CN101372512B

CN101372512B - 一类抗凝血多肽及其用途

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Publication number: CN101372512B
Application number: CN2007101206853A
Authority: CN
Inventors: 戴秋云; 黄园园; 董铭心; 胡洁
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2007-08-23
Filing date: 2007-08-23
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2027-08-23
Also published as: CN101372512A

Abstract

本发明公开了一类抗凝血多肽，属于生物医药领域。抗凝血多肽，一级结构如通式所示：(D)-FPRP-X ₁-X ₂-X ₃-X ₄-X ₅-QGDFEPIPEDAYDE-NH ₂。本发明的优点是：本发明根据凝血酶和抗凝药物比伐卢定的结构特点及作用方式，设计合成了一类抗凝血多肽，他们不仅能高效、特异抑制凝血酶活性，而且其所具有的氨基酸个数与比伐卢定相当，合成容易，抗凝活性更强。

Description

一类抗凝血多肽及其用途

技术领域

本发明涉及一类抗凝血多肽及其用途，属于生物医药领域。

背景技术

凝血是机体的重要生理防御过程，但病理性血栓严重危害人类健康。目前国内外临床使用的主要抗凝血药物是普通肝素、低分子量肝素、华法林等，这些药物存在导致血小板减少、出血等副作用或需要密切的实验室监测等缺点。而多肽类抗凝血药物，如水蛭素、比伐卢定以及可口服的小分子类肽药物(如希美加群等)等，具有起效快、副作用较小等突出优点，是今后抗凝血药的重点发展方向。

凝血酶在血栓过程中起着中心作用：(1)裂解纤维蛋白原成纤维蛋白；(2)激活因子V、VIII及XI，这些因子反过来形成更多的凝血酶；(3)刺激血小板。此外，通过激活因子VIII使纤维蛋白交联稳定栓塞。凝血酶具有三个结合区：纤维蛋白结合区、底物催化(活性)区及肝素结合区。凝血酶由含36个氨基酸的A链及259个氨基酸的B链组成，A链与B链由二硫键连接，像其他丝氨酸蛋白酶一样，它包括一个典型的催化三元体(Asp102、His57及Ser195)，其S1结合区象一个深的口袋，底部的Asp189能与底物的氨基或胍基形成氢键或静电相互作用，该区的疏水区可结合疏水基团。与其他胰蛋白酶不同的是还有第二个疏水区(S2)，该区含有疏水的YPPW环。此外，酸性的Glu192残基处于口袋的入口处，对识别底物及抑制剂十分重要。凝血酶的纤维蛋白及肝素结合区主要由数个精氨酸及赖氨酸组成，可与电负性氨基酸及基团结合。

水蛭素是最早发现的多肽类凝血酶直接抑制剂，由65个氨基酸残基组成，自然界中有多种水蛭素变异体，抗凝活性较强的主要有HV1、HV2及HV3等(Salzet M.CurrPharm Des，2002，8(7)：493～503)。水蛭素可结合凝血酶的底物催化区和纤维蛋白结合区，与凝血酶形成1∶1的复合物(结合常数Ki为高达20fM)(Krsttenansky J L，et al.FEBS Lett，1990，269：425～429)，阻止凝血酶将纤维蛋白原降解成为纤维蛋白单体，从而抑制纤维蛋白单体的凝结。水蛭素具有不能口服、体内易降解等缺点，可通过结构修饰来克服。如用PEG分子或硬脂酸、油酸等亲脂化合物修饰的水蛭素可获得较长的半衰期。RGD融合水蛭素则还具有抗血小板聚集功能。注射用的基因工程双功能水蛭素(RGD-hirudin)已于2005年获国家食品药品监督管理局批准进入临床研究，临床适应症为血管吻合术后的抗凝、防栓治疗，并可用于治疗心绞痛、深静脉血栓等疾病。

由水蛭素衍生出的小分子肽很多，有的只结合凝血酶催化区，有的只结合凝血酶的纤维蛋白结合区，活性不理想，有的活性虽然较高，但合成较难。比伐卢定(Bivalirudin，hirulog-1)是人工合成的水蛭素衍生物，含有20个氨基酸残基，其氨基端能结合凝血酶的底物催化区，而其呈酸性的羧基端则能结合凝血酶的纤维蛋白结合区(Bourdon P，et，al.FEBS Lett，1991，293：163～166)，中间由4个Gly组成一个柔性的连接部分。比伐卢定比水蛭素有更宽的治疗窗及安全性，但缺点是两者都不能口服，体内易降解，半衰期较短。

小分子类肽抗凝剂主要有阿加曲班、希美加群、达比加群等。阿加曲班由N-α-苯磺酰基-L-精氨酸甲酯改造而成，能可逆、选择性地结合凝血酶催化位点(Preville P，et al.Bioorg Med Chem Lett，1997，7(12)：1563～1566)。近年来，一些阿加曲班类似物被合成(Salvagnini C，et al.Eur J Med Chem.2007，42(1)：37-53.)，如将其强碱性的胍基替换成亲脂性的侧链，以提高其细胞通透性及口服利用度。美拉加群是D-Phe-Pro-Arg三肽序列的类似物，其中苯脒基代替精氨酸，azetidine-2-羧酸代替脯氨酸，D-型环己基甘氨酸代替D-苯丙氨酸，美拉加群能可逆地抑制凝血酶的催化位点(GustafssonD，et.al.J Intern Med.2003，254(4)：322～334)。将美拉加群的羧基上变成酯基，脒基加胺肟基，可转化为口服的前药—希美加群(Boos C J，et.al.Eur J Intern Med，2005，16(4)：267～278)，希美加群是继肝素发展50多年后，出现的第一个可口服的抗凝血药，它受食物和其他药物的干扰小，药效可以预测，不需要抗凝血监测，但由于其肝毒性，2006年2月Astrazeneca公司宣布将希美加群(ExantaTM)从市场上撤回。达比加群(dabigatran，BIBR 953)包含三取代的苯并咪唑核心骨架，含有一个4-氨基的苯丙氨酸类似物，可结合凝血酶催化位点(Bates S M，et.al.Br J Pharmacol.2005，144(8)：1017～1028)，达比加群酯化后转变成可口服的BIBR 1048(dabigatranexexilate)。目前已进入III期临床试验。

理想的抗凝血药物应该具有如下特性：抗凝活性良好，药效可以预测，不需要实验室监测，可口服，起效快，副作用小等。目前的抗凝药还未能满足这些要求。小肽及可口服的小分子类肽或化合物将是今后抗凝血药物的重点研究方向，而小分子类肽凝血酶抑制剂已经取得了很大进展，减少副作用是今后的努力方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一类新型抗凝血多肽，该类多肽与比伐卢定相比，其抗凝血活性更强。

本发明要解决的另一个技术问题是：提供这类抗凝血多肽在制药领域的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

抗凝血多肽，一级结构如通式所示：

(D)-FPRP-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

其中：

X1选自G、AEEA、K(steric)、R中任意一个；

X2选自G、K(steric)、R中任意一个或空缺；

X3选自G、K(steric)、D中任意一个或空缺：

X4选自G、K(steric)、W、D中任意一个；

X5选自P、S中任意一个或空缺；

其中A为丙氨酸；D为天冬氨酸；E为谷氨酸；F为苯丙氨酸；(D)-F为D型苯丙氨酸；G为甘氨酸；I为异亮氨酸；K(steric)为具有硬脂酸侧链的赖氨酸；P为脯氨酸；Q为谷氨酰胺；R为精氨酸；S为丝氨酸；W为色氨酸；Y为酪氨酸，AEEA为2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙酸。

通式I多肽分别是下列多肽，他们的序列分别如下：

多肽1：(D)-FPRP-GGGG-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

多肽2：(D)-FPRP-AEEA-G-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

多肽3：(D)-FPRP-G-K(steric)GG-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

多肽4：(D)-FPRP-GG-K(steric)G-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

多肽5：(D)-FPRP-GGG-K(steric)-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

多肽6：(D)-FPRP-GRGDS-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

多肽7：(D)-FPRP-RGDWP-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

多肽8：(D)-FPRP-K(steric)GGG-QGDFEPIPEDAYDE-NH2

在上述多肽中，抗凝活性特别好的是多肽1、2、3及6。此外，我们还合成了下列多肽，他们的序列如下：

多肽9：(D)-FPRP-AEEA-G-NGDFEEIPEEYL

多肽10：(D)-FPRP-PABA-G-NGDFEEIPEEYL

多肽11：(D)-FPRP-PAMBA-G-NGDFEEIPEEYL

多肽12：(D)-FPRP-GRGDWP-DFEEIPEEYL

多肽13：(D)-FPRP-RGDWPG-DFEEIPEEYL

PABA为对氨基苯甲酸，PAMBA为对氨甲基苯甲酸。

本发明所提供的多肽能同时结合凝血酶的底物催化区和纤维蛋白结合区，并具有更强的抗凝血活性。其氨基端为疏水性的(D)-FPRP序列，能结合凝血酶的底物催化区，而凝血酶在与其结合后能缓慢切割R-P之间的酰胺键(Witting J I，et.al.Biochem J，1992，283：737～743)，使其失活。其羧基端氨基酸序列整体呈电负性，能结合凝血酶的纤维蛋白结合区，我们用水蛭素变种III的羧基端序列(QGDFEPIPEDAYDE)替换了hirulog-1的羧基端的十二个氨基酸残基(NGDFEEIPEEYL)，替换后的羧基端具有更强的电负性，与凝血酶的亲和力更强。而羧基端与氨基端之间则用柔性的氨基酸序列连接起来，我们用人工合成的有机化合物替换了柔性序列中的一个或几个氨基酸，另外，在序列终引入了带有硬脂酸侧链的赖氨酸，以期减缓凝血酶对多肽的降解，增强抗凝活性。

本发明可以通过固相合成、液相合成、工程菌表达等方法进行生产。例如，采用固相合成，在树脂上逐个偶联氨基酸序列，以形成本发明；合成或提取可以表达本发明的DNA序列，连接到某一载体上，并转染到真核或者原核生物的细胞中，表达含有本发明所提供的多肽序列的蛋白质或者多肽，经提取和纯化得到本发明的多肽。

本发明提供的多肽可以在美国应用系统生物的ABI433型固相合成仪上合成，多肽的修饰手工完成。该合成使用的氨基酸以Fmoc保护(美国Advanced Chemtech公司产品)，使用的树脂为Rink树脂或Wang树脂(美国Advanced Chemtech公司产品)。合成时使用1-羟基苯并三唑(HoBt)(美国Advanced Chemtech公司产品)溶解在N-甲基吡咯烷酮(NMP)(PE公司)中作为活化剂，使用二环己基碳二亚胺(DCC)(Acros公司)作为偶联剂，使用哌啶(Piperidine)(上海吉尔生化)除去保护基。氨基酸均具有L-型化学结构(Fmoc-D-Phe-OH除外)，它们被依次偶联在Rink或Wang树脂上。

树脂的使用量与Fmoc保护氨基酸的使用量按1∶5进行，保护氨基酸(美国Advanced Chemtech公司产品)如下：Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、而人工改造而成的Fmoc-Lys(steric)-OH、Fmoc-AEEA-OH、Fmoc-PABA以及Fmoc-PAMBA为本实验室合成，氨基酸的偶联按照仪器操作规程进行。

上述合成后的肽树脂用裂解液(组成：二巯基苏糖醇(DTT)0.5g，水0.5ml，三氟乙酸(TFA)8.8ml，和三异丙基硅烷(TIPS)0.2ml)裂解2.5～3.0小时，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸去大部分三氟乙酸后，用预冷的无水乙醚进行沉淀，过滤得到初肽，用去离子水或稀氨水溶解固体，过滤，滤液冻干。

上述冻干粗肽用反相HPLC进行纯化，纯化柱为反相C₁₈半制备柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)，梯度洗脱液为含有不同梯度的乙腈(含0.1％TFA)/水(含0.1％TFA)，收集目标峰，旋转蒸发除去大部分乙腈，冻干得到纯肽。

一类抗凝血多肽用于制备预防和治疗血栓性疾病的药物的用途。

本发明的多肽可以用于手术后深静脉血栓的预防及治疗，用于行经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)的不稳定型心绞痛患者的抗凝治疗，或者与血小板糖蛋白II b/IIIa抑制剂联合用于经皮冠脉介入(PCI)治疗的患者的抗凝治疗，以及替代肝素用于需要抗凝治疗的肝素引起的血小板减少症的患者。

可以将含有本发明的多肽或其截断物、衍生物及组合物的药物直接给予病人，或者与适宜的载体或者赋型剂混合后给予病人。这里的载体材料包括：水溶性载体材料，如聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，有机酸等；难溶性载体材料，如乙基纤维素，胆固醇硬脂酸酯等；肠溶性载体材料，如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等。使用这些材料，可以制成如下的剂型：片剂、栓剂、溶液、胶囊、气雾剂、泡腾片和滴剂等。

使用上述剂型，本发明的所提供的多肽及其衍生物、截断物和类似物及组合物可以：经注射给药，包括静脉注射、皮下注射、腔内注射等；粘膜给药，如鼻腔给药，在局部起效或经粘膜吸收全身发挥作用；腔道给药，如经直肠给药，局部起效或者经吸收全身发挥作用。上述给药途径优选的是经静脉注射给药。

本发明的优点是：本发明根据凝血酶和抗凝药物比伐卢定的结构特点及作用方式，设计合成了了一类抗凝血多肽，他们不仅能高效、特异抑制凝血酶活性，而且其所具有的氨基酸个数与比伐卢定相当，合成容易，抗凝活性更强。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为多肽1纯化后的HPLC分析图谱。

图2为多肽2纯化后的HPLC分析图谱。

图3为多肽3纯化后的HPLC分析图谱。

图4为多肽6纯化后的HPLC分析图谱。

图5为多肽7纯化后的HPLC分析图谱。

具体实施方式

实施例1：多肽1的合成和纯化

一.合成：

称取0.17gRink树脂(0.1mmol，取代率0.6g/mmol)，各Fmoc保护氨基酸的用量为0.5mmol，以1-羟基苯并三唑(HoBt)及二环己基碳二亚胺(DCC，Acros公司)为缩合剂，哌啶(Piperidine，上海吉尔生化)脱保护，按美国应用系统生物的ABI433A型固相合成仪的操作说明，适当延长偶合时间(60-90min)及脱保护时间(20-30min)，合成肽-树脂。

取上述肽-树脂，放入10ml裂解液中(组成：0.5g二巯基苏糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三异丙基硅烷(TIPS))，裂解3.0小时，用G3玻璃砂芯漏斗过滤，用旋转蒸发仪蒸去大部分滤液至残余液体约2ml后，用100ml预冷的无水乙醚进行沉淀，静置1小时，G4玻璃砂芯漏斗过滤得到初肽，用1％的稀氨水溶解固体，滤液冻干得粗肽，纯度约为60％。

二.纯化：

取粗肽39.0mg用HPLC纯化，色谱柱为反相C₁₈半制备柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)。流动相：A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脱梯度为：1-25min，15％-70％A，流速3ml/min，UV214nm检测，每次上样5mg。收集目标组分，旋转蒸发除去大部分乙腈，冻干得到纯肽19.2mg。多肽1的纯度分析见图1。

多肽纯化后的HPLC分析图谱：

流速：1ml/min

检测波长：214nm

柱温：25℃

梯度：洗脱梯度为

0-1min，0-15％A

1-25min，15％-70％A

25-27min，80％-90％A

A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)

上样量：50μg

分析柱：Kromasil，C-18柱(北京分析仪器厂)，5μm，Φ4.6mm×250mm

实施例2：多肽2的合成和纯化

一.合成：

取上述肽-树脂，放入10ml裂解液中(组成：0.5g二巯基苏糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三异丙基硅烷(TIPS))，裂解3.0小时，用G3玻璃砂芯漏斗过滤，用旋转蒸发仪蒸去大部分滤液至残余液体约2ml后，用100ml预冷的无水乙醚进行沉淀，静置1小时，G4玻璃砂芯漏斗过滤得到初肽，用1％的稀氨水溶解固体，滤液冻干得粗肽，纯度约为65％。

二.纯化：

取粗肽39.0mg用HPLC纯化，色谱柱为反相C₁₈半制备柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)。流动相：A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脱梯度为：1-25min，15％-70％A，流速3ml/min，UV214nm检测，每次上样5mg。收集目标组分，旋转蒸发除去大部分乙腈，冻干得到纯肽21.8mg。多肽2的纯度分析见图2。

多肽纯化后的HPLC分析图谱：

流速：1ml/min

检测波长：214nm

柱温：25℃

梯度：洗脱梯度为

0-1min，0-15％A

1-25min，15％-70％A

25-27min，80％-90％A

A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)

上样量：50μg

分析柱：Kromasil，C-18柱(北京分析仪器厂)，5μm，Φ4.6mm ×250mm

实施例3：多肽3的合成和纯化

一.合成：

取上述肽-树脂，放入10ml裂解液中(组成：0.5g二巯基苏糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三异丙基硅烷(TIPS))，裂解3.0小时，用G3玻璃砂芯漏斗过滤，用旋转蒸发仪蒸去大部分滤液至残余液体约2ml后，用100ml预冷的无水乙醚进行沉淀，静置1小时，G4玻璃砂芯漏斗过滤得到初肽，用1％的稀氨水溶解固体，滤液冻干得粗肽，纯度约为55％。

二.纯化：

取粗肽38.0mg用HPLC纯化，色谱柱为反相C₁₈半制备柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)。流动相：A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脱梯度为：1-25min，15％-70％A，流速3ml/min，UV214nm检测，每次上样5mg。收集目标组分，旋转蒸发除去大部分乙腈，冻干得到纯肽14.3mg。多肽3的纯度分析见图3。

多肽纯化后的HPLC分析图谱：

流速：1ml/min

检测波长：214nm

柱温：25℃

梯度：洗脱梯度为：

0-1min，0-45％A

1-25min，45％-80％A

25-27min，80％-90％A

A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)

上样量：50μg

分析柱：Kromasil，C-18柱(北京分析仪器厂)，5μm，Φ4.6mm×250mm

实施例4：多肽6的合成和纯化

一.合成：

二.纯化：

取粗肽35.0mg用HPLC纯化，色谱柱为反相C₁₈半制备柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm ×25cm)。流动相：A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脱梯度为：1-25min，15％-70％A，流速3ml/min，UV214nm检测，每次上样5mg。收集目标组分，旋转蒸发除去大部分乙腈，冻干得到纯肽16.5mg。多肽6的纯度分析见图4。

多肽纯化后的HPLC分析图谱：

流速：1ml/min

检测波长：214nm

柱温：25℃

梯度：洗脱梯度为

0-1min，0-15％A

1-25min，15％-70％A

25-27min，80％-90％A

A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)

上样量：50μg

分析柱：Kromasil，C-18柱(北京分析仪器厂)，5μm，Φ4.6mm ×250mm

实施例5：多肽7的合成和纯化

一.合成：

二.纯化：

取粗肽40.0mg用HPLC纯化，色谱柱为反相C₁₈半制备柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)。流动相：A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脱梯度为：1-25min，15％-70％A，流速3ml/min，UV214nm检测，每次上样5mg。收集目标组分，旋转蒸发除去大部分乙腈，冻干得到纯肽18.7mg。多肽7的纯度分析见图5。

多肽纯化后的HPLC分析图谱：

流速：1ml/min

检测波长：214nm

柱温：25℃

梯度：洗脱梯度为

0-1min，0-15％A

1-25min，15％-70％A

25-27min，80％-90％A

A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)

上样量：50μg

分析柱：Kromasil，C-18柱(北京分析仪器厂)，5μm，Φ4.6mm×250mm

实施例6：抗凝血活性的测定

一.实验目的

测定本发明所提供的多肽的抗凝血活性，评价其于对照肽hirulog-1相比抗凝活性的强弱。并测定本发明所提供的多肽相对于不同种属(猪、牛及人)的凝血酶抗凝血活性的强弱。

二.实验材料和方法

(一)实验材料

1.缓冲液：含0.05mmol/L NaCl的0.05mol/L的Tris-HCl溶液，PH7.4。

2.0.5％纤维蛋白原溶液(包括猪、牛及人的纤维蛋白原溶液)，用上述缓冲液配制。

3.不同浓度梯度的凝血酶溶液(包括猪、牛及人的凝血酶溶液)：浓度分别为20NIH/ml(为1个滴定体积，既1V，为0.1ATU)，40NIH/ml(2V)，100NIH/ml(5V)，200NIH/ml(10V)，400NIH/ml(20V)，800NIH/ml(40V)及1000NIH/ml(50V)。

4.各抗凝血多肽溶液：分别称取各多肽5mg，分别配制成2.5mmol/L的溶液。实验过程中，根据各个多肽抗凝活性的强弱分别稀释为合适浓度。

5.Hirulog-1：购自成都凯捷生物医药科技有限公司，称取5mg，配制成2.5mmol/L的溶液。实验过程中再稀释为合适浓度。

(二)方法

1.抗凝血活性的测定采用凝血酶滴定法(Markwardt F.Methods Enzymol，1970，69：924-932.陈华友等，生物技术，2002，12(6)：24-25)。

具体操作步骤如下：取几支小试管(0.75*10cm)，分别加入200μL 0.5％纤维蛋白原溶液及50μL待测多肽溶液，37℃温育5min，取其一支，滴加5V的NIH/ml凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明抗凝活性小于5V，则重新在另一支试管中加入1V的凝血酶溶液5μL，若1min内不凝，再加入1V的凝血酶溶液5μL，如此下去，直至1min内凝固为止。如果待测样品在加入5V的凝血酶溶液5μL，1min内没有凝固，则再加入20V的凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明活性在5V-25V之间，所以再取一支小试管，滴加入20V的凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内不凝固，则再取一支试管中加入1V的凝血酶溶液5μL，若1min内不凝，再加入1V的凝血酶溶液5μL，如此下去，直至1min内凝固为止。

2.多肽3的活性测定过程如下(多肽3浓度为0.1mM，凝血酶为猪凝血酶)：

取5支小试管，分别加入200μL 0.5％纤维蛋白原溶液及50μL待测多肽溶液，37℃温育5min，取其一支，滴加5V的NIH/ml凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，1min内未凝固，再滴加入20V的凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，1min内未凝固，再加入20V的凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，仍未凝，直至共加入5次20V的凝血酶溶液时，出现凝固，说明活性再85V-105V之间，则另取一支小试管，加入40V的凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，1min内未凝固，再加入40V的凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，1min内未凝固，再加入20V的凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，仍未凝，再加入1V的凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，1min内出现凝固，说明其抗凝血活性为101V，即10.1ATU，重复3次，结果取其平均值。

其余多肽均如上述方法测定抗凝活性。

三.实验结果

本发明所提供的部分多肽以及对照肽hirulog-1相对于不同种属(猪、牛及人)凝血酶的抗凝活性，见表1。

表1：部分多肽的抗凝活性实验结果

四.结论

本发明所提供的多肽中有四个抗凝活性明显高于对照肽hirulog-1(多肽1、多肽2、多肽3及多肽6)：对猪凝血酶的抗凝血活性为对照肽3-4倍，对牛凝血酶的活性为对照肽的6-8倍，对人凝血酶则相等或近2倍。

实施例7：抑制常数(Ki)的测定

一.实验目的

通过分析生色底物Chromozym TH被凝血酶的降解，计算各多肽的动力学参数，评价其抗凝活性。

二.实验材料和方法

(一)实验材料

1.缓冲液：0.01M Hepes/0.01M Tris，0.1M NaCl，0.1％PEG6000，PH7.4。

2.底物：Chromozym TH(Tos-Gly-Pro-Arg-PNA，购自罗氏公司)，分别配制成浓度为25μM、33μM、40μM、50μM、100μM、125μM、200μM、330μM、500μM、1000μM.

3.牛凝血酶(购自sigma公司)溶液：配制成5NIH/ml.

4.抗凝肽的浓度：分别配制成0.05μM、0.10μM、0.15μM.

(二)方法

采用生色底物法(Cappiello M，et.al.Biochemical.Biochemical Pharmacology，1996，52：1141-1146.Maraganore J M，et.al.Biochemistry，1990，29：7095-7101)，底物Chromozym TH(Tos-Gly-Pro-Arg-PNA)能被凝血酶切割产生对硝基苯胺，而后者在405nm波长有很强的吸收，所以可以通过监测对硝基苯胺的生成来确定抗凝肽对凝血酶的抑制活性。

具体操作步骤如下：将0.05ml牛凝血酶溶液和0.05ml抗凝肽溶液加入到0.35ml缓冲液(0.01M Hepes/0.01M Tris，0.1M NaCl，0.1％PEG6000，PH7.4)中，混匀，于2min内加入0.05ml Chromozym TH溶液(终浓度分别为2.5μM、3.3μM、4.0μM、5.0μM、10.0μM、12.5μM、20.0μM、33.0μM、50.0μM、100.0μM)，室温下反应10min，BECKMAN DU640分光光度计监测其于405nm波长的吸光度变化。Km和Vmax通过双倒数作图法确定，Ki值通过竞争性和非竞争性抑制方程计算。

三.实验结果

本发明所提供的部分多肽以及对照肽hirulog-1抑制牛凝血酶的抑制常数Ki值，见表2。

表2：部分多肽的Ki值

抗凝肽 Ki(nM)

Hirulog-1 21.0

多肽1 10.4

多肽3 15.2

多肽6 15.5

多肽7 15.0

四.结论

多肽1、3、6、7的Ki值均小于hirulog-1的，这说明其抗凝活性均比hirulog-1的强。

综上所述，本发明提供了一类抑制凝血酶活性的抗凝血多肽。根据凝血酶和水蛭素的结构特点和作用机理，本发明设计合成了可以同时结合凝血酶底物催化区和纤维蛋白结合区的新型抗凝多肽，并用人工合成的有机化合物替换天然氨基酸，在序列中引入硬脂酸侧链等，获得抗凝活性更强、代谢更好的多肽。用本发明所述多肽可以制备预防和治疗血栓性疾病的药物。

序列表

Claims

1.抗凝血多肽，一级结构如下所示：

(D)-FPRP-GK(steric)GG-QGDFEPIPEDAYDE-NH₂

其中A为丙氨酸；D为天冬氨酸；E为谷氨酸；F为苯丙氨酸；(D)-F为D型苯丙氨酸；G为甘氨酸；I为异亮氨酸；K(steric)为具有硬脂酸侧链的赖氨酸；P为脯氨酸；Q为谷氨酰胺；R为精氨酸；Y为酪氨酸。

2.权利要求1所述的抗凝血多肽用于制备预防和治疗血栓性疾病的药物的用途。