CN102590490A - 测定凝固抑制剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于凝固诊断学领域，并涉及在样品中测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂（抗凝剂），特别是直接的凝血酶和因子Xa抑制剂的均相法，并也涉及在这样的方法中使用的检测试剂盒。使用与蛋白水解活性凝固因子结合但不被后者切割且与待测抗凝剂竞争的配体。

Description

测定凝固抑制剂的方法
技术领域
本发明属于凝固诊断学领域，并涉及在样品中测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂（抗凝剂，anticoagulant），特别是直接的凝血酶和因子Xa抑制剂的均相法，还涉及在这样的方法中使用的检测试剂盒。
背景技术
一般的抗凝剂治疗主要目的是抑制前凝固因子凝血酶（因子IIa、FIIa）和因子Xa（F Xa）。例如使用维生素K拮抗剂（例如香豆素）作用于抑制凝固因子合成的口服抗凝和由于在血流中抑制活性凝固因子而引起的抗凝之间存在区别。在抑制或失活血流中的活性凝固因子的抗凝剂中，分为直接作用的抗凝剂和间接作用的抗凝剂。直接作用的抗凝剂例如利伐沙班、达比加群或美拉加群结合凝血酶或因子Xa，并因此是高度特异的。间接作用的抗凝剂例如肝素结合内源凝固因子抑制剂例如抗凝血酶，并多次放大其抗凝作用。
通过特定的失活模式区分所有抑制血流中的活性凝固因子的抗凝剂。某些类型的物质，例如未分离的高分子量肝素，抑制凝血酶和因子Xa二者。其他物质高度特异地发挥作用，因此抑制凝血酶（例如水蛭素、达比加群、美拉加群）或抑制因子Xa（例如五糖，如磺达肝癸钠、利伐沙班）。
血液凝固系统的主要前凝固因子（因子Xa和凝血酶）的直接或间接抑制剂在治疗和预防心血管和血栓栓塞疾病中发挥了日益重要的作用。通过目前建立的测定仅可以非常复杂的方式检测这些抑制剂。用于所述物质的简单和灵敏的测定对治疗监控和在未知患者样品中检测所述物质的存在是很重要的。这些测定应当能够以高度灵敏的方式检测相对大量的结构上不相关的凝血酶或F Xa抑制剂。
目前用于测定抗凝剂的显色测定包括将通常由血浆组成的待分析的患者样品与凝固因子的底物混合。由于大多数血液凝固因子是丝氨酸肽链内切酶，即可切割肽键的水解酶，主要利用被待测的血液凝固因子尽可能地特异性切割的肽底物，且其具有可检测的信号基团。已建立的且也可商业获得的显色测定特别利用发色团对硝基苯胺（pNA）和5-氨基-2-硝基苯甲酸（ANBA），其具有在405 nm处的吸收峰。通常通过光度测定仪来测定生成的黄色。在抗凝剂的测定中，测定混合物中的颜色浓度与样品中的抗凝剂浓度成反比。
在第一类目前应用的用于测定抑制血液凝固因子活性的抗凝剂的显色测定中，待测患者样品通常与确定量的活化凝固因子混合以及与此凝固因子的底物混合。在样品中存在的抗凝剂越多，发生的对活化的凝固因子的抑制作用越强，和被切割的底物越少。基于此测定原理的可商业获得的测定的实例是Siemens Healthcare Diagnostics的Berichrom® 肝素测定，其基于对添加的因子Xa的抑制作用而用于测定肝素；或Siemens Healthcare Diagnostics的水蛭素活性测定，其基于对添加的凝血酶的抑制作用而用于测定水蛭素（hirudin）。
在第二类目前应用的用于测定抗凝剂的显色测定中，待测患者样品与失活的凝固因子、凝固活化剂混合以及与凝固因子的显色底物混合。凝固活化剂的加入在一开始活化加入的失活的凝固因子。在样品中存在的抗凝剂越多，发生的对活化的凝固因子的抑制作用越强，和被切割的底物越少。基于此测定原理的可商业获得的测定的实例是用于测定合成的直接的凝血酶抑制剂的来自JenAffin的Haemosys®-ECA T测定，或用于测定水蛭素的来自JenAffin的Haemosys®-ECA H，后者是基于由于加入凝血酶原和作为凝固活化剂的蛇静脉酶（ecarin）而在样品中形成的对凝血酶/meizothrombin的抑制作用。
EP-A1-2 177 625描述了另一种测定抗凝剂的测定原理。此测定原理类似地包含测定凝固因子特异性底物的切割，但借助于不同类型的信号产生系统，而不是借助于显色底物。所述系统包含2种成分，当与完整的底物同时结合时，2种成分由于在空间上极为接近而相互作用并产生可检测的信号，例如荧光或化学发光。作为底物肽键切割的结果，2种成分彼此分离，并因此不产生信号。在样品中存在的抗凝剂越多，发生对活化的凝固因子的抑制作用越强，被切割的底物越少和产生的信号越多。基于荧光或化学发光的测定相比显色测定的优势基本上在于，它们更灵敏和还允许在全血中测量。
在上述方法中可切割的底物在一定程度上“安装”在信号系统的2种成分之间，此方法的缺点在于在切割位点两侧的底物配体必须具有与信号成分结合的区域。底物配体通常是合成的低分子量肽底物，其具有2个与信号成分结合的人工残基，例如氨基端的Flag标签和羧基端的生物素残基。然而，这些残基与低分子量肽底物的结合始终具有这样的风险，即以使其不再结合或不再被待检测的酶切割的方式改变肽的结构，因此提供合适的底物配体在技术上是复杂的。
因此，希望以这样的方式修改已知的测定抗凝剂的方法（所述方法使用由于在空间上极为接近而相互作用并产生可检测的信号的2种成分），即可使用下述低分子量配体，其需要具有不超过1个用于结合任何信号成分的人工残基。
通过下述方法实现了此目的：将等分试样的疑为包含抗凝剂的样品与确定量的蛋白水解活性凝固因子混合以及与配体混合，所述配体与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不因此在肽键处被切割，并测量由配体与活化的凝固因子结合引起的信号产生系统产生的信号。在样品中存在的活化的凝固因子的抑制剂，即抗凝剂以浓度依赖的方式与配体竞争结合蛋白水解活性凝固因子的活性位点并因此抑制信号产生。在样品中存在的抗凝剂越多，产生的信号越少。
发明内容
本发明因此涉及在样品中测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂，即抗凝剂的方法，其包括以下步骤：
a)提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含
i. 等分试样的样品，
ii. 确定量的蛋白水解活性凝固因子，
iii. 至少一种配体，所述配体与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割，
iv. 信号产生系统的第一和第二成分，二者以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号，且其中蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合，或在孵育期间与其结合，且其中配体与信号产生系统的第二成分结合，或在孵育期间与其结合；
b）测量信号产生系统的信号，其中所述信号幅度（amplitude）与样品中的抗凝剂浓度成反比。
在本发明上下文中使用的术语“抗凝剂”指蛋白水解活性凝固因子的抑制剂，其为天然或合成来源的，且其预期用途是在人或动物中抑制体内的凝血系统。其也包括在多个结合位点上结合酶的高分子量物质例如水蛭素或肝素，以及仅结合酶的活性位点就足以抑制反应性的低分子量化合物例如利伐沙班、达比加群或美拉加群。用于本发明的目的，术语“抗凝剂”和“蛋白水解活性凝固因子的抑制剂”是同义地使用的。
在本发明上下文中术语“配体”指这样的物质，其与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合并因此与抑制剂竞争结合位点。然而，合适的配体不被蛋白水解活性凝固因子在肽键处切割，因为它们缺乏可被所述蛋白水解活性凝固因子切割的肽键，即它们不含有任意可被蛋白水解活性凝固因子水解的肽键（R-CONH-R, R = 氨基酸残基）。可逆和不可逆结合的配体都是合适的。
配体可为合成、重组或通过生物技术产生的分子或天然存在的分子。
配体可为肽衍生物，其序列来源于酶的天然底物的序列。用于本发明的目的的肽衍生配体与肽底物的区别在于，肽衍生配体不被蛋白水解活性凝固因子水解切割，而肽底物的切割产生从酶的活性位点释放的片段，且从反应中再次出现的酶没有变化。
合适的肽衍生物优选地包含从3至约150个氨基酸残基。为了能够避免蛋白水解活性凝固因子在肽键处切割本发明的肽衍生物，后者的羧基端羧基优选地被置换为来自醛(-CHO), 酮(-COR; R = 烷基或芳基), 三氟甲基酮(-COCF3), α-酮羧酸(-COCOOH), α-酮酰胺(-COCONHR; R = 烷基或芳基),和α-酮酯 (-COCOOR; R = 烷基或芳基), 酯(-COOR; R = 烷基或芳基), 硼酸(-B(OR)2), 氯甲基酮(-COCH2Cl)和磺酰氟(-SO2F)的官能团。肽衍生物可还具有结构修饰，例如部分使用D-氨基酸代替天然存在的L-氨基酸。
表1包含了用于可逆和不可逆结合的肽衍生配体的一般官能团的实例。
表1
Figure 579525DEST_PATH_IMAGE001
。
结合凝血酶的活性位点但不因此在肽键处被切割的肽衍生配体的实例是：
• H-D-Phe-Pro-Arg-H
• Me-D-Phe-Pro-Arg-H
• H-D-Phe-Pro-Agm
• H-D-Phe-Pro-Arg-CH2-Cl
• H-D-Phe-Pro-Arg-CH2F
• Boc-DL-Dpa-Pro-Arg-H
• Ac-D-Phe-Pro-boroArg 蒎烷二醇酯
• D-Phe-Pro-NH-CH(甲氧基丙基)-P(O)(OPh)2。
结合因子Xa的活性位点但不因此在肽键处被切割的肽衍生配体的实例是：
• D-Arg-Gly-Arg-H
• 丹磺酰基-Glu-Gly-Arg-CH2Cl。
有关提到的肽衍生配体，又见Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436。
配体也可为不属于肽化合物组的化合物，例如精氨酸酯、脒基苯丙氨酸酯、对胍基苯基-丙氨酸酯、3-脒基苯丙氨酸酯、二元（脒基芳基）丙酸衍生物或
Figure 496666DEST_PATH_IMAGE002
唑烷酮衍生物。
结合凝血酶的活性位点但不因此在肽键处被切割的精氨酸衍生配体是，例如Nα-芳基磺酰基精氨酰胺(R1-SO2-Arg-N-R2/R3; R1 = 疏水脂肪基或芳基) (Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436)。
结合凝血酶的活性位点但不因此在肽键处被切割的脒基苯丙氨酸衍生配体是，例如Nα-(β-萘基磺酰基-4-脒基苯丙氨酸哌啶化物（piperidide）或Nα-(β-萘基磺酰基-甘氨酰基)-4-脒基苯丙氨酸哌啶化物(Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436)。
结合凝血酶的活性位点但不因此在肽键处被切割的对胍基苯丙氨酸衍生配体是，例如Tos-Gpa-哌啶化物(Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436)。
结合因子Xa的活性位点但不因此在肽键处被切割的3-脒基苯丙氨酸酯衍生配体是，例如Nα-(β-萘基磺酰基-甘氨酰基)-3-脒基苯丙氨酸 (Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436)。
结合因子Xa的活性位点但不因此在肽键处被切割的二元（脒基芳基）丙酸衍生配体是，例如(2S)-2-[4[[(3S)-1-亚氨代乙酰基-3-吡咯烷基]氧基]苯基]-3-(7-脒基-2-萘基)丙酸(Nagahara, T.等人, J. Med. Chem. 1994, 37, 1200-1207)。
结合因子Xa的活性位点但不因此在肽键处被切割的
Figure 73140DEST_PATH_IMAGE003
唑烷酮衍生配体是，例如5-氯-N-({(5S)-2-氧代-3-[4-(3-氧代吗啉-4-基)苯基]-1,3-
Figure 468350DEST_PATH_IMAGE003
唑烷-5-基}甲基)噻吩-2-甲酰胺(Roehrig, S.,等人, J. Med. Chem. 2005, 48(19), 5900-5908)。
可逆结合的配体指可以浓度依赖的方式被至少一种天然或合成的抑制剂从蛋白水解活性凝固因子的活性位点置换的配体。
与凝血酶可逆结合的合适的配体实例是肽衍生物，例如H-D-Phe-Pro-Arg-H, Me-D-Phe-Pro-Arg-H或H-D-Phe-Pro-Agm。在胍基丁胺（Agm）中的羧基已被氢置换。其他与凝血酶可逆结合的配体是Nα-芳基磺酰基精氨酰胺(R1-SO2-Arg-N-R2/R3)，或脒基哌啶衍生物例如Nα-(β-萘基磺酰基)-4-脒基苯丙氨酸哌啶化物，或对胍基苯丙氨酸（Gpa），脒基苯丙氨酸（Apa）的衍生物，例如Tos-Gpa-哌啶化物和Tos-Apa-哌啶化物，或其他肽氨基硼酸或肽氨基膦酸，例如Ac-D-Phe-Pro-NH-CH(CH2-苯基)-B-OPin和D-Ala-Pro-NH-CH(甲氧基丙基)-P(O)(OPh)2。
与因子Xa可逆结合的合适的配体实例是肽衍生物，例如D-Arg-Gly-Arg-H或苯甲脒衍生物和3-脒基苯丙氨酸酯，例如Nα-(β-萘基磺酰基-甘氨酰基)-3-脒基苯丙氨酸。
不可逆结合的配体指以不依赖浓度的方式结合蛋白水解活性凝固因子的活性位点且再也不能被置换的配体，因为其与酶形成例如共价键并以使活性位点不可逆地失活的方式修饰酶。一般的不可逆结合的配体由将其引入酶的活性位点的部分和能够与酶（在蛋白水解活性凝固因子的情况下，即与活性位点中的丝氨酸的羟基官能团）形成共价键的化学反应性基团组成。为了与酶形成共价键，官能团的一部分从配体移除，然后在同一反应步骤中，其与酶共价结合。
与凝血酶不可逆结合的合适的配体实例是H-D-Phe-Pro-Arg-CH2-Cl和H-D-Phe-Pro-Arg-CH2F。
与因子Xa不可逆结合的合适的配体实例是丹酰基-Glu-Gly-Arg-CH2Cl。
可通过其反应动力学区分可逆和不可逆结合的配体。在恒定的底物浓度（S）下将1/v（其中v是反应速率）对配体浓度（i）作图得到直线。当使用2种或多种不同的底物浓度(S1, S2… SN)时，线相交于一点。此点的x轴值对应-Ki，其中Ki对应结合常数，详见图3(Dixon, M., 1953, Biochem J, 55, 170-171)。对不可逆抑制，曲线在x轴上的一点汇合，其也对应-Ki。
优选的配体与蛋白水解活性凝固因子的结合亲和力相当于或低于与待测的抗凝剂的亲和力。使用凝血酶抑制剂作为抗凝剂显示了在2.7 × 10-14 摩尔 (水蛭素)至1.9 × 10-8 摩尔（阿加曲班）范围内的与凝血酶的结合常数(Prasa, D.等人, Thromb Haemost 77, 1997, 498-503)。除了凝血酶以外，凝血酶抑制剂也结合F Xa，虽然具有显著较低的亲和力，即具有较大的结合常数，例如阿加曲班的2.1 × 10-4 摩尔(Prasa, D.等人, Thromb Haemost 78, 1997, 1215-1220)。F Xa抑制剂具有在8 × 10-11 摩尔 (阿哌沙班，apixaban)至6.6 × 10-9 摩尔(LY517717 富马酸氢盐)范围内的结合常数，所述F Xa抑制剂也在一定程度上结合凝血酶但弱多达10000倍，例如利伐沙班(Perzborn, E., Hämostaseologie 3, 2009, 260-267)。因此可用待测抑制剂从蛋白水解活性凝固因子的活性位点置换可逆配体。具有合适的选择亲和力的不可逆配体在相关时间内不能这样从蛋白水解活性凝固因子的活性位点置换待测药物。另一方面，亲和力不能太低，因为否则就不能产生信号了。
合适配体的结合常数因此优选地在0.0001至100 000 nM (10-13 至10-4 M)的范围内，更优选地在0.1至10 000 nM (10-10至10-5 M)的范围内，特别优选地在1至1000 nM (10-9 至10-6 M)的范围内。
用于本发明的目的，术语“样品”指疑为包含待检测的抗凝剂的材料。术语“样品”特别地包含人和动物的生物液或组织，例如血液、血浆、血清以及其他体液、排泄物或提取物。
本发明的方法包括提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含等分试样的样品，确定量的蛋白水解活性凝固因子，至少一种配体，所述配体与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不因此在肽键处被切割，信号产生系统的第一和第二成分，二者以这样的方式相互作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。所述蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合，或在孵育期间与其结合。所述配体与信号产生系统的第二成分结合，或在孵育期间与其结合。作为配体与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合的结果，信号产生系统的成分变得彼此极为接近，由此产生与反应混合物中的蛋白水解活性凝固因子活性相关的可检测的信号。在样品中存在的抗凝剂以浓度依赖的方式与不能在肽键处被切割的配体竞争结合蛋白水解活性凝固因子的活性位点，并因此抑制信号产生。样品中存在的抗凝剂越多，产生的信号越少。测量产生的信号，其中所述信号幅度与样品中的抗凝剂浓度成反比。
本发明的方法适于测定蛋白水解活性凝固因子凝血酶（因子IIa）、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa或因子XIIa的抑制剂。
向反应混合物中加入哪一种活化的凝固因子和哪一种配体取决于待测抗凝剂的特异性。
加入凝血酶或因子Xa和加入具有凝血酶或因子Xa特异性的配体特别适于测定肝素，即高分子量、未分离的肝素（HMW肝素）或低分子量肝素（LMW肝素）或类肝素。加入因子IIa（凝血酶）和加入具有凝血酶特异性的配体特别适于测定直接的凝血酶抑制剂，例如阿加曲班、美拉加群、希美加群、比伐卢定、达比加群、水蛭素、来匹卢定、MCC-977、SSR-182289、TGN-255、TGN-167、ARC-183和odiparcil。加入因子Xa和加入具有因子Xa特异性的配体特别适于测定直接的因子Xa抑制剂，例如利伐沙班、阿哌沙班、奥米沙班（其与新的活性物质类型xabane组合）、磺达肝癸钠、LY 517717、YM 153、DU-176b、DX-9065a和KFA-1982。
加入反应混合物的蛋白水解活性凝固因子可为从动物或人组织或体液（例如血液或血浆）中分离的凝固因子，或从动物或人细胞培养物或表达重组凝固因子的微生物例如细菌或真菌的真核细胞培养物的上清或裂解液中分离的凝固因子。活化原本失活的多种凝固因子酶原的方法是本领域技术人员熟知的。在反应混合物中加入哪一种活化的凝固因子取决于待测的抗凝剂。
在本发明的方法的一个实施方案中，蛋白水解活性凝固因子具有结合对X/Y的第一结合配偶体（binding partner）X，且信号产生系统的第一成分与所述结合对X/Y的第二结合配偶体Y结合，由此，由于结合配偶体X和Y的结合，蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合，或在反应混合物的孵育期间与信号产生系统的第一成分结合。
结合配偶体X和Y是两种不同的分子，二者彼此特异性识别并结合。特异性识别和结合的实例是抗体-抗原相互作用、多核苷酸相互作用等等。
合适的结合对X/Y特别地是抗原/抗体组合，其中结合配偶体X是蛋白水解活性凝固因子的抗原表位。抗原表位可为天然蛋白质的天然序列表位或结构表位。抗原表位也可为修饰的活性凝固因子的异源序列表位或结构表位。异源序列或结构表位的实例是FLAG，或HIS或特别用于标记肽或蛋白质的荧光素标签。其他合适的结合对X/Y是互补的多核苷酸X和Y。必须选择与信号产生系统的第一成分结合的结合配偶体Y，以使蛋白水解活性凝固因子能够被特异性结合。结合配偶体Y优选地由抗体或其抗原结合片段组成。特别优选的结合对X/Y是FLAG标签/抗FLAG标签抗体，HIS标签/抗HIS抗体，荧光素/抗荧光素抗体，生物素/抗生物素和生物素/链霉抗生物素。
在本发明的方法的另一个实施方案中，蛋白水解活性凝固因子通过共价键与信号产生系统的第一成分连接。
在优选的实施方案中，加入反应混合物的配体具有第一结合对A/B的第一结合配偶体A，用于结合信号产生系统的第二成分，所述成分适当地具有所述结合对A/B的第二结合配偶体B。特别优选地，配体具有至少一个生物素残基作为结合配偶体A。
结合配偶体A和B是两种不同的分子，二者彼此特异性识别并结合。特异性识别和结合的实例是抗体-抗原相互作用、多核苷酸相互作用等等。
合适的结合对A/B特别地是抗原/抗体组合，其中结合配偶体A是配体的抗原表位。抗原表位可为天然蛋白质或蛋白质片段的天然序列表位或结构表位。抗原表位也可为修饰的肽的异源序列表位或结构表位。异源序列或结构表位的实例是FLAG，或HIS或特别用于标记低分子量物质、肽或蛋白质的荧光素标签。其他合适的结合对A/B是互补的多核苷酸A和B。必须以这样的方式选择与信号产生系统的第二成分结合的结合配偶体B，使配体可被特异性结合。优选地，结合配偶体B由抗体或其抗原结合片段组成。特别优选的结合对A/B是FLAG标签/抗FLAG标签抗体，HIS标签/抗HIS抗体，荧光素/抗荧光素抗体，生物素/抗生物素和生物素/链霉抗生物素。
原则上，必须这样选择用于将配体与第二信号成分结合的可能的结合对A/B，即，使其不干扰（由于相互结合）用于将蛋白水解活性凝固因子与第一信号成分结合的可能的结合对X/Y。
本发明的一个优势是使用的配体可（但不需要）具有结合对的第二人工结合配偶体。
用于本发明的目的，术语“信号产生系统”指包含至少第一和第二成分的系统，二者以这样的方式相互作用，即当二者变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
在一个实施方案中，信号产生系统的成分是微粒状固相，例如乳胶颗粒，通过浊度计或散射浊度计测定其聚集。为此，信号产生系统的第一成分由第一微粒状固相组成，其性质是与蛋白水解活性凝固因子结合或可与蛋白水解活性凝固因子结合。第一微粒状固相可通过共价键或通过结合对X/Y与蛋白水解活性凝固因子连接或通过反应混合物中的结合对X/Y与其连接。此外，信号产生系统的第二成分由第二微粒状固相组成，其特征是与配体结合或可与配体结合。第二微粒状固相可通过共价键或通过结合对A/B与配体连接或通过反应混合物中的结合对A/B与其连接。自从约1920年以来就知道基于颗粒增强的光散射原理的免疫测定（有关综述见Newman, D.J.等人, Particle enhanced light scattering immunoassay. Ann Clin Biochem 1992; 29: 22-42）。优选使用从0.1至0.5 µm，特别优选从0.15至0.35 µm的直径的聚苯乙烯颗粒。优选使用具有羧基或醛基官能团的聚苯乙烯颗粒。进一步优选使用壳/芯（shell/core）颗粒。在例如Peula, J.M.等人, Covalent coupling of antibodies to aldehyde groups on polymer carriers. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 1995; 6: 779-785中描述了所述颗粒的合成和配体的共价连接。
在本发明的方法的另一个实施方案中，信号产生系统包含至少第一和第二成分，二者以这样的方式相互作用，即当它们变得彼此极为接近并可因此彼此相互作用时产生可检测的信号。在所述成分之间的相互作用特别地指能量转移——即，成分之间的直接的能量转移，例如通过光或电子辐射和通过反应性化学分子，例如短暂的单线态氧。能量可从一种成分转移至另一种，但也可能在多种物质的级联中产生能量转移。例如，成分可为由能量供体和能量受体组成的对，例如光敏剂和化学发光剂(EP-A2-0515194, LOCI® Technologie)或光敏剂和荧光团(WO 95/06877)或放射性碘<125>和荧光团(Udenfriend等人 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672 – 8676)或荧光团和荧光猝灭剂(US 3,996,345)。
可彼此相互作用的信号产生系统的第一成分和/或第二成分可共价地或通过特异性相互作用与微粒状固相结合或被包埋在其中。术语微粒状固相指可悬浮的颗粒，例如金属溶胶、二氧化硅颗粒、磁性颗粒或特别优选地，乳胶颗粒。优选0.01-10微米直径的颗粒，特别优选0.1-10微米直径的颗粒。
信号产生系统的第一成分的性质是，其与蛋白水解活性凝固因子结合或可与蛋白水解活性凝固因子结合，所述信号产生系统的成分以这样的方式相互作用，以使当它们变得彼此极为接近并可因此彼此相互作用时产生可检测的信号。信号产生系统的第一成分可能与蛋白水解活性凝固因子直接结合或可与蛋白水解活性凝固因子直接结合。优选地，信号产生系统的第一成分与蛋白水解活性凝固因子间接结合或可与蛋白水解活性凝固因子间接结合。为此，信号产生系统的第一成分与微粒状固相结合，所述固相另外地与蛋白水解活性凝固因子共价结合或通过结合对X/Y结合或可通过结合对X/Y结合。
信号产生系统的第二成分的性质是，其与配体结合或可与配体结合，所述信号产生系统的成分以这样的方式相互作用，以使当它们变得彼此极为接近并可因此彼此相互作用时产生可检测的信号。信号产生系统的第二成分可能与配体直接结合或可与配体直接结合。优选地，信号产生系统的第二成分与配体间接结合或可与配体间接结合。为此，信号产生系统的第二成分与微粒状固相结合，所述固相另外地与配体共价结合或通过结合对A/B结合或可通过结合对A/B结合。
在本发明的用于测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂的方法的优选实施方案中，样品另外与纤维蛋白聚集抑制剂混合。纤维蛋白聚集抑制剂是避免凝血酶诱导的纤维蛋白单体聚集的物质。这避免了在包含纤维蛋白原的样品中产生纤维蛋白结块，否则这将对测量具有负面影响，例如通过限制扩散和猝灭来实现。优选的纤维蛋白聚集抑制剂是合成肽，例如具有甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、脯氨酸序列的肽（Pefabloc® FG, Pentapharm, Switzerland，可商业获得）。可用作纤维蛋白聚集抑制剂的其他优选的肽，特别是具有甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸序列的优选肽在EP-A2-456 152中描述。
在本发明的用于测定蛋白水解活性凝固因子的直接抑制剂的方法的优选实施方案中，向反应混合物中另外加入聚胺例如Polybrene® (溴化己二甲铵)、精胺或聚赖氨酸。聚胺抑制肝素对凝固因子的间接抑制。这样，本发明的方法可用于区分肝素诱导的抑制和直接抑制。
在提供了包含样品、确定量的蛋白水解活性凝固因子、至少一种与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不因此在肽键处被切割的配体和信号产生系统的第一和第二成分的反应混合物后，将反应混合物孵育有限的时间以确保蛋白水解活性凝固因子、抗凝剂和配体的充分结合，在适当的情况下，确保第一信号成分与蛋白水解活性凝固因子和/或第二信号成分与配体的充分结合。术语“充分”应被理解为指，方法总体上能够以定量的方式测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂。可通过实验测定特定测定设计的最佳孵育时间。可在几个分别的步骤中以不同的顺序和不同的孵育时间提供反应混合物。
在反应混合物中产生的根据时间而变化的信号或信号变化与蛋白水解活性凝固因子的抑制剂的活性或量相关。在根据时间而变化的信号或信号变化的辅助下，通过所述相关性可确定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂的活性或量。为此，优选使用标准物进行校正。所述标准物含有确定活性或量的蛋白水解活性凝固因子的抑制剂。
本发明还涉及实施本发明的方法的多种实施方案的检测试剂盒。
第一检测试剂盒包含以下单独的成分：
i. 第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，
ii. 第二试剂，其包含至少一种与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体；
iii. 第三试剂，其包含信号产生系统的第一成分，所述成分可与第一试剂中的蛋白水解活性凝固因子结合；和
iv. 第四试剂，其包含信号产生系统的第二成分，所述成分可与第二试剂中的配体结合。
当使用这样的检测试剂盒时，每种成分分别加入样品或反应混合物，并且在反应混合物中孵育时发生蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分的结合以及配体与信号产生系统的第二成分的结合。此试剂盒的优势是，如果蛋白水解活性凝固因子和配体分别通过常规的结合对A/B和X/Y分别结合，例如通过链霉抗生物素/生物素、抗生物素/生物素、FLAG标签/抗FLAG标签抗体等等，在各个情况下第三和第四试剂可为通用检测试剂。
另一种检测试剂盒包含以下单独的成分：
i. 第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，其中蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合；
ii. 第二试剂，其包含至少一种与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体；和
iii. 第三试剂，其包含信号产生系统的第二成分，所述成分可与第二试剂中的配体结合。
当使用这样的检测试剂盒时，在反应混合物中孵育时仅发生配体与信号产生系统的第二成分的结合；蛋白水解活性凝固因子已经与信号产生系统的第一成分结合。
另一种检测试剂盒包含以下单独的成分：
i. 第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，
ii. 第二试剂，其包含信号产生系统的第一成分，所述成分可与第一试剂中的蛋白水解活性凝固因子结合；和
iii. 第三试剂，其包含至少一种与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体，且其中所述配体与信号产生系统的第二成分结合。
当使用这样的检测试剂盒时，在反应混合物中孵育期间仅发生蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分的结合；配体已经与信号产生系统的第一成分结合。
另一种检测试剂盒包含以下单独的成分：
i. 第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，其中蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合；
ii. 第二试剂，其包含至少一种与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体，且其中所述配体与信号产生系统的第二成分结合。
当使用这样的检测试剂盒时，蛋白水解活性凝固因子和配体都已经与信号产生系统的特定成分结合。
其中蛋白水解活性凝固因子和/或配体已经与特定信号成分结合的试剂盒的特别的优势是，最小化使用的试剂数目，因此避免了吸移（pipetting）步骤和减少了吸移误差的风险。
缩写列表
Ac 酰基-
Agm 胍基丁胺
Ala 丙氨酸
ANBA 5-氨基-2-硝基-苯甲酸
Arg 精氨酸
B-f-P-R-H 生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H
Boc 叔丁基碳酸酯
B-r-P-R-H 生物素基-Ttds-D-Arg-Pro-Arg-H
Dpa β,β-二苯基丙氨酸
f D-苯丙氨酸
Gly 甘氨酸
Gpa 胍基苯丙氨酸
His 组氨酸
IPA 异丙基酰胺
Ki 结合常数
Me 甲基-
Ph 苯基-
Phe 苯丙氨酸
pNA 对硝基苯胺
Pro 脯氨酸
r D-精氨酸
R 相关系数
Tos 甲苯磺酰基-
Ttds 4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二氨基琥珀酸
Z-D-Leu 苄氧羰基-D-亮氨酸。
附图说明
图1
用于本发明的通过LOCI技术测定凝血酶抑制剂的方法的示例性测定设计的图示。蛋白水解活性凝血酶与微粒状固相结合，所述固相还用化学发光剂(Chemibead, CB)包被。信号产生系统的第二成分由用光敏剂以及链霉抗生物素(Sensibead, SB)包被的微粒状固相组成。与凝血酶活性位点结合但不因此被切割且具有结合Sensibead的链霉抗生物素的生物素标签的配体使信号产生系统的2种成分变得在空间上极为接近。用光激发光敏剂导致短暂的单线态氧的产生，其能够激活化学发光剂，由此发射发光信号。在样品中存在的与不可切割的生物素化配体竞争结合凝血酶的凝血酶抑制剂（抗凝剂）越多，产生的发光信号越少。
图2
凝血酶特异性配体生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H和因子Xa-特异性配体生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H的氨基端生物素基-4,7,10-三氧杂-13-十三烷氨基氨基琥珀酸（生物素基-Ttds）接头的结构式。
图3
生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H)的凝血酶结合常数的测定。代表性显示了在根据实施例2的凝血酶测定中，在4、2和0.5 mM的显色底物浓度下，反应速率的倒数根据配体浓度而变化。
图4
生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H)的凝血酶结合常数的测定。图3的放大细节。
图5
生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H (B-r-G-R-H)的凝血酶结合常数的测定。代表性显示了在根据实施例2的凝血酶测定中，在4、2和0.5 mM的显色底物浓度下，反应速率的倒数根据配体浓度而变化。
图6
生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H)的F Xa结合常数的测定。代表性显示了在根据实施例3的F Xa测定中，在4、2和0.5 mM的显色底物浓度下，反应速率的倒数根据配体浓度而变化。
图7
生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H (B-r-G-R-H)的F Xa结合常数的测定。代表性显示了在根据实施例3的F Xa测定中，在4、2和0.5 mM的显色底物浓度下，反应速率的倒数根据配体浓度而变化。
图8
在标准人血浆中的化学发光信号的产生，其使用不同浓度的凝血酶抑制剂法安明、肝素钠（liquemin）、阿加曲班、美拉加群和重组水蛭素（水蛭素），使用与凝血酶包被的Chemibead和链霉抗生物素包被的Sensibead共同使用的配体生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H)。
图9
在标准人血浆中的化学发光信号的产生，其使用不同浓度的F Xa抑制剂法安明、肝素钠（liquemin）和利伐沙班和不同浓度的凝血酶抑制剂重组水蛭素（水蛭素）和阿加曲班，使用与抗F Xa抗体包被的Chemibead，F Xa和链霉抗生物素包被的Sensibead共同使用的配体生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H (B-r-G-R-H)。
实施例
以下实施例用于说明本发明，而不应被理解为限制本发明。
实施例1：凝血酶和因子Xa的生物素基-Ttds-肽醛配体的合成
在固相上合成肽醛-D-Phe-Pro-Arg-H (参见Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 第417页)和-D-Arg-Gly-Arg-H (参考Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 第426页)，其延伸出Ttds间隔区(Ttds = 4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二氨基-琥珀酸 (Bartos, A.等人, 2009, Biopolymers 92(2), 110-115))，并具有生物素。化合物生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H具有930.15克/摩尔的分子量并在下文中缩写为B-f-P-R-H。化合物生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H具有899.10克/摩尔的分子量并在下文中缩写为B-r-G-R-H。用三氟醋酸从固相上去除肽醛。以冻干的形式在-20℃储存化合物。生物素接头的结构在图2中描述。
实施例2：肽醛配体的凝血酶结合常数的测定
在显色测定形式中测定肽醛配体的动力学数据，通过在不同的底物浓度和肽醛-配体浓度下测量与肽醛配体竞争结合特定酶的活性位点的显色肽底物的水解速率来进行。通过已知方法测定结合常数（Ki）(Dixon, M., 1953, Biochem J, 55, 170-171)。
使用Siemens Healthcare Diagnostics的水蛭素活性测定试剂测定凝血酶结合常数。水蛭素活性测定包含冻干的凝血酶试剂（其由牛凝血酶、肝素抑制剂和抑肽酶组成），和冻干的显色底物试剂（其在重构后具有4 mmol/l tos-Gly-Pro-Arg-ANBA-IPA（甲苯磺酰基甘氨酰基-L-丙基-精氨酰基-5-氨基-2-硝基苯甲酰基异-丙基酰胺）的浓度）。在缓冲液（三羟甲基氨基-甲烷，NaCl, pH 8.2）中重构凝血酶试剂。用去离子水制备底物试剂的稀释液。在水中溶解根据实施例1制备的肽醛配体并用作样品。在26.1至0.815 µM的浓度范围中使用B-r-G-R-H配体。在26.1至0 µM的浓度范围中使用B-f-P-R-H配体。在BCS® XP凝固分析仪(Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany)中自动进行测定。
如下混合反应混合物：
30 µl 样品（肽醛配体B-r-G-R-H或B-f-P-R-H），
150 µl 凝血酶试剂，
50 µl 显色底物试剂（tos-Gly-Pro-Arg-ABNA-IPA）。
基于反应混合物在405 nm波长处的光密度的增加来测定反应速率，以mE/分钟计。为此，对B-f-P-R-H肽醛配体在15至40秒的时间间隔中，或对B-r-G-R-H肽醛配体在5-16秒的时间间隔中测定反应混合物的光密度。
可通过其反应动力学区分可逆和不可逆结合的配体。在恒定的可切割的底物浓度（S）下，将1/v（其中v是反应速率）对配体浓度（i）作图得到直线。当使用2种或多种不同的底物浓度(S1, S2… SN)时，所述线相交于一点。此点的x轴值对应-Ki，其中Ki对应结合常数，见例如Klebe, G., Wirkstoffdesign, 第二版, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 2009, 第52-62页和Dixon, M., 1953, Biochem J, 55, 170-171。对不可逆抑制，曲线在x轴上的一点汇合，其也对应-Ki。
表2描述了在反应混合物中使用的肽醛配体B-f-P-R-H的浓度和使用不同浓度的显色底物得到的反应速率的倒数。
表2
Figure 282722DEST_PATH_IMAGE004
。
在不同底物浓度下，在根据配体浓度（CB-f-P-R-H）而变化的1/反应速率图的线性区中绘制回归曲线（图3和4）。在C底物=0.5 mM时，0至0.04076 µM的浓度不在线性区并因此被排除。从回归曲线的交点计算出3个Ki值，然后从这些值计算平均Ki值和图的交点。从这样得到的Ki值计算平均Ki值（表3）。由于回归曲线的交点不在x轴上，肽醛与凝血酶的结合是可逆的。肽醛配体B-f-P-R-H的平均凝血酶结合常数KiM是0.131 µmol(1.31 × 10-7 mol)。由于相关药物（治疗有效和合适的凝血酶抑制剂）的结合常数较大，根据描述的方法、使用凝血酶作为活性凝固酶的化合物适用于检测高亲和力的凝血酶抑制剂。
表3
Figure 433081DEST_PATH_IMAGE005
。
表4指示了在反应混合物中使用的肽醛配体B-r-G-R-H的浓度和使用不同浓度的显色底物得到的反应速率的倒数。
表4
Figure 700114DEST_PATH_IMAGE006
。
在不同底物浓度下，在根据配体浓度（CB-r-G-R-H）而变化的1/反应速率图的线性区绘制回归曲线（图5）。从回归曲线的交点计算出3个Ki值，然后从这些值计算平均Ki值和图的交点。从这样得到的Ki值计算平均Ki值（表5）。由于回归曲线的交点不在x轴上，肽醛与凝血酶的结合是可逆的。肽醛配体B-r-G-R-H的平均凝血酶结合常数KiM是20.9 µmol(2.09 × 10-5 mol)。因此，根据描述的方法、使用凝血酶作为活性凝固酶，配体也适于检测低亲和力的凝血酶抑制剂。
表5
Figure 961331DEST_PATH_IMAGE007
。
实施例3：肽醛配体的F Xa结合常数的测定
使用Siemens Healthcare Diagnostics的Berichrom®肝素测定的试剂测定F Xa结合常数。Berichrom®肝素测定由以下试剂组成：
● F Xa试剂，其由冻干的包含因子Xa的血浆组分和添加剂例如Tris、NaCl、EDTA和防腐剂组成，
● 显色底物试剂(Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-甲基-酰胺)，
● 用于重构的稀释试剂，和
● 葡聚糖硫酸化物（dextran sulfate）试剂，其由冻干的葡聚糖硫酸化物组成。
在10 ml稀释试剂中重构后，葡聚糖硫酸化物浓度为0.02 g/l。用重构的葡聚糖硫酸化物试剂重构F Xa试剂。底物试剂在用2ml去离子水构建后，包含4 mmol/l Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-甲基-酰胺。用去离子水制备底物试剂的稀释液。在水中溶解根据实施例1制备的肽醛配体并用作样品。在BCS® XP凝固分析仪(Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany)中自动进行测定。
如下混合反应混合物：
20 µl 水，
15 µl 样品（肽醛配体B-r-G-R-H或B-f-P-R-H），
15 µl 水，
150 µl F Xa试剂，
30 µl 底物试剂（Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-甲基-酰胺）。
基于反应混合物在405 nm波长处的光密度的增加来测定反应速率，以mE/分钟计。为此，在10-70秒的时间间隔中测定反应混合物的光密度。
表6描述了在反应混合物中使用的肽醛配体B-f-P-R-H的浓度和使用不同浓度的显色底物得到的反应速率的倒数。
表6
Figure 630210DEST_PATH_IMAGE008
。
在不同底物浓度下，在根据配体浓度（CB-f-P-R-H）而变化的1/反应速率图的线性区绘制回归曲线（图6）。从回归曲线的交点计算出3个Ki值，然后从这些值计算平均Ki值和图的交点。从这样得到的Ki值计算平均Ki值（表7）。由于回归曲线的交点不在x轴上，肽醛与F Xa的结合是可逆的。肽醛配体B-f-P-R-H的平均F Xa结合常数KiM是16.9 µmol(1.69 × 10-5 mol)。因此，根据描述的方法、使用F Xa作为活性凝固酶，配体适于检测低亲和力的F Xa抑制剂。
表7
Figure 184425DEST_PATH_IMAGE009
。
表8描述了在反应混合物中使用的肽醛配体B-r-G-R-H的浓度和使用不同浓度的显色底物得到的反应速率的倒数。
表8
Figure 938755DEST_PATH_IMAGE010
。
在不同底物浓度下，在根据配体浓度（CB-r-G-R-H）而变化的1/反应速率图的线性区中绘制回归曲线（图7）。从回归曲线的交点计算出3个Ki值，然后从这些值计算平均Ki值和图的交点。从这样得到的Ki值计算平均Ki值（表9）。由于回归曲线的交点不在x轴上，肽醛与F Xa的结合是可逆的。肽醛配体B-r-G-R-H的平均F Xa结合常数KiM是0.332 µmol(3.32 × 10-7 mol)。由于相关药物（治疗有效和合适的F Xa抑制剂）的结合常数较大，根据描述的方法、使用F Xa作为活性凝固酶的化合物适用于检测高亲和力的F Xa抑制剂。
表9
Figure 675767DEST_PATH_IMAGE011
。
实施例4：通过LOCI试剂测定凝血酶抑制剂的本发明的方法
使用的样品是标准人血浆和加入增加浓度的直接（水蛭素、美拉加群、阿加曲班）或间接（肝素钠、法安明）凝血酶抑制剂的标准人血浆。
使用的信号产生系统是LOCI®系统，其由化学发光化合物（2-(4-(N,N,二-十四烷基)-苯胺基-3-苯基二甲基噻吩）和光敏剂（双-(三己基)-硅-叔丁基-酞菁）组成。化学发光化合物与光敏剂都连接乳胶颗粒。术语“Chemibead”指用化学发光化合物包被的颗粒，以及“Sensibead”指用光敏剂包被的颗粒，并也在下文中使用。本文使用的LOCI技术是基于连接乳胶颗粒的化学发光化合物（Chemibead）和连接乳胶颗粒的光敏剂（Sensibead），通过结合分析物，二者变得在空间上彼此极为接近，且因此由光敏剂产生的单线态氧（singlet oxygen）可激发化学发光化合物。
本文使用的Chemibead另外用牛凝血酶包被。为此，牛凝血酶与乳胶颗粒共价连接。本文使用的Sensibead另外用链霉抗生物素包被。
使用的配体是生物素化的肽醛，生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H)。
在缺乏凝血酶抑制剂时，配体通过其生物素残基结合链霉抗生物素包被的Sensibead，并通过其肽部分结合凝血酶包被的Chemibead，并产生化学发光信号（又见图1）。在存在与配体竞争结合凝血酶包被的Chemibead、但不能结合Sensibead的凝血酶抑制剂时，化学发光信号与凝血酶抑制剂浓度成反比。
在每种情况下组合2 µl样品、10 µl纤维蛋白聚合抑制剂肽甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸(10 mg/ml)、20 µl Chemibead（400 µg/ml）和10 µl配体(1.25 µM)并孵育6分钟。在加入20 µl Sensibead (600 µg/ml)和孵育10分钟后，用水填充混合物至250 µl并测量化学发光信号。如图8所示，随着直接的凝血酶抑制剂的类型和浓度的递进（meter in），化学发光信号降低。间接抑制凝血酶的肝素（肝素钠、法安明）的递进（meter in）也导致化学发光信号的明显降低。
实施例5：通过LOCI试剂测定因子Xa抑制剂的本发明的方法
使用的样品是标准人血浆和加入增加浓度的直接或间接的凝血酶抑制剂（水蛭素、阿加曲班、肝素钠）或因子Xa抑制剂（利伐沙班、肝素钠、法安明）的标准人血浆。
使用的信号产生系统是根据实施例4的LOCI系统。
这里使用的Chemibead另外用可商业获得的针对F Xa的多克隆抗体包被。为此，以10mg抗体比50ng颗粒的连接比例将抗体共价连接至乳胶颗粒。这里使用的Sensibead另外用链霉抗生物素包被。
使用的配体是生物素化的肽醛：生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H (B-r-G-R-H)。
在缺乏F Xa抑制剂时，配体通过其生物素残基结合链霉抗生物素包被的Sensibead，并通过其肽部分结合F Xa，所述F Xa自身与抗体包被的Chemibead结合，并产生化学发光信号（又见图1）。在存在与配体竞争结合F Xa包被的Chemibead、但不能结合Sensibead的F Xa抑制剂时，化学发光信号与F Xa抑制剂浓度（例如利伐沙班）成反比。但是，在凝血酶抑制剂（例如阿加曲班或水蛭素）的存在下，信号不降低，因为凝血酶抑制剂不能置换配体。
10 µl包含人F Xa（约1000 IU/l）和纤维蛋白聚合抑制剂肽甘氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸(10 mg/ml)的试剂与2 µl样品、20 µl Chemibead（400 µg/ml）和10 µl配体(6 µM)混合并孵育5分钟。在加入60 µl Sensibead (200 µg/ml)和孵育10分钟后，用水填充混合物至260 µl并测量化学发光信号。如图9所示，随着直接的F Xa和凝血酶抑制剂的类型和浓度的递进（meter in），化学发光信号降低。间接抑制F Xa的肝素（肝素钠、法安明）的递进（meter in）也导致化学发光信号的明显降低。

Claims (20)

1.一种在样品中测定蛋白水解活性凝固因子的抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
a）提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含
i. 等分试样的样品，
ii. 确定量的蛋白水解活性凝固因子，
iii. 至少一种配体，所述配体与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割，
iv. 信号产生系统的第一和第二成分，二者以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号，且其中蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合，或在孵育期间与其结合，且其中配体与信号产生系统的第二成分结合，或在孵育期间与其结合；
b）测量信号产生系统的信号，其中所述信号幅度与样品中的抑制剂浓度成反比。
2.根据权利要求1的方法，其中与蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合的所述配体具有Ki=10-13 - 10-4 M的与蛋白水解活性凝固因子的结合亲和力。
3.根据权利要求1和2中任一项的方法，其中所述信号产生系统的第一和第二成分各个包含微粒状固相，且其中测量在所述反应混合物中的所述微粒状固相的聚集。
4.根据权利要求1和2中任一项的方法，其中所述信号产生系统的第一成分是化学发光剂，且所述信号产生系统的第二成分是光敏剂，反之亦然，且其中测量在所述反应混合物中的化学发光。
5.根据权利要求4的方法，其中所述化学发光剂与第一微粒状固相结合和/或所述光敏剂与第二微粒状固相结合。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中所述配体具有第一结合对A/B的第一结合配偶体A，且其中所述信号产生系统的所述第二成分具有所述第一结合对A/B的第二结合配偶体B，且其中所述配体由于所述结合配偶体A和B的结合与所述信号产生系统的所述第二成分结合，或在孵育期间与其结合。
7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述配体是肽衍生物。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述配体是肽衍生物，所述肽衍生物具有选自醛、酮、三氟甲基酮、α-酮羧酸、α-酮酰胺、α-酮酯、酯、硼酸、氯甲基酮和磺酰氟的羧基端基团。
9.根据权利要求6的方法，其中选择所述结合配偶体A和B使其形成选自FLAG标签/抗FLAG标签抗体，HIS标签/抗HIS标签抗体，荧光素/抗荧光素抗体，生物素/抗生物素和生物素/链霉抗生物素的结合对A/B。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白水解活性凝固因子具有第二结合对X/Y的第一结合配偶体X，且其中所述第二结合对X/Y的第二结合配偶体Y与所述信号产生系统的所述第一成分结合，且其中所述蛋白水解活性凝固因子由于所述结合配偶体X和Y的结合与所述信号产生系统的所述第一成分结合，或在孵育期间与其结合。
11.根据前述权利要求中任一项的用于测定凝血酶抑制剂的方法，其中提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含确定量的蛋白水解活性凝固因子：凝血酶。
12.根据权利要求11的方法，其中提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含与凝血酶的活性位点可逆结合但不因此被切割的肽：生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H。
13.根据权利要求11和12中任一项的用于测量凝血酶抑制剂的方法，所述凝血酶抑制剂选自肝素、肝素衍生物、比伐卢定、水蛭素、达比加群、阿加曲班、美拉加群、希美加群、来匹卢定、MCC-977、SSR-182289、TGN-255、TGN-167、ARC-183和odiparcil。
14.根据权利要求1至10中任一项的用于测定因子Xa抑制剂的方法，其中提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含确定量的蛋白水解活性凝固因子：因子Xa。
15.根据权利要求14的用于测定因子Xa抑制剂的方法，所述因子Xa抑制剂来自肝素、肝素衍生物例如磺达肝癸钠、利伐沙班、阿哌沙班、奥米沙班、LY 517717、YM 153、DU-176b、DX-9065a和KFA-1982。
16.根据权利要求14和15中任一项的方法，其中提供和孵育反应混合物，所述反应混合物包含与因子Xa的活性位点可逆结合但不因此被切割的肽：生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H。
17.一种实施根据权利要求1至16中任一项的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下单独的成分：
i. 第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，
ii. 第二试剂，其包含至少一种与所述蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体；
iii. 第三试剂，其包含信号产生系统的第一成分，所述成分可与第一试剂中的蛋白水解活性凝固因子结合；和
iv. 第四试剂，其包含信号产生系统的第二成分，所述成分可与第二试剂中的配体结合；
其中所述信号产生系统的所述第一和第二成分以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
18.一种实施根据权利要求1至16中任一项的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下单独的成分：
i. 第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，其中所述蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合；
ii. 第二试剂，其包含至少一种与所述蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体；和
iii. 第三试剂，其包含所述信号产生系统的第二成分，所述第二成分可与所述第二试剂中的所述配体结合；
其中所述信号产生系统的所述第一和第二成分以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
19.一种实施根据权利要求1至16中任一项的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下单独的成分：
i. 第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，
ii. 第二试剂，其包含信号产生系统的第一成分，所述第一成分可与所述第一试剂中的所述蛋白水解活性凝固因子结合；和
iii. 第三试剂，其包含至少一种与所述蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体，且其中所述配体与所述信号产生系统的第二成分结合；
其中所述信号产生系统的所述第一和第二成分以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
20.一种实施根据权利要求1至16中任一项的方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含以下单独的成分：
i. 第一试剂，其包含确定量的蛋白水解活性凝固因子，其中所述蛋白水解活性凝固因子与信号产生系统的第一成分结合；
ii. 第二试剂，其包含至少一种与所述蛋白水解活性凝固因子的活性位点结合但不被后者在肽键处切割的配体，且其中所述配体与所述信号产生系统的第二成分结合；
其中所述信号产生系统的所述第一和第二成分以这样的方式共同作用，即当所述信号产生系统的所述第一和第二成分变得彼此极为接近时产生可检测的信号。
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