BG60759B2 - Инхибитори на тромбин - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до биологично активни молекули, които се свързват към тромбина и го инхибират. Тези молекули имат тромбин анионсвързващ екзосайт асоциирана част (авеам), линкерен участък с дължина поне от 18 а и тромбин каталитична сайт насочена част (сsdм). Изобретението се отнася и до състави, комбинации и методи, използващи тези молекули за терапевтични, профилактични и диагностични цели. 37 претенции

Description

ИНХИБИТОРИ НА ТРОМБИН

ЛИТЕРАТУРНА СПРАВКА,СВЪРЗАНА СЪС ЗАЯВКАТА

Настоящата заявка е частично продължение на свързания патент на САЩ със сериен номер на заявката 595 482, подаден

I на 18.08.1989г., изоставен понастоящем.,'

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение се отнася до нови биологичноактивни молекули, които се свързват към и инхибират тромбина. Специфично, тези молекули се характеризират с тромбин анионсвързващ екзосайт асоциираща част (ABEAM); част от

линкера с дължина поне 18 А; и тромбин каталитична сайт-насочена част (CSDM). Настоящето изобретение се отнася също така до състави, комбинации и методи, използващи тези молекули за терапевтични, профилактични и диагностични цели.

СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Акутиите съдови заболявания като инфаркт на миокарда, удар, белодробна емболия, тромбоза на дълбоките вени, периферна артериална оклузия и други тромбози по кръвоносната система съставляват основните здравни рискове. Такива заболявания се причиняват чрез частична или цялостна оклузия на кръвоносния съд от кръвен съсирех, съдържащ фибрин и плаки.

Съвременните методи за лечение и профилактика на тромбозните заболявания изискват терапии, действащи по един от два различни начина. Първият начин за лечение инхибира активността на тромбина или образуването на тромбин, като по този начин се предпазва от формирането на съсирех. Тези лекарства също фака инхибират активирането и агрегацията на плаките. Втората категория терапевтици ускорява тромболизата и разтваря кръвния съсирех, като по този начин го отстранява от кръвоносния съд и деблокира кръвния поток [ J.P.Cazenava et al., Agents Action. 15, Suppl., pp. 24-49 (1984)].

Хепаринът, съединение от предхождащия клас, е бил широко прилаган при третиране на условията, като венозна тромбоемболия, при които активността на тромбина е отговорна за развитието и разпространението на тромба. Въпреки че е активен, хепаринът причинява много нежелани странични ефекти, включително хеморагии и тромбоцитопения. Това доведе до

търсенето на по-специфичен и по-малко токсичен антикоагулант.

Хирудинът е полипептид,срещащ се в природата , който се продуцира от кръвосмучещата пиявица Hirudo medicinal is. Веществото, което се синтезира в слюнните жлези на пиявицата, е най-силният известен природен инхибитор на коагулация. Хирудинът предпазва кръвта от коагулация чрез здраво свързване към тромбина (Κ^=2χ10 М) в 1;1 стехиометричен комплекс [S. R. Stone and J. Hofsteenge, Kinetics of the Inhibition of Thrombin by Hirudin, Biochemistry, 25, pp. 4622-28 (1986)]. Това инхибира тромбина при катализирането на превръщането на фибриногена във фибрин (съсирек), тъй както и инхибирането на всички останали тромбин-медиирани процеси [J. W. Fenton, II, Regulation of Thrombin Generation and Functions, Semin. Thromb. Hemost., 14, pp. 254-40 (1988)].

Същинското свързване между хирудина и тромбина е двустепенен процес.ΐПървоначално, хирудинът се свързва към ниеко афинитетния сайт на тромбиновата молекула (IQ=1x10 М), който е отделен от каталитичния сайт. Това свързване въвлича взаимодействие на структура от С-края на хирудина с един ’’анионсвързващ екзосайт (АВЕ) в тромбина [J. W. Fenton, II et al., Thrombin Anion Exosite Intractions with Heparin and Various Polyanions, Ann.New York Acad. Sci., 556, pp. 15865 (1989)]. Следвайки ниско афинитетното свързване, комплексът хирудин-тромбин претърпява конформационна промяна, след което хирудинът се свързва към високо афинитентия сайт на тромбина [S. Kono et al.,

Analysis of Secondery Structure

of Hirudin and the Conformational Change Upon Interaction with Thrombin, Arch, iochem. Biophys., 267, pp. 158-66 (1988)]. Този по-късен сайт отговаря на активния сайт на тромбина.

Изолирането, пречистването и химическият състав на хирудина са известни от нивото на техниката [Р. Walsmann and F. Markwatdt, Biochemical and Pharmacological Aspects of the Thrombin Inhibitor Hirudin, Pharmazie, 56, pp. 655-60 ' I(1981)]. Наскоро бе разкрита пълната аминокиселинна последователност на полипептида [J. Dodt et al., The Complete Covalent Structure of Hirudin : Localization of the Disulfide Bonds, Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 566, pp. 575-85 (1985); S.J.T. Mao et al., Rapid Purification and Revised Amino Terminal Sequence of Hirudin : A Specific Thrombin Inhibitor of the Blood-Sucking Leech, Anal. Biochem. 161, pp. 514-18 (1987); and R.P. Harvey et al., Cloning and Expression of a c]DNA Coding for the Anti-Coagulant Hirudin from the Bloodsucking Leech, Hirudo medicinalis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 1084-88 (1986)].

Секвенирани са най-малко десет различни изоморфни форми на хирудина и е доказано, че незначително се различават по аминокиселинната си последователност [D. Tripier, Hirudin : A Family of Iso-Proteins. Isolation and Sequence

Determination of New irudins, Folia Haematol., 115, pp. 5055 (1988)]. Всичките форми на хирудина включват протеин с едноверижен полипептид, съдържащ 65 или 66 аминокиселини , в които амино краят първоначално съдържа хидрофобни аминоки-

селини, а карбокси краят съдържа типично полярни аминокиселини. По-специфично, всички форми на хирудин се характеризират чрез един N-терминален домен (остатъци 1-59), стабилизиран чрез три дисулфидни моста при 1-2, 5-5 и 4-6 полуцистеинилова проба и високо киселинен С-терминален сегмент (остатъци 40-65). Освен това, С-крайниятсегмент на хирудина се характеризира чрез присъствието на тирозинов остатък при 65та аминокиселинна позиция, която е сулфатирана.

При изучаването на животните, хирудин, пречистен от пиявици, показва ефикастност при предпазване от венозни тромбози, съдови отклоняващи се оклузии и тромбин-индуцирани десиминирани интраваскуларни (вътресъдови)' коагулации. Освен това, хирудинът показва ниска токсичност, малка антигенност и много къс

Markwardt et botic Action период на отстраняване от циркулацията [ F.

al.,Pharmacological Studies on the Antithromof Hirudin in Experimental Animals, Thromb.

Haemost.,

47, рр.

226-29 (1982)]

С цел да се получат по-големи количества хирудин, са

правени опити да се произвежда полипептида чрез рекомбинантни ДНК техники

Присъствието на О-сулфатиран тирозинов остатък в нативния хирудин и невъзможността на микроорганизмите да извършат подобна модификация на протеина направиха перспективата за рекомбинантно производство на биологично активен хирудин много спекулативна. Наблюдението, че дисулфатохирудините са почти толкова активни,колкото техните сулфатирани двойници [U.S. Pat. No. 4,654,502], все пак доведе до клонирането и експресията на хирудин в Е. coli [European

-6 patent applications 158,564,168,342 and 171,024] и дрожди [European patent application 200,655]. Въпреки тези предим ства, хирудинът е все още относително скъп за производство и не е широко достъпен в търговската мрежа.

Наскоро бяха направени усилия да се идентифицират пептидни фрагменти от нативния хирудин, които също са ефективни при продължаването на времето на съсирване. Един несулфати ран С-терминален фрагмент от хирудин с 21 аминокиселини ,

IN-ацетилхирудин , инхибира in vitro образуването на съсирек. Освен това, няколко други по-малки, несулфатирани пептида, съответствуващи на С-терминалните 11 или 12 аминокиселини на хирудина (остатъци 55-65 и 54-65) също са демонстрирали ефикасност при инхибиране на образуването на съсирен in vitro [J.L. Krstenansky et al., Antithrombin Properties of C-terminus of Hirudin Using Synthetic Unsulfated Nacetyl-hirudin , FEBS Lett, 211, pp. 10-16 (1987)]. Bee

пак, такива пеп.тидни фрагменти могат да се окажат недостатъчно задоволителни за разтварянето на кръвните съсиреци при режима на приложената терапия, поради ниската си активност.

Например , N-ацетил-хирудин 45·, притежава специфична активност с четири степени на величината по-ниска от нативния хи рудин .

Освен че катализира образуването на фибриновия съсирех, тромбинът притежава още някои други биорегулаторни роли [J.W. Fenton, II, Thrombin Bioregulatory Functions, Adv. Clin. Enzymol., 6, pp. 186-93 (1988)]. Например, тромбинът директно активира агрегацията на плаки и пуска реакциите. Това

4*

означава, че тромбинът играе централна роля при акутните съсирек-зависими тромбози.[S.R. Hanson and L.A. Harker, Interruption of Acute Platlet-Dependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Phenylalanyl-L-Prolyl-L-Arginyl-chloromethylketone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 3184-88 (1988)]. Тромбинът може също така директно да активира възпалителния отговор чрез стимулиране синтеза на активиращ плаките фактор (PAF) в ендотелните клетки [S. Prescott et al., Human Endothelialm Cells in Culture Procedure Platelet-Activating Factor (1-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3phospho-choline) When Stimulated With Thrombin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 3534-38 (1984)]. PAF се разполага на повърхността на ендотелните клетки и служи като лиганд при неутрофилна адхезия и последващо дегранулиране [G.M. Vercolletti et al.,Platelet-Activating Factor Primes Neutrophil Response to Agonists : Role in Ptomoting Neutrophil-Mediated Endothelial Damage, Blood, 71, pp. 1100-07 (1988)]. Алтернативно, тромбинът може да спомогне възпалителния процес чрез повишаване съдовата пропускливост, което може да доведе до едема [P.J. Del Vecchio et al., Endothelial Monolayer Permeability to Macromolecules, Fed. Proc., 46, pp. 2511-15 (1987)]. Реагентите, които блокират активния сайт на тромбина, като хирудин, прекъсват активирането на плаките и ендотелните клетки [C.L. Knupp, Effect of Thrombin Inhibitors on Thrombin-Induced Release and'Aggregation, Thrombosis Res., 49, pp. 23-36 (1988)].

Тромбинът участва, освен това, в потенциране на ръка,

-ΰ на неговия нативен смилателен

основаващо се на способността продукт, фибрин, да служи като субстрат при растежа на тумури [A. Falanga et al.,Isolation and Characterization of Cancer Procoagulant : A Cysteine Proteinase from Malignant Tissue, Biocheistry, 24, pp. 5558-67 (1985); S.G. Gordon et al.,Cysteine Proteinase Procoagulant From Amnion-Chorion, Blood, 66, pp. 1261-65 (1985); and A. Falanga et al., A New Procoagulant in Acute Leukemia, Blood, 71, pp. 870-75 (1988)]. Тромбинът, също така, участва в невродегенеративните заболявания, основавайки се на способността му да причинява невритна реакция [D. Gurwitz et al.,Thrombin Modulates and Reverses Neuvroblastoma Neurite Outgrowth, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5440-44 (1988)]. Ето защо, способността да се регулира in vivo активността на тромбина е от съществено клиническо значение.

Независимо от развитието до момемнта, все още съществува нуждата от молекула, която ефективно да инхибира тромбина при образуването на съсиреци, активирането на плаките и много други тромбин-медиирани процеси и която да може да се произвежда не скъпо и в търговски приложими количества.

СЪДЪРЖАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение решава изброените по-горе проблеми, като осигурява молекули, които имитират действието на хирудина, чрез свързване към двата - ниско афинитетния аниосвързващ екзосайт (АВЕ) и каталитичния сайт на (/-тромбина.

Тези молекули са по-силни от хирудина и следователно могат да се прилагат върху пациентите в дози, относително по-ниски от тези, изискващи се при режима на терапия, основаващ се на хирудин. Молекулите, съгласно изобретението, могат да се използват в състави и методи за инхибиране на тромбин-медиирани или тромбин-свързани функции или процеси. Фармацевтични състави, съдържащи тези молекули, така както и използуващи ги методи за лечение и профилактика на съдови заболявания, възпалителни отговори, карциноми и невродегенеративни заболявания, представляват също част от настоящето изобретение. Тези молекули могат, също така, да се използват в състави и методи за ex vivo ;моделиране, за складиране и тре тиране на извънтелесна кръв и за покриване на инвазивни устройства. Освен това, молекулите съгласно настоящето изобретение, могат да се прилагат на пациентите в комбинация с фибринолитичен агент, с цел повишаване ефикасността на при ложената доза на агента или за да се намали дозата на необходимия за дадения ефект агент, така че да се разтвори кръвниятсъсирек.

Благодарение на тяхната голяма мощ и на факта, че могат да се приготвят чрез техники на химичния синтез, молекулите, съгласно настоящито изобретение, могат да се приготвят евтино и в търговски приложими количества. В добавка на това, молекулите, съгласно настоящето изобретение, са значително по-малки от хирудина и съществува по-малка вероятност да стимулират нежелан имунен отговор при пациентите, третирани с тях. Във връзка с това, използването на тези инхибитори на

- -IQ тромбина не се огравичава само до лечението на остри заболявания. Тези молекули могат също така да се използват при лечение на хронични тромбоемболични заболявания, като атеросклероза и рестенозис в следствие на ангиопластия. Молекулите, съгласно настоящето изобретение, могат също така да се използват при голям брой други приложения на мястото на естествен или рекомбинантен хирудин.

Както ще бъде подчертано от следващото описание, моле»кулите, съставите и методите, съгласно изобретението, са полезни при третирането и предпазването от многобройни болести, дължащи се на нежеланите ефекти на тромбина, също както и за диагностични цели.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА СХЕМИТЕ

Фиг.1 изобразява авторадиография на SDS-полиакриламиден гел, демонстриращ свързването на DNFB-[^Sj-сулфо-Туг^_? хирудин gf към човешки «{-тромбин в присъствие или отсъствие на сулфо-Туг^ -Н-ацетил-хирудин^__{с 4} .

Фиг.2 изобразява триизмерен модел на човешки -тромбин.

Фиг.З-А изобразява ефектите на хирулог-8 и сулфо-Туг_сз хииудин^. ₆* върху разцепването на Спектрозим TH от човешки -тромбин.

Фиг.З-В изобразява Linewaever-Burke плот на разцепване на Спектрозим TH от човешкиoL-тромбин в присъствие или отсъствие на Хирулог-8 или Сулфо-Туг_вз -хирудин^_ .

Фиг.4 изобразява ефекта на вариращи концентрации на Хирулог-8, хирудин или Сулфи-Туг^^ -N-ацетил-хирудин върху

-Η -

времето за активиран частичен тромбопластин на нормален човешки серум.

Фиг.5-А изобразява протичането на времето за разцепване при различни концентрации на Хирулог-8 от човешки о(-тромбин.

Фиг.5-В изобразява връзката между концентрацията на Хирулог-8 и времетраенето на инхибирането на хидролизата на Спектрозим TH от човешки ^С-тромбин.

Фиг-6 изобразява ефекта от дължината на линкера на ин-

I- хибитора на тромбина, съгласно изобретението, върху инхибирането на тромбин-катализираната хидролиза на Спектрозим TH.

Фиг.7 изобразява ефекта на инхибиране на различни концентрации Хирулог-8 или сулфо-Туг_£5 -N-ацетил- хирудин^ върху модифицирането на тромбина от ^C-DFP.

Фиг.8 изобразява in vivo ефекта на различни дози Хирулог-8 върху АРТТ от бабуини.

Фиг.9 изобразява съпоставителните инхибиторни ефекти на Хирулог-8 или хепарин върху хидролизата на фибриноген от разтворим или свързан със съсиреха тромбин.

Фиг.10 изобразява in vivo ефектите на различни дози Хирулог-8 върху отлагането на плаки върху ендартеректомизиран сегмент на аорта от бабуин.

Фиг.11 изобразява in vivo ефектите на различни дози Хирулог-8 върху отлагането на плаки върху сегмент от обвит с колаген тюбинг, вкаран в бабуин.

Фиг.12 изобразява съотношението на in vivo ефектите на хепарин, хирудин или Хирулог-8 върху отлагането на плаки върху сегмент от обвит с колаген тюбинг, вкаран в бабуинско

-12AV отклонение.

Фиг.15 изобразява in vivo ефектите на различни дози на

Хирулог-8 върху отлагането на фибрин върху сегмент от обвит с колаген тюбинг, вкаран в бабуинско AV отклонение.

Фиг.14 изобразява изменението в

АРТТ в момент,следващ интравенозно болус инжектиране на бабуини с

Хирулог-8.

Фиг.15 изобразява изменението на АРТТ в момент,следващ подкожно инжектиране на

Фиг.16 изобразява бабуин с Хирулог-8. *' * съотношението на in vivo ефектите на тъкънен плазминоген активатор заедно с физиологичен разтвор, хепарин, хирудин или Хирулог-8 върху времето за реперфузия в модел на плъх.

Фиг.17 изобразява съотношението на in vivo ефектите на тъканен плазминоген активатор заедно с физиологичен разтвор, хепарин, хирудин или Хирулог-8 върху времето за реоклюзия в модел на плъх.

Фиг.18 изобразява съотношението на in vivo ефектите на

тъканен плазминоген активатор заедно с физиологичен разтвор, хепарин, хирудин или Хирулог-8 върху АРТТ в модел на плъх.

Фиг.19 изобразява съотношението на in vivo ефектите на тъканен плазминоген активатор заедно с физиологичен разтвор, хепарин, хирудин или Хирулог-8 върху отвора на съда в модел на плъх.

Фиг.20 изобразява ефекта на различни дози Хирулог-8 върху времето на кървене в модел на бабуин.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Следните най-често употребявани съкращения на аминоки-

селините	се използват в заявката и в претенциите :
Огп	- орнитин	Gly - глицин
Ala	- аланин	Vai - валин
Leu	- левцин	lie - изолевцин
Pro	- пролин	Phe - фенилаланин
Trp	- триптофан	Met - метионин 1—
Ser	- серин	Thr - треонин
Cys	- цистеин	Туг - тирозин
Asn	- аспаргин	Gin - глутамин
Asp	- аспартат	Glu - глутамат
Lys	- лизин	Arg - аргинин
His	- хистидин	Nle - норлевцин
Hyp	- хидроксипролин	Pgl - фенилглицин
Ac -	ацетил	Sue - сукцинил
BOC	- третичен бутокси карбонил	Tos - параТолуол сулфонил
Cbz	- карбобензилокси	D-Ala - D-аланин
3,4,	-дехидроРго - 3,4,-	Sar - саркозин

дехидропролин (N-метилглицин)

Tyr(OSO^H) - тирозин сулфат

Tyr(S0₃H) - тирозин сулфонат

3-,5-ДийодоТуг - 3-,5дийодотирозин

Терминът коя да е аминокиселина”, както се използва . тук, включва L-изомери на естествено съществуващите в приро-44.

дата аминокиселини, така както и други не-белтъчни «’С аминокиселини, обикновено използвани от работещите в белтъчната химия, когато приготвят синтетични аналози на естествено срещащите се в природата белтъчини. Естествено срещащите се в природата аминокиселини са: глицин, аланин, валин, левцин, изолевцин, серин, метионин, треонин, фенилаланин, тирозин, триптофан, цистеин, пролин, хистидин, аспартат, аспаргин, глутамат, глутамин, -карбоксиглутамат, аргинин, орнитин и лизин. Примери за ’’небелтъчни” ^-аминокиселини

са норлевцин, норвалин, алоизолевцин, хомоаргинин, тиапролин, дехидропролин, хидроксипролинч (Нур), хомосерин, циклохексилглицин (Chg), &С -амино-п-бутират (Aba), циклохексилаланин (Cha), аминофенилбутират (РЬа), фенилаланини, заместени на орто, мета или пара позиция от фенилната част с едно или две от следните : (С^-С^.) алкил, (С^-С^.) алкокси, халоген или нитрогрупи или заместени с метилендиоксидна група; -2 и 3-тиофен-аланин, Р-2- и 3-фуранил-аланин, -2-, 5- и

4-пиридил-аланин, В-(бензотиофен-2- и 3-у1)аланин, В-(1- и

2-нафтил)аланин, О-алкилирани производни на серин, треонин или тирозин, S-алкилиран цистеин, S-алкилиран хомоцистеин, О-сулфат, О-фосфат и О-карбоксилирани естери на тирозин, 3и 5-сулфонил-тирозин, 3- и 5-карбонил-тирозин, 3- и 5-фосфонил-тирозин, 4-метилсулфонил-тирозин, 4-метилфосфонил-тирозин, 4-фенил оцетна киселина, 3,5-дийод-тирозин, 3- и 5-нитротирозин, £-алкиллизин, делта-алкил орнитин и D-изомерите на естествено .срещащите се в природата аминокиселини.

Терминът пациент както се използва в настоящето ~4b'~ описание, се отнася до кое да е млекопитаещо, и по-специално човека.

Терминът анионна аминокиселина, както е употребен тук, означава мета, пара или орто, моно- или ди-заместен фе нилаланин, циклохексилаланин или тирозин, съдържащ карбоксилна, фосфорилна или сулфонилна част, също както и S-алкилиран цистеин, S-алкилиран хомоцистеин, ft-карбоксиглутамат, £-алкил лизин, делта-алкил орни^ин, глутамат и аспартат. Примери за анионни амино киселини са фосфотреонина, фосфосерина, фосфотирозина, 3-, 4-, или 5-сулфотирозина, З-метил фосфонил тирозина и З-метил сулфонил тирозина.

Термините каталитичен сайт, активен сайт и покет на активния сайт, както са употребени тук, всеки се отнася до кой да е или до всички от следните сайтове в тромбина:

субстрат-свързващия или S^ сайт; хидрофобно свързващия или oily сайт; и сайтът, при който в същност се извършва разцепването на субстрата (същински носещ сайт).

Терминът , както се употребява тук, се отнася

до азота на страничната верига на орнитина. Терминът се отнася до кой да е азот на страничната верига на аргинина.

Терминът N*^ се отнася до pZ -амино-групата на аминокиселина. Терминът psi, както се употребява в заяв ката и претенциите, се отнася до заместването на една амидна връзка с атомите, посочени в скоби, съгласно номенклатурата, описана в J. Rudinger, In Drug Design, Vol. II, E.J. Ariens, ed., Academic Press, New York, p. 319 (1971).

Терминът главна верига, както се употребява тук, се отнася до участъка от химическата структура, който дефинира най-малкия брой последователни връзки, които могат да се на-Ί6пишат от единия до другия край на химическата структура. Атомните компоненти,които се включват в главната верига, могат да съдържат кой да е атом, способен да образува връзки с най-малко два други атома.

Например, всяка от следните химични структури се характеризира с главна верига от 7 атома (атомите, които са включени в главната верига,са посочени одебелено):

Терминът изчислена дължина, както се употребява в на-

стоящето описание, се отнася до предполагаеми измервания, произтичащи от сумирането на дължините на връзките между атомите, от които се състои главната верига. Дължините на връзките между които и да са два дадени атома са добре известни от нивото на техниката [виж например, CRC Handbook of Chemistry and Physics, 65th Edition, R.C. Weist, ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., pp. F-166-70 (1984)].

Настоящето изобретение се отнася до молекули, които се свързват към и инхибират тромбин. Тези молекули се характе-

ризират от три домена: каталитична сайт-насочена част (CSDM), линкерна област и анион-свързващ екзосайт асоциирана част (ABEAM).

Съгласно ностоящето изобретение, първият домен, CSDM, се свързва към каталитичния сайт на тромбина, локализиран или близо до Ser-195 и инхибира или забавя амидолитичната или естеролитичната активност на тромбина. За предпочитане, CSDMs, съгласно настоящето изобретение, се подбират от една от три главни групи: тези, които обратимо се свързват към тромбина и бавно се разцепват; тези, които обратимо се свързват към тромбина и не могат да бъдат разцепени; и тези,

които се свързват необратимо към тромбина. Обратимите инхибитори се свързват към активния сайт на тромбина чрез нековалентни връзки, такива като йонните връзки, хидрофобните връзки или водородните връзки. Необратимите CSDMs образуват ковалентни връзки с тромбина.

Съгласно предпочитания вариант, CSDMs, които се свързват обратимо към тромбина и се разцепват бавно са с формула:

Х-А₄-Α_Λ-Α₃-Υ където X е водород или се характеризира чрез главна верига, състояща се от 1 до 35 атома; А^ е Arg, Lys или Огп; Ао е неамидна връзка; А^ се характеризира с главна верига, състояща се от 1 до 9 атома; a Y е връзка.

Компонентът на неамидната връзка, сагласно настоящето изобретение, може да се образува,като химически се модифицира една амидна връзка. Това може да се постигне чрез добре известни методи ,.от нивото на техниката [М. Szelke et al., Potent New Inhibitors of Human Renin, Nature, 299, pp 55557 (1982); D.H.Coy et al. Facile Solid Phase Preparetion of Proteins Containing the CH^-NH Peptide ond Isostere and Application to the Synthesis of Somatoststin (SRIF) Octapeptide Analogue, Peptides 1986, D. Theodoropoulos, Ed., Walter DeGruyter & Co., Berlin, pp. 143-46 1987)]. Когато по този начин се образува : неамидна . връзка, за предпочитане е химичната модификация да се осъществи преди прибавянето на дипептйда, съдържащ тази връзка, към другите компоненти на CSDM или към остатъка от тромбин-инхибиращата молекула. По този

-4Ч-

начин, к_л -A^-Aj - се прибавя в блок към остатъка от молекулата, при едно единствено стъпъло от синтезата.

Съгласно най-предпочитания вариант, А, е Arg, а А_? е Pro, D-Pro или Sar. При тази установка е естествено срещаща се в природата амидна връзка, която бавно се разцепва от тромбина. Така се избягва нуждата от преобразуване на неамидната връзка и позволява и А^ да бъдат прибавени на секвенции към остатъка от молекулата, отколкото в блок.

Както се установи по-горе, CSDMs, съгласно настоящето изобретение, могат да се свързват необратимо към тромбина. Примери за необратими CSDMs включват, но не се ограничават до, общи серин протеиназни инхибитори, такива като фенилметилсулфонилфлуорид (PMSF), диизопропилфлуорофосфот (DFP), тозилпролилхлорометилкетон (ТРСК) и тозиллизилхлорометилкетон (TLCK); хетероциклични инхибитори на протеаза, като изокумарини; тромбин-специфични инхибитори, като D-Phe-Pro-ArgСНС1 (РРАСК); и аналози на транзиционно състояние, като дифлуорокетометилен.

Съгласно друг предпочитан вариант на настоящето изобретение, неразцепващи се, обратими CSDMs се състоят във формулата :

^X-^C^-^C _a-^A3-^Y където С^ е производно на Arg, Lys или Огп, характеризиращ се с редуцирана карбоксилирана част или карбоксилирана част, която е изместена спрямо -въглерода от химическа структура, характеризираща се с главна верига от 1 до 10 атома ; С^ е неразцепваща . се връзка; a X, Y и А^, са дефи-2Gнирани преди това. Примери за С компоненти са ^2 -хомоаргиt нин; аргинин съдържащ редуцирана карбоксилирана част, като Asg[psiCH NH] ; β -хомолизин и β-хомоорнитин.

Други неразцепващи се, обратими CSDMs, които могат да се използуват в тромбиновите инхибитори, съгласно изобретението са бензамидин, DAPA, NAPAP и аргатробан (аргипидин).

За тези инхибитори на тромбина, съгласно изобретението, които притежават CSDM области, характеризиращи се с или С^ \ ; връзка, терминът P^-fy секвенция, както се използува тук, се отнася до двете химически структури, свързани със споме натата връзка.

X компонентът от CSDM, който не участва в същинското свързване към каталитичния сайт, може да е с неограничена дължина и различна структура. Все пак, по целесъобразност и за намаляване стойността на синтеза, X за предпочитане се характеризира с главна верига,състояща се от 1 до 55 атома и не превишава пресметната дължина от 56 А. Предпочита се X да е пептид, особено предпочитано, D-Phe-Pro. Този най-пред-

почитан вариант позволява X компонентът да се намести в една вдлъбнатина на тромбина, която е съседна на активния сайт [S. Bajust et al. ··Inhibition of Thrombin and Trypsin by

Tripeptide

Alde-hydes, Int

Peptide Protein Res., 12, pp. 217-21 (1978); C. Kettner et al . , D-Phe-Pro-Arg-CH Cl-A selective

Affini-ty Label for

Thrombin, Thromb. Res.,

14,рр. 969-75 (1979)].Това позволява CSDM компонентът и следователно ¹ молекулите, съгласно настоящето изобретение, да свързват тромбина c преимуществено висока степен на

-21афинитетност и оптимална специфичност.

Съгласно настоящото изобретение, вторият компонент на инхибиторите на тромбина, от настоящето изобретение, е линкерна област. Тъй като ролята на този участък от молекулата е да осигури мост между CSDM и ABEAM, от първостепенно значение е дължината на линкера, отколкото стуктурата му. Пресметната дължина на главната верига, характиризираща линкера, о трябва да е най-малко около 18 ·Α - разстоянието между каталитичния сайт и анионсъдържащия екзосайт на тромбина - и с по-малко от 42 А.

Главната верига на линкера може да съдържа кои да са атоми, способни да се свързват към поне два други атома. За предпочитане, главната верига се състои от коя да е химически възможна комбинация от атоми, избрани между кислород, въглерод, азот и сяра. Специалистите в областта усещат коя комбинация на атомите от горната главна верига попада в нужната дължина, базираща се на известните разстояния между различните връзки [виж например, R.T. Morisson and R.N. Boyd, Organic Chemistry, 5th Edition, Allyn and Bacon, Inc. Boston, Mass. (1977)]. Съгласно предпочитания вариант за осъществяване, линкерът е пептид, съдържаш аминнокиселинната последователност Gly-Gly-Gly-Asn-Gly Asp-Phe. За предпочитане е аминокиселинната връзка към ABEAM компонента да е Phe.

Третият домен на тромбиновите инхибитори, съгласно настоящето изобретение, е ABEAM, който се свързва към анионсвързващия екзосайт на тромбина. За предпочитане ABEAM има следната формула :

където W е връзка; В^ е анионна аминокиселина ; В^ е коя да е аминокиселина .; В^ е lie, al, Leu, Nle или Phe; В^ е Pro, Hyp, 3,4- дехидроРго, тиазолидин-4-карбоксилат, амино киселина; В θ е анионна аминокиселина ; В? е липофилна аминокиселина, избрана от група, състояща се от Туг , Trp, Phe, Leu, Nle, Не, Vai, Cha, Pro или дипептид, състоящ се от една от тези липофилни аминокиселини и коя да е аминокисе»лина; В& е връзка или пептид, съдржащ от един до пет остатъка от коя да е аминокиселина ; Z е карбокси краен остатък, избран от ОН, С^-С^. алкокси, амино, моно- или ди-(С^-С^) алкил заместен амино или бензиламино.

Установено е , че пептиди, които са хомоложни на карбокси крайния участък на хирудина, се свързват към анионсвързващия ексзосайт на тромбина [ copending U.S. patent application Ser. No. 314,756 and J.M. Maraganore et al., Anticoagulant Activity of Synthetic Hirudin Peptides, J. Biol. Chem., 264^ pp. 8692-98 (1989); като и двата са включени тук за справка].

Съгласно предпочитания вариант на изобретението, ABEAM е хомоложен на аминокиселини 56-64 на хирудина, т.е. В^ е Glu; В^ е Glu; Bj е Не; В^_ е Pro; Ве Glu; В^. е Glu; е Tyr-Leu, Tyr(SO^ H)-Leu или Tyr(OSOjH)-Leu или (3-,5-ДийодоTyr)-Leu; Β_β е връзка; a Ζ е ОН. Трябва да се отбележи, че нативният хирудин съдържа Tyr(OSOjH) при позиция 63. Въпреки това, карбокси крайните пептиди на хирудина, които съдъжат Tyr(SOjH) , притежават антикоагулантна активност идентична на тези, съдържащи нативен Туг(OSOjH) [see ifpending U.S. application Ser. No. 314,756].

Други ABEAM компоненти в сферата на настоящето изобретение могат да включават тези участъци от коя да е молекула, за която е известно, че се свързва-към анион-свързващ сайт на тромбина. Те включват аминокиселини 1675-1686 на Фактор V, амино киселини 272-285 от плака гликопротен 1Ь, аминокиселини 426-444 на тромбомодулин, аминокиселини 245-259 на протромбиновия фрагмент 2 и аминокиселини 30 до 44 на фибриноген А о£- веригата. Освен това, ABEAM компонентът може да бъде избран от кой да е аналог на пептида на хирудина, описани от J.L. Krstenansky et al., Development of MDL28,050, A small Stable Antithrombin Agent Based on a Functional Domain of the Leech Protein, Hirudin, Thromb. Haemostash, 63, pp. 208-14 (1990).

Предпочитаните инхибитори на тромбина, съгласно настоящето изобретениесе наричат Хирулоги и са описани в следващите примери. Най-предпочитаните Хирулоги са Хирулог-8, Хирулог-12, Хирулог -18а, Хирулог-18Ь и Хирулог-33. Хирулог-8, -12 и -33 са обратими инхибитори на тромбина, които бавно се разцепват Хирулог-18а и -18Ь са обратими инхибитори, които не се разцепват.

Инхибиторите на тромбин, съгласно настоящето изобретение, могат да бъдат синтезирани по различни техники, добре известни в нивото на техниката. Те включват ензиматично разцепване на естествен или рекомбинантен хирудин, рекомбинантни ДНК- техники, твърдо-фазов пептиден синтез,

течно-фазов пептиден синтез, органично химични техники на синтез или комбинация от тези техники. Изборът на техниката на синтез ще зависи, разбира се, от състава на отделния инхибитор. В предпочитания вариант, съгласно изобретението, тромбиновиятинхибитор е изцяло пептиден и се синтезира по техниките на твърдо-фазов пептиден синтез, течно-фезов пептиден синтез или тяхна комбинация, които съставят най-ефикасните по отношение на стойноста начини за производство на промишлени количества от тези молекули.

Когато не-белтъчни аминокиселини се съдържат в молекулата инхибитор на тромбин, те могат или да бъдат директно прибавени към растящата верига по време на пептидния синтез или да бъдат приготвени чрез химична модификация на целия синтезиран пептид, в зависимост от същността на желаната не-пептидна аминокиселина. Специалистите в химичния синтез добре чувстват кои не-пептидни амино киселини могат директно да се добавят и кои трябва да бъдат синтезирани чрез химическо модифициране на цялостната пептидна верига след белтъчния синтез.

Синтезът на тези инхибитори на тромбина, съгласно изобретението, които съдържат както не-амино киселина така и пептидни участъци, за предпочитане се осъществява чрез смесено хетероложно/твърдо-фазова техника. Тази техника въвлича твърдо-фазовата техника на всички или на повечето от пептидните участъци на молекулата, следвана от прибавянето на неаминокиселинни компоненти, които са синтезирани чрез течно-фазови техники. Не-; аминокиселините , могат да бъдат съ

- 2Fединени към пептидния участък чрез твърдо-фазови или течнофазови методи. Подобно, всеки оставащ пептиден участък, също може да бъде прибавен чрез твърдо-фазови или течно-фазови методи.

Молекулите съгласно настоящето изобретение проявяват силна антикоагулантна активност. Тази активност може да бъде изследвана in vitro, използувайки коя да е конвенционална техника. За предпочитане.изследване за антикоагулантна активност включва директно определяне на тромбин-инхибиторната активност на молекулата. Такива техники измерват инхибирането на тромбин-катализираното разцепване на колориметрични субстрати, или още по-добре, повишаването на тромбиновото време, или повишаването на времето на активиран частичен тромбопластин на кръвна плазма. Следващо изследване установява фактори в присъщите пътища на коагулацията. Алтернативно, използуваното изследване може да използува пречистен тромбин и фибриноген за измерване инхибирането на остатъка от фибринопептиди А или В чрез радиоимунен анализ или ELISA.

Антиплаковата активност на молекулите съгласно настоящето изобретение също може да бъде измерена чрез кой да е i конвенционален анализ за плаки. За предпочитане,анализът трябва да измерва промяната на степента на агрегация на плаките или промяна в остатъка от секреторния компонент на плаките, в присъствие на тромбин. Гореописаното може да бъде измерено чрез агрегометър. Последното може да бъде измерено, като се използват RIA или ELISA техники, специфични за сек- ;

S.

ретираните компоненти.

Молекулите от настоящето изобретение са приложими в състави, комбинации или методи за лечение и профилактика на различни болести, дължащи се на тромбин-медиирани или тром бин-свързани функции или процеси. Те включват инфаркт на миокарда, удар, белодробна емболия, тромбоза на дълбоките вени, периферна артериална оклюзия, рестенозис вследствие на артериално увреждане или кардиологични инвазивни процеду ри, остра или хронична атеросклероза, едем и възпаление, с различни клетъчно-регулаторни процеси (например секретиране, промяна на формата, пролиферация), рак и метастази и невро дегенеративни заболявания.

Тромбиновите инхибитори съгласно настоящето изобрете ние могат да се образуват, като се използват конвенционал ни методи за приготвяне на фармацевтично приложими състави, като прибавяне на фармацевтично приемлив носител. Тези състави и методите, които ги използват, могат да бъдат използвани за лечение или предпазване от тромбозни заболява

ния на пациента.

Съгласно изменен вариант на настоящето изобретение, тромбиновите инхибитори могат да бъдат използвани в комбинации, състави и методи за лечение на тромбозни заболявания и за намаляване дозата на тромболитичния агент, нужен за осъществяване на реперфузия или за предотвратяване на реок люзия на пациента. Освен това тромбиновите инхибитори съгласно изобретението могат да бъдат използвани : в комбинации, състави и методи за намаляване времето за реперфузия или за

-27увеличаване времето за реоклюзия в пациент, третиран с тромболитичен агент. Тези комбинации и състави включват фармацевтично ефективно количество тромбинов инхибитор, съгласно настоящето изобретение и фармацевтично ефективно количество от тромболитичния агент.

В тези комбинации и състави, тромбиновият инхибитор и тромболитичнияг агент работят в допълващ се начин за разтва ряне на кръвните съсиреци, в резултат на намаленото време за реперфузия и увеличеното време за реоклюзия в пациенти, третирани с тях. Специфично, тромболитичниягагент разтваря съсиреха, докато тромбиновиятитхибитор предотвратява ново изложения, включен в съсиреха или свързан със съсирека тромбин от регенериране на съсирека. Употребата на тромбиновия инхибитор в комбинациите и съставите, съгласно настоящето изобретение, преимуществено позволява прилагането на тромболитичен реагент телно приложени.

в дози, разгледани по-горе, като прекадено ниски да доведат до тромболитични ефекти, ако са самостояПо този начин се избягват нежеланите стра нични ефекти, свързани с употребата на тромболитични агенти, като усложнения с кървене.

Тромболитичните агенти, които могат да бъдат използвани в комбинациите и композициите, съгласно насто ящето изобретение, са тези,известни от нивото на техниката.

Такива агенти включват, но не се ограничават до, тъканен плазминоген активатор, пречистен от природни източници, рекомбинантен тъканен плазминоген активатор, стр&птокиназа, урокиназа, прурокиназа, анизолиран стрептокиназен плазмино-

ген активаторен комплекс (ASPAC), плазминоген активатори от слюнчни жлези на животни и известни, биологически активни производни от което и да е по-горните.

Терминът комбинация, както се използва тук, включва единична форма на дозиране, съдържаща най-малко един тромбинов инхибитор, съгласно настоящето изобретение, и най-малко тромболитичен агент; многократна форма на дозиране, при която инхибиторът на тромбин и тромболитичниятагент се прилагат поотделно, но конкурентно; или многократна форма за приложение, при която двата компонента се прилагат поотделно, но последователно. При последователното приложение, инхибиторът . на тромбин може да се приложи на пациента, в период от 5 часа преди до 5 часа след прилагането на тромболитичния агент. За предпочитане, тромбиновият инхибитор се прилага на пациента по време на период от 2 часа до 2 часа след прилагането на тромболитичния агент.

Алтернативно., тромбиновият инхибитор и тромболитичният агент могат могат да бъдат във форма на самостоятелни, конюгирани молекули. Конюгацията на два компонента може да се осъществи чрез стандартни cross-linking техники, добре известни в нивото на техниката. Самостоятелната молекула може също така да приеме формата на рекомбинантен фузионен протеин, ако и двата - инхибиторът на тромбин и тромболитичният агент са белтъчни.

Могат да се използват различни форми на дозиране за прилагане на съставите и комбинациите, съгласно изобретението. Те включват, но не се ограничават до, парантерално при

-29 ложение, орално приложение и локална апликация. Съставите и комбинациите съгласно настоящето изобретение могат да се прилагат на пациента във вякакви фарамацевтично приемливи форми на дозиране, включително и тези,които могат да се прилагат на пациента интравенозно като болус или чрез продължителна инфузия, мускулно - включително паравертебрално и периартикуларно - подкожно, интракутанозно, интраартикулярно, интрасиновиално, интратекално, интралезионално, периостално или чрез орален, назален или локален път. Такива комбинации и състави са за предпочитане адаптирани за назално орално или парентерално приложение, но най-вече за парентерално приложение.

Парентералните състави най-вече се прилагат интравенозно, както и болус форма или като постоянна инфузия. Ако инхибиторът на тромбин се използва като антиплаково съединение се предпочита постоянна инфузия. Ако инхибиторът на тромбин се използва като антикоагулант, се предпочита подкожно или интравенозно болус инжектиране. За парентерално приложение се приготвят течни единично дозирани форми, които съдържат инхибитор на тромбин съгласно настоящето изобретение и стерилен носител (вехикулум). Инхибиторът на тромбин може както да бъде суспендиран, така и разтворен, в зависимост от естеството на носителя и естеството на определения инхибитор на тромбин. Парентералните състави обикновено се приготвят чрез разтваряне на инхибитора на тромбин в носителя, при желание заедно с други компоненти, и се стерилизират през филтър преди пълнене в подходящи флакони или

-30ампули и се запечатват.За предпочитане, адюванти като локална анестезия, консерванти и буферни агенти, също се разтварят в носителя. Съставът може след това да бъде замра-

зен и лиофилизиран,	за да се засили стабилността.
Парентералните	суспенсии се приготвят по съвсем същия
начин, с изключение	на случаите, когато активната компонента

по-скоро е суспендирана, отколкото разтворена в носителя.

Стерилизирането на съставите за предпочитане се осъществява

чрез излагане на етиленов оксид преди суспендиране в стерилен носител. Преимуществено повърхностно активно вещество или мокрещ агент се включва в състава за улесняване еднородното разпределяне на компонентите му.

Таблетките и капсулите за орално приложение могат да съдържат конвенционални носители като свързващи агенти, пълнители, разтворители, таблетиращи агенти, мазилни вещества, дезинтегратори и мокрещи вещества.Таблетката може да бъде обвита, съгласно добре известни от нивото на техниката методи. Подходящите пълнители, които могат да бъдат използ вани, включват целулоза, манитол, лактоза и други подобни агенти. Подходящите дезинтигратори включват, но не се ограничават до нишесте, поливинилпиролидон и производни на нишестето като натриево гликолатна скорбяла. Подходящите мазилни вещества включват, например, магнезиев стеарат. Подходящите мокрещи агенти включват натриев лаурил сулфат.

Оралните течни препарати могат да бъдат под форма на водни или масни суспенсии, разтвори, емулсии, сиропи или еликсири, или могат да бъдат представени като сух продукт за

-У1~

възстановяване с вода или друг подходящ носител преди употреба. Такива течни препарати могат да съдържат конвенционални добавки. Те включват суспендиращи агенти като сорбитол, глюкоза, метил целулоза, желатин, хидроксиетил целулоза, карбокси-етил-целулоза, алуминиев стеарат гел или хидрогенирани хранителни мазнини; емулгиращи агенти, които включват лецитин, сорбитан моноолеат, полиетилен гликоли или акация; неводни носители, като бадемово масло, фракционирано кокосово масло и маслени естери; и консерванти, като метилили пропил- р-хидроксибензоат или сорбинова киселина.

Съставите, формовани за локално приложение могат, например, да бъдат водни желета, маслени суспенсии или емулгирани унгвентни форми.

Дозирането и размерът на дозата на тромбиновия инхибитор ще зависи от различни фактори, такива като големината на пациента, специфичните фармацевтични състави, които са използвани , третирания обект, например,терапия или профилактика, естеството на тромбозните заболявания, които се третират, и преценката на лекуващия лекар.

Съгласно настоящето изобретение, предпочитаната фармацевтично активна дневна доза на тромбиновия инхибитор, съгласно изобретението, е между 1 jat/kt тегло на пациента,за който се третира (телесно тегло) и около 5 мг/кг телесно тегло. При съставите, съдържащи тромболитичен агент, фармацевтично ефективната дневна доза на тромболитика е между 10¾ и 80¾ от конвенционалното ниво на дозиране. Конвенционалното ниво на дозиране на тромболитичния агент е дневната доза

ЗЯ използувана, когато този агент се прилага при монотерапия. [Physician’s Desk Reference 1989, 43rd Edition, Edward R. Barnhart, publisher]. Това конвенционално ниво на дозиране ще зависи, разбира се, от използвания тромболитичен агент. Примери за конвенционално ниво на дозиране са както следва : урокиназа - 500,000 до 6,250,000 единици/пациент; стрептокиназа - 140,000 до 2,500,000 единици/пациент; tPA - 0,5 до 5,0 мг/кг телесно тегло; ASPAC - 0,1 до 10 единици/телесно тегло.

За предпочитане, терапевтичните и профилактични състави, съгласно настоящето изобретение, включват тромбинов инхибитор в дози между 10у<г/кг телесно тегло и 500уИг/кг телесно тегло Най-предпочитаните комбинации включват същото количество тромбинов инхибитор и между 10% и 70% от конвенционалното ниво на дозиране на тромболитичния агент. Трябва също да се разбере, че дневната фармвщивтично ефективна доза на тромбиновите инхибитори, съгласно изобретението или на тромболитичния агент, присъстващ в съставите, съгласно изобретението, може да е по-малка или по-голяма от специфични те нива, цитирани по-горе.

След установяване на подобрение в състоянието на пациента, се прилага при нужда поддържаща доза от комбинацията или състава, съгласно изобретението. Следователно, дозата или честотата на приложение или и двете, може да се ограничат като функция от симптомите, до степен,при която се задържа подобреното състояние. След като симптомите се облекчат до желаното ниво, лечението трябва да се прекрати. Паци-зз ·

ентът може да се нуждае, въпреки това, от периодично лечение при поява на кой да е симптом на болестта.

Съгласно един алтернативен вариант на изобретението, тромбиновите инхибитори могат да се използват при състави и методи за покриване на повърхностите на инвазивни уреди, като се намалява риска от образуване на съсиреци или активиране на плаките, при пациенти,получаващи такива устройства. Повърхностите, които могат да бъдат покрити със съставите

Iсъгласно изобретението , включват например протези, изкуствени клапи, съдови присадки, стентове и катетри. Методите и съставите за покриване на тези уреди са извести# на специалистите в областта . Това включва химическо омрежване или физическа абсорбция но тромбин-инхибитор съдържащия състав на повърхността на уредите.

Съгласно следващ вариант на настоящето изобретение, тромбиновите инхибитори могат да се използват за ex vivo представяне на тромб в пациент.При този вариант, тромбиновият инхибитор се маркира с радиоизотоп. Изборът на радиоизотоп се основава върху броя токсичност, биологичен на добре известни фактори, например полуживот > и откриваемост (детектив ност). Предпочитаните радиоизотопи включват, но не се ограΊΖζ _т 42 З_т 4<1 _т ничават до I, I и In. Техниките за маркиране на тромбиновия инхибитор са добре известни от нивото на техниката. Предпочита се радиоизотоп I, а маркирането се осъyj 2 ществява, като се използва I-Bolton-Hunter реагент. Маркираният тромбинов инхибитор се прилага на пациент и позволява свързване към тромбина, съдържащ се в съсиреха. След

			‘34-
това	се	наблюдава	съсирека,	като се използуват добре
известни	техники з4.	откриване	като камера, способна да от-
крие	радиоактивност,	съчетана	с компютърна изобразителна

система. Тази техника позволява също така, образи на свързания с плака тромбин и на меизотромбин.

Изобретението се отнася също така до състави,съдържащи инхибиторите на тромбин, съгласно настоящето изобретение и методи за употреба на такива състави при лечението на туморни метастази. Ефикасността на тромбиновите инхибитори, съгласно изобретението, за третирането на туморни метастази, се изразява чрез инхибирането на растежа на метастазите. Това се основава на присъствието на прокоагулантен ензим в някои ракови клетки. Този ензим активира конверсията на Фактор Ха в коагулационна каскада, завършваща с отлагане на фибрин, който на свой ред служи като субстрат при растежа на тумора. Чрез инхибиране отлагането на фибрин чрез инхибирането на тромбин, молекулите съгласно настоящето изобретение служат като ефективни агенти срещу туморните метастази. Примери за метастатични тумори, които могат да бъдът третирани с инхибиторите на тромбин, съгласно изобретението, включват, но не се ограничават до карцинома на мозъка, карцинома на черния дроб, карцинома на белия дроб, остеокарцинома и неопластична карцинома на плазмените клетки.

Изобретението също се отнася до методи и състави, използващи горе описаните инхибитори на тромбин за инхибиране на тромбин-индуцираната активация на ендотелните клетки. Това инхибиране включва репресията на синтеза на фактора за

- з$активиране на плаките (PAF) от ендтелните клетки. Тези състави и методи имат важно приложение при лечението на заболявания, характеризиращи се с тромбин-индуцирано възпаление и едем, които се считат са медиирани от PAF. Такива заболявания включват и не се ограничават до синдром на старческо респираторно изтощение, септичен шок , септицемия и реперфузионни увреди.

Ранните стадии на септичния

Iшок включват прекъснати, остри възпалителни и коагулопатични отговори. Преди това бе показано, че инжектирането на бабуини с летална доза от живи

Е. coli води до отклонение в неутрофилното броене, кръвното налягане и хематокрита. Промените на кръвното налягане и хематокрита се дължат от части на генерирането на десеминирана интраваскуларна коагулопатия (DIC) и са посочени за успоредна консумация на фибриноген [F.B. Taylor et al., ’’Protein C

Prevents the

Coagulation and Lethal Effects of Escherichia coll infusion in,, the Baboon, J. Clin. Invest., 79, pp. 91825 (1987)]. Неутропенията се дължи на остър възпалителен отговор, причинен от септичен шок, който причинява подчертано повишаване на степента на тумор-некрозис фактора. Тромбиновите инхибитори, съгласно изобретението, могат да се използуват в състави и методи за лечение или предпазване от DIC при септицемия и други заболявания.

Настоящето изобретение се отнася също така до употребата на горе описаните инхибитори на тромбина или включващи ги състави като антикоагуланти за извънтелесна кръв

Както се използва . тук, терминът извънтелесна кръв включва

-Ъб отделена. от пациента кръв, подложена на извънтелесно третиране, след което отново върната в пациента, при такива процеси като процедурата на диализа, филтриране на кръвта или кръвен байпас при операция. Терминът включва също и кръвни продукти, които се запазват извънтелесно за евентуално при-

ложение върху пациент и взимане на кръв от пациент, която да се използва при различни изследвания. Такива продукти включват цяла кръв, плазма или коя да е кръвна фракция, при която е желателно инхибирането на коагулацията.

Количеството или концентрацията на тромбиновия инхиби тор в този тип състави се базира на обема на кръвта за тре тиране или, за предпочитане, нейното тромбиново съдържание.

/

За предпочитане, ефективно количество от тромбиновия инхибитор, съгласно извънтелесната изобретението, за предпазване от коагулация в кръв, е от 1 г/ бОмл извънтелесна кръв до около 5 мг/ 60 мл извънтелесна кръв

Тромбиновит© инхибитори съгласно изобретението могат да се използват за инхибиране на свързания със съсиерка тромбин, за който се смята, че допринася за увеличаването на съсирека. Това особено важно, тъй като общо използваните антитромбинови агенти като хепарин и хепарина с ниско молекулно тегло, са неефективни срещу свързания със съсирека тромбин.

Накрая, тромбиновите инхибитори, съгласно изобретението, могат да се използват в състави и методи за третиране на невродегенеративни заболявания. Известно е, че тромбинът причинява невритна ретракция, процес предполагащ закръгляне-37то при промените на формата на мозъчните клетки и замесен в невродегенеративните зоболявания, като болестта на Алцхаймер и болестта на Паркинсон.

За да бъде по-пълно разбрано описаното тук изобретение, са изготвени следните примери. Трябва да се разбере, че тези примери са само за илюстративна цел и не трябва да се тълкуват като ограничаващи по какъвто и да е начин настящето изобретение.

ПРИМЕР 1

Приготвили сме този пептид чрез твърдофазов пептиден синтез, използвайки

Applied Biosystems 430 A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, Calif.).

Специфично реагират 0,259 мек от BOC-O-Leu смола (1% DVB смола) последователно с 2 ммола от предпазените аминокиселини. След 10 цикъла на синтез, отстранихме предпазването на пептида и го отделихме от DVB смолата чрез третиране с анхидро HF: р-крезол: етил метил сулфат (10:1:1, об/об/об). След това пептидът се пречиства на Vydac C^g обратно фазова колонна HPLC (22 мм х 25 см), която предварително се калибрира с 0,1% TFA във вода. Преди поставянето на пептида в колоната, го разтваряме в 2,0 мл 0,1% TFA във вода. Ако е нужно, се прибавя нъм пробата допълнително 1мл 6М гуанидин хлорид за повишаване разтворимостта. След поставяне на пробата, колоната се промива с растящ линеен градиент на ацетонитрил (0-80%) в 0,1% TFA над 45 минути при скорост на потока 4,0 мл /мин. Изходният поток се изследва на 229 нм и фракциите се събират ръчно.

Сулфатираме получения пречистен пептид при единичния тирозинов остатък, използувайки стандартна методика [Т. Nakahara et al., Preparation of Tyrosine-0-[ ^3S~ SjSulfated Cholecystokinin Octapeptide From A Non-Sulfated Precursor Peptide, Anal. Biochem., 154,.pp. 194-99 (1986)]. Сулфо-Туг_вз

хирудин^^ след това се пречиства от други пептиди и реакционни компоненти чрез обратно фазова HPLC, използувайки

Vydac Сд колона (4,6 х 25 см) и Applied Biosystems система за течна хроматография. Колоната се калибрира с 0,1% TFA/воден разтворител и се промива ацетонитрил с концентрация от скорост на потока 0,8 мл/мин с тел. Фракциите се изследват за с растящ линеен градиент на до 35% над 90 минути при 0,085% TFA-съдържащ разтвориабсорбция при 214 нм.

ПРИМЕР 2

I Омрежване на човешки тромбин със сулфо-Туг-ез динитрофлуоробензил-хирудин ₆

Приготвяме сулфо-Туг -динитрофлуоробензил-хирудин^ (2,0 мг; приготвен както в пример 1) със стехиометрично количество дифлуородинитробензол (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) в диметил формамид (DMF) в продължение на 18 часа при стайна температура. След това подлагаме пробата на аналитично HPLC разделяне, използувайки Applied Biosystems 150 A Liquid Chromatographic System и Brownlee RP-500 C& ko- |

-32* лона (0,46 х 10 см), за да се определи степента на произволност. Колоната се калибрира с 0,1% TFA във вода (солвент А) и се промива с 0-50% линеен градиент на 0,085% TFA/70% ацетонитрил (солвент В) над 45 минути и след това 50 100% линеен градиент от солвент В над 15 минути.

Използваме постоянна скорост на потока от 1,0 мл/мин.

Изходният поток се изследва за абсорбция на 214 нм и 310

нм. Производният пептид с дифлуородинитробензолов реагент абсорбира при 310 нм. Открихме, че гореописаната реакция дава сулфо-Туг

-DNFB-хирудин при 15 до 30% добив.

След синтеза сулфо-Туг -DNFB-хирудин се запазва в същия диметилформамиден разтворител при 20^вС до 1 месец.

Извършва се реакция между 10 пъти моларен сулфо-Туг^ DNFB-хирудин 53^4 в излишък с човешки -тромбин (12,5 мг) в прждължение на 18 часа при стайна температура във фосфат-буфериран физиологичен разтвор. Установяваме степента на омрежване чрез анализиране на реакционната смес на SDS-полиакриламиден гел. SDS-PAGE показва намаляване на относителната подвижност на тромбиновата ивица, отразяващо увеличаване на молекулното тегло от 1000-2000 далтона (Da). Тази промяна се дължи на омрежването на тромбина със сулфо-Туг-DNFBхирудину^.^4. на единичен сайт.

Потвърждаваме, че тази конформация мужду ковалентния комплекс сулфо- Туг$₃-DNFB-хирудин и човешки тромбин е специфична чрез използване на [^*S]-сулфо-Туг^ -DNFB-хирудин . [³⁵δ]-сулфо-Tyr^j -DNFB-хирудинсе приготвя предимно както е описано по-горе, използувайки

-^0-

вместо Η·£ SO^ при процеса на сулфатиране на Накахара [ виж свързания патент на САЩ заявка ser. Nos. 164,178, 251,150, 280,618 и 514,756 и J.M. Maraganore et al., Anticoagulant Activity of Synthetic Hirudin Peptides, J. Biol. Cjem., 264, pp. 8692-98 (1989), всички,от които са включени тук за справка].

Поставяме в реакция [ S]-сулфо-Туг-DNFB- хирудин^^ с човешки s^- тромбин както в присъствие, така и в отсъствие на 5 или 20 пъти моларен (над концентрацията на тромбин) сулфо-Туг^ -N-ацетил-хирудинв излишък (приготвен, както в пример 1, с прибавяне на N-ацетил аспаргин като крайна стъпка от пептидния синтез). Следва инкубиране при стайна температура в продължение на 18 часа, след което сместа се подлага на SDS-PAGE и авторадиография. Резултатите (фиг. 1) показват, че [^S]-маркираният пептид се инкорпорира в ивицата, която представя тромбин и че присъствието на студен, немаркиран хирудин пептид намалява размера на обра-

зуване на ковалентния комплекс до < 10^. Така, реакцията на сулфо-Туг-DNFB-хирудинс тромбин води до стехиометрично свързване 1:1 на хирудин пептида към специфичния свързващ сайт.

С цел да се идентифицира сайта на тромбина, където сулфо-Tyrgj -DNFB-хирудинсе свързва, тромбин/сулфо-Туг^удинитробензил( DNB )-хирудин _ комплекса (1,0 мг) се пуска на Sephadex G-50 колона (1,5 х 45 см), калибрира се и промива с 7М уреа, 20 мМ Трие, pH 7,5. Тази хроматография отделя всеки нереагирал сулфо-Туг^ -DNFB-хирудин^ _. Изолира се

-Цпик, съдържащ тромбин/сулфо-Туг^-DNB-хирудин^в свободния обем фракции, обединени и редуцирани чрез прибавяне на

10^дл ^-меркапто етанол.

След редукцията подлагаме комплекса на S-карбокси метилиране, използвайки s йодооцетна киселина, както е описано по-горе [J. М. Maraganore et al., A New Class of Phospholipases Aj£ > with Lysine in Place of Aspartate-49, J. Biol. Chem. 259, pp. 13839-43 (1984Ц. Редуцираният S-алкилиран протеин след това се диализира екстензивно спрямо 5% оцетна киселина при стайна температура. След диализата смиламе комплекса с пепсин (2% т/о) в продължение на 4 часа при 37*С. Пептидните фрагменти от редуцирания S-карбокси метилиран тромбин /сулфо-Туг^ -DNB-хирудинg^. се пречистват чрез обратно-фазова HPLC, използвайки Aquapore Rp-300 С& колона (0,46 х 10 см ). Колоната се калибрира с 0,1 % TFA във вода и се промива с растящ градиент на 0,08536 TFA/70% ацетонитрил (О-бОЗб) над 80 минути при скорост на изтичане 1,0 мл/мин. Изходният поток се изследва за абсорбция както при 214 нм,

така и при 310 нм. Автоматично се събират фракции по 10 мл.

HPLC разделянето на пептидните фрагменти позволява отделяне то на единичен най-висок пик при 214, както и при 310 нм абсорбиращ материал. Поради неговата далечна UV абсорбция, този фрагмент съдържа свързания сулфо-Туг_ез -DNFB-хирудин^_

След това подлагаме фрагмента на автоматична Edman деградация с Applied Biosystems 470 А газово-фазов секвентор, екипиран с 900А система данни. Фенилтиохидантоин (РТН) аминокиселини се анализират on-line, използвайки Applied Biosys-42tems 120A PTH анализатор и PTH-C^g колона (2,1 х 220 мм).

Следва таблица, показваща повторяеми добиви на секвентния анализ :

цикъл		аминокиселина	пмола
1		Lys i-	858,5
2		Glu	629,2
5		Thr	557,6
4		Trp	276,5
5		Thr	289,0
6		Ala	474,4
7		Asn	569,0
8		Vai	490,7
9		Gly	296,1
10		(x)	(-)
1 1		Gly	267,2
12		Gin	208,8
15		Pro	105,5
14		Ser	21 ,6
15		Vai	25,5

Thrombin Active Site Regions

Semin. Thromb. Hemostasis

12, pp. 200-08 (1986)]. Пептидното разцепване се осъществява при Leu-Lys и Vai-Leu връзките, съгласно специфичността на ензима.

-4 '3 ~

По време на секвентния анализ, аминокиселината _?отговаряща на Lys-149 (цикъл 10),не може да бъде идентифицирана или количествено определена. Това най-вероятно се дължи на дериватизацията (произволността) на £ -NH^ групата на тази аминокиселина с динитрофлуоробензилна част от сулфо-Туг^ DNFB-хирудин

Така, Lys-149 е най-големия сайт, където сулфо-Туг ₽3

-DNFB-хирудин^ реагира с d, -тромбин.

ПРИМЕР 3

Модел на тромбинов инхибитор, способен да блокира каталитичния сайт, и свързващ се към анионсвързващия екзоасайт

Карбокси крайните хирудин пептиди ефективно блокират хидролизата на ^ромбин-катализиран фибриноген, но не и хидролизата на хромогенен субстрат [J.M. Maraganore et al., J. Biol. Chem., 264, pp. 8692-98 (1989)]. Освен това, хирудиновите пептиди не неутрализират тромбин-катализираната активация на Фактори V и VIII [J.W. Fenton, II, et al., Hirudin Inhibition by Thrombin, Angio. Archiv. Biol., 18, p. 27 (1989)].

Хирудиновите пептиди като сулфо-Туг^ -N-ацетил-хирудин^^/ изразяват силен инхибиторен ефект срещу тромбин-индуцираната активация на плаките in vitro [J.A. Jakubowsky and J.M. Maraganore, Inhibition of Thrombin-Induced Platelet Activi

ties by a Synthetic 12 Amino Acid Residue Sulfated Peptide (Hirugen), Blood, p. 1213 (1989)]. Въпреки това, тромбинов инхибитор, способен да блокира активния сайт може да бъде нужен за инхибирането на плановата тромбоза in vivo, ако активирането на Фактори V и VIII са степен-ограничаващи стъпки. Това заключение се основава на резултатите, получени с необратимия тромбинов инхибитор (D-Phe)-Pro-Arg-CHCl [S. R.Hanson and L>A Harker, Interruption of Acute PlateletDependent Thrombosis by the Synthetic Antithrombin D-Phenylalanyl-L-Arginyl Chloromethyl Ketone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 3184-88 (1988)] и други обратими инхибитори на тромбина [J.F. Eidt et al.,Thrombin is an Important Mediator of Platelet Aggregation in Stenosed Canine Coronary Arteries with Endothelial Injury, J. Clin. Invest., 84, pp. 18-27 (1989)].

Използвайки горната информация, че КН^-краягна хиродиновите пептиди е проксимален до Lys-149, използвахме триизмерен модел на тромбин (Фиг. 2),[B.Furie,, et al., Computer-Generated Models of Blood Coagulation Factor Xa, Factor IXa, and Thrombin Based Upon Structural Homology with Other Serine Protease, J. Biol. Chem. 257, pp. 3875-82 (1982)] за да се обрисува агент ₅който : 1 \ се свързва към анион свързващия екзосайт на тромбина; 2\ е способен да блокира джоба на активния сайт на тромбина и да инхибира функцията на каталитичните остатъци, съдържащи се там.

Определихме, че минималното разстояние на £ -NH^ на л ·°

Lys-149 от 7? -хидроксилата на Ser-195 е 18-20 А. Основава-4,5вайки се на дължина о

А/ аминокиселинен остатък , пресметнахме, че най-малко около 4-7 аминокиселини ще са нужни за да свържат хирудиновия пептид, така както сулфо-Туг.,

-хирудина^₃ _ , към домен, съдържащ структура на активния сайт на инхибитора. Съставът на линкера е посочен като глицин. Глицинът е избран,за ла се проектира най-голямата подвижност на линкера за тези предварителни изследвания. Трябва да се разбира, все пак, че другу* по-здрави полимерни линкери също могат да бъдат използвани

Избрахме последователността (D-Phe)-Pro-Arg-Pro като инхибитор на активния сайт, тъй като тромбинът проявява специфичност към

Arg като Р^ аминокиселина при разцепването на субстратите. Pro, следващ Arg, води до връзка, която се разцепва много бавно от тромбина. Означаваме редуващите се пептиди чрез заместване на Pro (следващ Р„ или N-метил-аланин аминокиселина или чрез

Arg) със саркозил химическа редукция на Arg-Gly разцпена (сисилна) връзка.

ПРИМЕР 4

Синтез на Хирулог-8

Формулата на Хирулог-8 е: H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly )^_Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH.

Синтезирахме Хирулог-8 чрез конвенционален твърдо-фазов пептиден синтез, използвайки Applied Biosystems 43ОА Peptide Synthesizer. Този пептид се синтезира, използвайки BOC-Lлевцин-О-дивинил-бензолова смола. Допълнително се използват t-BOC- аминокиселини ; (Peninsula Laboratories, Belmont, Са-46-

lif.), включващи BOC-O-2,б-дихлоробензил тирозин, BOC-L-глутамат (7-бвнзил- естер), BOC-L-пролин, BOC-L-изолевцин, ВОСL-фенилаланин, BOC-L-аспартат (В-бензил естер), ВОС-глицин, BOC-L-аспаргин, BOC-D-фенилаланин и BOC-D-аргинин. С цел да се получат по-високи добиви при синтеза, (Gly)^. линкерният сегмент се прикрепва в два цикъла при ръчно прибавяне на ВОС-глицилглицин (Beckman Biosciences, Inc., Philadelphia, Pa.) . След завършване на синтеза, пептидът изцяло се отделя от предпазителите и се разделя от дивенилбензоловата смола, чрез третиране с безводен HF: р-крезол: етилметил сулфат (10:1:1, об/об/об) . След отделянето от смолата, пеп

тидът се лиофилизира до сухо.

Суровият Хирулог-8 се пречиства чрез обратно-фазова HPLC, използвайки Applied Biosystems 151А течно хроматографска система и Vydac колона (2,2 х 25 см). Колоната се калибрира с 0,1% TFA/вода и се промива с линеен градиент на растяща концентрация на ацетонитрил от 0 до 80% над 45 минути в 0,1% TFA при скорост на изтичане 4,0 мл/мин. Изходният поток се изследва за абсорбция при 229 нм и фракциите се събират ръчно. Пречистваме 25-30 мг суров Хирулог-8 чрез HPLC и получаваме 15-20 мг чист пептид.

Потвърждаваме структурата на пречистения Хирулог-8 чрез анализ на аминокиселините и последователностите. Приготвят се аминокиселинни хидролизати чрез третиране на пептида с 6N НС1, in vacuo, при 110°С в продължение на 24 часа. След това анализираме хидролизатите чрез йонообменна хроматография и последващо нинхидрин-дериватизация/определяне, '47използвайки Beckman 6500 автоматичен анализатор. Осъществихме секвенционен анализ, използвайки автоматична Edman деградация с Applied Biosystems 470А газово-фазов секвенатор, оборудван с Model 900А система данни. Фенилтиохидантоин (РТН) аминокиселини се анализират on-line, използвайки д_р_ plied Biosystems 120А рТН-анализатор и РТН-С колона (2,1 х 220 мм).

ПРИМЕР 5

Синтез на Хирулог-9

Формулата на Хирулог-9 е: Н-( D-Phe )-Pro-Arg-D-Pro-( Gly )^

-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Синте зирахме този пептид по същия начин, както е описано в пример 4, използвайки л BOC-D-пролин (Peninsula Laboratories) при цикъл 15 вместо BOC-L-пролин. Пречистването и охарактеризираното се осъществяват както е описано в пример 4.

ПРИМЕР 6

Синтез на Хирулог-10

Формулата на Хирулог-10 е: H-(D-Phe )-Pro-Arg-Sar-( Gly )j-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Пептидът се синтезира, както в пример 4, използвайки

ВОС-саркозин (Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo.) при цикъл 16. Пречистването и характеризирането се осъществяват, както е описано в пример 4.

ПРИМЕР 7

Синтез на Хирулог-11

Формулата на Хирулог-11 е : H-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly)4.

-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-(5,5-дийодоТуг )Leu-OH. Този пептид е синтезиран,както в пример 4, използ вайки ВОС-3,5-дийодо-Ь-тирозин (Sigma) при цикъл 2. Пречистването и характеризирането се осъществяват, както е описано в пример 4.

ПРИМЕР 8

Синтез на Хирулог-12

Формулата на Хирулог-12 е : Н-(D-Phe)-Pro-Arg-Pro-(Gly) -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-I1e-Pro-Glu-Glu-Туг(OSO j )-Leu-OH. Този пептид се синтезира, като реагират 1,0 мг Хирулог-8 в диметилформамид (80 ух. л) с дициклохексилкарбодиимиден разтвор (1,25 г/мл, 0,007 мл) и концентрирана сярна киселина (0,5 л) при 0°С, в продължение на 10 минути. Реакцията се прекратява чрез прибавяне на вода (1,0 мл).

Реакционната смес може да се подложи на обратно-фазова HPLC, използувайки Applied Biosytems 150А течна хроматографска система и Aquapore RP-300 Cg(O,46 х 10 см). Колоната се калибрира с разтвор А (0,1% TFA/вода) и се промива с растяща концентрация на разтвор В (0,085% TFA/70% ацетонитрил) от 0 до 50% над 45 минути, при скорост на изтичане 1,0 мл/мин.

Изходният поток се изследва за абсорбция при 214 нм.

ПРИМЕР 9

Инхибиране на тромбин-катализираната хидролиза на синтетичен р-нитроанилиден субстрат от

Хирулог 8

След това анализирахме ефектите на Хирулог-8 върху

-4$човешки χ. тромбин-катализирана хидролиза на Спектрозим TH (тозил-С1у-Рго-Агй-р-нитроанилид; American Diagnostica, New York, NY). Специфично измерваме първоначалните стойности на скоростите, в присъствие или отсъствие на Хирулог-8 над степента на субстратна концентрация от 2,2 до 22у«М. Тромбин катализираната стойност се измерва на Cary 19 спектрофотометър при 405 нм и се записва непрекъснато като функция от

времето. Кинетиката се осъществява при стайна температура (25 i 1°С) в 0,05 М Tris, pH 7,5, 0.1 М NaCl буфер.

За типична ензимна реакция 1,0 мл от буфера се прибавя към пробата и контролната кювета. Тромбин (3,2 х 10 М, крайна концентрация) и Хирулог-8 (0-4 х 10 М) се прибавят към кюветата с пробата, преди прибавянето на Спектрозим TH (2,2-22уцМ). Веднага след прибавянето на субстрата, съдържанието на кюветата с пробата се разбърква, използвайки пластмасова пипета. Реакцията се проследява спектрофотометрично в продължение на 5-15 минути.

Първоначалните стойности на скоростите при всяка кон-

центрация на субстрата се изразяват като молове хидролизиран Спектрозим ТН/сек/мол тромбин. Това бе определено по време на първоначалната линейна фаза на реакцията (3=15% общ хидролизат на субстрата) чрез измерване на наклона на хидролиз ната реакция. Съгласно това се конструират графики на Line weaver-Burke чрез нанасяне на обратната стойност на първоначалната скорост срещу обратната стойност на субстратната концентрация. Резултатите показват, че -тромбин-катализираната хидролиза на Спектрозим ТН има Υ^,^χ· = 17 мола хидроли

-50зиран/сек/мол тромбин и К при 1,19 х 10 М. Фиг. 3 А и В, показват, че растящата концентрация на Хирулог-8 води до значително увеличение на К_м, зависещо от дозата, с незначително увеличение на за Спектрозим TH хидролизата. Следователно, инхибирането на тромбин-катализираната реакция от Хирулог-8 се осъщствява чрез смесени компететивни/неком пететивни компоненти с оглед хидролизата на Спектрозим TH.

Ki на Хирулог-8 за -тромбин се определя, използувайки уравнението :

където

е наклона на тромбин-катализираната реакция, в присъствие на Хирулог-8: [Хирулог-8] е моларна концентрация на пептида;

и ИХИ ьИРДЙ

е тромбин-катализираната реакция, в присъствие на инхибитор; Ki е моларната инхибиторна константа за Хирулог-8 с

-5ί-

човешки -тромбин. Ki за Хирулог-8 е калкулиран 1,95 ί 0,11 х 10 М.

ПРИМЕР 10

Специфичност на Хирулог-8 към хирудин-пептид свързващия сайт и активния сайт на човешки тромбин

Хирулог-8 се посочва като аналог, свързващ човешкия тромбин, чрез своя хирудин-пептид-свързващ сайт, блокирайки по този начин тромбиновия каталитичен сайт. Изпробвахме каталитичната способност на Хирулог-8 да осъществи тези функции чрез различни изследвания, описани по-долу

тромКинетиките на Хирулог-8 инхибирането на човешки бин се изследват предимно както е описано по-горе, в пример за човешки -тромбин. $-тромбин катализираната реакция спрямо Спектрозим TH показва :ζ Ί, 14 мола хидролизиран/ сек/мол тромбин и К. = 1,1 х 10 М. Тези резултати потвърждават, че -тромбин, протеолитична форма на тромбина, показва почти пълна каталитична способност, въпреки, че тази форма не притежава съществена маскираща (обвиваща) активност [S.D. Lewis et al., Catalytic Competence of Human - and y^-Thrombins in the Activation of Factor Xiii, Biochemistry,

26, pp. 7597-7603 (1987)]. Инхибирането на -тромбин от Хиизследва над нивото на пептидни концентрации от рулог-8 се

2,7 х 1О'^&

-8 изявява нарастващо Ki с 5 порядъка от стойноста спрямо <£— g>

до 6,8 х 10 М. Както е показано по-долу, Хирулог тромбина. Това отсъствието на спрямо -тромбина се дължи на интактен анион-свързващ екзосайт (АВЕ) в високо Ki

-52тромбина [J.W. Fenton, II, et

-Thrombin and al., Anion-Biding Exosite of

Fibtin(ogen) Recognition, (1988)]. ^^-тромбинът се образува чрез протеолиза на В-веригата на о/ -тромбина при LysHuman

Biochemistry, 27, рр. 7106-12

149 и Arg-78.

Инхибирането на човешки c>L -тромбин от Хирулог-8 зна

чително намалява в присъствие на сулфо-Туг^-N-ацетил-хиру-έ. -s' дин^ при концентрации от 2,6 х 10 М до 129 х 10 М.

Това е така, тъй като сулфо-Туг₆^ Ν-ацетил хирудин^₃_ се съревновава с Хирулог-8,за да се свърже към АВЕ на тромбина.

Това бе демонстрирано също чрез добавяне на финилметилсулфонил- -тромбин (PMS--тромбин; 18 нМ, крайна) към реакциитена Хирулог-8 с човешки -тромбин. Прибавянето на този модифициран тромбин има за резултат съществено намаляване способността на Хирулог-8 да инхибира ^-тромбин.

PMS- о/ -тромбин притежава интактен АВЕ, но е ковалентно разклонен при неговия активен сайт. Този модифициран тромбин отделя Хирулог-8 в реакционната смес и следователно редуцира количеството на пептид, способен да инхибира интактен, каталитично активен човешки^ -тромбин.

Осъществихме, също така, изследване на ефекта на солеви концентрации върху Ki на Хирулог-8 за тромбин, както е опи сано по-гаре, в пример 9. ИзмерихмеKi, в присъствие или от~9 съствие на Хирулог-8 (11,5 х 10 М), в буфери, съдържащи

0.1, 0.25 и 0.5 М NaCl. Както е показано в таблицата по-долу, инхибирането на е/ -тромбин от Хирулог-8 нараства при пониските солеви концентрации. Този резултат потвърждава, че j взаимоотношението на високо анионната хирудин-пептидна част от Хирулог-8 със сайта с положителен товар, заобикалящ Lys149 на тромбина, е съществен за Хирулог-8 инхибирането на тромбин-катализираната хидролиза от Спекрозим НТ.

Ензим	Условия	Хирулог-8, Ki, нМ
човешки^/ -	0.05М Трие, pH 7.5	1 .95
тромбин	0.1М NaCl (буфер)
човешки 7^-	буфер	1 .080
тромбин
човешки/ ”	буфер + 2.бу< М	25.5
тромбин	сулфо-Туг^-N-ацетил
човешки ok -	хирудину^-с^
буфер + 1 2.9^ М	> 2.000
тромбин	сулфо-Туг^з -N-ацетил
	хирудин 5-3- 6 f
човешки*/ -	буфер + PMS-	9.90
тромбин	-тромбин
човешки -	0.05М Трие, pH 7.5	2.09
тромбин	0.025 М NaCl
човешки/ -	0.05 М Трие, pH 7.5	3.72
тромбин	0.5 М NaCl

-ΜПРИМЕР 1 1

Антикоагулантна активност на Хирулог-8: Сравнение с хирудин и сулфо-Tyr^j -N-ацетил-хирудин^

Изучаваме антикоагулантната активност на Хирулог-8, обединена, нормална кръвна плазма (George King Biomedical, Overland Park, Kan.) и Coag-A-Mate XC инструменти (General Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, Okla.). Активността се изследва, използувайки проба за времето за активи*ран частичен н тромбопластин (АРТТ) с СаС1^ и фосфолипидни разтвори, получени от производителя. Хирулог-8, хирудин или сулфо-Туг^з -М-ацетил-хирудин^_£.£ се прибавят след това към АРТТ определителните ямки при крайни концентрации от 10 до 32.300 нг/мл в общ обем от 25у^л преди прибавянето на 100 л плазма.

КонтролниятАРТТ (отсъствие на инхибитор) е 29.6 сек (означава, n=8, SEM<0.5%). Фиг. 4 показва резултатите от тези изследвания на зависимостта от дозата. Хирулог-8 е 2 до 3 пъти по-силен от хирудина и 100 до 150 пъти по-силен от сулфо-Tyr^j -N-ацетил-хирудин^. Хирулог-8 и хирудинът повишават АРТТ на плазмата до стойности, които са прекадено високи,за да бъдат измерени. Това е в контраст със сулфо-Туг^ -N-ацетил-хирудин, който показва насищаща се доза-отговор в АРТТ до 200-25056 от контролните клапи [J.M. Maraganore et al., «J. Bio. Chem. 264, pp. 8692-98, (1989)]. Този резултат показва, че Хирулог-8 може да блокира активния сайт на тромбина в плазмата, както и in vitro при хромогенни опити, по начин подобен на хирудина.

-5S’

ПРИМЕР 12

Инхибиране на тромбин индуцираната активация на плаките от Хирулог-8

Изследвания за тромбин-индуцираната активация на плаките се осъществяват при 37^0, използувайки Biodata PAP планов агрегоматър. Богата на плаки плазма (PRP) се получава от нормален, здрав доброволец, който не е приемал никакви лекарства, променящи функцията на_ плаките поне една седмица до преди изследването. RPR се приготвя,както е описано от J.A. Jakubovski et al., Modification of Human Platelet by a Diet Enriched in Satured or Polyunsatured Fat, Atherosclerosis, 31, pp. 335-44 (1978). Различни концентрации на Хирулог-8 (0-500 нг/мл в 50 у*л вода) се прибавят към 0.4 мл предварително затоплена (37^0) PRP. Една минута по-късно прибавяме човешки oZ -тромбин към суспензията от плаки до крайна концентрация 0.2, 0.25 или 0.5 единици/мл общ изследван обем.

Агрегацията се изследва като повишаване на пропускливостта на светлина 5 минути след прибавянето на тромбин. След това изчислихме % инхибиране като (% агргация πρρβΎν ) / агрегация контрсаа ) х 100. Това изследване показва., че Хирулог-8 блокира тромбин-индуцираната активация на плаки in vitro.

ПРИМЕР 13

Употреба на Хирулог-8 при изобразяване на тромби

Хирулог-8 се модифицира чрез ковалентно свързване на съдржаща I химическа група. Специфично, Хирулог-8 (както е приготвен в пимер 4) реагира с реактива на⁴^I-Bolton Hun “56ter (New England Nuclear, Boston, Mass.) в 0.1 M натриев борат, pH 9.0. Маркираната c I молекула (със специфична активност >5 р. Ci/yU г) се обезсолява на Biogel Р2 колона, калибрирана с фосфатен буфер във физиологичен разтвор.

Ex vivo моделиране на експериментални тромби се осъществява предимно както е описано от Т.М. Palabrica et al., Thrombus Imaging in a Primate Model with Antibodies Specific for an External Membtane .JProtein of Activated Plate lets, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, pp. 1036-40 (1989). Специфично, моделирането се осъществява в бабуини, използувайки външно Ticoflex отклонение между феморалната артерия и феморалната вена. Образува се експериментален тромб чрез поставяне на сегмент от предварително покрит Dacron присадка в отклонението. I-маркиран инхибитор на тромбина се инжектира във венозния участък на Ticoflex отклонението. Напра вени са серия от снимки от 0,5 до 1 час, използувайки Ohio

Nuclear Series 100 Gamma Camera c PDP-11/34 компютър. Кинетиката на I-инхибитора на тромбин , повишена от присаж-

дането и обединената кръв произтича от радионуклеидните изображения, получени по този начин.

Същата техника може да бъде използвана за получаване на ex vivo изображения на тромби на дълбоките вени, причинени от стазис във феморалната вена на бабуини. Тъй като IХирулог-8 се свързва към тромбина с висока специфичност, употребата на тази молекула позволява прецизни ex vivo изображения на тромби. Също така, малкият размер на Хирулог-8, в контраст с нативния хирудин или антителата за тромбина,

-bl

обезпечават възможността радиомаркираният инхибитор на тромбина да доведе до изображение на свързан с плаки тромбин и мейзотромбин, така както и тромбин, съдържащ се във фибриновия съсирек.

ПРИМЕР 14

Антиметастатична активност на инхибиторите на тромбин

Антиметастатичната активност на инхибиторите на тромбин, съгласно настоящето изобретение, за предпочитане Хирулог-8, се изследва използвайки саркома Т241 клетки [L.A. Liotta et al., Nature, 284, pp. 67-68 (1980)] и сингенетична C57BL/6 мишка (Jackson Laboratory, Bar Harbor Me.). Мишките се инжектират или интравенозно или подкожно с 0-250 г/кг Хирулог-8, приготвен както в пример 4, последвано от инжектиране с 10 -10® Т241 тумурни клетки. След 15 дена, животното се умъртвява и се измерват белодробните тумурни колонии. Антиметастатичната активност на Хирулог-8 се измерва като процентна редукция на тумурните колонии, сравнено с плацеботретирана контролна мишка. Хирулог-8 демонстрира антиметастатична активност при този опит.

ПРИМЕР 15

I

Инхибиране на Кндотелни клетки от инхибитора на тромбин

Способността на тромбиновите инхибитори, съгласно настоящето изобретение, да предотвратяват тромбин-индуцирани синтези на плаки активиращ фактор (PAF), е изледвана, като

се използват култивирани ендотелни клетки от човешка пъпна вена (HUVECs). HUVECs се изолират от човешка пъпна връв чрез колагеназно смилане, съгласно установената процедура [М.А. Gimborn, Jr., Culture of Vascular Endothelium, Prog. Hemost. Thromb., 3, pp. 1-28 (1976)]. HUVECs се култивират до сливане в 96-ямкова микротитърна плака в присъствие на [^Н]ацетат. Култивираните по този начин клетки продуцират [³Н]ацетил-PAF, който може да бъде количествено определен чрез екстракция от HUVEC мембранните фосфолипиди.

Хирулог-8 (0-1у<г/мл) се прибавя към HUVECs, натоварени с [^Н]-ацетат, 1 минута преди прибавянето на тромбин (крайна концентрация IU/мл). Клетките се инкубират в продължение на 5 минути и супернатантата се отделя. Среда, съдържаща 0,1% желатин, 50 мМ оцетна киселина в метанол (2:1 об/об) се прибавя след това към KUVECs. След това се екстрахира PAF и се определя количествено, използвайки конвенционални техники [Т.М. McIntyre et al., Cultured Endothelial Cells

Synthesize Both Platelet-Activating Factor and Prostacyclin in Response to Histamine, Bradykinin and Adenosine Triphosphate, J. Clin. Invest., 76, pp. 271-80 (1985)]. ICстойностите се изчисляват след това. Хирулог-8 инхибира синтеза та на PAF от HUVECs при това изследване.

Ефектът на Хирулог-8 върху адхезията на тромбин-индуцирани полиморфоядрени левкоцити (PMN) към HUVECs може да се демонстрира както следва. HUVECs се култивират до сливане в МЕМ, съдържащ 1% серум от телешки ембрион в 24-ямкови групо ви панички. След това средата се отстранява, клетките се про59' миват двукратно с прясна безсерумна среда и се инкубират в <?

същата среда в продължение на 10-50 минути при 57 С до отде£ ляне на серумните продукти. PNMs (2,5 х 10 в 1 мл), които о са предварително темперирани при 37 С, се прибавят след това към всяка ямка. Дава се възможност на PMNs да се утаи върху HUVEC монослоя в продължение на 2 минути. Хирулог-8 (5у<г/ мл) или физиологичен разтвор се прибавят към всяка ямка, непосредствено след прибавянето на -тромбин (0,1 или 1 U/мл).

Iо

Клетките се инкубират в продължение на 5 минути при 37 С, промиват се двукратно и се изследват чрез фазово - контрастна ; микроскопия. Адхерентните PMNs се броят директно. Проби, ин/·кубирани с Хирулог-8 имат значително по-малко адхерентни PMNs, отколкото тези, третирани с физиологичен разтвор.

ПРИМЕР 16

Синтез на Хирулог-13

Формулата на Хирулог-13 е следната: H-(D-Phe)-Pro-ArgРго-(Gly )j> -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-LeuОН. Синтезирахме, пречистихме и характеризирахме този пептид предимно както е описано в пример 4, с изключение на това, че само един цикъл на ВОС-глицилглицин се използва , за произвеждането на диглициновия сегмент.

ПРИМЕР 17

Синтез на Хирулог-14

Формулата на Хирулог-14 е следната : H-(D-Phe)-Arg-Pro(Gly )^. -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH.

- έ/ύ Хирулог-14 се синтезира, пречиства и характеризира, използвайки методите, описани в пример 4, с изключение на това, че един цикъл на прибавянето на ВОС-глицин се използва след двата цикъла на прибавяне на ВОС-глицинглицин за производство на пентаглициновия сегмент.

ПРИМЕР 18

Синтез на Хирулог—15

Формулата на Хирулог-15 е следната : Н-(D-Phe)-Pro-ArgРго-(Gly -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-LeuOH. Хирулог-15 се синтезира, пречиства и характеризира, използвайки методите, описани в пример 4, с изключение на това, че три цикъла от прибавянето на ВОС-глицилглицин се използват за приготвянето на хексаглициновия сегмент.

ПРИМЕР 19

СинТез на Хирулог-16

Формулата на Хирулог-16 е следната :Н-(D-Phe)-Pro-ArgРго-(Gly -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-LeuОН. Хирулог-16 се приготвя, пречиства и ^характеризира както е описано в пример 4, с изключение на това, че четири цикъла от прибавянето на ВОС-глицилглицин се използват за приготвяне на октаглицинов сегмнт.

ПРИМЕР 20

Синтез на Хирулог-17

Формулата на Хирулог-17 е следната: Н-(D-Phe)-Pro-Arg- Ci'

Pro-Gly-Gly-Glu-Gly-His-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-ProGlu-Glu-Tyr-Leu-OH. Хирулог-17 се синтезира предимно както е описано в пример 4, с изключение на това, че Gly-Gly-GluGly-His-Gly замества Gly^ сегмента, присъстващ в Хирулог-8. Тази последователност се прибавя върху растящата пептидна верига чрез последователно прибавяне на ВОС-глицин, BOC-Lхистидин, ВОС-глицин, BOC-L-глутамат и ВОС-глицилглицин при цикли 13-17 от синтеза. Пречистването и характеризирането се осъществяват както е описано в пример 4.

ПРИМЕР 21

Синтез на Хирулог-18а, -18Ь и -18с

Формулата на Хирулог-18а е следната: Н-(D-Phe)-Рго-(хомоаргинин)-(Gly)^--Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GluTyr-Leu-OH. Формулата на Хирулог-18Ь е следната : H-(D-Phe)Рго-( -хомоаргинин)-(Gly) -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-ProGlu-Glu-Tyr-Leu-OH. Формулата на Хирулог-18с е следната : Н(D-Phe )-Рго-(-хомоаргинин)-Val-(Gly)у-Asn-Gly-Asp-Phe-GluGlu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Синтезирасе Хирулог-18а, използувайки смесена хомогенна/твърдо-фазова процедура. Остатъци 5-20 се приготвят чрез твърдо-фазова синтеза, както е описано в примери 4 и 17. Полученото междинно, свързано със смолата, реагира с ВОС-β -хомоаргинин-Gly предпазено междинно, което се синтизера по многостепенна реакционна схема, изобразена по-долу и описана непосредствено след това.

ЦА/ / )= N

Η- N \

'вос

Η -Ν

С 0CH₃

(2l>z

) \CO2 Η вос

chem, Torrance, СА)и 2.1 мл (19.1 ммола) N-метилморфолин (Aldrich, Milwaukee, Wis.) в 100 мл анхидриден тетрахидрофуран (THF) под аргон в продължение на 5 минути при стайна о

температура. Разтворът се изстудява след това до -15 С и се прибавят 2.8 мл (21.6 ммола) изобутилхлороформат (Aldrich).

Продължаваме да разбъркваме реакционната смес при -15°С в продължение на 5 минути, след което се филтрира през пълнеж от Celite/MgSO^., След това прибавяме филтрата

към ледено студен етерен разтвор на диазометаан (150 мМ, получен от

32.4 г Diazald; Aldrich). Разтворът се разбърква и се оставя постепенно да достигне температурата на околната среда до другия ден. След това, разтворителя се отстранява чрез вакуум, а остатъкът се разтваря в 200 мл хлороформ. След това промиваме органичния разтвор последователно с 200 мл наситен NaHCO , последван от 200 мл наситен NaCl, изсушава се над безводен MgSO^. и се концентрира отново до мослообразен оста

тък. След това остатъкът се пречиства чрез мигновена хромато графия върху 4 х 17 см колона от силикагел, използвайки стъпаловиден градиент на ацетон в хлороформ (10% ацетон в 2л хлороформ, последван от 20% ацетон в 3 л хлороформ). Фракциите, съдържащи жлания продукт^ се обединяват и се изсушават до сухо. Продуктът диазометилкетон се пречиства като бледожълта пяна (6.54 г ) .

N -BOC-N^-Tos-t-хомоаргинин метилестер

Разтваряме приготвения преди това диазометилкетон в 100

-64мл анхидриден метанол и пропускаме получения разтвор под аргон, докато разтвор на сребърен бензоат катализатор (165 мг в 400 р. л триетиламин) се прибавя на капки. След 50 минути,

Z обратно течащият(в прониво ток) разтвор се изстудява до стайна температура, суспендира се с Norit и се филтрира през Celite. След това разтворителят се отделя чрез вакуум и маслообразният остатък се пречиства чрез мигновена хроматогра фия през силикагел. Елуирането .се осъществява с 4 л 10% ацетон в хлороформ. Желаният продукт, у^-хомоаргининметилестер се пречиства по този начин като светла жълтеникаво-кафява пяна (6.45 г ),

Всичко [ -BOC-N^-Tos- F-хомоаргинин | от горния метилов естер разтваряме в 100 мл метанол, след което го оставяме да реагира с разтвор на LiOH (1.48 г в 50 мл вода) през цялата нощ при стайна температура под аргон и при постоянно разбъркване. Отстраняваме метанола под вакуум, разтваряме утайката във вода и я промиваме в етил ацетат. След това прибавяме наситен разтвор на лимонена киселина,докато разтворът достигне рН 4.

След това екстрахираме получената карбонова киселина етил ацетат.

Екстракцията се повтаря при рН 5 и комбинираните органични фази се изсушават над MgSO^. и се концентрират под вакуум. Получената сурова киселина се събира под формата на бяла пяна (4.9 г). След това киселината се пречиства на Vydac С^?

обратно-фазова HPLC колона, както е описано в пример 4, с изключение на това, че изходният поток се изследва при 214 нм.

—&5След лиофилизация

Tos-^-хомоаргинин, на желаните фракции, продуктът, се получава като бяла аморфна

N -BOC-N твърда фаза.

Проба от N -BOC-N<

I^Tos-у^-хомоаргинин се хидролизира в HF анализ.

използва като стандарт за

Времето на ретенация на β -хомоаргинина е идентично на това и се аминокиселинния на аргинина, но интензитетът на пика е значително по-нисък от очакваното.

N -BOC-N^-Tos-p⁵ - хомоаргининилглицин бензилестер

След това комбинираме 4.06 г (9.2 ммола) от горната карбонова киселина с 2.04 мл N-метилморфолин в 25 мл анхидрио ден THF. Сместа се разбърква под аргон при -5 С. Изстуден разтвор на изобутил-хлороформат (2.4 мл в 25 мл THF) се прибавя след това на капки към разтвора над 10 минути. След прибавянето реакционната смес се разбърква в продължение на о

минути при -5 С. За Хирулог-18а прибавяме след това раз твор на глицин бензилов естер (4.9 г в 40мл THF; 27.6 ммола) и даваме възможност на реакционната смес да достигне стайна температура. След това разтворителят се отстранява под вакуум, а получената утайка се разтваря в 100 мл етил ацетат. Разтворът се екстрахира последователно с по 100 мл наситен NaHCOj и наситен NaCl, изсушава се над MgSO^. и се концентрира под вакуум. Полученият суров дипептиден естер се пре чиства върху колона 4 х 20 см силикагел с метанолов стъпаловиден градиент в хлороформ, съдържащ 10 капки NH^OH на 100 мл (2 л 1% метанол в хлороформ, последвано от 3 л 2% метанол в изследват се чрез хлороформ). Събират се фракции (25 мл),

TLC и тези, съдържащи продукта се обединяват, а разтворителят се отстранява под вакуум. Полученият продукт N -BOC-N^-TosР-хомоаргининглицин бензилов естер се изолира като бяла пяна ( 3.9 г ).

За Хирулог-18Ь и -18с по-горната реакция е идентична, с изключение на следните модификации : за Хирулог-18Ь глицин бензиловият естер се замества с пролин бензилов естер и реакцията се провежда 1.8 ммола скала; за Хирулог-18с глицин бензиловият естер се замества с валин бензилов естер и реакцията се провежда при 3.0 ммола скала.

-хомоаргининилглицин

Горният бензилов естер се разтваря в 50 мл метанол и се хидрогенира под атмосферно налягане над 1 .0 г 10% паладиум/ въглерод в продължение на 17 часа. Полученият разтвор се филтрира през Calite, а разтворителят се отстранява под вакуум. Реакционният добив е 2.9 г суров N -BOC-N^-Tos-^-xomoаргининилглицин, който се пречиства на Vydac С/ρ HPLC колона, както е описано по-горе.

Горният N -BOC-N^-Tos-^-хомоаргининилглицин (1.02 г ) се разтваря в 1 мл анхидриден DMF и се изстудява на ледена баня. След това последователно прибавяме към този разтвор 5-5 мл 0.5М хидроксибензтриазол в DMF (Applied Biosystems Inc, Foster City. Calif.) и 5.5 мл 0.5M дициклохексилкарбодиимид в CH^CL^ (Applied Biosystems). След 1 час студената суспензия от симетричен анхидрид на дипептидната единица бързо се

- 67 ~ филтрира през запушалка от стъклена вата за отстраняване на дициклохексиловата уреа.

Междувременно, суспензия на N-BOC-( Gly -Asn-Gly-AspPhe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM (0.2 ммола в CH^Clg) се активират по стандартен метод за пептиден синтез. Kaiser тест върху получения продукт посочва свободна крайна аминогрупа.

Активираният -хомоаргинилглицин дипептид се присъединява след това към свързания със смолата хексадекапептид. ь

Полученият октадекапептид се присъединява след това последователно към N-BOC-Pro и N-BOC-(D-Phe), използвайки стандартна свързваща процедура. Полученият пептид Хирулог-18а се пречиства и характеризира,както е описано в пример 4.

Подобна схема се осъществява при синтезата на Хирулог18Ь и Хирулог-18с.

ПРИМЕР 22 •с

Синтез на Хирулог-19

Формулата на Хирулог-19 е следната : Н-(D-Phe)-Pro-Arg[psiCH- NH]-(Gly)^ -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GluTyr-Leu-OH. Остатъци 4-20 от този пептид се събират чрез твърдо-фозови пептид синтетични процедури, както е описано в пример 4. Следващият прибавен остатък -BOC-N^-тозил-аргининал се приготвя . както е изобразено и описано по-долу.

-

ВСС вОСг

N -BOC-N-⁷-Tos-аргининал

N -B0C-N7 -Tos-аргинин (Bachem Inc.; 10 г) се прибавя ι о

към 80 мл анхидриден THF и суспензията се изстудява ь до 0 о

С. След това прибавяме 1,1’-карбонилдиимидазол (Aldrich; 3.61 г) изведнъж и продължаваме да разбъркваме в продължение на 20 минути. Полученият чист разтвор частично се потопява в сух лед/ацетонова баня,за да се поддържа температура от -20 о

до -30 С по време на прибавянето на капки на суспензия: от литиево алуминиев хидрид (Aldrich; 1.8 г в 80 мл THF) над 45 минути при постоянно разбъркване. Реакционната смес се с

разбърква допълнително 30 минути при -2Q С и след това се потиска чрез прибавяне на какпки на 63 мл 2N НС1 при -10°С. Филтрираме получения разтвор през средна стъклена фуния и концентрираме получения филтрат на вакуум.

Полученият суров алдехид, събран като бяла пяна, (11.5

г), се суспендира в 100 мл хлороформ, промива се с вода (2 х 50 мл) и органичният слой се изсушава след това над натриев сулфат и се концентрира под вакуум. Суровият алдехид (7.7 г) се разтваря в 100 мл хлороформ и се пречиства чрез флаш хро-G9матография над 5 х 20 см флош колона, съъдржаща 350 мл силикагел (Merck Grade 60, 230-400 дупки, 60 А). Елуирането се осъществява чрез използване на стъпаловиден градиент на 0.5% метанол в 500 мл хлороформ, 1% метанол в 1 л хлороформ и 1.5% метанол в 1 л хлороформ. Тази процедура води до добив

8.9 г N -BOC-N^-Tos-аргининал.

N^-BOC-N^-Tos-aprHHHHanbT (258 мг) се прибавя след това към свързания със смолата (Gly )^- -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-GluIle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-O-PAM при условия на твърдо-фазово редуктивно алкилиране (40 мг натриев цианоборохидрид в продължение на 24 часа), използвайки метода на D.H. Coy et al., Solid-Phase Synthesis of Peptides In Peptides, Vol. 8 pp. 119-121 (1978). Следвайки реакцията на свързания със

смолата пептид с предпазения аргенинал, пептидниятсинтез се завършва с цикъл на инкорпориране на ВОС-пролин и цикъл на инкорпориране на ВОС-(D-фенилаланин). След завършване на синтеза, Хирулогг19 се освобождава от предпазителя и се отстранява от смолата,както е описано в пример 4.

Хирулог-19 се пречиства чрез обратно-фазова HPLC, използвайки Applied Biosystems 151А течна хроматографска система и Aquapore С& колона (10 х 22 см. Колоната се калибрира с една част 70% ацетонитрил/50% вода, съдържаща 0,85% TFA (буфер В) и 4 части вод^, съдържаща 1% TFA (буфер А). Колоната се промива с линеен градиент с растяща концентрация на буфер В (20-50%) над 120 минути при скорост на потока 4,0 мл/минута. Изходният поток се изследва за абсорбция при 214 нм и фракциите се събират ръчно. Последващото пречистване се το CИНТ£5 HA

Г-Et

M

-7/ ~ извършва при изократни условия, използвайки 20% буфер В/80% буфер А.

ПРИМЕР 23

Синтез на Хирулог-21

Фжормулата на Хирулог-21 е следната: Н-(D-Phe)-Pro-ArgPro-( Gly )4. -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu(Gly)^ -Lys-OH.Хирулог-21 се синтезира, използвайки методите, описани в пример

4, използвайки подходящите ВОС аминокиселини.

Пречистването и .характеризирането на ХируЛог-21 се осъществява по методите, описани в пример 4.

ПРИМЕР 24

Синтез на Хирулог-25

Формулата на Хирулог-25 е следната: H-(D-Phe)-Рго-(4аргининил-2,2-д ифлуоро )малонилглицил-( Gly ) zj. -Asn-Gly-AspPhe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Хексадекапептидът (Gly)^ -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu, се синтезира, както е описано^ по-горе,и се оставя да се свърже към смолата. Следващият остатък (З-аргининил-2,2-дифлуоро) малонилглицин се синтезира по долуописаната и изобразена схема (стр. 71).

1-[(2’-карбоетокси 1’, 1’-дифлуоро)θτηπ]Ν -BOC-N бензил-N °^ГИ-СЬгорнитинол

Разтвор от 3,1 г (7,1 ммола) N -BOC-N -бензил-N ,_гл СЬгорнитинол [F. Salituro et al. , ·'Inhibition of Aspartic Proteinases by Peptides Containing Lysine and Ornithine Side 'BiChain Analogues of Statine, J. Med. Chem., 30, pp. 286-95 (1987)], и се прибавя 1,56 мл (9,23 ммола) етилбромодифлуороацетат в анхидриден 15 мл THF над 90 минути в противоток

към суспензията от	786 мг Zn прах (Fluka) в 15 мл THF под
аргон. След 4 часа	в обратен поток и 2 часа при стайна тем-
пература, сместа се	изстудява и се разделя между етил ацетат

и наситен NaCl/KHSO^no 200 мл всеки. Органичната фаза се изолира, изсушава над MgSO 4. , и концентрира под вакуум. Полученият маслообразен остатък се пречиства на силикагел, използвайки СНС1^ : метанол (90 : 10) плюс 100 капки/л NH^.

ОН като елуент.

-[(2’-карбоетокси 1’,

1’-дифлуоро)етил]И

-ВОС орнитинол тетрбутилдиметилсилил етер

Полученото съединение 1-[(2’-карбоетокси 1’, 1’-дифлуоро )етил]№^—ВОС—N ^0ГЯ -бензил-N^1?ГИ-СЬгорнитинол реагира след това с 5 еквивалента терт-Бутилдиметилсилил хлорид и 10 еко вивалента имидазол в анхидриден DMF при 35 С, следвайки про-

цедурата на E.J. Corey et al., Protetion of Hydroxyl Groups as tertButyldimethylsilyl Derivatives, J. Amer. Chem. Soc.,

94, pp. 6190-91, (1972). Ортогонално предпазеният амин се разтваря след това в метанол и се хидрогенира над Pd(OH), при 30 psi в продължение на 18 часа. Катализаторът се отстранява след това чрез филтрация, а филтратът се концентрира във вакуум до получаване на 1-[(2’-карбоетокси 1’, 1’-дифлу°с оро)етил]И -ВОС-орнитинол tert-Бутилдиметилсилилов етер.

- [( 2 ’ -карбоетокси 1’, 1’-дифлуоро)етил]И -BOC-N^Tos аргининол-tert-Бутилдиметилсилилов етер

Горе приготвеното съединение реагира след това с по 6,8 еквивалента от 1-гуанил-3,5-диметилпиразол и триетиламин във <2 вода при 105 С в продължение на 24 часа. Сместа се лиофилизира след това, а остатъкът се подлага на подготвителна HPLC, както е описано в пример 4. Фракциите, съдържащи желаното гуанидиново съединение (изпробвани чрез TLC) се обединяват и изсушават на вакуум. Утайката се разтваря в Н,0 : ацетон (1:4), изстудява в ледена баня и се юстира до pH 12 с 50% w/v NaOH. Към този разтвор се прибавя разтвор от 5 еквивалента пара толуол сулфонилхлорид в ацетон над 60 минути, докато pH се задържа на 11-12 с NaOH. Разтворът се оставя да достигне до стайна температура и се разбърква цялата нощ. След това ацетонът се отделя под вакуум, а останалият воден разтвор се промива с етер. Етерният слой се отделя и отново се екстрахира с наситен NaHCO^. Водните фази се обединяват и подкиселяват до pH 5 с 2N НС1. Полученият кисел разтвор се екстрахира след това двукратно с етил ацетат, изсушава се и се концентрира под вакуум до добиване на желания продукт.

-[(2’-карбоетокси 1’, 1 ’-дифлуоро)етил]И -BOC-N^TTos-Аргининол

От полученото съединение 1-[(2’-карбоетокси 1’, 1’-дифлуоро)етил]№^-ВОС-Н$-Тоз-аргининол tert-Бутилдиметилсилилов етер се премахва силилът чрез третиране с 3 еквивалента тетра-п-бутиламониев флуорид в THF при стайна температура, както е описано от E.J. Corey et al., supra. Полученото чрез този процес съединение след това се сапунифицира чрез трети ране с 2,5 еквивалента LiOH в метанол/вода при стайна темпе ратура под аргон през цялата нощ. Реакционната смес след то ва се промива с етилацетат и се подкислява с лимонена киселина до рН 4. Получената киселина се екстрахира с етил ацетат, изсушава се органичната фаза и се концентрира под вакуум.

Суровата киселина се пречиства_след това на Vydac

C^g обратно фазова HPLC колона при условията, описани в пример 4.

< а.

1-[(2’-карбоетокси 1’, 1’-дифлуоро )етил]И -BOC-N Tos-аргининон

Алкохолната функция на предходното съединение се превръща в кетон чрез прибавяне на 1 еквивалент пиридин дихромат в СН^С1^ , съдържащ 0,5% ледена оцетна киселина в присъствие на молекулярно сито [N. Peet et al., Synthesis of Peptidyl and Fluoromethyl Ketones and Peptidyl©/-Keto Esters as Inhibitors of Porcine Pancreatic Elastase, Human

Neutrophil Elastase, and Rat and Human Neutrophil Cathepsin G, J. Med. Chem., 55, pp. 594-407 (1990)]. След разбъркване под аргон в продължение на 15 часа, реакционната смес се филтрува, а разтворителят се отстранява под вакуум. Получава ният 1-[(2’-карбоетокси 1’, 1’-дифлуоро)етил]И -BOC-N -Tosаргининон се събира като маслообразен остатък и след това се пречиства на HPLC, съгласно условията, дадени в пример 4.

Свободната карбонова киселина се превръща в симетричния анхидрид и реагира със свързания със смолата хексадекапептид, ~Ί5 както е описано в пример 21. Двата N-крайни остатъка от Хирулог-25, ВОС-Рго и ВОС-(D-Phe) се прибавят при условията на стандартен пептиден синтез и полученият пептид се разцепва с HF след това.

ПРИМЕР 25

Синтез на Хирулог-26

Формулата на Хирулог-26 е следната : Н-(D-Phe)-Pro-Arg оксопропионилглицил-(Gly)^ -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-ProGlu-Glu-Tyr-Leu-OH. Хексадекапептидът (Gly)^ -Asn-Gly-AspPhe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH се синтезира, както предварително е описано и се оставя да се свърже със смолата. Следващият остатък, N -ВОС-аргоксопропионилглицин, се синтезира по реакционната схема, изобразена и описана по-

долу .

-

3-(СЬгамино)2-оксо-3-{3-[(N^-Tos)гуанидил]-пропил)-ди -тертбутилмалонат уй

Приготвяме партида от N^4, -Cbz-N -Tos-аргининдиазометил <4в кетон по същия начин, както се приготвя N -BOC-N^y-Tos-aprHниндиазометил кетон, описан в пример 21, с изключение на заal ft оСЧ, местването на N -Cbz-N -Tos-аргинин с N -BOC-N^-Tos-аргинин. Разтваряме 4.5 мг N -Cbz-N^-Tos-аргининдиазометил кетон в

Q

200 мл CH^Cl^ в колба и изстудяваме разтвора до -70 С в сух лед/ацетонава баня при бъркане. Анхидриден НВг газ се продухва след това през разтвора при средна скорост на въздушния поток, в продължение на 15 минути. Разтворът се разбърг ква за още допълнителни 15 минути при -70 С, а после се кон4 В центрира под вакуум. Полученият продукт, N -Cbz-N -Tos-ArgCOCH Br се събира като 5.0 г жълти кристали.

Междувременно, разтвор на натриев хидрид (36 мг; 80% маслена дисперсия) в 1 мл DMF и 1.2 мл хексаметилфосфорамид (НМРА) се прибавя към разтвор от 259 мг дитертбутоксимало- ??нат в 4 мл DMF. Сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 40 минути и се прибавя след това на капки над 20 минути към разтвора от 1 ммол N^-Cbz-N^-Tos-Arg-COCH^Br в 1 мл DMF/0.13 мл НМРА. Дава се възможност на реакцията да се осъществи в продължение на 3 часа, след което разтворът се излива в 50 мл вода и се екстрахира с 2 х 50 мл етил ацетат. Органичната фаза се изолира, изсушава и концентрира под вакуум до маслообразен остатък. Остатъкът се пречиства след

Iтова на 3x10 см колона със силикагел, която се елуира последователно с 400 мл 5% ацетон в хлороформ, 400 мл 10% ацетон в хлороформ и 200 мл 20% ацетон в хлороформ. Събират се фракции (25 мл) и се изследват чрез TLC. Фракциите, съдържащи желания продукт, се обединяват и концентрират до получаване на 3-(СЬгамино)2-оксо-3-<3-[(N^-Tos)гуанидил]-пропил )-ди-тертбутил малонат.

fl·

5-(N -СЬгамино)4-оксо-5-{3-[(N -Tos)гуанидил]-пропил)

пентаноилглицин бензилов естер

Горният ди-t бутилов естер се разбърква в 1.2 еквивалента 1N НС1 в продължение на 2 часа при стайна температура.

с

След това се декарбоксилира в излишък на пиридин при 100 С в продължение на 15 минути. След това разтворителят се отстра нява под вакуум, а остатъкът се пречиства чрез силикагелна хроматография, както е описано по-горе. Получената карбонова киселина се ацилира с глицин бензилов естер, съгласно метода, описан в пример 21.

-?&

пентноилглицин

Полученият естер се разтваря в 500 мл метанол и се хидрогенира през цялата нощ при 1 атм водород газ над 600 мг 10% паладиево-въглероден катализатор. Реакционната смес се филтрира след това през Celite и се концентрира под вакуум до твърд остатък (155 мг). Получената аминокиселина се пре-

в пример 4 .

условията, описани

5-( N -ВОСамино)-4-оксо-5-{3-[ ( N$-Tos)гуанидил]-пропил) пентноилг лицин

Горната аминокиселина се превръща в отговарящата й ВОС производна чрез разтваряне в диоксан/ вода (2:1, об/об) и о изстудяване до ОС при разбъркване. pH се юстира на 10 с 0.1N NaOH, а после се прибавят 1.1 еквивалента ди-tert-бутил дикарбонат (в диоксан). Реакцията протича при разбъркване ΰ о при 0 С до 20 С, в продължение на 4 часа и после се изпарява под вакуум. Остатъкът се разделя след това между етил ацетат/1% лимонена киселина (2:1). Изолира се органичната фаза, като еднократно се екстрахира с 1% лимонена киселина, а после трикратно с наситен NaCl. Органичната фаза се изсушава над MgSO₄, филтрува се и се концентрира под вакуум до получаване на ВОС-предпазения продукт.

Полученият свободен от предпазен псевдопептид карбоксилат се присъдинява след това към свързания със смолата хексадекапептид, използвайки стандартни техники за пептиден

синтез. Следва последователно прибавяне на BOC-D-Phe и ВОСРго към свързания със смолата пептид. Завършеният (пълният) Хирулог-26 се отцепва след това от смолата, премахва се предпазителят и се пречиства,както е описано в пример 4.

ПРИМЕР 26

Синтез на Хирулог-27

Формулата на Хирулог-27 е следната: Н-(D-Phe)-Pro-Arg( СО-СН^ )-Pro-(Gly)|-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GluТуг-Leu-OH. (Gly)^ -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GluТуг-Leu хексадекапептидът се синтезира, както е описано преди това и се оставя да се свърже към смолата. Останалата част от молекулата се синтезира по реакционната схема, изобразена

и описана по-долу.

бензилов естер ^ = 1-1 = Η

Разтваряме 720 мг пролин бензилов естер (НС1 сол) в 25 мл THF. Разтворът се изстудява след това до -78^0 в ацетон/ сух лед баня при разбъркване под аргон. След това прибавяме литиев диизопропиламид (8.0 мл суспенсия 0.75 М хексан) и се разбърква допълнително в продължение на 5 минути. Прибавяме <2 4на капки към това 1.08 г N -СЬг-ЬИ-Тоз-аргининбромметил кетон в 10 мл THF, приготвен както е описано в пример 25, над 20 минути. Рекцията протича при разбъркване още допълнително минути и разтворът се оставя да се затопли след това до стайна температура прн разбъркване. Прекъсваме реакцията чрез прибавяне на 10 мл наситен NaCl, даваме възможност на фазите да се разделят и изолираме органичната фаза. Тази фаза се изсушава след това над MgSO^, филтрува се и се изпарява под вакуум.

N^-BOC-N^-Tos-aprHHHH( COCH,, )пролин

Горният бензилов естер (1.5 г) се хидрогенира, използ вайки паладиево-въглеродната процедура, описана в пример 25.

Полученият псевдодипептид е ВОС-предпазен по процедурата, описана в пример 25, за продуциране на желания продукт.

Пречистеният, предпазен псевдопептид се свързва след това към свързания със смолата хексадекапептид чрез стнадартни техники на пептиден синтез. Хирулог-27 се освобождава от предпазителя, отцепва се от смолата и се пречиства по техниките, описани в пример 4.

ПРИМЕР 27

Синтез на Хирулог-28

Формулата на Хирулог-28 е следната :Н-(D-Phe )-Pro-Arg (СН_Л N)-Pro-(Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GluТуг-Leu-OH. (Gly)^ -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GluTyr-Leu-O-PAM хексадекапептидът се синтезира както е описано преди това и се оставя да се свържи към смолата. Останалата част от молекулата се синтезира по реакционната схема, изобразена и описана по-долу.

V —

N -BOC-N^-Tos-аргинин [psiCH^N]пролин бензилов естер о

Един грам натрошени 3 А молекулно сито (Aldrich) се прибавят към разбъркан разтвор от 5.25 г пролин бензилов естер свободна основа (Schweizerhall, Inc.) в 10 мл анхидриден THF и 2 мл анхидриден етанол под аргон при стайна температура. Прибавяме 1.45 мл 5N метанолова НС1 и 1.5 г N -BOC-N Tos-аргининал (приготвен както е описано в пример 22) към тази смес и разбъркваме в продължение на 1 час. Прибавя се към сместа една 85 мг -ова порция натриев цианоборохидрид, а после, 1 час по-късно, се прибавя втора 85 мг -ова порция натриев цианоборохидрид. Реакцията се провежда при разбъркване в продължение на 20 часа и се филтрува. Прибавяме 1 мл вода и

0.9 мл 1 N НС1 към филтрата при разбъркване, след еб което разтворът се концентрира под вакуум до добив 6.2 г N BOC-N^-Arg[psiCH^ Н]-Рго бензилов естер, като светла масло образна течност.

След това маслото се пречиства чрез флаш хроматография през 5 см флаш колона, съдържаща 350 мл силикагел (Merck

Grade 60, 230-400 дупки, 60 А). Продуктът се получава чрез последователно елуиране с 0.25%, 0.75% и 1.5% метанол в хлороформ.

N -BOC-N -Tos-аргинин [psiCH^NjnponHH

Полученият бензилов естер се хидрогенира през паладийвъглерод и се пречиства, както е описано в пример 25. Този процес дава 160 мг N -BOC-N -Tos-Arg [рз!СН^М]пролин свободна киселина, която след това се пречиства, използвайки HPLC

хроматографична система, описана в пример 4, с изключение на това, че елуирането се извършва с изократна 26% буфер В/74% буфер А система, описана преди това в пример 22. Крайният добив на дипептид е 86 мг.

Дипептидът се свързва след това към свързания със смолата хексадекапептид, следвано от цикъл на ВОС-Рго инкорпориране (включване) и цикъл на BOC-(D-Phe) инкорпориране. Отсраняването на протектора, отцепването и пречистването на напълно синтезирания Хирулог-28 се осъществява чрез методите, описани в пример 4.

ПРИМЕР 28

Синтез на Хирулог-29

Формулата на Хирулог-29 е следната : 4-хлоро-изокумарино-3-карбоксиетокси-(С1у)^- -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-ProGlu-Glu-Туг-Leu-OH. (Gly)^. -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-ProGlu-Glu-Tyr-Leu хептадекапептидът се синтезира както е описано преди това и се оставя да се свърже към смолата. 4-хлороизокумарино-3-карбоксиалкокси частта се синтезира по описаната и изобразена по-долу реакционна схема.

Етил 2-бромо-хомопталат

Смесват се хомопталова киселина (10.0 г), 2-бромоетанол (21.0 г) и бензол (200 мл). След това се прибавят 12-15 капки сярна киселина и загрява до обратно изтичане в продължение на 2.5 часа. Разтворът се филтрира след това и се концентрира под вакуум. Утайката се промива с 250 мл етер/хексан (1:1) и се филтрува върху стъклена фуния. Полу ченото светло кафяво твърдо вещество се изсушава до получаване на приблизително 15.0 г от продукта.

4-хлоро-З-[2-бромоетилокси]-изокумарин

-QFСмесваме етил 2-бромо хомофталат , приготвен както е описано преди това (4 г) заедно с фосфорист пентахлорид (8.2 г) и бензол (100 мл). Сместа се пуска в противоток в продължение на 4.5 часа, топла се филтрува и се изпарява под вакуум. Червеникаво-кафявият маслообразен остатък незабавно се хроматографира на 24 мм х 175 мм колона със силикагел, използвайки дихлорометон като елуент. Събират се фракции по 20 мл и се изследват чрез TLC. 4-хлоро-З-[2-бромоетилокси]Iизокумарин се елуира във фракции 2-6. Фракциите се обединяват, изпаряват под вакуум, а полученият остатък се събира като чисто, светложълто масло (2.2 г).

4-хлоро-З-[3-оксипропионат]-изокумарин

4-хлоро-З-[2-бромоетил]-изокумарин (1.4 г), приготвен по-горе се разтваря в анхидриден THF и директно се прибавя към обратно изтичащия разтвор от магнезиеви стружки (170 мг)

и няколко кристала йод в 15 мл анхидриден THF, като се разбърква под аргон. Сместа се пуска в противоток за 1.5 час. След това се излива през изключително сух лед в 400 мл бехер. Оставяме сместа при 20 С, докато цялото количество СО^ в излишък сублимира и тогава прибавяме към < сместа j, приблизително по 100 мл диетел етер и THF, което води до жълт разтвор, съдържащ голямо количество бял, груб преципитат.

о

Продухваме анхидриден НС1 през тази смес при 20 С, който разтваря по-голямата част от преципитата. След това разтворът се филтрира и изпарява под вакуум до получаване на суровия продукт. След това се рекристализира през нощта от

8вDCM.

Полученият 4-хлоро-З-[3-оксипропионат]-изокумарин се прикрепя към глецен бензоловия естер и полученият продукт се хидрогенира каталитично през паладий-въглерод, както е описано в пример 25· След това, този псевдодипептид се прикрепя към свързания със смолата хексадекапептид, (Gly).-Asn-GlyAsp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu, чрез стандартни техники на пептиден синтез.

ПРИМЕР 29

Синтез на Хирулог-ЗО

Формулата на Хирулог-ЗО следната : -4-хлоро-З-[2-аминоетанол]-изокумарин-(Gly)-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-ProGlu-Glu-Tyr-Leu. Хексадекапептидът (Gly)^ -Asn-Gly-Asp-PheGlu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu се синтезира,както е описано преди това и се оставя да се свържи към смолата.

4-хлоро-З-[2-амино-етанол]-изокумариновата част се приготвя по начин аналогичен на този, описан в пример 28 за синтезиране на 4-хлоро-З-[2-бромоетанол]-изокумарин, с изключение на това, че се използва 2-аминоетанол вместо 2бромоетанол в първата стъпка на ес^ерификация на хомопталовата киселина.

Свързването на уреата се образува при реагиране на амино групата от 4-хлоро-З-[2-аминоетанол]-изокумарина с активиращия агент, карбонилдиимидазол (CDI). Полученият междинен имидазолид не се изолира, но реагира със свързания със смолата хексадекапептид за получаване на Хирулог-ЗО. Хирулог

- £7-50 се освобождава след това от протектора, отцепва се от смолата и се пречиства по техниките, описани в пример 4.

ПРИМЕР 30

Синтез на хирулог-31

Формулата на Хирулог-31 е следната : аргипидил-( Gly )^_Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Хексадекапептидът -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GluTyr-Leu се синтезира по стандартните техники за пептиден синтез, описани преди това и се остава да се свърже със смолата. Агрипидилглициновият участък от този Хирулог се синтезира по реакционната схема, описана и изобразена по-долу.

V

- 89 3

Дехидро-lP-нитро-аргипидинът се синтезира предимно по метода за синтезиране на аргипидин, който е описан в патент на САЩ No 4,258,192, включен тук за справка. Единствените разлики са, че гуанидиновата група се предпазва от нитро функция и хетероциклиният пръстен от хинолина остава ненаситен. Междинното се използва . за ацилиране на t-бутил глицин по метода, описан в пример 21. t-бутиловият естер се отстранява по стандартните техники на кисела хидролиза. Получената свободна киселина реагира с хексадекапептида, използвайки стандартни методи на свързване. Полученият пептид се освобождава от протектора, отцепва се от смолата и се пречиства по техниките, описани в пример 4.

След това пептидът се подлага на процедурата на хидрогениране, описана в патент 4,258,192 и се пречиства чрез HPLC техника, описана в пример 4.

ПРИМЕР 51

Синтез на Хирулог-52

Формулата на Хирулог-52 е следната : Н-(D-Phe )-Pro-Arg (Gly )^- -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Хирулог-52 се синтезира, пречиства и характеризира, използвайки методите,описани в пример 4, с изключение на това, че ВОС-глицин се използва вместо ВОС-пролин при цикъла, следващ двата цикъла на ВОС-глицилглицин прибавяне.

ПРИМЕР 52

Синтез на Хирулог-55 доФормулата на Хирулог-33 е следната : N-aixeTHn-Gly-AspPhe-Leu-Ala-Glu-(Gly-Vai-Arg-Pro-(Gly)-Asn-Gly-Asp-PheGlu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Хирулог-33 се синтезира, пречиства и характеризира по стандартните техники за пепти-

ден синтез, използувани в пример 4, с подходящи ВОС-аминокиселинии замествания. CSDM участъкът от Хирулог-33 притежава аминокиселинна последователност, идентична на сегмент от последователност от фибринопептид А от A ¢/-веригата на човешки фибриноген.

ПРИМЕР 33

Разцепване на различни Хирулози от тромбин

Установено е, че инхибирането на тромбин от Хирулог-8 е преходно, дължащо се на бавното разцепване на Arg-Pro връзка от тромбина. След това разцепване се наблюдава, че тромбинът

си възвръща пълната хидролитична активност по отношение на хромогенния субстрат. Следователно, Хирулог-8 се характеризира като бавен-субстрат инхибитор на тромбина.

Разцепването на Хирулог-8, така както и на другите Хирулози, съгласно настоящето изобретение, от човешкиоб -тромбин се онагледява при in vitro изследвания. Реакционни смеси, съдържащи«/.-тромбин (1.6 нМ) и различни концентрации на Хирулог-8, Хирулог-10, Хирулог-18а, Хирулог-18Ь, Хирулог18с, Хирулог-19, Хирулог-32 или Хирулог-33 (80 до 160 нМ) се приготвят в 20 мМ Трис-Hcl, pH 7.4, съдържащ 0.1 М NaCl. Аликвоти (0.975 мл) на реакционните смеси се отстраняват по различно време и се смесват в кювета с 0.025 мл Спектрозим

-31 TH (11 JA. M крайна концентрация), хромогенен субстрат. Началното ниво на реакцията се определя и на основа на контролните смеси, съдържащи тромбин в отсъствие на Хирулог, се изчислява 10% инхибиране.

Алтернативен метод използва _t обратно-фазово HPLC разделяне на този се аликвоти от Хирулог/тромбин реакционната смес. При прибавя човешкио^-тромбин( 0.25yt( М крайна концентрация) от горните Хирулози

Аликвоти (50/L) се отделят и прибавянето на тромреакионния съд, съдържащ един ( 12.5 уИ М крайна концентрация).

двете преди и при различни моменти след бин. Аликвотите се замразяват в колби или се впръскват директно върху HPLC колона. HPLC системата използва , Applied Biosystems течна хроматографска система, снабдена с Aquapore С колона (0.46 х 10 см). Колоната се калибрира с 70% разтворител А (0.1% TFA във вода) и 30% разтворител В (0.085% TFA/70% ацетонитрйл) и се проявява с линеен градиент от 30 до 50% разтворител В в продължение на 30 минути при скорост на потока 1 мл/минута. Изходният поток се изследва при 214 нм. Концентрацията на пептидите се определя чрез измерване височината на пиковете.

И двете от горепосочените изследвания позволяват определяне степента на хидролиза на Хирулог от тромбин (изразена в М/мин) и обратното ниво (к^.^; изразена в мин ) И двата метода дават съпоставими k _ccit стойности, които са показани на следващата таблица.

ИНХИБИТОР	р _ pi А А
СЕКВЕНЦИЯ	-/ <мин )
Хирулог-8	Arg-Pro	0.31-0.5
Хирулог-10	Arg-Sar	10
Хирулог-18а	β-хомо-Arg-Gly	<0.01
Хирулог-18Ь	p—хомо—Arg—Pro	<0.01
Хирулог-18с	p-хомо-Arg-Val	<0.01
Хирулог-19	ArgfpsiCH NH]-Gly	<0.01
Хирулог-32	Arg-Gly	535
Хирулог-33	Arg-Pro	0.056

Както е показано по-горе, Хирулог-8, -1О, -32, и -33 се разцепват от тромбина с стойности от 0.056 мин^-^ (бавно разцепване) до 535 мин^-' (бързо разцепване). Противно на то-

ва, Хирулог-18а, -18Ь, -18с и -19 се оказва резистентен към разцепване с тромбин.

Фиг. 5, А и В, показват по-подробни анализи на разцепването на Хирулог-8 от тромбина. Както е изобразено на фиг.

5А, концентрациите на Хирулог-8 в незначителен излишък над тромбина показва неустойчива инхибиторна активност (по-голяма или равна на минути, зависеща от концентрацията на

Хирулог ) .

Прогресивно нарастващи концентрации на Хирулог-8 показват удължени инхибиторни ефекти. Линейна зависимост между продължителността на инхибирането и концентрацията на

-у 3

Хирулог-8 е показана на фиг. 5В. От тези данни се изчислява

I -4 реципрочното време или k на 0,37 мин

Чрез пречистване и секвенционен анализ на продукти, получени от смилане с Хирулог-8, получени при горните реакции, се определя, че Хирулог-8 се разцепва бавно от тромбина, при Arg-Pro връзката. Това е съвсем необикновен сайт на разцепване за серин-протеазите, и се предполага, че е възможно разцепване при Хирулог-8, дължащо се на високия афинитет на t пептида към тромбина.

Ефект

Хирулог-8, личават помежду

ПРИМЕР 34 на дължината на линкера върху активността на Хирулог

Хирулог-13, Хирулог-15 и Хирулог-16, се разси единствено по дължината на полиглициновия участък на техните съответни линкерни сегменти. С цел да се определи какъв е ефектът на дължината на линкера върху антивността, се съпоставя инхибирането на човешки оС -тромбин от всеки един от тези Хирулози. Следващата таблица дава дължината на линкера на всеки един от тези Хирулози :

пептид о

дължина на линкера (А)

Хирулог-824

Хирулог-1318

Хирулог-1530

Хирулог-1636

Антитромбиновите активности на тези Хирулози се измерват предимно спрямо тромбин-катализираната хидролиза на Спектрозим TH, описан в пример 9. Фиг. 6 изобразява взаимовръзката между дължината на линкера и К₄ за инхибирането на Хирулог от тази тромбин-катализирана реакция. Тази фигура показва, че Хирулог-8, -15 и -16 имат съпоставими инхибиторни активности, докато Хирулог-13, с 18 X дължина на линкера, притежава активност, намалена с повече от 10 пъти. То·- О о ва потвърждава, че дължини на линкер >18 А и <42А не повлияват активността на Хирулог. Тъй като не се надяват да намерят теоретично обяснение, заявителите смятат, че това се дължи на факта, че линкерът на Хирулога е толкова объркан, когато е свободен в разтвор, както и когато е свързан с тромбин. Заявителите смятат също, че тук съществува малка кооперативност при свързването на CSDM и ABEAM участъците на инхибиторите на тромбин, съгласно изобретението, към тромбин .

ПРИМЕР 55 д Инхибиране на тромбин-катализираната хидролиза от различни Хирулози

Съпоставяме инхибиторната активност на различни инхибитори на тромбин, съгласно настоящето изобретение, спрямо тромбин-катализирана хидролиза на трипептидил-р-нитроанилиден субстрат. Антитромбиновите активности на Хирулог-10, Хирулог-18а, Хирулог-18Ь, Хирулог-18с, Хирулог-19, Хирулог52 и Хирулог-35 се изследват по метода, описан в пример 9, използвайки Спектрозим TH като субстрат. Следващата таблица

-95‘ изброява изчислените Ki стойности .както и Р. -Р.* ’ последователността на всеки един от тези инхибитори на тромбин.

Инхибитор	р. -р/ * Последователност	K (mM)
Хирулог-8	Arg-Prq,	1,9 1,4
Хирулог-10	Arg-Sar	> 2,000
Хирулог-18а	Р-HomoArg-Gly	7,4
Хирулог-18Ь	β-HomoArg-Pro	4,6
Хирулог-18с	уЗ -HomoArg-Val	205,0
Хирулог-19	Arg[psiCH NH]-Gly	20,0
Хирулог-32	Arg-Gly	> 2,000
Хирулог-33	Arg-Pro	3,6

Както е посочено по-горе, Хирулог-10 и Хирулог-52 са

слаби инхибитори на тромбин-катализирана хидролиза на Спектрозим TH. Това съответствува на факта, че всеки от тези инхибитори бързо се разцепва от тромбина при ₽₁ -Р^ ’ връзката. В Хирулог-19, където тази връзка е редуцирана до ρβίΟΗ,-ΝΗ свързване и е направена неразцепваща се от тромбина, се наблюдава ефективно инхибиране на тромбиновата хидролиза.

Изследванията сjB-хомоаргинин-съдържащи инхибитори (Хирулог-18а, -18Ь и -18с) показват, че това аминокиселинно производно може да замести аргинина в инхибиторите, съгласно у·

-9Gефективността. Още повече, изобретението, без да засегне това показва, че разместването на амидната връзка от един метилен не намалява чувствително тромбин инхибиторната активност. Повишаването с 30 до 50 пъти на Ki за Хирулог-18с, сравнено с Хирулог-18а и -18Ь, съответно, предполага, че структурата на Р^’ аминокиселината е от значение за инхибиторната активност. Тъй като не се надяват да намерят теоретично обяснение, заявителите смятат, че присъствието на phipsi ъгли в ’ аминокиселината , (Gly в Хирулог-18а; Pro в Хирулог-18Ь) , така както и конформационни причини, (такива, каквито се предизвикват от пролин в Хирулог-18Ь), съдейст.ват за силата на инхибиторите, съгласно настоящето изобретение. Алтернативна възможност е 3 -разклонената странична

I ^J верига на Р^ * аминокиселината Vai в Хирулог-18с да може нечетно да свързва CSDM участъка на тази молекула към реакционния център на тромбина, дължащ се на етерични причини.

ПРИМЕР 36

Свързване на Хирулог-8 към активния сайт на тромбина

Диизопропилфлуорофосфат (DFP) е добре известен инхибитор на серин-протеазите, включително тромбин, който действа чрез ковалентно модифициране на хидроксилната група на Ser-195. Прибавяме в излишък от 270 пъти С-DFP към тромбина в 0,1 М натриев борат, pH 8,0. След десет минутна реакция се демонстрира образуване на тромбинов комплекс чрез SDS-PAGE и флуорографични анализи (Фиг. 7, пътека 1). Когато

37реакцията се осъществява в тил-хирудин£₃(при 500 и присъствие на сулфо-Туг -N-ацеbj

3000 пъти моларен излишък спрямо тромбина), модификацията на тромбин от [^Cj-DFP не се променя значително (фиг. 7, пътеки 4 и 5). Въпреки това, когато реакцията се осъществи в присъствието на Хирулог-8 (при 3 или 30 пъти моларен излишък спрямо тромбин) инкорпорирането на [C]-DFP в каталитичния сайт на тромбина е напълно блокирано (фиг. 7, пътеки 2 и 5). Тези данни показват, че CSDM на инхибиторите на тромбин, съгласно изобретението, са способни на свързване към каталитичния сайт на тромбина и инхибиране на каталитичната активност.

ПРИМЕР 37

Съпоставка между антитромбиновата активност на

Хирулог-8 и синтетичния каталитичен сайт-насочен пентапептид (D-Phe-Pro-Arg-Gly)

Както е посочено на фиг. 1, Хирулог-8, за разлика от съставящата го анион-свързващ екзосайт асоциирана част, сул®o-Tyr_f3 -N-ацетил-хирудин £5_, е способен да инхибира тромбин-катализираната хидролиза на малки р-нитроанилидни субстрати. Подобно на това се изпробва и способността на (DPhe)-Pro-Arg-Gly пентапептид да инхибира тромбиновата каталитична реактивност.

Пентапептидът се синтезира както е описано в пример 4, използувайки ВОС-глицин-дивинилбензолова смола. Пептидът се пречиства и характеризира, както е описано в пример 4.

Ефектите на двата Хирулог-8 и този пентапептид по отно-9<Sшение на тромбин-катализираната хидролиза на Спектрозим TH се изследват както е описано в пример 9, използвайки ΐ фиксирани концентрации на пептида от 50 нМ или

Ю^М, съответно.

Резултатите сочат,

Хирулог-8 могат да че докато наномоларните концентрации на инхибират тромбин-катализираната реакция, концентрации на пентапептида високи до 10 М имат незначите лен ефект на тромбиновата, катализа. Тези данни сочат, че CSDM компонентът на инхибиторите на тромбин, съгласно изоIбретението, е сам по себе си, слаб инхибитор на каталитичните функции на тромбина.

ПРИМЕР 38

Антикоагулантна активност на Хирулог-8 in vivo

In vivo антикоагулантната активност на Хирулог-8 се определя след интравенозно прилагане на този пептид в бабуини. Използва _се различно дозиране на Хирулог-8, от 0.002 до 0.2 мг/кг/мин. Бабуините (мъжки, 10-15 кг) се успокояват с кетамин хидрохлорид преди приложението на Хирулог-8. Цялата кръв от третираните и контролните животни се отделя чрез катетър, сложен във феморалната вена и се събира в 3.8% натриев цитрат (9:1; кръв:натриев цитрат). Изолира се плазма по стандартни методи и АРТТ се записва по методите, описани в пример 10. Както е показано на фиг. 8, Хирулог-8 води до зависимо от дозата повишаване в АРТТ. 200% повишаване в АРТТ (считано за терапевтично ниво) се постига с най-ниската доза Хирулог (0.002 мг/кг/мин инфузия).

ПРИМЕР 39

Инхибиране на свързания със съсирех тромбин от Хирулог-8

Изветно е, че тромбинът може да се свърже към фибриновия съсирех и след като е вече абсорбиран, продължава да разцепва допълнителния фибриноген, получен при разрастването на съсиреха. Демонстрирано бе, че свързаният със съсиреха тромбин е резистентен към неутрализиране с хепарин-антитромбин III комплекс [P.J. Hogg et al., Fibrin Monomer Protects Thrombin from Inactivation By Heparin-Antithromb-in III : Implications for Heparin Efficacy, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA. 86, pp. 3619-23 (1989)], но може да бъде инхибиран чрез антитромбин III-независими инхибитори, като РРАСК, хирудин или сулфо-Туг^ -N-ацетил-хирудин. Предполага се, че свързаният със съсирека тромбин играе роля при приръста на тромба и при ретромбозата, следваща тромболитична терапия .

Сравняваме способностите на Хирулог-8 и хепарина да инхибират свързания със съсирек тромбин, използвайки методът, описан от J.I. Weitz et al., Clot-Bound Thrombin Is Protected from Heparin Inhibition-A Potential Mechanism for Rethrombosis After Lytic Therapy, Blood, 74, p. 136a, (1989 ) .

От значение за клиниката доза хепарин (0.1 U/мл) инхибира фибринопептид A (FPA) остатък катализиран от разтворим тромбин, около 70%. Докато подобна доза няма ефект върху FPA остатък, катализиран от свързан със съсирек тромбин. Обрат ното, Хирулог-8 притежава приблизително идентичен инхибиторен ефект върху FPA остатъка, катализиран или от разтворим или от свързан със съсирека тромбин (Фиг. 9).

Това изследване показва, че Хирулог-8, така както и другите инхибитори на тромбин, съгласно изобретението, са по-ефективни от обикновените лекарства при блокирането на нарастването на тромба, увеличавайки степента на тромболитична реперфузия и предпазвайки от ретромбози, следващи тромболитично лечение.

ПРИМЕР 40

Ефектът на Хирулог-8 при in vivo плака-зависима тромбоза

Тъй като е известно, че бабуините имат подобни коагулационен и хемостатичен отговори като човека, се използва модел на бабуин за определяне способността на Хирулог-8 да прекъсне плака-зависимата тромбоза. Специфично, се поставят различни тромбогенни повърхности в хронично изнесено AV отклонение в животните. Тези повърхности включват сегменти от ендартеректомизирана аорта на бабуин, покрита с колаген силастична тръба, покрит с колаген Gortex и Dacron кръвоносни присадки. След поставянето в отклонението, повърхностите се оставят на потока нативна кръв, за да се предизвика образуване на тромб. Измерва се образуването на тромби в продължение на 60 минути чрез изследване позицията на плаките върху тромбогенната повърхност. Измерванията се записват чрез външно гама-камера изображение , следващо преинфузията

- ΊΟ4~ на тестуваното животно с автоложни In-маркирани плаки.

Поставянето на 5 см-ов сегмент от ендартеректомизирана аорта на бабуин във външното AV отклонение при отсъствие на Хирулог-8 води до време зависимо отлагане на плаки. Това акумулиране достига до плато след 60 минути, при което време $ се откриват общо 14.0 £ 5.1 х 10 плаки/см, отложени върху ендартеректомизирания сегмент. Дози от 0.002 и 0.01 мг/кг/ мин Хирулог-8 инхибират отлагането на плаки с 53-6% и 75.5%, съответно. Тези резултати са изобразени на фиг. 10. за

Хирулог-08 (нужната доза за намаляване на отлагането на плаки с 50%) при тази моделна система е 0.002 мг/кг/мин.

Когато се поставят 5 см-ови сегменти от покрити с колаген силастични тръби в AV отклонението, 12-6 + 5.0 х 10® плаки/см се отлагат след 60 минути, при отсъствие на Хирулог-8. Прилагането на Хирулог-8 води до зависимо от дозата инхибиране на отлагането на плаки. Доза от 0.04 мг/кг/мин Хирулог-8 изцяло инхибира отлагането на плаки. Резултатите от тази част на експеримента са изобразени на фиг. 11. ED^ на Хирулог-8 в тази система се изчислява на стойност 0.004 мг/кг/мин.

И двете, покрити с колаген, Gortex или Dacron кръвоносни присадки, са известни като по-тромбогенни отколкото сиА ластичните тръби. Общ брой от 35.0+6.0 х 10 плаки/см се отлагат върху Gortex след 60 минутно излагане на нативната кръв в отсъствие на Хирулог-8. Установи се, че Хирулог-8 отново демонстрира зависим от дозата антитромботичен ефект по отношение на плаковото образуване на тромби. Доза от 0.2

702 ut/ylvIiawa Хирулог-8 причинява 62.9% инхибиране на отлагането на плаки. ED-p за Хирулог-8 в Gortex системата е 0.155 мг/ кг/мин. Подобен резултат се получава за Dacron присадките. Най-високата доза Хирулог-8, нужна,за да се инхибира отлагането на плаки върху тези две повърхности,беше очаквана, поради тяхната висока тромбогенна активност.

Също така се определя ефектът на Хирулог-8 спрямо двете най-ниско и най-високо отместени, зависимо от плаките образуване на тромб, използвайки устройство на дуалова камера, което дава възможност за едновременно измерване на двете отместени условия. Устройството се състои от два 2 см-ови сегмента от покрити с колаген Gortex, следвани от два 2 см-ови сегмента с по-щирок диаметър. Използвайки това устройство, образуването на тромби се инициира чрез излагане на нативния кръвен поток на сегмент от покрит с кораган Gortex с голямо отместване. Тази част от експеримента симулира артериало подобни условия. Когато кръвта навлезе в сегментите с по-широк е

диаметър, се поддържа ниско отклонение, вортекс условия, ка-

то по този начин се симулира венозна тромбоза. В контролните животни, общ брой от 9.3-^ 2.3 х 10 и 6.1 -#» 0.5 х 10^с плаки /см се акумулират след 40 минути в сегмента с високо и ниско отместване, съответно. Хирулог-8 инхибира отлагането на плаките в двата сегмента, с високо и ниско отместване, в зависим от дозата начин. Доза от 0.05 мг/кг/мин инхибира акумулирането на плаки с 42.6% при ниското отместване и 29.0% при високото отместване.

-Ί03ПРИМЕР 41

Сравнение на Хирулог-8 с други антитромботични агенти при инхибиране на остра зависима от плаките тромбоза

Разгледани са ефектите на хепарина, хепарина с ниско молекулно тегло и рекомбинантния хирудин, върху отлагането на плаките в покритите с колаген силастични тръби/бабуинов модел/на изнесено AV отклонение, описано в пример 40.

Посочено е преди това, че приложението на хепарин като 160 U/кг болус инжектиране, последвано от 160 U/кг/час инфузия, инхибира отлагането на плаките до степен около 80% от това, наблюдавано при третираните с физиологичен разтвор контролни животни. Хепаринът с ниско молекулно тегло, приложен като болус инжекция от 53 анти-Ха U/кг, последван от инфузия от 53 анти-Ха U/кг/час, води до подобни резултати [Y. Cadroy,

In vivo Mechanism of

Thrombus Formation.

Studies Using a Primate

L’Universite Paul Sabatier de

Model, Doctoral Thesis,

Toulouse (Sciences) (1989)].

При еквивалентни моларни дози (5 нмола/кг/мин) рекомбинантен хирудин [А.В. Kelly et al., Recombinant Hirudin Inter ruption of Platelet-Dependent Thrombus Formation, Circulation, 78, p. 11-511 (1988)] и Хирулог-8, и двата инхибират зависимото от плаките образуване на тромби с 60-70% в сравнение с контролата. Тези резултати са изобразени на фиг.

12. Други инхибитори на тромбин са изпитани преди това в бабуиновия модел [А.В. Kelly et al., Comparison of Antithrombotic and Antihemostatic Effects Produced by Anti thrombins in Primate Models of Artrial Thrombosis, Thromb. and Hemostas., 62, p. 42 (1989)]. Описаните ED^ дози върху покрити c колаген повърхности за тези агенти, както и наште ED определения, са обобщени в следващата таблица :

Агент	EDy(7
РРАСК	75 нмола/кг/мин
Gyki 14,451	500
Бензамидин	3000
Аргипидин (MD805)	550
гес-Хирудин	<5
Хирулог-8	<5

ПРИМЕР 42

Ефект на Хирулог-8 върху отлагането на фибрин

Измерва се ефекта на Хирулог-8 върху отлагането на фибрин(оген) в образуваните тромби в ендартеректомизираната аорта и покритите с колаген сегментни силастични тръби моделни системи, описани в пример 40. Отлагането на фибрин се определя чрез измерване на ¹¹ & 1-фибрин(оген) 30 дена след завършване на In-плаки изследването, описано по-горе. Та*44 ка се дава възможност на In маркирането да отпадне на непречещо ниво.

Фиг. 13 демонстрира, че в отсъствие на Хирулог-8, 0.17 мг/см фибрин минутното

Дози от 0.01

- 46Fсе отлага върху покритите с колаген тръби, след излагане на кръвния поток, описано в пример 40.

и 0.04 мг/кг/мин изцяло инхибират отлагането на фибрин(оген ) . Подобни резултати се получават с ендартеректомизирания аортен сегментен модел.

Тези резултати сочат, че инхибиторите на тромбин, съгласно изобретението, са ефективни при редуцирането на свързаното с тромб отлагане на фибрин(оген), така както и блокирането на акутно, зависимо от плаките образуване на тромби.

ПРИМЕР 43

Измерване на времето за изчистване за Хирулог-8

Използва се бабуинов модел за определяне времето за изчистване на Хирулог-8, следващо интравенозна инфузия, единична болус интравенозна инфузия и единично болус подкожно инжектиране.

АРТТ опити, осъществени както е описано в пример 111,се използват за изследване на времето за изчистване.

Прилагат се различни дозировки Хирулог-8 (0.002-0.2 мг/ кг/мин) на бабуини чрез системни интравенозни инфузии в продължение на 60 минути. АРТТ се измерва след 60 минутната инфузия и при различни интервали от време след това.

Определя се средното време на полуизчистване за Хирулог-8 на 9.2 -»

3.3 минути.

За определяне на времето за изчистване след единично б о лус инже к тир ан е, се инжектират интравенозно или подкожно бабуини с доза от взимат в различни мг/кг Хирулог-8. АРТТ измерванията се интервали от време след инжектирането.

‘100Фиг. 14 демонстрира, че АРТТ се повишава до пик от 57% спрямо контролната стойност, 2 минути след интравенозното инжектиране. Времето на полуживот на Хирулог-8 след интравенозното инжектиране е 14 минути.

Фиг. 15 демонстрира, че в ранните точки от времето, следващо подкожното инжектиране на Хирулог-8 (15 минути), АРТТ нараства приблизително с 200% спрямо контролата. Изчистването чрез подкожния път е продължено до половината от tвремето от 340 минути. Установи се, че Хирулог-8, приложен подкожно, се абсорбира изцяло.

ПРИМЕР 44

Ефект на Хирулог-8 в бабуинов модел на десеминирана интраваскуларна коагулация

Индуцира се септицемия в бабуини чрез инжектиране на летална доза от живи Е.

Taylor et al., J. Clin.

s coll, съгласно метода,описан от F.B.

invest., 79 рр. 918-25 (1987). Хиру лог-8 се инфузира при доза от 0.08 мг/кг/час от 15 минути преди инжектирането на

Е. coli до над 6 часа след инжектирането.

При отсъствие на

Хирулог-8, Е. coll индуцирания септичен шок води до значително спадане в неутрофилното броене, кръвното налягане и хематокрита. Контролните животни показват спадане на хематокрита със 70% от нивото, а в кръвното налягане до 20% от базисното след 3 часа. Прилагането на Хирулог-8 напълно атенуира спадането на хематокрита и ограничава спадането на пика при кръвното налягане до 60% от ос новното .

- 4&t'

Въпреки атенуирането на DIC от Хирулог-8, леталната инфузия от Е. coll все пак воли до смърт. При аутопсията на двете животни, контролното и третираното с Хирулог-8, се откриват масивни тъканни едеми и в двете групи. Въпреки това, само контролната група показва интраваскуларна тромбоза. Резултатите от аутопсията сочат, че единствено прекъсване на коагулопатичния стадий на септицемията не е достатъчно да предпази от смърт, дължаща се на септичен шок.

* —

ПРИМЕР 45

Ефект на комбинация от tPA и Хирулог-8 върху тромболизата

За да се определи ефекта на Хирулог-8 върху засилващата се tРА-индуцирана тромболиза, се използва - модел на плъх за артериална тромболиза. При този модел се образува един експериментален тромб в абдоминалната аорта след балонно катетерно оголване и висока степен на стеноза (95¾). Кръвният ток и кръвното налягане се записват дистално от местото на * нараняване и стеноза. Взимат се плъхове на слука, които да получат tPA (1.0 мг/кг болус , следван от

1.0 мг/кг/час инфузия) заедно с едно от следните физиологичен разтвор, хепарин (10 U/кг болус, следван от i.5 U/кг/мин инфузия), рекомбинантен хирудин (1.0 мг/кг болус,следван от 0.02 мг/ кг/час инфузия) или Хирулог-8 (0.6 мг/кг болус,следван от 0.02 мг/кг/час инфузия). Антитромботичният агент или физиологичен разтвор се прилагат едновременно с tPA и за допълнителни 50 минути, следващи края на tPA инфузията.

~ 408-

Фиг. 16 изобразява резултатите от тези експерименти.

Животните,третирани с tPA плюс физиологичен разтвор,показват време на реперфузия 16,2 минути. Хепаринът намалява времето на реперфузия до 12,2 минути, докато рекомбинантниятхирудин го намалява до 15,0 минути. Нито едно от тези снижавания не са статистически показателни (р<0.005). Комбинацията на Хирулог 8 с tPA означава намаляване на времето за реперфузия до 4.4 минути (р<0.01), като така се ускорява фибринолитичния ефект от tPA чрез четири фактора.

Хепарин, хирудин и Хирулог 8, всичките значително предпазват от реоклузии, в сравнение с третираните с физиологичен разтвор контроли (фиг. 17). Всеки от тези агенти също така продължава АРТТ до стойности от 600%, 500% и 400%, респективно, над контролните стойности (фиг. 18). Накрая, всеки от хепарин, хирудин и Хирулог 8 увеличават времето за отвореността на съдовете до стойности от 80.2%, 82% и 95.1%, съответно (контрола ват, че инхибиторите тение, превъзхождат

45.6%) (фег. 19). Тези резултати показна тромбин, съгласно настоящето изобредругите известни антитромботици при увеличаването на ефикасността на tPA.

ПРИМЕР 46

Ефект на Хирулог-8 и други антитромботични агенти върху времето на кървене при бабуини

Използва се шаблонно измерване на времето на кървене за изследване на ефектите на Хирулог-8 върху хемостазиса.

Различни дозировки на Хирулог-8 (0.002 до 0.2 мг/кг/

мин) се анализират за техния ефект върху времето на кървене. Дози от 0.002 до 0.04 мг/кг/мин не причиняват значително нарастване на времето на кървене. Резултатите от това изследване са изобразени на фиг. 20. При доза от 0.1 мг/кг/мин Хирулог-8 причинява двукратно нарастване на времето на кървене над контролните стойности. При 0.2 мг/кг/мин на Хирулог-8, времето на кървене трикратно нараства над контролните стойност. Резултатите ясно показват, че дозите, нужни за инхибиiрането на зависимите от съсирека тромбози (0.002 мг/кг/мин; виж Пример 40) не оказват значителен ефект върху хемостатичното образуване на тапа.

Изпробва се също така ефектът на различни други агенти върху шаблонното време на кървене при бабуини, както и върху системните антикоагулантни ефекти (както са измерени чрез АРТТ). Резултатите са обобщени по-долу :

Агент (% от	АРТТ контролата)	време на кървене (мин)
Хирулог-8	500.6	5.5
гес-хирудин	595.9	12.1
РРАСК	287.9	1 2
Gyki 14,451	459.4	14
бензамидин	757.6	10
аргипидин (MD805)	>900	>50
хепарин	706.1	10

Както сме представили по-горе няколко предпочитани варианта на настоящето изобретение става ясно, че нашата основна конструкция може да се променя, така че да осигури други варианти, които използуват молекулите, съставите, комбинациите и методите на настоящето изобретение. Следователно трябва да се оцени, че обсегът на настоящето изобретение ще се дефинира по-скоро от претенциите, приложени тук, отколкото специфичните варианти, които бяха представени като приί

Claims (33)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Инхибитор на тромбин,състоящ се от :

   а) каталитична сайт-насочена част, която се свързва с и инхибира активния сайт, на тромбина; където посочената каталитична сайт-насочена част се избира измежду серии протеиназни инхибитори, хетероцикличните протеиназни инхибитори, тромбин-специфични инхибитори, транзиционни аналози на състоянието, бензамидин, DAPA, ΝΑΡΑΡ, аргипидин или части от формулите :

   Х-А^-A^-Aj-Y или X-C₄-C₂-A₃-Y където X е водород или се характеризира с основна верига, състояща се от 1 до 35 атома; е Arg, Lys или Огп; е неамидна връзка; А^ се характеризира с основна верига, състояща се от 1 до 9 атома, Y е връзка; е производно на Arg, Lys или Огп, съдържащ карбоксилирана част, която се редуцира или заместена от«{-въглерода от част, характеризираща се с основна верига, състояща се от 1 е неразцепяща се връзка;

   б) линкерна част, характеризираща се притежаваща пресметната дължина от <9 ло 42 А; и до 10 атома; и % основна верига, е

   около 18 А и окоанион-свързващ екзосайт асоциирана част;

   -HI посочената каталитична сайт-насочена част е свързана с посочената линкерна част, а посочената линкерна част е свързана с посочената анион-свързващ екзосайт асоциирана част; където посоченият инхибитор е способен едновременно да се свързва към каталитичния сайт и анион-свързващия екзосайт на тромбина .
2. 2.

   Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1, където посочения анион-свързващ екзосайтна част се състои от формулата

   W-B₄ -Β^-Β,-Β^-Β,-Β^-Ζ където

   W е връзка;

   В. е анионна аминокиселина

   В^ е коя да е аминокиселина

   Bj е lie, Vai, Nle или Phe;

   Рго, Нур,
3. 3,4-дехидро Pro тиазолидин-4-карбоксилат, Sar коя да е N-метил аминокиселина или D-Ala; Bjе анионна аминокиселина;

   В ₆ е анионна аминокиселина ; В? е липофилна аминокиселина, избрани измежду групата, състояща се от Туг,

   Тгр,

   Phe, Leu,

   Nle, Не, Vai,

   Cha, Pro или дипептид, състоящ се от една от тези липофилни аминокиселини и коя да е аминокиселина; В& е връзка или пептид,съдържащ от един до пет остатъка от коя да е аминокиселина .; Z е карбокси краен остатък , избран измежду

   ОН, -С_еалкокси, амино, моноили ДИ-(Су ^С4 ) алкил заместен амино или бензиламино.

   3.

   Инхибитор на тромбин, съгласно претенция

   2, където

   Leu

   Leu е Glu;

   Туг

   В^ е Не;

   В₇ е Туг(SOjH)-Leu,

   В^ е Pro; В^. е Glu; Bg, е Glu;

   Tyr-(0S0₃H)-Leu или (3-,5-лииодоТуг)връзка; Z е

   ОН
4. 4. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1, където

   443посочената основно верига на посочената линкерна част се състои от коя да е комбинация от атоми, избрани измежду групата, състояща се от въглерод , азот, сяра и кислород.
5. 5. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 4, където посоченият линкер включва следната аминокиселинна последователност : Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe.
6. 6. Инхибитор на тр омбин, съгласно претенция 1, където посочената каталитична сайт-насочена част се свързва обратимо към и бавно се разцепва с тромбин.
7. 7. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1, където посочената каталитичната сайт-насочена част се свързва обратимо и не може да се разцепи с тромбин.
8. 8.

   Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1, където посочената каталитична сайт-насочена част се свързва необратимо към тромбина.
9. 9. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1, където

   X е D-Phe-Pro; А. е

   Arg; и Ag е

   D-Рго, Pro или Sar.
10. 10. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 9, където посоченият инхибитор на тромбин е избран измежду състояща се от Хирулог-8 и Хирулог-12.

    Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1, групата, където

    X е N-aneTHn-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val; Aj е

    Arg; а А^ е Pro.
11. 12. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1, избран измежду група, състояща се от Хирулог-18а и Хирулог-18Ь.
12. 13. Фармацевтично приемлив състав, състоящ се от извес тно количество инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1, _s ефективно за инхибирането на тромбин-медиирана функция при пациент или в извънтелесна кръв и фармацевтично приемлив носител .
13. 14. Фармацевтично приемлив състав, съгласно претенция 13, където посоченото фармацевтично ефективно количество е между около 1^цг/кг телесно тегло /ден до около 5 мг/кг телесно тегло/ден.

    между около 10уЦ
14. 15. Фармацевтично приемлив състав, съгласно претенция i14, където посоченото фармацевтично ефективното количество е г/кг телесно тегло/ден до около 500^ц г/кг телесно тегло/ден.
15. 16.

    Състав за покриване на повърхността на инвазивни инструменти, които да се вкарват в пациента, където посочения състав съдържа подходящ буфер и поне един инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1.
16. 17. Фармацевтично приемлива комбинация за лечение или предпазване от тромботични заболявания при пациенти, включ ваша :

    а) инхибитор на тромбин, съгласно претенция 1;

    б) тромболитичен агент; и

    в) фармацевтично приемлив носител.
17. 18. Фармацевтично приемлива комбинация, съгласно претенция 17, където посоченият инхибитор на тромбин е Хирулог8, а посоченият тромболитичен агент е tPA.
18. 19. Комбинацията, съгласно претенция 17, където дневната доза на посочения инхибитор на тромбин е между lyUr/кг телесно тегло и 5 мг/кг телесно тегло и където дневната доза

    -HS-на посочения тромболитичен агент е между около 10% и около 80% от конвенционалната степен на дозиране на посочения тромболитичен агент.
19. 20. Комбинацията, съгласно претенция 19, където дневната доза на посочения инхибитор на тромбин е между Ю^иг/кг телесно тегло и 500 уК г/кг телесно тегло и където дневната доза на посочения тромболитичен агент е между около 10% и около 70% от конвенционалната степен на дозиране на посочения тромболитичен агент.
20. 21. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 2, където посочената линкерна част се характеризира с основна вери- о о га, притежаваща изчислена дължина от около 18 А и 36 А и се подбира измежду групата, състояща се от ацилова група от около 17 до 35 въглеродни атома, алкилова група от около 17 до 35 връзки на основната верига, пептид притежаващ около 2 до 12 остатъка от коя да е аминокиселина и техни комбинации .
21. 22. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 5, където :

    В е Туг(SO.Н)-Leu или Туг(OSO.Н)-Leu;

    линкерът е пептид от около 8 до 10 амино киселини, като аминокиселината на посочения линкер, която е най-близко до анион-свързващ екзосайтната част е Phe; а каталитичната сайт-насочена част се състои от следната формула :

    X-Arg-R, където X се избира измежду групата, състояща се от DPhe-Pro и тозил-Gly; a R се избира от групата, състояща се

    -4i6от Pro, Sar, и N-метил Ala.

    25. Инхибитор на тромбин, съгласно претенция 11, където посоченият инхибитор на тромбин е Хирулог-55.
22. 24. Състав, съгласно коя да от претенциите 13-15 или 16, където посоченият инхибитор на тромбин е Хирулог-8.
23. 25. Комбинация, съгласно коя да е от претенциите 17,

    1.9 или 20, където посоченият инхибитор на тромбин е Хирулог-

    8.
24. 26. Метод за намаляване дозата на тромболитичния, ефективен за прилагането на реперфузия или за дневна реоклузия при пациент, като посоченият метод включва етапа на прилагане на тромболитичния агент на посочения пациент като част от комбинация, съгласно претенция 18.
25. 27. Метод за намаляване времето на реперфузия и увеличаване времето на реоклузия при пациент, третиран с тромбо- литичен агент, като посоченият метод включва етапа на придало гане върху посочения пациент на състав, съгласно претенция 13, където посочения състав се прилага върху посочения пациент в продължение на около 5 часа преди, до 5 часа след третиране на пациента с тромболитичния агент.
26. 28. Метод, съгласно претенция 27, където посоченият състав се прилага върху посочения пациент ^в продължение на

    2 часа преди до 2 часа след третирането на посочения пациент с посочения тромболитичен агент.
27. 29. Метод за инхибиране на тромбиновите каталитична и рецептор-медиирана функции при пациент или при извънтелесна кръв, включваш етапа на третиране на посочения пациент или посочената извънтелесна кръв със състава,посочен в претенция 13 .
28. 30.

    Метод съгласно претенция 29, където посоченият метод се използва за лечение или предпазване на тромботично заболяване при пациенти.
29. 31 .

    Метод съгласно претенция 29, където посоченият метод се използва з_а лечение или предпазване на тромбининдуцирано възпаление при пациент.
30. 32.

    Метод съгласно првтнция

    31, където посоченото възпаление се причинява от заболяване избрано измежду групата, състояща се от синдром на възрастово дихателено изтощение, септичен шок, септицемия и реперфузионно нараняване.
31. 33.

    Метод съгласно претенция 29. където посоченият метод се използва за инхибиране нарастването на тромба при пациенти, причинен от свързан със съсирека тромбин
32. 34.

    Метод съгласно претенция

    29, където посоченият метод се използва за инхибиране на зависимата от плаките тромбоза при пациент

    55.

    Метод съгласно претенция

    29, където посоченият метод се използва _за лечение или предпазване от дисеминирана вътресъдова коагулация при пациенти.
33. 36Метод съгласно коя да е претенция от

    26-28 или

    29-35, където посоченият пациент е човек.

    Метод съгласно коя да е претенция от

    26-28 или

    29-35, където посоченият инхибитор на тромбин, използван в посочения състав или комбинация е Хирулог-8.