 eq, 0.88 ~ 2.64 eq이다. 합성 스케일은 0.57 mmol이며 실험 시퀀스 및 결과(순도)는 하기 표 21에 나타내었다.
Run no. GNA C5 (eq.) EDC·HCl (eq.) Collidine (eq.) Purity
1 1.92 1.76 1.76 94.5%
2 1.67 2.64 1.76 94.3%
3 1.28 2.64 2.64 92.4%
4 1.28 0.88 2.64 80.0%
5 1.92 2.64 2.64 94.6%
6 1.92 0.88 0.88 21.7%
7 1.92 0.88 2.64 66.1%
8 1.67 1.76 1.76 95.2%
9 1.67 1.76 0.88 94.9%
10 1.28 2.64 0.88 92.7%
11 1.67 1.76 2.64 95.5%
12 1.28 1.76 1.76 92.8%
13 1.92 2.64 0.88 95.6%
14 1.28 0.88 0.88 53.7%
15 1.67 0.88 1.76 64.7%
상기 실험에서 각 변수들의 상호작용은 없었다. 3가지 변수 중 EDC를 1.76 eq으로 고정하고 GNA의 순도가 94% 이상으로 설정하고 이를 달성할 수 있는 두 변수(GNA C5, Collidine)들의 운영범위에 대한 Design space를 도출하였다. Design space 안에서 GNA C5의 운영 범위는 1.54 ~ 1.78 당량(중심점: 1.65 당량), Collidine의 운영 범위는 1.72 ~ 2.25 당량(중심점: 1.99)이다. 이 범위안에서 어떠한 당량을 사용하여도 목표 순도 94%를 달성할 수 있다. 이를 증명하기 위해 Design space 내의 각 꼭지점 및 중심점에서의 GNA C5과 Collidine의 당량에서 실험을 진행하였을 시 순도가 94% 이상이 되는지 검증 실험을 진행하였다. 합성 스케일은 1.14 mmol이며 결과는 하기 표 22와 같다. 실험 결과와 같이 모든 지점에서의 목표 순도(94%)보다 높았다. 따라서 GNA C5와 collidine에 대한 최적의 운영범위로 적절하게 설정되었음을 검증하였다.
Point GNA C5 (eq) EDC·HCl (eq) Collidine (eq) purity
A 1.54 1.76 1.72 95.5%
B 1.78 1.76 1.72 95.9%
C 1.54 1.76 2.25 95.7%
D 1.78 1.76 2.25 96.0%
T 1.65 1.76 1.99 96.1%
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 19로 표시되는 펩타이드 중간체 A를 수득하는 단계;
    하기 화학식 21로 표시되는 펩타이드 중간체 B를 수득하는 단계; 및
    상기 중간체 A와 중간체 B의 수렴합성을 통해 하기 화학식 13으로 표시되는 가니렐릭스를 수득하는 단계를 포함하는, 가니렐릭스(Ganirelix)의 제조방법:
    [화학식 19]
    Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-OH
    [화학식 21]
    H2N-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2
    [화학식 13]
    Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-Arg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는,
    하기 화학식 18로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계; 및
    상기 수득한 화학식 18로 표시되는 펩타이드로부터 보호기와 레진을 제거하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법:
    [화학식 18]
    Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser(R1)-Tyr(R1)-O-Resin
    (상기 화학식 18에 있어서, 상기 R1은 수소 또는 히드록시기 보호기임).
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 레진은 2-클로로트리틸 레진(2-Chlorotrityl), 트리틸 레진(Trityl), 4-메틸트리틸 레진(4-Methyltrityl), 4-메톡시트리틸 레진(4-Methoxytrityl) 또는 MBHA 레진(4-Methylbenzhydrylamine)인 것인, 제조방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 보호기와 레진을 제거하는 단계는,
    상기 화학식 18로 표시되는 펩타이드를 삼불화초산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 디클로로메탄(DCM), 에틸렌디옥시디에산싸이올(DODT), 디메틸설파이드(DMS) 및 아이오딘화암모늄(NH4I)으로 이루어진 군에서 선택된 것들의 조합을 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계; 및
    이의 반응용액에 Et2O, MTBE 또는 이들의 조합을 혼합하여 고체화하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt), 에틸하이드록시이미노시아노아세테이트(Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-디이소프로필카보디이미드(N,N'-Diisopropylcarbodiimide, DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride, EDC·HCl), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4-(3H)-원(3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT), 비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridinium-3-oxide hexafluorophosphate, HATU), O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플르오로포스페이트(O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HCTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오르보레이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate, TBTU), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로벤조트리아조륨-3-옥사이드-테트라플루오로보레이트(1-[Bis(dimethylamino)methylen]-5-chlorobenzotriazolium 3-oxide tetrafluoroborate, TCTU), N-[[[1-시아노-2-에톡시-2-오소에틸아이덴]아미노]옥시](다메틸아미노)메틸렌]-N-메틸-메탄아미늄 테트라플루오로보레이트(N-[[[(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy](dimethylamino)methylene]-N-methyl-methanaminium tetrafluoroborate, TOTU), 2-(2-피리돈-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(2-(2-Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TPTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트(N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate, HBTU) 또는 이들의 조합을 포함하는 활성화제 존재 하에 수행되는 것인, 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 두번째 아미노산으로서 Ser을 하기 염기시약 존재 하에 커플링하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법:
    2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine), 피리딘(Pyridine), 이미다졸(Imidazole), 피롤리딘(Pyrrolidine), 사이클로헥실아민(Cyclohexylamine), 몰포린(Morpholine), 피페리딘(Piperidine), 4-메톡시피리딘(4-Methoxypyridine), 2-클로로피리딘(2-Chloropyridine), 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine), 아닐린(Aniline), 4-메톡시아닐린(4-Methoxyaniline), 4-페닐렌디아민(4-Phenylenediamine), 에틸아민(Ethylamine), 디에틸아민(Diethylamine), 트리에틸아민(Triethylamine), DIEA(N,N-Diisopropylethylamine), DBU(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene) 또는 이들의 조합.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 중간체 A를 수득하는 단계는, 두번째 아미노산으로서 Ser을 0.5 내지 4 당량의 상기 염기시약 존재 하에 커플링하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 중간체 B를 수득하는 단계는,
    하기 화학식 20으로 표시되는 펩타이드를 수득하는 단계;
    상기 수득한 화학식 20으로 표시되는 펩타이드로부터 레진을 제거하는 단계; 및
    상기 레진이 제거된 펩타이드를 정제하여 상기 중간체 B를 수득하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법:
    [화학식 20]
    H2N-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH-Resin.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 레진은 2-클로로트리틸 레진(2-Chlorotrityl), 트리틸 레진(Trityl), 4-메틸트리틸 레진(4-Methyltrityl), 4-메톡시트리틸 레진(4-Methoxytrityl) 또는 MBHA 레진(4-Methylbenzhydrylamine)인 것인, 제조방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 레진을 제거하는 단계는,
    상기 화학식 20으로 표시되는 펩타이드를 삼불화초산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 디클로로메탄(DCM), 에틸렌디옥시디에산싸이올(DODT), 디메틸설파이드(DMS) 및 아이오딘화암모늄(NH4I)으로 이루어진 군에서 선택된 것들의 조합을 포함하는 혼합용액과 반응시키는 단계; 및
    이의 반응용액에 Et2O, MTBE 또는 이들의 조합을 혼합하여 고체화하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 중간체 B를 수득하는 단계는, 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt), 에틸하이드록시이미노시아노아세테이트(Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-디이소프로필카보디이미드(N,N'-Diisopropylcarbodiimide, DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride, EDC·HCl), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4-(3H)-원(3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT), 비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridinium-3-oxide hexafluorophosphate, HATU), O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플르오로포스페이트(O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HCTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오르보레이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate, TBTU), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로벤조트리아조륨-3-옥사이드-테트라플루오로보레이트(1-[Bis(dimethylamino)methylen]-5-chlorobenzotriazolium 3-oxide tetrafluoroborate, TCTU), N-[[[1-시아노-2-에톡시-2-오소에틸아이덴]아미노]옥시](다메틸아미노)메틸렌]-N-메틸-메탄아미늄 테트라플루오로보레이트(N-[[[(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy](dimethylamino)methylene]-N-methyl-methanaminium tetrafluoroborate, TOTU), 2-(2-피리돈-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(2-(2-Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TPTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트(N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate, HBTU) 또는 이들의 조합을 포함하는 활성화제 존재 하에 수행되는 것인, 제조방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는, 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine), 1-하이드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt), 에틸하이드록시이미노시아노아세테이트(Ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate, Oxyma), N,N'-디이소프로필카보디이미드(N,N'-Diisopropylcarbodiimide, DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)hydrochloride, EDC·HCl), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(1-Hydroxy-7-azabenzotriazole, HOAt), 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4-(3H)-원(3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one, DEPBT), 비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥사이드헥사플루오로포스페이트(Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] pyridinium-3-oxide hexafluorophosphate, HATU), O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플르오로포스페이트(O-(1H-6-Chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HCTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오르보레이트(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate, TBTU), 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-5-클로로벤조트리아조륨-3-옥사이드-테트라플루오로보레이트(1-[Bis(dimethylamino)methylen]-5-chlorobenzotriazolium 3-oxide tetrafluoroborate, TCTU), N-[[[1-시아노-2-에톡시-2-오소에틸아이덴]아미노]옥시](다메틸아미노)메틸렌]-N-메틸-메탄아미늄 테트라플루오로보레이트(N-[[[(1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy](dimethylamino)methylene]-N-methyl-methanaminium tetrafluoroborate, TOTU), 2-(2-피리돈-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(2-(2-Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TPTU), N,N,N',N'-테트라메틸-O-(1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트(N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate, HBTU) 또는 이들의 조합을 포함하는 커플링 시약 존재 하에 수행되는 것인, 제조방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는 0.5 내지 4 당량의 EDC·HCl 존재 하에 수행되는 것인, 제조방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는 0.2 내지 3 당량의 HOAt 존재 하에 수행되는 것인, 제조방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는, 상기 중간체 A와 중간체 B를 1.5 내지 2.5 당량의 상기 커플링 시약 존재 하에서 수렴합성하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
  16. 청구항 12에 있어서, 상기 가니렐릭스를 수득하는 단계는,
    상기 중간체 A와 중간체 B를 상기 커플링 시약 존재 하에서 수렴합성 반응시키는 단계; 및
    이의 반응용액에 DCM, MTBE 또는 이들의 조합을 혼합하여 고체화하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 고체화하는 단계는 상기 반응용액에 DCM과 MTBE를 1:2 내지 2:1의 부피비(v/v)로 혼합하여 고체화하는 것인, 제조방법.
  18. 하기 화학식 19로 표시되는 펩타이드 중간체 A를 수득하는 단계;
    하기 화학식 21로 표시되는 펩타이드 중간체 B를 수득하는 단계;
    상기 중간체 A와 중간체 B의 수렴합성을 통해 하기 화학식 13으로 표시되는 가니렐릭스를 수득하는 단계; 및
    상기 수득한 가니렐릭스를 정제하고, 아세트산 염으로 치환하여 하기 화학식 22로 표시되는 초산 가니렐릭스를 수득하는 단계를 포함하는, 초산 가니렐릭스(Ganirelix Acetate)의 제조방법:
    [화학식 19]
    Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-OH
    [화학식 21]
    H2N-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2
    [화학식 13]
    Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-Arg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2
    [화학식 22]
    Ac-D-2-Nal-D-Phe(4-Cl)-D-3-Pal-Ser-Tyr-D-hArg(Et)2-Leu-hArg(Et)2-Pro-D-Ala-NH2·2AcOH.
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