ES2959277T3

ES2959277T3 - Composiciones y métodos para terapias antitrombóticas y hemostáticas

Info

Publication number: ES2959277T3
Application number: ES17796981T
Authority: ES
Inventors: Zaverio Ruggeri; Wolfram Ruf; Yuichi Kamikubo
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2024-02-22
Anticipated expiration: 2037-05-12
Also published as: JP2022058539A; WO2017197332A1; EP3455636B1; JP6772298B2; US20190127442A1; EP4299585A2; EP3455636A1; JP7091413B2; EP3455636A4; JP2021021737A; JP2019521324A; EP4299585A3; US11136370B2; US20210395341A1

Abstract

En diversas realizaciones, en el presente documento se describen ensayos para medir la trombina generada (TG) en una muestra de sangre, que comprenden: incubar la muestra de sangre con TF, FIXa y CaCl2; y medir TG en la muestra de sangre. También se describen en el presente documento ensayos para determinar un riesgo de hemorragia en un sujeto, que comprenden obtener una muestra de sangre del sujeto; añadir a la muestra de sangre TF y/o FIXa; determinar la cantidad de factor VIII de coagulación (FVIII:C) en la muestra de sangre; y determinar (a) un riesgo de hemorragia leve en el sujeto si la cantidad de FVIII:C en la muestra es >5 UI/dL, (b) un riesgo de hemorragia moderado en el sujeto si la cantidad de FVIII:C en la muestra es 1-5 UI/dL, y (c) un riesgo de hemorragia grave en el sujeto si la cantidad de FVIII:C en el sujeto es <1 UI/dL. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para terapias antitrombóticas y hemostáticas

Campo de la invención

La presente divulgación se encuentra en el campo médico y biomédico, específicamente en el área de los trastornos de hemorragia.

Antecedentes de la divulgación

La activación de la coagulación sanguínea es clave para la hemostasia y la inmunidad innata en respuesta a una lesión tisular, pero también contribuye a la trombosis vascular y, por tanto, a la patogénesis de enfermedades graves. En el esquema de coagulación actual, el complejo de iniciación de la vía extrínseca del factor (F) VIIa y el factor tisular (TF) promueve una cascada de reacciones proteolíticas que producen FXa que, con FVa, forma protrombinasa activa y convierte la protrombina (FII) en trombina (FIIa). Se pensaba que la trombina generada inicialmente era la clave para la amplificación de la coagulación mediante la activación por retroalimentación de los cofactores FVIII y FV, pero datos recientes indican que el FXa es más probablemente responsable de la activación del FV durante el inicio de la coagulación.

La literatura actual no está clara si reacciones adicionales, tales como la activación del FVIII catalizada por FXa o TF-FVIIa, desempeñan una función importante en el desencadenamiento de la coagulación. El esquema de coagulación actual respaldado por el conocimiento actual no puede explicar por qué los fármacos que se orientan selectivamente a las proteasas comunes de la vía de coagulación, FXa y trombina, reducen el riesgo de hemorragia intracraneal mayor y grave cuando se dosifican para lograr una eficacia antitrombótica similar a la de los antagonistas de la vitamina K que afectan múltiples factores de coagulación.

Ninivaggi ("Thrombin generation assay using factor IXa as a trigger to quantify accurately factor VIII levels in haemophilia A, 2011, J Thromb y Haem) divulga un ensayo de generación de trombina que comprende incubar una muestra de sangre con TF o FIXa y más CaCl2, y usar Z-GGR-AMC para medir la trombina generada. Mcintosh(A modified thrombin generation test for the measurement of factor VIII concentrates, 2003, J Thromb and Haem) divulga una prueba de generación de trombina que utiliza FIXa como desencadenador y mide FVIII. US 7235377 B2 divulga un método para detectar la competencia hemostática de la sangre usando TF para iniciar la coagulación. El documento WO 2015/066700 A2 divulga un ensayo de potencial de trombina endógena utilizando TF junto con otros factores de coagulación. El documento US 2009/298108 A1 divulga un ensayo que utiliza TF junto con FIX para desencadenar la coagulación.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en el campo de proporcionar una explicación mecanicista de la interferencia reducida de los inhibidores antitrombóticos del FXa con la coagulación hemostática para el desarrollo de tratamientos médicos novedosos y más eficaces, así como pruebas de diagnóstico y pronóstico.

Resumen de la divulgación

El alcance de la invención reivindicada está definido por las reivindicaciones.

Se proporciona un ensayo combinado para medir la trombina generada (TG) en una muestra de sangre y determinar tanto la cantidad de TG medida que depende de la activación del factor tisular (TF) de FVIII a FVIIIa como la cantidad de TG medida que es independiente de la activación de TF de FVIII a FVIIIa en la muestra de sangre, que comprende:

(i) incubar la muestra de sangre con factor tisular (TF), FIXa y CaCh por hasta 5 minutos; y medir TG en la muestra de sangre usando HD-ciclohexil-alanil-alanil-argininil-amidometilcumarina (AMC) y/o butiloxicarbonil-valil-prolinilargininil-AMC (V-P-R-AMC), en donde las TG medidas dependen de la activación de T<f>de FVIII a FVIIIa, y

(ii) incubar la muestra de sangre con factor tisular (TF) y CaCh, pero omitiendo FIXa, por hasta 5 minutos; y medir TG o actividad de TG en la muestra de sangre usando HD-ciclohexil-alanil-alanil-argininil-amidometilcumarina (AMC) y/o butiloxicarbonil-valil-prolinil-argininil-AMC (V-P-R-AMC), en donde las TG medidas son independientes de la activación del TF de FVIII a FVIIIa.

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención, un ensayo rápido y altamente sensible para medir la trombina generada (TG) en una muestra de sangre, que comprende: incubar la muestra de sangre con factor tisular (TF), FIXa y CaCh por hasta 5 minutos; y medir TG en la muestra de sangre usando HD-ciclohexil-alanilalanil-argininil-amidometilcumarina (AMC) y/o butiloxicarbonil-valil-prolinil-argininil-AMC (V-P-R-AMC). El ensayo puede comprender además la incubación de la muestra de sangre mediante la adición de EDTA. La cantidad de Tf agregada a la muestra de sangre puede estar entre 1 pM y 1 fM. La cantidad de FIXa añadida a la muestra de sangre puede estar entre 1 uM y 1 pM. La cantidad de CaCh añadido a la muestra de sangre puede estar entre 1 mM y 999 mM. La muestra de sangre puede ser de un paciente con hemofilia grave. El TF puede ser factor tisular recombinante (rTF). El ensayo puede ser muy sensible y tener un límite de detección de TG de aproximadamente 5 pM. El ensayo puede predecir el riesgo de hemorragia y trombogénesis en un paciente. El ensayo puede completarse en 10 minutos. El ensayo puede comprender además determinar el nivel de FVIII en la muestra de sangre. El ensayo puede ser útil para identificar variantes de FVIII con funcionalidad mejorada y/o estabilidad aumentada. El ensayo puede ser útil para cribar nuevos agentes hemostáticos.

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención, un ensayo para determinar el riesgo de hemorragia en un sujeto, que comprende:

obtener una muestra de sangre del sujeto; añadir a la muestra de sangre una composición que comprende factor tisular (TF) y/o factor IXa (FIXa); determinar la cantidad de factor VIII de coagulación (FVIII:C) en la muestra de sangre; y determinar un riesgo de hemorragia leve en el sujeto si la cantidad de FVIII:C en la muestra es >5 IU/dL, un riesgo de hemorragia moderado en el sujeto si la cantidad de FVIII:C en la muestra es de 1-5 IU/dL, o un riesgo de hemorragia grave en el sujeto si la cantidad de FVIII:C en el sujeto es <1 IU/dL. El ensayo puede tener una alta sensibilidad para discriminar el riesgo de hemorragia moderado del grave. La cantidad de TF añadida a la muestra de sangre puede ser de 1 fM a 1 pM. La cantidad de FIXa añadida a la muestra de sangre puede ser de 1 pM a 1 nM. El ensayo puede comprender además medir la activación del FVIII usando el anticuerpo monoclonal 12C7, cuando la generación de FXa libre disminuye y la generación de FIXa por TF-FVIIa está bloqueada. El ensayo puede comprender además agregar a la muestra el mutante T99Y de FVII u otro mutante identificado por propiedades útiles similares, y medir la activación del FVIII cuando disminuye la generación de FXa libre. El ensayo puede comprender además agregar a la muestra el mutante E154A de FVII u otro mutante identificado por propiedades útiles similares, y medir la activación del FVIII cuando disminuye la generación de FXa libre. El ensayo puede permitir diferenciar la activación de los cofactores FVIII y FV. El límite de detección de la cantidad de FVIII:C puede ser 0.1 IU/dL o menos. Se pueden añadir TF y FIXa a la muestra de sangre individual simultáneamente. El TF puede estar en forma relipidada. Es posible que al sujeto se le haya diagnosticado previamente hemofilia A grave. Es posible que al sujeto se le haya diagnosticado previamente deficiencia adquirida de FVIII. El ensayo puede comprender además una caracterización precisa de los fenotipos de hemorragia. La evaluación de los niveles de coagulación sanguínea puede ser parte de un régimen de tratamiento general para pacientes con hemofilia A grave. La evaluación de los niveles de coagulación sanguínea puede ser parte de una terapia de reemplazo general con productos de FVIII. El ensayo puede determinar los niveles de FVIII:C en pacientes con hemofilia grave con una sensibilidad al menos 10 veces mayor que los métodos disponibles actualmente. El ensayo puede ser útil para monitorizar el tratamiento con concentrados de FVIII y para evaluar la potencia del concentrado. En una realización, el ensayo comprende además identificar variantes de FVIII con funcionalidad mejorada y/o estabilidad aumentada. El ensayo puede comprender además el cribado de nuevos agentes hemostáticos con eficacia y seguridad mejoradas para el tratamiento de la hemofilia A. El ensayo puede ser útil para diseñar nuevos métodos y kits para monitorizar la seguridad y eficacia de la terapia antitrombótica para pacientes individuales. El ensayo puede ser útil para identificar y caracterizar nuevos agentes antitrombóticos con eficacia terapéutica mejorada. El ensayo puede ser útil para identificar y caracterizar nuevos agentes antitrombóticos con impacto reducido para la hemostasia. El ensayo puede reducir las complicaciones hemorrágicas potencialmente mortales, tal como la hemorragia intracraneal espontánea o postraumática. El ensayo puede ser útil para identificar nuevos agentes hemostáticos con mayor eficacia y seguridad. El sujeto puede tener deficiencias congénitas o adquiridas de FVIII y FIX (hemofilia). El ensayo puede medir la contribución relativa del TF-FVIIa-FXa nativo a la generación del cofactor FVIIIa activo a diferencia de la activación del FVIIIa por el FXa libre o el bucle de retroalimentación de trombina. El ensayo puede activar el FVIII, pero no el FV, y lo hace sin requerir la generación inicial de trombina. Free FXa puede activar FV a FVa.

También se describe, pero no forma parte de la invención, un kit para determinar la coagulación sanguínea, que comprende: una composición que comprende factor tisular (TF), factor IXa (FIXa), procoagulante (PL) y/o factor IIa (FIIa), o un producto farmacéutico equivalente, derivado, análogo y/o sal del mismo. El kit puede comprender además una composición que comprende H-D-ciclohexil-alanil-alanil-argininil-amidometilcumarina (AMC) y/o butiloxicarbonilvalil-prolinil-argininil-AMC (V-P-R-AMC). El kit puede comprender además un aparato para determinar niveles de actividad de FVIII:C. El kit puede comprender además un aparato para determinar la cantidad de TG. La composición de TF y/o FIXa puede estar en dosis picomolares y/o nanomolares. El kit puede resultar útil para el diagnóstico individualizado de pacientes con hemofilia. El kit puede ser útil para predecir el riesgo de hemorragia en pacientes con defectos congénitos y adquiridos del FVIII:C. El kit puede resultar útil para la monitorización y evaluación de regimientos antitrombóticos. El kit puede comprender además diagnóstico, monitorización y/o evaluación basado en el tratamiento de fármacos o combinación de fármacos.

También se describe, pero no forma parte de la invención, un método para diagnosticar, monitorizar o pronosticar una enfermedad caracterizada por hemorragia en un paciente, que comprende: obtener una muestra de plasma sanguíneo del paciente; incubar la muestra de sangre con factor tisular (TF), FIXa y/o CaCl2; analizar la muestra para determinar el nivel de FVIII:C y/o trombina generada (TG); y diagnosticar, monitorizar o pronosticar la enfermedad basándose en la cantidad de FVIII:C en la muestra, en donde la enfermedad gana en gravedad a medida que disminuyen los niveles de FVIII:C. La enfermedad puede ser un trastorno de hemorragia. La enfermedad puede ser un trastorno asociado con una reacción adversa al tratamiento antitrombótico. La enfermedad puede ser un trastorno hemostático. El paciente puede tener un riesgo de hemorragia leve si la cantidad de FVIII:C detectada es superior a 5 IU/dL. El paciente puede tener un riesgo de hemorragia moderado si la cantidad de FVIII:C detectada está entre 1-5 IU/dL. El paciente puede tener un riesgo de hemorragia grave si la cantidad de FVIII:C detectada está entre 1-0.1 IU/dL. Se pueden administrar TF y/o FIXa a la muestra de sangre del paciente en cantidades picomolares o nanomolares. El método puede comprender además un tratamiento adicional mediante la administración de un tratamiento antitrombosis apropiado. El método puede comprender además administrar una combinación de fármacos para el tratamiento de la trombosis. El método puede ser útil para lograr un tratamiento individualizado con diferentes anticoagulantes selectivos de objetivos en términos mecanicistas. El paciente puede estar recibiendo tratamiento con un anticoagulante. El anticoagulante puede ser un anticoagulante oral. El ensayo puede detectar niveles bajos de FVIII:C en pacientes con hemofilia A grave. El ensayo puede detectar niveles bajos de FVIII:C en personas con deficiencia adquirida de FVIII. Los ensayos de actividad del FVIII con mayor sensibilidad pueden permitir una caracterización más precisa de los fenotipos de hemorragia. Los ensayos de actividad del FVIII con mayor sensibilidad pueden permitir una predicción del riesgo de hemorragia en pacientes con hemofilia A grave. El ensayo puede ayudar a identificar variantes del FVIII antihemofílico con ganancia de función y/o mayor estabilidad en la vía de coagulación recientemente identificada, mejorando así la terapia de reemplazo en pacientes con función defectuosa del FVIII antihemofílico.

También se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para cribar y/o evaluar nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos o prohemostáticos que comprende: obtener una muestra de plasma sanguíneo de un paciente; añadir a la muestra de sangre una composición que comprende TF, FIXa y/o CaCh y analizar la muestra para determinar el nivel de FVIII:C o el nivel de trombina generada (TG); y cribar y/o evaluar nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos o prohemostáticos con base en el nivel de FVIII:C o el nivel de TG. Se pueden añadir TF y FIXa a la muestra de sangre en cantidades picomolares o nanomolares. La evaluación de nuevos agentes antitrombóticos o prohemostáticos puede comprender diseñar o cribar nuevos agentes antitrombóticos o prohemostáticos. Los agentes antitrombóticos o prohemostáticos pueden tener una eficacia terapéutica mejorada. Los agentes antitrombóticos o prohemostáticos pueden tener un perfil de seguridad mejorado. La evaluación específica y cuantitativa de nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos puede centrarse en la preservación funcional o degradación de los cofactores de la coagulación en el contexto de la coagulación iniciada por TF, diferenciando entre vías protrombóticas y prohemostáticas. Los agentes antitrombóticos o prohemostáticos se pueden evaluar basándose en el mejor perfil de efectos antitrombóticos versus el perfil de seguridad con respecto a las complicaciones hemorrágicas.

También se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para evaluar la eficacia terapéutica de un anticoagulante, que comprende: proporcionar una muestra de sangre; perfundir la muestra de sangre sobre una superficie recubierta con colágeno o rTF inmovilizado; medir la agregación plaquetaria y el depósito de fibrina en la superficie recubierta con colágeno o rTF inmovilizado; y evaluar la eficacia terapéutica del anticoagulante basándose en el volumen de agregados plaquetarios y/o fibrina depositada. El anticoagulante puede ser un coagulante orientado a FXa. El anticoagulante puede ser un coagulante orientado a FXa. El anticoagulante puede ser heparina (cofactor antitrombina), warfarina (antagonista de la vitamina K), dabigatrán (inhibidor directo de la trombina), rivaroxabán y/o apixabán (dos inhibidores directos del FXa). El coagulante puede ser un coagulante dirigido, tal como un aptámero que disminuye el nivel de FXI y, por tanto, la actividad en plasma. La perfusión puede realizarse a una rata de cizallamiento de la pared de 300 s-1 durante 5 minutos.

También se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para diagnosticar la susceptibilidad a una enfermedad, que comprende:

obtener una muestra de un paciente; analizar la muestra para determinar la presencia o ausencia de activación de FVIII:C; y diagnosticar la susceptibilidad a la enfermedad basándose en la ausencia de activación de FVIII:C. La enfermedad puede estar asociada con una hemorragia elevada. La enfermedad puede estar asociada con un trastorno hemostático. La activación de FVIII:C puede caracterizarse activando FVIII a FVIIa sin producir FVa al mismo tiempo. La enfermedad puede caracterizarse por un sesgo de la respuesta de la coagulación hacia la hemostasia en lugar de la trombosis.

También se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para caracterizar un riesgo significativo de hemorragia y/o fenotipo anormal en un paciente, que comprende: obtener una muestra del paciente; analizar la muestra para determinar la presencia o ausencia de activación de FVIII mediada por FX naciente en el complejo de iniciación TF-FVIIa-FXa antes de la activación por retroalimentación de FVIII; y determinar un riesgo significativo de hemorragia anormal basado en la ausencia de activación del FVIII.

Descripción de los dibujos

Se pretende que los ejemplos y figuras divulgados en el presente documento se consideren ilustrativos en lugar de restrictivos.

Figura 1 ilustra diferentes representaciones esquemáticas del inicio y amplificación de la coagulación. En el paradigma actual (izquierda), se considera que la activación de los cofactores FVIII y FV está mediada principalmente por trombina, aunque se ha destacado una función clave del FXa en relación con la trombina para la activación del FV A la derecha está el nuevo esquema de coagulación como se describe en esta divulgación. El FVIII se activa mediante FXa naciente dentro del complejo de iniciación extrínseco TF-FVIIa-FXa antes de la inhibición por TFPI. Al activar simultáneamente FIX, el complejo extrínseco TF-FVIIa puede iniciar directamente la vía antihemófila y no solo amplificar la coagulación intrínseca, como se piensa actualmente. Las dos vías representadas de activación de la coagulación pueden integrarse de forma variable en respuestas a diferentes estímulos.

Figura 2 ilustra el efecto de los inhibidores de la coagulación sobre la formación de trombos en el flujo sanguíneo expuesto al TF. (A) Deposición de plaquetas y fibrina sobre rTF inmovilizado usando las concentraciones de solución de recubrimiento indicadas. Se perfundió sangre citratada recalcificada (1.29 mM Ca2+) de controles (C; n = 9) y pacientes tratados con warfarina (W; n = 12, INR promedio 2.6) o rivaroxaban (R; n = 10, concentración plasmática promedio de 312 nM 2 horas después de la ingesta del fármaco) durante 5 min a una rata de cizallamiento de la pared de 300 s1. (B) Izquierda: Se perfundió sangre normal sin (C) o con rivaroxaban (R) 300 nM y/o anti-FVIII MoAb (ESH-8, 40 μg/ml) sobre rTF inmovilizado durante 2 minutos como en (A); n = 3 para todas las condiciones. Tenga en cuenta que, debido a los diferentes microscopios utilizados, los campos cuantificados en (B) fueron 4.65 veces más grandes que en (A). Derecha: Imágenes confocales representativas (lado = 312 jm ) con señales superpuestas de los canales de fluorescencia verde (plaquetas y leucocitos) y rojo (fibrina); la colocalización produce amarillo. Los resultados se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes de mínimo a máximo (A) o (cuando n ≤ 3) como barras de mínimo a máximo (B); una línea horizontal indica la mediana. La evaluación estadística se realizó con las pruebas de Kruskal-Wallis/Dunn (A) o ANOVA/Tukey (B). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Figura 3 ilustra la amplificación de la vía intrínseca de TG por TF-FVIIa subumbral. (A) TG (que representa 2) inducida por TF 0.6 pM en PRP citratado recalcificado (180 x 103 plaquetas/μl) que contenían 30 μg/ml de CTI sin o con rivaroxaban o apixaban y anti-FVIII MoAb (ESH-8, 40 μg/ml). (B) TG (que representa 3) inducida por rTF 0.15 pM o/y FlXa 20 pM añadido a PRP citratado recalcificado con 30 μg/ml de c T i y con 40 μg/ml de IgG de conejo no inmune (izquierda) o anti-TFPI (derecha). (C) TG (que representa 2) inducida por rTF 0.15 pM con 50 μg/ml de CTI en plasma deficiente en FIX reconstituido con 180 x 103 plaquetas normales/μl. (D) Ensayo de alta sensibilidad de TG inducida por rTF 0.15 pM sin/con FIXa 20 pM en PRP deficiente en FVII, con CTI 30 μg/ml, reconstituido o no con WT FVIIa 400 pM o mutante inactivo S195A (iFVIIa) e incubado durante 5 (n =2-5), 8 (n =2-5) o 11 (n =3) min a 37°C. (E) Ensayo de alta sensibilidad de TG inducida por complejos estables preincubados (2 min, 37 °C) formados con TF 10 nM, iFVIIa 10 nM, FXa 5 nM, TFPI o NAPc2 40 nM y CaCh 2.5 mM. Se agregaron complejos, sin/con FIXa 10 pM, a las concentraciones indicadas de TF y FXa en plasma deficiente en FVII (con CTI) reconstituido con plaquetas normales, y se incubaron durante 8 minutos a 37 °C (n = 3-5). Los resultados (D, E) se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes de mínimo a máximo y una línea en la mediana. Las diferencias se evaluaron mediante la prueba ANOVA/Tukey después de la transformación de los datos como y = log-iü y. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Figura 4 ilustra la activación del FVIII independiente de trombina por el FXa naciente a partir de TF-FVIIa. (A) Análisis WB (que representa 2) de la activación del FVIII por el complejo estable de TF 50 pM (fosfolípidos procoagulantes 0.37 jM ) con iFVIIa inactivo 100 pM, FXa 100 pM, NAPc25 nM incubados durante 120 s con FVIII 0.7 nM, FV 3 nM, lepirudina 200 nM, sin/con TFPIa 10 nM o antitrombina (AT) 2.5 jM/cofactor pentasacárido (penta) 5 jM . (B) Generación de FXa inducida por FIXa 10 nM o FVIIa 200 pM o los dos combinados añadidos a TF 50 pM, FX 135 nM, FVIII 0.7 nM, FV 3 nM, protrombina 1 jM , CaCh 2.5 mM, sin (n = 7) o con (n = 13) DAPA 4 jM y se incubaron durante 180 s a 37°C. En 4 experimentos, el mutante S195A inactivo sustituyó a la protrombina WT (sin DAPA). El FXa por FIXa/FVIIIa se calculó restando el FXa generado por FVIIa y FIXa individualmente del generado por FVIIa/FIXa sumados. (C). Generación de FXa por TF-FVIIa o FIXa-FVIIIa después de 180 segundos en reacciones que incluyen FVIIa 500 pM, TF 400 pM, FIXa 10 nM, FX 135 nM, FVIII 0.7 nM, FV 3 nM, protrombina 1 jM , TFPIa 40 nM, DAPA 4 jM , CaCl22.5 mM, sin (n=5) o con (n=4) VWF 18 nM. (D) Análisis WB (que representa 2) de la generación de FVIIIa mediante preactivado ode novogeneró FXa y su inhibición al aumentar las concentraciones de AT/penta. Reacciones (37°C) iniciadas por FXa 200 pM o FVIIa 20 pM con FX 50 nM en mezclas de TF 400 pM, FVIII 0.7 nM, lepirudina 200 nM sin (arriba, incubación 60 s) o con (abajo, incubación 120 s) FV 3 nM/FIX 50 nM. (E) Cuantificación (en relación con el control no inhibido) de FVIIIa generado como en D (abajo) calibrado con cantidades conocidas de FVIIIa (n = 6-8 por FXa naciente, 4-6 por FXa preformado). Los resultados (B, C, E) se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes de mínimo a máximo y línea en la mediana. Las diferencias se evaluaron mediante ANOVA seguido de Tukey (B) o Dunnett. (MI) prueba; datos en (B) se transformaron como y = log10 y antes del análisis. **P<0.01; ***P<0.001.

Figura 5 ilustra una realización en la que los mutantes de FVIIa con liberación alterada del producto FXa aún pueden soportar la activación de FVIII por FXa naciente. (A) Ensayo libre de fosfolípidos de conversión de FX (1 jM ) a FXa mediante el complejo de rTF soluble 2 jM con FVIIa WT, T99Y o E154A 10 nM. (B) Generación de FXa mediante rTF reconstituido con fosfolípidos 50 pM con FVIIa WT, T99Y o E154A 200 pM añadidos a FX 135 nM, FVIII 0.7 nM, FV 3 nM y lepirudina 200 nM (2 min, n = 2-3; 4 min, n = 4-5; 6 min, n =6-9). (C) WB (que representa 2) de activación de FVIII en reacciones de t F 50 pM, FVIIa WT 200 pM o mutantes, FVIII 0.7 nM, FV 3 nM y lepirudina 200 nM sin/con FX 135 nM, incubados durante 120 s a 37 °C. Obsérvese el dominio FVIII A1337-372 inactivo más pequeño generado por FVIIa WT en ausencia de FX (11), lo que indica que las escisiones activadoras son preferentemente por FXa naciente. (D) WB (que representa 2) de la activación de FVlII (arriba; incubación 180 s) y FV (abajo; incubación 420 s) inducida por TF 50 pM, FVIIa WT 200 pM o mutante, FX 135 nM, sin o con TFPIa 10 nM. (E) Generación de FXa medida en reacciones como en (D) sin TFPIa y en presencia de FlXa 10 nM (izquierda, incubación 180 s; n = 5-6 excepto = 2 para E154A) o FIX 90 nM (derecha, incubación durante 360 s; n = 5-6). (F) TG (que representa 3) por TF 2.5 pM en PRP reconstituido deficiente en FVII que contiene CTI 30 μg/ml suplementado con FVIIa WT 400 pM o mutante sin anticuerpo (izquierda), con anti-FVIII (8D4, 8 μg/ml; centro) o con anti-FXI (O1A6, 20 μg/ml; derecha). Los resultados se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes de mínimo a máximo (línea en la mediana). Las diferencias se evaluaron mediante la prueba ANOVA/Tukey; Los resultados a los 4 y 6 minutos en (B) y en reacciones con FIX en (E, derecha) se analizaron después de la transformación como y =log10 y (**P<0.01, ***P<0.001).

Figura 6 ilustra la formación de trombos dependiente de FVIIIa inducida por el complejo de iniciación de la coagulación del TF en la sangre que fluyeex-vivo.(A) Se resuspendieron células sanguíneas tipo O lavadas normales al volumen original con PPP citratado deficiente en FVII y se suplementaron con WT 200 pM o FVIIa mutante sin o con adición de anti-FVIII MoAb C5 (25 μg/ml), seguido de recalcificación (Ca2+ 1.29 mm ) y perfusión durante 3.5 min a 300 s-1 rata de cizallamiento de la pared. También se evaluó el efecto de añadir FlXa (20 pM) a la sangre reconstituida con el mutante FVIIa T99Y. Se muestran imágenes confocales representativas con canales de fluorescencia verdes (agregados de plaquetas y leucocitos) y rojos (fibrina) superpuestos. Lado de la imagen = 312 jm . (B) Cuantificación del volumen de agregados de plaquetas y fibrina depositados sobre la superficie recubierta de TF (n = 4-6 para las diferentes condiciones). (C) Generación de FVIIIa funcional sobre micropartículas procoagulantes (MP) de macrófagos de ratón que expresan TF humano activado (izquierda) o TF de ratón endógeno (derecha). La generación de FVIIIa se indujo añadiendo suspensiones de MP en reacciones que contenían FVIIa humano o de ratón de especie equivalente 10 nM y FVIII 0.7 nM, FV 3 nM, FX 135 nM, lepirudina 200 nM, sin o con FIXa 2 nM. La activación del FX por FVIIIa-IXa se calculó a partir de las velocidades de reacción total e individual. Los resultados se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes mínimo a máximo (B) o barras de mínimo a máximo (C, n =2-3) con una línea en la mediana. Las diferencias se evaluaron mediante la prueba ANOVA/Tukey (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

Figura 7 ilustra que TF contribuye a la generación de FVIIIa en la trombogénesisin vivo.(A) Oclusión de la arteria carótida después de una lesión de7% (0.26 M) o 8% (0.3 M) FeCh6H2O en ratones C57BL/6J que recibieron las concentraciones indicadas de anti-TF 21E10 y anti-FXI 14E11. Se midieron el tiempo hasta la primera oclusión y el índice de flujo (n = 5-20 en los diferentes grupos). (B) El FVIIIa, pero no el FVIII (ambos a 40 pM), revirtió la inhibición de TG inducida por MoAb anti-TF 5G9 (50 μg/ml) iniciada en PRP humano por TF/FIXa (0.15/20 pM). (C) Oclusión de la vena femoral después de una lesión con 4% (0.15 M) FeCh6H2O en ratones C57BL6J (n = 3-7 en los diferentes grupos) tratados con los anticuerpos indicados e infundidos antes de la lesión con FVIII o FVIIIa (bolo de 1.4 pmol/0.47 pmol/min durante 15 min). (D) Imágenes representativas de fibrina en la vena femoral que muestran la restauración de la coagulación mediante FVIIIa, pero no la infusión de FVIII después del tratamiento antitrombótico con MoAbs. Arriba a la izquierda, sin anticuerpos/sin infusión de FVIII(a); arriba a la derecha, aa-FXI 65 ng/g a-TF 9 μg /g FVIII; abajo a la izquierda, los mismos MoAbs, pero FVIIIa; abajo a la derecha, a-FXI 125 ng/g FVIIIa. Los gráficos de puntos muestran la mediana y el intervalo intercuartílico (A, arriba y C) o la media con CI del 95 % (A, abajo). La evaluación estadística se realizó con las pruebas de Kruskal-Wallis/Dunn (A, arriba y C) o ANOVA/Tukey (A, abajo). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Figura 8 ilustra el inicio directo del TF de la coagulación intrínseca que escapa a los inhibidores farmacológicos del FXa. (A) Inhibición de la actividad amidolítica del FXa por rivaroxaban y apixaban. Se incubó FXa (1 nM) con rivaroxaban o apixaban (n = 3 cada uno) a las concentraciones indicadas y se midió la actividad residual de FXa con el sustrato cromogénico S-2765 (360 jM ) a 37°C para calcular el % de inhibición (media ± SEM). Los valores de IC50(nM) fueron: Rivaroxaban 1.9± 0.09; apixaban 3.56±0.32. (B) Inhibición de la actividad protrombinasa FXa (50 pM) después de la incubación con las concentraciones indicadas de rivaroxaban o apixaban (n = 3 cada uno) durante 4 min a 37°C en reacciones que contienen rTF 50 pM como superficie fosfolípida, FVa 3 nM y protrombina 1 jM . La trombina se cuantificó con un sustrato fluorogénico para calcular el % de inhibición. Los valores de IC50(nM) fueron: Rivaroxabán 0.43± 0.06; apixabán 1.08±0.11 (C) Análisis WB de la generación de FVIIIa y su inhibición mediante concentraciones crecientes de rivaroxaban o apixaban. Las reacciones se iniciaron con FXa 100 pM con rTF 50 pM como superficie de fosfolípidos (arriba);o el complejo preformado de TF 50 pM, iFVIIa 100 pM, FXa 100 pM, NApc2 5 nM(centro);o TF 50 pM /FVIIa 200 pM /FX 135 nM(abajo)en mezclas de FvIII 0.7 nM, FV 3 nM, lepirudina 200 nM, TFPI 10 nM y CaCh 2.5 mM se incubaron durante 120 s a 37°C. (D) Análisis WB del efecto de rivaroxabán sobre la activación del FVIII por FXa generado por el activador de FX del veneno de víbora de Russel (RVV) (13.5 pM) o TF-FVIIa, que genera FXa de 1.25 y 1.23 nM, respectivamente, después de 120 s de incubación de reacciones como en (C). (MI) Inhibición de TG inducida por FVIIa 200 pM, FIXa 10 nM, rTF 50 pM, FX 135 nM, FV 3 nM, protrombina 1 jM , TFPIa 10 nM sin o con FVIII 0.7 nM durante 240 s a 37 °C (n = 3-4). (F) Trombogramas que muestran la inhibición de rivaroxaban (izquierda, sin adición; centro, 50 nM) de TG iniciada por TF 2.5 pM en PRP deficiente en FVII reconstituido con WT 400 pM o FVIIa mutante T99Y o E154A. El potencial de trombina endógena (ETP, derecha) se calculó a partir del área bajo la curva TG (n = 2). Los resultados en (E) y (F) se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes de mínimo a máximo o barras de mínimo a máximo (cuando n ≤ 3) con una línea en la mediana. Las diferencias se evaluaron con la prueba ANOVA/Tukey (realizada después de la transformación log10 de los datos mostrados en E); *P<0.05, ***P<0.001.

Figura 9 ilustra una realización de la divulgación proporcionada en el presente documento. (A) Análisis WB (que representa 3) del efecto de los anti-FVIIa MoAbs 3G12 y 12C7 (20 μg/ml) sobre la generación de FVIIIa dependiente de TF después de 120 s en reacciones que incluyen tF 50 pM, FVIIa 200 pM, FX 135 nM, FVIII 3.5 nM, Fv 3 nM y lepirudina 200 nM; cuantificación como en la Fig.4e. (B) Preservación de la generación de FXa dependiente de FVIIIa mediante anti-FVIIa MoAb 12C7 en presencia de FIXa 10 nM (incubación de 180 s, n=3) pero no de FIX 90 nM (incubación de 360 s; n=3-5), en contraste con la inhibición por MoAb 3G12. Las reacciones contenían TF 50 pM, FVIIa 200 pM, FVIII 0.7 nM, FV 3 nM, FX 135 nM, TFPI 10 nM, lepirudina 200 nM y CaCh 2.5 mM; Los MoAb anti-FVIIa o la IgG de ratón de control estaban en 20 μg/ml; el anti-FVIII MoAb 8D4 bloqueador de la función estaba en 8 μg/ml. (C) Efecto de los anti-FVIIa MoAbs 3G12 y 12C7 (20 μg/ml), sin o con anti-FVIII MoAb 8D4 (8 μg/ml) o anti-FXI MoAb O1A6 (20 μg/ml), sobre TG en condiciones normales PRP. (D) Efecto dependiente de la dosis de rivaroxabán sobre las TG dependientes de TF en PRP en presencia de los anti-FVIIa 12C7, anti-FVIII y anti-FXI MoAbs, como se indica (n = 2-13 en diferentes grupos). Los resultados en (B) y (D) se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes de mínimo a máximo o barras de mínimo a máximo (cuando n ≤ 3) con una línea en la mediana. Las diferencias se evaluaron mediante una prueba t de dos colas con corrección de Welch (A) o la prueba ANOVA/Tukey (B y D). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Figura 10 ilustra pruebas de TG para medir la actividad coagulante de FVIII añadido al plasma de un paciente con hemofilia A grave. La TG se indujo mediante la adición de TF relipidado (0.15 pM), FlXa (200 pM) o una combinación de ambos, seguido de recalcificación. A. TG en plasma del paciente, al que se le añadió 0.1 lU/dL de FVIII recombinante (rFVIII). B. TG en plasma de paciente inducido por TF y FlXa combinados con fosfolípidos (5 jM ), al que se le añadió 0.07-0.56 lU/dL de FVIII derivado del plasma. C. Curva de calibración para FVIII construida con el parámetro potencial de trombina endógena (ETP) de Tg determinado calculando el área bajo las curvas que se muestran en el panel B.

Figura 11 ilustra la vía del TF y la activación del FVIIIin vivo.(A) Oclusión de la arteria carótida después de una lesión con (0.26 M) o 8% (0.3 M) FeCl36H2O en ratones C57BL/6J tratados con anti-TF 21E10 y/o anti-FXI 14E11 MoAbs, como se indica (n = 5-20 en diferentes grupos); A los ratones de control (C) se les inyectó tampón o IgG de ratón no inmune de isotipo coincidente. (B) Oclusión de la vena femoral después de la lesión con 4% (0.15 M) FeCl36H2O en ratones (n = 3-7) que recibieron FVIII o FVIIIa (bolo de 1.4 μmol/0.47 μmol/min durante 15 min) antes de la lesión y el tratamiento con MoAb. Los resultados en A, arriba y B (gráficos de puntos, mediana e intervalo intercuartílico) se analizaron con pruebas de Kruskal-Wallis/Dunn; en A, abajo (gráfico de puntos, media y CI del 95%) con pruebas ANOVA/Tukey. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. (C) Formación de fibrina en la vena femoral. Arriba a la izquierda, ratones de control inyectados con solución salina tamponada con fosfato; arriba a la derecha, la inyección de FVIII no previene el efecto antitrombótico de 9 μg/g anti-TF/65 ng/g anti-FXI MoAbs combinados; abajo a la izquierda, la inyección de FVIIIa evita la inhibición de esta combinación de anticuerpos; abajo a la derecha, el FVIIIa no puede evitar la inhibición con una dosis completa (125 ng/g) de anti-FXI MoAb solo. (D) Tg representativa (n=3) inducida por rTF 0.15 pM y/o FIXa 20 pM en PRP humano citratado (180103 plaquetas/μl) recalcificadas con CaCh 18 mM a 37 °C y que contiene 30 μg/ml de CTI para bloquear FXIIa E (izquierda) 40 μg /ml de IgG anti-TFPI de conejo o (derecha) IgG no inmune. (E) TG representativa (n=2) inducida por rTF y/o FIXa como anteriormente en PPP deficiente en FIX recalcificado que contiene 50 μg/ml de CTI y 180103 plaquetas lavadas normales/μl.

Figura 12 ilustra que el complejo de iniciación de TF activa el FVIII. (A) Se indujo TG con FIXa 20 pM; o FVIIa WT 400 pM o mutante S195A inactivo (iFVIIa); o FIXa combinado con FVIIa WT o iFVIIa agregado en PRP reconstituido deficiente en FVII (180103 plaquetas/μl) que contienen 30 μg/ml de CTI, rTF 0.15 pM y CaCh18 mM, seguido de incubación durante 5 (n =2-5), 8 (n =2-5) o 11 (n =3) min a 37°C. (B) Activación de FVIII (1.4 nM) mediante rTF 400 pM-FVIIa 500 pM con/sin FX 135 nM en reacciones que contienen TFPIa 40 nM y lepirudina 200 nM incubadas durante 30 s a 37 °C. Después de bloquear FXa y TF-FVIIa residuales con péptido anticoagulante de garrapata (TAP) 70 nM y 20 μg/ml de cada MoAb 5G9 y 12C7, respectivamente, se midió la actividad de coagulación de FVIIIa (n = 2-4) añadiendo la mezcla de reacción a plasma deficiente en FVIII con FIXa 10 nM, PL 20 jM y CaCh 8 mM. (C) TG como en (A) pero inducida por un complejo preformado de TF 10 nM/iFVIIa 10 nM/FXa 5 nM y TFPI o NAPc240 nM añadidos a las concentraciones indicadas de TF/FXa sin (izquierda) o con (derecha) FIXa 10 pM. Incubación durante 8 min a 37°C (n =3-5). Los resultados en (A-C) se muestran como barras de percentiles 25 a 75 (bigotes de mínimo a máximo, línea en la mediana) o, cuando n ≤3, barras flotantes de mínimo a máximo (línea en la media; análisis mediante ANOVA/Pruebas de Tukey (después de y =log-i0 y transformación en C). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. (D) Inmunotransferencias representativas (n = 2) de la generación de FVIIIa y FVa después de 30 o 60 s en reacciones con las combinaciones indicadas de FXa 200 pM, iFVIIa 500 pM, NAPc240 nM y tAp 1 jM añadidos a rTF 400 pM, FVIII 700 pM, FV 3 nM y lepirudina 200 nM. (E) Arriba. Inmunotransferencias representativas que muestran el efecto de TAP (1 jM ) sobre la activación de FVIII por TF-FVIIa (400 y 500 pM, respectivamente) y FX 135 nM. Las reacciones, que también contenían FVIII 700 pM, FV 3 nM y lepirudina 200 nM, se incubaron durante 30 s a 37 °C. Abajo. Cuantificación de los experimentos como se muestra en el panel superior (n = 4), presentados como barras de percentiles 25 a 75 y analizados mediante prueba t de dos colas. ***P<0.001. (F) Dosis-respuesta del efecto de FVa sobre la conversión de protrombina 1 jM en trombina en reacciones que contienen FXa 10 pM, rTF 50 pM y FVIII 700 pM incubadas durante 180 s a 37 °C; media ± 95 % CI(n = 4). (G) Dosis-respuesta del efecto de FVa sobre la activación de FVIII por FXa 10 pM en reacciones con rTF 50 pM, FVIII 700 pM y lepirudina 200 nM incubadas durante 180 s a 37 °C. La actividad de FVIIIa (media ± IC del 95 %, n = 4) se midió como FXa generado en presencia de FIXa 2 nM y se expresó como porcentaje del medido en ausencia de FVa. (H) Izquierda. Inmunotransferencias representativas (n=3) de la generación de FVIIIa en reacciones como en G. Derecha. Cuantificación del FVIIIa generado (n=3) expresado como en (G) y mostrado mediante barras flotantes de mínimo a máximo; análisis mediante prueba t de una muestra.

Figura 13 ilustra la activación del FVIII independiente de trombina por el TF-FVIIa-FXa naciente. (A) Arriba. Inmunotransferencias representativas que muestran la generación de fragmentos de activación de FVIIIa A1 inducida por FVIIa 200 pM/rTF 50 pM (fosfolípidos 0.37 jM ) en reacciones que contienen FVIII 700 pM, FV 3 nM, FX 135 nM, protrombina (FII) 1 jM - Wt sin/con Da PA 4 jM (n = 4) o mutante S195A inactivo (n = 3) -y CaCh2.5 mM se incubaron a 37 °C durante 120 s. Abajo. Cuantificación del FVIIIa-A1 generado calibrado con cantidades conocidas del fragmento. (B) Actividad de FVIIIa calculada a partir de la generación de FXa en reacciones como en (A), pero con FIXa 10 nM añadido e incubado durante 180 s a 37 °C (n =4-12). La generación de FXa dependiente de la actividad de FVIIIa-FIXa se calculó restando el FXa generado por FVIIa y FIXa agregados individualmente del generado por FVIIa/FIXa sumados. (C) Actividad de FVIIIa generada y calculada en reacción como en (A, B) pero con la adición de TFPIa 10 nM. Resultados en A (abajo), B y C: mostrados como barras de percentiles 25 a 75, bigotes de mínimo a máximo, línea en la mediana; o barras flotantes de mínimo a máximo con línea en la media cuando n ≤3 - se analizaron mediante pruebas ANOVA/Tukey. ***P<0.001; NS, no significativo. (D) Efecto de diferentes concentraciones de hirugen sobre TG iniciada por FlXa 10 pM en PRP normal (180103 plaquetas/μl) que contenían 30 μg/ml de CTI y 20 μg/ml de anti-FXIa bloqueante MoAb O lA6 (n=3). (E) Trombogramas representativos iniciados en PRP normal - que contiene CTI y anti-FXIa MoAb como en (D) - mediante rTF 0.15 pM y/o FlXa 10 pM sin (izquierda) o con (derecha) hirugen 2 pM (n=3).

Figura 14 ilustra que los mutantes de FVIIa con alteración del recambio del producto FXa apoyan la activación del FVIII por el FXa naciente cuando se bloquea la retroalimentación de trombina. (A) Izquierda. Curso temporal (media ± SEM) de la activación de FX 1 pM por TF recombinante soluble libre de fosfolípidos 2 pM con mutantes FVIIa WT 10 nM (n = 4-7), T99Y (n = 2-3) o E154A (n = 3 -4); incubación a 37°C. Derecha. Generación de FXa en reacciones con rTF reconstituido con fosfolípidos 50 pM, FVIIa WT 200 pM o mutantes, FX 135 nM y FVIII 700 pM incubados durante 2 (n = 2-3), 4 (n = 4-5) o 6 (n = 6-9) mín. (B) Inmunotransferencias representativas (n = 2) de activación de FVIII mediante rTF 50 pM, FVIIa Wt 200 pM o mutantes, FX 135 nM, FVIII 700 pM, FV 3 nM, lepirudina 200 nM, sin/con TFPIa 10 nM incubado durante 180 s. (C) Inmunotransferencias representativas (n = 2) de activación de FV en reacciones como en (B) incubadas 420 s. (D) Izquierda. Actividad de FVIIIa (barras de percentiles 25 a 75, bigotes mínimo a máximo, línea en la mediana) generada como en (B), pero sin TFPIa, medida como FXa producido por FIXa 10 nM (n = 9 para FVIIa WT y T99Y; n = 5 para E154A). **P<0.01, ***P<0.001) mediante pruebas ANOVA/Tukey. Derecha, actividad de FVIIIa-FIXa generada con FIX 90 nM reemplazando a FIXa; incubación 360 s (n=5-6). (E) t G representativa (n = 3) iniciada por rTF 2.5 pM/FVIIa WT 400 pM o mutantes en PRP reconstituido deficiente en FVII que contiene CTI 30 μg/ml, anti-FVIIIa MoAb 8D4 8 μg/ml. (F) TG representativa (n = 3) como en (E) pero sin anti-FVIIIa MoAb y sin (izquierda)/con (derecha) anti-FXIa MoAb O1A620 μg/ml. (G) TG representativa (n = 3) iniciada por FIXa 20 pM en PRP reconstituido deficiente en FVII que contiene hirugen 4 pM, CTI 30 μg/ml, anti-FXIa MoAb 20 μg/ml. (H) TG representativa como en (G) pero iniciada por rTF 2.5 pM /FVIIa WT o E154A 400 pM con (izquierda; n = 3)/sin (derecha; n = 5) MoAb anti-FVIIIa 8 μg/ml. (I) TG representativa como en (H) pero con FVa 3 nM añadido con (izquierda; n =4) o sin (derecha; n =5) anti-FVIIIa MoAb.

Figura 15 ilustra Anti-FVIIa MoAb 12C7 imita las propiedades funcionales de FVIIa Y99A. (A) Izquierda. Inmunotransferencia representativa que muestra el efecto de los anti-FVIIa MoAb 3G12 y 12C7 (20 μg/ml) sobre la generación de FVIIIa dependiente de TF en reacciones que incluyen rTF 50 pM, FVIIa 200 pM, FX 135 nM, FVIII 3,5 nM, FV 3 nM, lepirudina 200 nM se incubaron durante 120 s a 37°C. Derecha. Cuantificación de los datos de la izquierda (n =3; barras flotantes de mínimo a máximo, línea en la media); las diferencias se evaluaron mediante la prueba t de dos colas corregida por Welch. (B) Anti-FVIIa MoAb 12C7 -pero no 3G12- conserva la generación de FXa dependiente de FVIIIa mediante FIXa 10 nM (izquierda; n = 3), pero no FIX 90 nM (derecha; n = 3-5), en reacciones que contienen rTF 50 pM, FVIIa 200 pM, FVIII 700 pM, FV 3 nM, FX 135 nM, TFPIa 10 nM, lepirudina 200 nM y CaCh 2,5 mM se incubaron 180 o 360 s, respectivamente, 37°C. Se añadieron los Anti-FVIIa MoAb o IgG de ratón de control a 20 μg/ml. Los resultados (barras flotantes mín-máx, línea en la media) se analizaron mediante pruebas ANOVA/Tukey. ***P<0.001. (C) Trombogramas representativos (n = 2) que muestran el efecto de los anti-FVIIa MoAb 3G12 y 12C7 (20 μg/ml) en t G inducidas por rTF 1.2 pM en p Rp normal con CTI (30 μg/ml) y sin (izquierda) o con (derecha) adición de anti-FXI MoAb O1A6 (20 μg/ml) que bloquea la activación de FIX por FXIa.

Figura 16 ilustra la formación de trombos dependiente de FVIIIa inducida por el complejo de iniciación TF-FVIIa en el flujo sanguíneo. (A) Se recalcificó sangre reconstituida con células sanguíneas tipo 0 lavadas añadidas al recuento original en PPP citratado deficiente en FVII con WT o FVIIa mutante 200 pM y sin/con el inhibidor anti-FVIII MoAb C5 (25 μg/ml) a Ca2+1.29 mM y perfundido durante 3.5 min a 300 s_1 rata de cizallamiento de la pared. Cuando se indicó, se añadió FIXa (20 pM) a la sangre. Se muestran imágenes confocales representativas con canales de fluorescencia verdes (agregados de plaquetas y leucocitos) y rojos (fibrina) superpuestos. Lado de la imagen = 312 μm. (B) Cuantificación del volumen de agregados plaquetarios y fibrina depositada después de agregar FVIIa WT, T99Y o S195A sin/con anti-FVIII MoAb (n = 4-6 para las diferentes condiciones). (C). Como en B, pero después de añadir FVIIa WT o E154A (n =3-8 para las diferentes condiciones). Resultados en (B) y (C): mostrados como barras de percentiles 25 a 75, bigotes de mínimo a máximo, línea en la mediana; o barras flotantes de mínimo a máximo, línea en la media cuando n ≤3 - se evaluaron mediante las pruebas ANOVA/Tukey; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Figura 17 ilustra curvas de calibración construidas con un calibrador FIIa utilizando sustratos FIIa (50 pM).

Figura 18 ilustra un ensayo discontinuo de 2 etapas de TG inicial. La TG inicial se indujo en plasma normal pobre en plaquetas mediante la adición combinada de rTF y FIXa, seguido de una incubación durante hasta 5 minutos (excepto 3 minutos en los paneles B-D) a 37°C. (A) TG por rTF 150 fM, FIXa 200 pM y PL 1.3 pM. (B) Titulación de rTF añadido en TG por FIXa 200 pM con PL 1.3 pM. (C) Titulación de FIXa añadido en TG por rTF 150 fM con PL 1.3 pM. (D) Efecto de mejora de PL agregado sobre Tg mediante rTF 150 fM y FIXa 200 pM. Cada dato denota la media ± SEM de 3 experimentos.

Figura 19 ilustra la validación del ensayo probando la reproducibilidad del ensayo de TG. Se indujo TG en plasma normal combinado mediante rTF 150 fM, FIXa 200 pM y Pl 1.3 pM durante 3 minutos a 37°C. (A y B) Determinación de variaciones intraensayo. Los resultados (n=7-8) en el panel A se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes mínimo/máximo y una línea en la mediana de tres experimentos independientes. La tabla del panel B indica que la precisión intraensayo es alta debido al bajo coeficiente de variación (CV), con <15 %. (C) Determinación de la variación interensayo (n = 4). También se observó que el valor de CV interensayo era <15 %.

Figura 20 ilustra el efecto de los anticuerpos monoclonales (MoAb) anti-FVIII sobre las TG iniciales en PPP normal mediante rTF 150 fM/FIXa 200 pM y PL 1.3 pM. Se añadieron MoAbs a 125 nM. Cada columna indica la media ± SEM (n=3) de Fila generado después de 3 minutos de incubación.

Figura 21 ilustra ensayos de TG en PPP deficiente en FVIII sin o con inhibidores anti-FVIII. (A) Se indujo TG inicial en un ensayo discontinuo de 2 etapas añadiendo rTF 150 fM /FlXa 200 pM y PL 5 pM, seguido de una incubación durante 5 minutos a 37 °C. Cada columna indica la media+SEM (n=3) de Fila generado. (B) Comparación de la curva dosisrespuesta de FVIII añadido en TG en plasma con deficiencia de FVIII mediante un ensayo discontinuo de 2 etapas con el ensayo continuo. También se indujo TG continua añadiendo rTF 150 fM/FIXa 200 pM y PL 5 pM, seguido de incubación durante 40 min a 37°C.

Figura 22 ilustra las TG dependientes e independientes de FVIIIa en plasma de pacientes tratados con Coumadin. La TG dependiente de FVIIIa se indujo añadiendo rTF 150 fM/FIXa 200 pM con PL 1.3 pM, mientras que la TG independiente de FVIIIa se indujo mediante rTF 1.2 pM con PL 1.3 pM. Cada columna indica la media+SEM(n=3) de FIIa generado después de 3 minutos de incubación.

Figura 23 ilustra el efecto del bloqueo de la función FXIa o TF sobre la agregación plaquetaria y la deposición de fibrina en superficies recubiertas con colágeno fibrilar tipo I o rTF. Se perfundió sangre completa con citrato recalcificado a una rata de cizallamiento de la pared de 300 s_1 durante 5 minutos. El volumen de agregados de plaquetas visualizados mediante la captación de mepacrina y de fibrina visualizados mediante un anticuerpo fluorescente se midió mediante microscopía confocal.

Figura 24 ilustra el inicio de la coagulación intrínseca del TF que escapa a los inhibidores farmacológicos del FXa. (A) Efecto de rivaroxaban o apixaban sobre la actividad protrombinasa FXa (50 pM) en reacciones con superficie de fosfolípidos 50pMrTFas, FVa 3 nM y protrombina 1 pM incubadas durante 4 min, 37 °C (n=3). (B) WB representativo que muestra la inhibición dependiente de la dosis por parte de rivaroxaban (n=5) o apixaban (n=3) de la generación de FVIIIa en reacciones iniciadas por FXa 100 pM con rTF 50 pM (arriba); o 50 pMrTF, iFVIIa 100 pM, FXa 100 pM, complejo NAPc25 nM (centro); o rTF 50 pM, FVIIa 200 pM, FX 135 nM (abajo) en reacciones con FVIII 700 pM, FV 3 nM, lepirudina 200 nM, TFPIa 10 nM (excepto con FXa, arriba) y CaCh 2.5 mM se incubaron 120 s, 37°C. (C) WB representativo que muestra la inhibición dependiente de la dosis por parte de rivaroxaban (n=2) de la generación de FVIIIa en reacciones con FX 135 nM iniciadas por TF-FVIIa o activador de FX del veneno de víbora de Russel (RVV) (13.5 pM) que genera FXa de 1.25 y 1.23 nM., respectivamente, en 120 s. (D) Evaluación cuantitativa por WB de la inhibición de la generación de FVIIIa dependiente de la dosis por rivaroxaban (n=3-4) en reacciones que contienen FXa WT (25 pM) o mutante V17M (500 pM) con rTF 1 nM, iFVIIa 1 nM, NAPc25 nM, lepirudina 200 nM y CaCh 2.5 mM se incubaron 120 s, 37°C. (E) WB representativo (n=3) de la inhibición por rivaroxabán de la generación de FVIIIa por FXa WT o mutante V17M en reacciones como en (D).

Figura 25 ilustra experimentos de deposición de plaquetas y fibrina. (A) Deposición de plaquetas y fibrina en experimentos como en la Fig. 23 pero con rTF inmovilizado en las concentraciones de recubrimiento indicadas. C (n=9), controles; W (n=12), tratamiento con warfarina (INR promedio 2.6); R (n=10), tratamiento con rivaroxaban (concentración plasmática promedio 312 nM 2 horas después de la ingesta). (B) Perfusión como en (A) pero durante 2 min usando sangre sin -C- o con rivaroxaban -R- y/o anti-FVIII MoAb (n=3). Los resultados -cuantificados en áreas 4.65 veces más grandes que en (A)- se muestran como barras de percentiles 25 a 75 con bigotes mínimo/máximo (A) o barras mínimo/máximo (B) y una línea en la mediana. *P<0.05, **P<0.01, ***P<.,001 evaluados mediante ANOVA unidireccional y prueba posterior de Tukey. (C) Imágenes confocales representativas (lado = 312 μm) de superficies analizadas que muestran plaquetas/leucocitos (verde), fibrina (rojo) y colocalización (amarillo).

Figura 26 ilustra la perfusión de sangre-sangre con citrato recalcificado de controles normales (n =25) y pacientes tratados con warfarina (n =15), rivaroxabán (n =15) o dabigatrán (n =10) sobre colágeno fibrilar tipo I durante 5 minutos en la rata de cizallamiento de la pared de 300 s-1. El volumen de agregados plaquetarios y fibrina depositada se midió mediante microscopía confocal. Análisis estadístico mediante ANOVA unidireccional y posprueba de Tukey. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

Figura 27 ilustra la perfusión de sangre citratada recalcificada sobre superficies recubiertas con rTF, como se indica. (A) Volumen de agregados plaquetarios. (B) Volumen de fibrina depositada. Para ensayos en superficies recubiertas con rTF 20 o 40 pM, el número de muestras analizadas fue, respectivamente: controles normales 22, 14; warfarina 12, 13; rivaroxabán 28, 14; dabigatrán 27, 11.

Descripción detallada

A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Hornyak, et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7ma ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2013); ySambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012), proporcionan a los expertos en la técnica una guía general de muchos de los términos utilizados en la presente solicitud. Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" puede ser un vertebrado, tal como un mamífero, un pez, un pájaro, un reptil o un anfibio. Así, el objeto de la presente divulgación puede ser un ser humano, un primate no humano, un caballo, un cerdo, un conejo, un perro, una oveja, una cabra, una vaca, un gato, un conejillo de indias o un roedor. El término no denota una edad o sexo en particular. Así, se pretende que queden cubiertos los sujetos adultos y recién nacidos, así como los fetos, ya sean varones o mujeres. En un aspecto, el sujeto es un mamífero.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "paciente" se refiere a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno. El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios. En algunos aspectos de los métodos divulgados, al sujeto se le ha diagnosticado la necesidad de tratamiento para un trastorno sanguíneo y enfermedades relacionadas que incluyen, entre otras, un trastorno de hemorragia, tal como, por ejemplo, hemofilia A (deficiencia de factor VIII), hemofilia B (deficiencia de factor IX), enfermedad de Von Willebrand y deficiencias de factores poco comunes, incluyendo los factores I, II, V, VII, X, XI, XII y XIII, etc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "FVIII:C" contempla la actividad coagulante del FVIII plasmático. En algunos ejemplos, el término FVIII:C puede referirse a la concentración de FVIIIa en plasma. En algunos ejemplos, el término FVIII:C puede referirse a la función procoagulante del FVIII. Como se describe a lo largo de esta divulgación, se divulga una vía de activación de FVIII previamente desconocida, en la que el procofactor de FVIII se convierte en cofactor activo de FVIIIa independientemente de la activación por retroalimentación de FIIa. En algunos ejemplos, el FVIII:C se puede medir como se describe en los ejemplos, ensayos, métodos y kits de esta divulgación. En algunos ejemplos de esta divulgación, los pacientes con hemofilia se han clasificado en tres categorías con base en la actividad coagulante del FVIII en plasma (FVIII:C): grave si el nivel de FVIII:C es inferior a 1 IU/dL; moderado si el nivel de FVIRC está entre 1 IU/dL y 5 IU/dL; y leve si el nivel de FVIII:C es superior a 5 IU/dL.

Como se usan en el presente documento, los términos "Factor IIa", "FIIa" y "Trombina Generada" (TG), usados indistintamente en el presente documento, se refieren a una enzima en el plasma sanguíneo que provoca la coagulación de la sangre al convertir el fibrinógeno en fibrina. TG también puede referirse a la cantidad de trombina generada como resultado de los ensayos divulgados en el presente documento.

Como se describe en el presente documento, los inventores han desarrollado diversos ensayos y métodos que pueden usarse para evaluar la coagulación sanguínea en un sujeto. Los inventores han desvelado una nueva vía de iniciación de la coagulación en la que el complejo TF-FVIIa-FXa naciente activa directamente el FVIII aparte de la retroalimentación de trombina. La activación directa de la vía intrínseca por TF puede preservar la hemostasia bajo terapia anticoagulante orientada a la amplificación de trombina.

En el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona un ensayo rápido y altamente sensible para medir la trombina generada (TG) en una muestra de sangre, que comprende: incubar la muestra de sangre con factor tisular (TF), FIXa y CaCh por hasta 5 minutos; y medir<t>G en la muestra de sangre usando HD-ciclohexil-alanil-alanil-argininil-amidometilcumarina (AMC) y/o butiloxicarbonil-valil-prolinil-argininil-AMC (VPR-AMC). En una realización, el ensayo comprende además terminar la reacción en el paso (a) mediante la adición de EDTA. En una realización, la cantidad de TF agregada a la muestra de sangre está entre 1 pM y 1 fM. En una realización, la cantidad de FIXa añadida a la muestra de sangre está entre 1 uM y 1 pM. En una realización, la cantidad de CaCl2 agregado a la muestra de sangre está entre 1 mM y 999 mM. En una realización, la muestra de sangre es de un paciente con hemofilia grave. En una realización, el<t>F es factor tisular recombinante (rTF). En un ejemplo, el ensayo es muy sensible y tiene un límite de detección de TG de aproximadamente 5 pM. En una realización, el ensayo predice el riesgo de hemorragia y trombogénesis en un paciente. En una realización, el ensayo se puede completar en 10 minutos. En un ejemplo, el ensayo comprende además determinar el nivel de FVIII en la muestra de sangre. En una realización, el ensayo es útil para identificar variantes de FVIII con funcionalidad mejorada y/o estabilidad aumentada. En una realización, el ensayo es útil para cribar nuevos agentes hemostáticos.

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un ensayo para determinar el riesgo de hemorragia en un sujeto, que comprende:

obtener una muestra de sangre del sujeto; añadir a la muestra de sangre factor tisular (TF) y/o factor IXa (FIXa); determinar la cantidad de factor VIII de coagulación (FVIII:C) en la muestra de sangre; y determinar (a) un riesgo de hemorragia leve en el sujeto si la cantidad de FVIII:C en la muestra es >5 IU/dL, (b) un riesgo de hemorragia moderado en el sujeto si la cantidad de FVIRC en la muestra es 1-5 IU/dL, y (c) un riesgo de hemorragia grave en el sujeto si la cantidad de FVIRC en el sujeto es < 1 IU/dL. En un ejemplo, el ensayo es capaz de discriminar el riesgo de hemorragia moderado del grave. En un ejemplo, la cantidad de TF añadida a la muestra de sangre es de 1 fM a 1 pM. En un ejemplo, la cantidad de FIXa añadida a la muestra de sangre es de 1 pM a 1 nM. En un ejemplo, el ensayo comprende además medir la activación del FVIII utilizando el anticuerpo monoclonal 12C7, cuando la generación de FXa libre disminuye. En un ejemplo, el ensayo comprende además agregar el mutante T99Y de FVII a la muestra y medir la activación del FVIII cuando disminuye la generación de FXa libre. En otro ejemplo, el ensayo comprende además agregar el mutante E 154A de FVII a la muestra y medir la activación del FVIII cuando disminuye la generación de FXa libre. En un ejemplo, el ensayo permite diferenciar la activación de los cofactores FVIII y FV. En un ejemplo, el límite de detección de la cantidad de FVIII:C es 0.1 IU/dL o menos. En un ejemplo, se añaden TF y FIXa a la muestra de sangre individual simultáneamente. En un ejemplo, el TF está en forma relipidada. En un ejemplo, al sujeto se le ha diagnosticado previamente hemofilia A grave. En un ejemplo, al sujeto se le ha diagnosticado previamente deficiencia adquirida de FVIII. En un ejemplo, el ensayo comprende además una caracterización precisa de fenotipos de hemorragia. En un ejemplo, la evaluación de los niveles de coagulación sanguínea es parte de un régimen de tratamiento general para pacientes con hemofilia A grave. En un ejemplo, evaluar los niveles de coagulación sanguínea es parte de una terapia de reemplazo general con productos de FVIII. En un ejemplo, el ensayo determina los niveles de FVIII:C en pacientes con hemofilia grave con una sensibilidad al menos 10 veces mayor que los métodos actualmente disponibles. En un ejemplo, el ensayo es útil para monitorizar el tratamiento con concentrados de FVIII y para evaluar la potencia del concentrado. En una realización, el ensayo comprende además identificar variantes de FVIII con funcionalidad mejorada y/o estabilidad aumentada. En una realización, el ensayo comprende además cribar nuevos agentes hemostáticos con eficacia y seguridad mejoradas para el tratamiento de la hemofilia A. En un ejemplo, el ensayo es útil para diseñar nuevos métodos y kits para monitorizar la seguridad y eficacia de la terapia antitrombótica para pacientes individuales. En un ejemplo, el ensayo es útil para identificar y caracterizar nuevos agentes antitrombóticos con eficacia terapéutica mejorada. En un ejemplo, el ensayo es útil para identificar y caracterizar nuevos agentes antitrombóticos con impacto reducido para la hemostasia. En un ejemplo, el ensayo reduce las complicaciones hemorrágicas potencialmente mortales, tales como la hemorragia intracraneal espontánea o postraumática. En una realización, el ensayo es útil para identificar nuevos agentes hemostáticos con eficacia y seguridad mejoradas. En un ejemplo, el sujeto tiene deficiencias congénitas o adquiridas de FVIII y FIX.

En un ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, miden la contribución relativa de TF-FVIIa-FXa nativo a la generación de cofactor de FVIIIa activo a diferencia de la activación de FVIIIa por FXa libre o el bucle de retroalimentación de trombina. En un ejemplo, el ensayo activa el FVIII, pero no el FV, y lo hace sin requerir la generación inicial de trombina. En un ejemplo, en donde el FXa libre activa FV a FVa. Por lo tanto, los formatos de ensayo descritos en el presente documento pueden medir en una muestra de plasma o sangre la contribución relativa del TF-FVIIa-FXa nativo a la generación del cofactor FVIIIa activo a diferencia de la activación del FVIIIa por el FXa libre o el bucle de retroalimentación de trombina.

TF-FVIIa-FXa "nativo", como se usa en el presente documento, se refiere a la conversión del complejo TF-FVIIa-FX inicial, en el que FX está inactivo, en TF-FVIIa-FXa, en el que FVIIa asociado a TF ha convertido FX en la proteasa activa FXa, pero FXa todavía está asociado con TF-FVIIa. La propiedad única de este complejo, nunca antes reconocida, es la capacidad de activar selectivamente FVIII a FVIIIa mientras escapa a la inhibición por inhibidores fisiológicos y farmacológicos del FXa. En un ejemplo, la importancia de este hallazgo es que el FXa libre, es decir, el FX que ha sido activado por TF-FVIIa, pero liberado del complejo, además del FVIII, activa también el FV a FVa. FVa es el cofactor esencial del complejo protrombinasa (complejo FVa-FXa), esencial para la conversión eficiente de protrombina en trombina, que es el producto final de proteasa activa del sistema de coagulación. La trombina coagula el fibrinógeno y activa las plaquetas, ambos esenciales para la hemostasia normal pero también causantes de trombosis patológica. En condiciones normales, el control mediante inhibidores fisiológicos específicos garantiza el equilibrio que permite que se produzca suficiente trombina en el momento adecuado y en el lugar adecuado para favorecer la hemostasia. La generación incontrolada de trombina se convierte en la causa de la trombosis endovascular en condiciones patológicas. Por tanto, el descubrimiento de una reacción que activa el FVIII, pero no el FV y lo hace sin requerir la generación inicial de trombina y la descripción de métodos sensibles a la aparición de esta reacción es un aspecto importante de la divulgación porque proporciona una evaluación cuantitativa de una vía que puede explicar y evaluar la preservación de la hemostasia en el contexto del uso de anticoagulantes que deben amortiguar la generación de trombina para curar o prevenir la trombosis. Activar FVIII a FVIIIa sin producir FVa al mismo tiempo es un mecanismo que puede sesgar la respuesta de coagulación hacia la hemostasia en lugar de la trombosis. Evaluar cuantitativamente la función relativa de esta vía es importante para establecer el riesgo de hemorragia versus el riesgo de trombosis en individuos no tratados o pacientes que reciben anticoagulantes de diferentes tipos.

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un kit útil para determinar la coagulación sanguínea, que comprende: una composición que comprende factor tisular (TF), factor IXa (FIXa), procoagulante (PL) y/o factor IIa (FIIa), o un equivalente farmacéutico, derivado, análogo y/o sal del mismo. En un ejemplo, el kit comprende además una composición que comprende H-D-ciclohexil-alanil-alanil-argininilamidometilcumarina (AMC) y/o butiloxicarbonil-valil-prolinil-argininil-AMC (V-P-R-AMC). En un ejemplo, el kit comprende además un aparato para determinar niveles de actividad de FVIII:C. En un ejemplo, el kit comprende además un aparato para determinar la cantidad de TG. En un ejemplo, la composición de TF y/o FIXa está en dosificaciones picomolares y/o nanomolares. En un ejemplo, el kit es útil para el diagnóstico individualizado de pacientes con hemofilia. En un ejemplo, el kit es útil para predecir el riesgo de hemorragia en pacientes con defectos congénitos y adquiridos del FVIII:C. En un ejemplo, el kit es útil para la monitorización y evaluación de regimientos antitrombóticos. En un ejemplo, el kit comprende además diagnosticar, controlar y/o monitorizar una enfermedad basándose en el tratamiento de fármacos o una combinación de fármacos.

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para diagnosticar, monitorizar o pronosticar una enfermedad en un paciente, que comprende: obtener una muestra de plasma sanguíneo del paciente; incubar la muestra de sangre con factor tisular (TF), FlXa y/o CaCl2; analizar la muestra para determinar el nivel de FVIII:C y/o trombina generada (TG); y diagnosticar, monitorizar o pronosticar la enfermedad basándose en la cantidad de FVIII:C en la muestra. En un ejemplo, la enfermedad es un trastorno de hemorragia. En un ejemplo, la enfermedad es un trastorno trombótico. En un ejemplo, la enfermedad es un trastorno hemostático. En un ejemplo, el paciente tiene un riesgo de hemorragia leve si la cantidad de nivel de FVIII:C detectada es superior a 5 IU/dL. En un ejemplo, el paciente tiene un riesgo de hemorragia moderado si la cantidad de nivel de FVlRC detectada está entre 1-5 lU/dL. En un ejemplo, el paciente tiene un riesgo de hemorragia grave si la cantidad de nivel de FVIII:C detectada está entre 1- 0.1 lU/dL. En un ejemplo, se administran TF y/o FlXa a la muestra de sangre del paciente en cantidades picomolares o nanomolares. En un ejemplo, el método comprende además un tratamiento adicional mediante la administración de un tratamiento antitrombosis apropiado. En un ejemplo, el método comprende además administrar una combinación de fármacos para el tratamiento de la trombosis. En un ejemplo, el método es útil para lograr un tratamiento individualizado con diferentes anticoagulantes selectivos de objetivos en términos mecanicistas. En un ejemplo, el paciente está recibiendo tratamiento con un anticoagulante. En un ejemplo, el anticoagulante es un anticoagulante oral. En un ejemplo, el ensayo puede detectar niveles bajos de FVIII:C en pacientes con hemofilia A grave. En un ejemplo, el ensayo puede detectar niveles bajos de FVIII:C en individuos con deficiencia adquirida de FVIII. En un ejemplo, los ensayos de actividad del FVIII con mayor sensibilidad permiten una caracterización más precisa de los fenotipos de hemorragia. En un ejemplo, los ensayos de actividad del FVIII con mayor sensibilidad permiten predecir el riesgo de hemorragia en pacientes con hemofilia A grave. En un ejemplo, el ensayo ayuda a identificar variantes del FVIII antihemofílico con ganancia de función y/o mayor estabilidad en la vía de coagulación recientemente identificada, mejorando así la terapia de reemplazo en pacientes con función defectuosa del FVIII antihemofílico.

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para cribar y/o evaluar nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos o prohemostáticos que comprende: proporcionar una muestra de plasma sanguíneo de un paciente; añadir a la muestra de sangre una composición que comprende TF, FlXa y/o CaCl2 y analizar la muestra para determinar el nivel de FVIII:C o el nivel de trombina generada (TG); y cribar y/o evaluar nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos o prohemostáticos basándose en el nivel de FVIII:C o el nivel de trombina generada (TG). En un ejemplo, se añaden t F y FlXa a la muestra de sangre en cantidades picomolares o nanomolares. La evaluación de nuevos agentes antitrombóticos o prohemostáticos puede comprender diseñar o cribar nuevos agentes antitrombóticos o prohemostáticos. Los agentes antitrombóticos o prohemostáticos pueden tener una eficacia terapéutica mejorada. Los agentes antitrombóticos o prohemostáticos pueden tener un perfil de seguridad mejorado. En un ejemplo, la evaluación de nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos se centra específica y cuantitativamente en la preservación funcional o degradación de los cofactores de la coagulación en el contexto de la coagulación iniciada por TF, diferenciando entre vías protrombóticas y prohemostáticas. En una realización, los agentes antitrombóticos o prohemostáticos se evalúan basándose en el mejor perfil de efectos antitrombóticos frente al perfil de seguridad con respecto a las complicaciones hemorrágicas.

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para evaluar la eficacia terapéutica de un anticoagulante, que comprende: proporcionar una muestra de sangre; perfundir la muestra de sangre sobre una superficie recubierta con colágeno o rTF inmovilizado; medir la agregación plaquetaria y el depósito de fibrina en la superficie recubierta con colágeno o rTF inmovilizado; y evaluar la eficacia terapéutica del anticoagulante basándose en el volumen de agregados plaquetarios y/o fibrina depositada. En un ejemplo, el anticoagulante es un coagulante orientado a FXa. En un ejemplo, el anticoagulante es un coagulante orientado a FXa. En un ejemplo, el anticoagulante es heparina (cofactor antitrombina), warfarina (antagonista de la vitamina K), dabigatrán (inhibidor directo de la trombina), rivaroxabán y/o apixabán (dos inhibidores directos del FXa). En un ejemplo, el coagulante es un coagulante dirigido, tal como un aptámero que disminuye el nivel de FXl y, por tanto, la actividad en plasma. En un ejemplo, la perfusión se realiza a una rata de cizallamiento de la pared de 300 s_1 durante 5 minutos.

La terapia antitrombótica segura y eficaz requiere la comprensión de los mecanismos que contribuyen a la trombosis patológica pero que tienen menos impacto en la hemostasia. Como se describe en el presente documento, y de acuerdo con los diversos ejemplos divulgados en el presente documento, los inventores encontraron que el complejo de iniciación de la coagulación del factor tisular extrínseco (TF) puede activar selectivamente el cofactor antihemofílico, FVIII, desencadenando la vía de coagulación intrínseca hemostática independientemente de los bucles de retroalimentación de trombina. En un modelo de ratón con una lesión trombogénica relativamente leve, la activación del FVIII dependiente de TF establece el umbral para la formación de trombos a través del FlXa generado en fase de contacto.In vitro,el FXa asociado establemente con TF-FVlla activa el FVIII, pero no el FV Además, el producto FXa naciente de TF-FVlla puede escapar transitoriamente de la cinética lenta de la inhibición de tipo Kunitz por el inhibidor de la vía TF (TFPl) y activa preferentemente FVIII sobre FV. Por lo tanto, TF activa sinérgicamente la generación de trombina dependiente de FlXa independientemente de la activación del cofactor por la trombina. En consecuencia, los mutantes de FVlla deficientes en la generación directa de trombina dependiente de TF, pero que preservan la generación de FVIIIa por el FXa naciente, pueden apoyar la coagulación de la vía intrínseca. Enex-vivoen la sangre que fluye, un complejo mutante TF-FVlla con generación alterada de FXa libre pero que activa tanto FVIII como FlX apoya la formación eficiente de trombos dependientes de FVIII. Por lo tanto, una vía iniciada por TF previamente no reconocida que produce directamente el complejo de tenasa intrínseca FVIIIa-FlXa puede ser prohemostática antes de que una mayor amplificación de la coagulación mediante bucles de retroalimentación dependientes de trombina aumente el riesgo de trombosis.

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para evaluar la coagulación sanguínea en un sujeto hemofílico, que comprende agregar una dosificación eficaz de una composición que comprende factor tisular (TF) y/o factor IXa (FIXa) a una muestra de sangre obtenida de un individuo y analizar la muestra para determinar los niveles del factor de coagulación VIII (FVIII:C). El método es capaz de discriminar el riesgo de hemorragia moderada del grave resultante de niveles de FVIII:C en el intervalo de -1-0,1 IU/dL, ya que el riesgo de hemorragia grave surge cuando el FVIII:C es < 1 IU/dL, el riesgo de hemorragia moderada surge cuando el FVIII:C es de 1 a 5 IU/dL y surge un riesgo de hemorragia leve cuando el FVIII:C es >5 IU/dL. En un ejemplo, el método es capaz de discriminar el riesgo de hemorragia moderado del riesgo de hemorragia grave resultante de niveles de FVIII:C en el intervalo de 1-0,1 IU/dL. En algunos ejemplos, TF y FIXa se añaden simultáneamente a la muestra de sangre del paciente. En algunos ejemplos, el TF está en forma relipidada. En algunos ejemplos, se añaden TF y FIXa al plasma del paciente (PRP o PPP). En algunos ejemplos, TF y FIXa se añaden en cantidades picomolares o nanomolares. En un ejemplo, el método se utiliza en pacientes con hemofilia A grave. En algunos ejemplos, el método<se utiliza en pacientes con deficiencia adquirida de f>VII.<En algunos ejemplos, el método permite una caracterización>más precisa de los fenotipos de hemorragia. En algunos ejemplos, el método es útil para predecir el riesgo de hemorragia en pacientes con hemofilia A grave. En un ejemplo, el método mejora la terapia de reemplazo con productos de FVIII. En algunos ejemplos, el método determina los niveles de FVIII:C en pacientes con hemofilia grave con una sensibilidad al menos 10 veces mayor. En algunos ejemplos, el método es útil para monitorizar el tratamiento con concentrados de FVIII y para evaluar la potencia del concentrado. En algunas realizaciones, el método comprende además identificar variantes de FVIII con funcionalidad mejorada y/o estabilidad aumentada. En algunas realizaciones, el método comprende además cribar nuevos agentes hemostáticos con eficacia y seguridad mejoradas para el tratamiento de la hemofilia A u otros trastornos de hemorragia. En algunos ejemplos, el método es útil para diseñar nuevos métodos y kits para monitorizar la seguridad y eficacia de la terapia antitrombótica para pacientes individuales. En algunos ejemplos, el método es útil para identificar y caracterizar nuevos agentes antitrombóticos con eficacia terapéutica mejorada. En algunos ejemplos, el método es útil para identificar y caracterizar nuevos agentes antitrombóticos con impacto reducido para la hemostasia. En algunos ejemplos, el método reduce las complicaciones hemorrágicas potencialmente mortales, tales como la hemorragia intracraneal espontánea o postraumática. En algunos ejemplos, el método es útil para identificar nuevos agentes hemostáticos con eficacia y seguridad mejoradas. En algunos de estos ejemplos, el paciente tiene deficiencias congénitas o adquiridas de FVIII y FIX (hemofilia).

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para evaluar la coagulación sanguínea en un sujeto, que comprende: obtener una muestra de sangre adecuada de un sujeto; añadir a la muestra individual las concentraciones prescritas de factor tisular (TF) y/o factor IXa (FIXa); y analizar la muestra para determinar los niveles del factor VIII de coagulación (FVIII:C), en donde surge un riesgo de hemorragia leve cuando el FVIII:C es >5 IU/dL; el riesgo de hemorragia moderado surge cuando el FVIII:C es de 1 a 5 IU/dL; y el riesgo de hemorragia grave surge cuando el FVIII:C es < 1 IU/dL. Por lo tanto, el ensayo es capaz de discriminar el riesgo de hemorragia moderado de grave resultante de niveles de FVIII:C en el intervalo de -1-0.1 IU/dL. En algunos de estos ejemplos, el uso del anticuerpo monoclonal 12C7 y cualquier equivalente de la mutación T99Y permite medir la activación del FVIII cuando disminuye la generación de FXa libre. En algunos ejemplos, el método permite diferenciar la activación de los cofactores FVIII y FV En algunos ejemplos, el uso del anticuerpo monoclonal 12C7 permite medir la activación del FVIII cuando disminuye la generación de FXa libre. En algunos ejemplos, el uso del mutante T99Y de FVII, o cualquier equivalente del mismo, permite medir la activación de FVIII cuando disminuye la generación de FXa libre. En algunos ejemplos, el mutante T99Y de FVII, o cualquier equivalente del mismo, se usa para evaluar bucles de FXI similares a formatos de ensayo con anticuerpo monoclonal 12C7.

Se divulga además en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un ensayo para superar la unión del FVII en sangre a TF que comprende (a.) obtener una muestra de sangre de un individuo; (b) añadir un mutante del factor de coagulación VlIa en una concentración elevada; y (c) la unión del FVII en sangre a TF. En algunos ejemplos, el mutante del factor de coagulación Vlla es E154A o un mutante similar que realiza una función sustancialmente similar.

Se describe además en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para evaluar nuevos candidatos a fármacos hemostáticos que comprende: (a) iniciar TG en reacciones iniciadas por TF con el anticuerpo monoclonal 12C7 presente; (b) determinar que TG es ineficaz en presencia de 12C7; (c) añadir el candidato a fármaco hemostático; y (d) evaluar que el candidato a fármaco hemostático es eficaz si complementa las TG ineficaces en reacciones iniciadas por TF con 12C7 presente.

Como se describe adicionalmente en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, los inventores han desarrollado diversos dispositivos y aparatos que pueden usarse para la evaluación de la coagulación sanguínea. Por ejemplo, en un ejemplo, la presente divulgación proporciona un dispositivo para evaluar la coagulación sanguínea, que comprende un aparato adaptado para la medición de uno o más niveles de FVIII:C de una muestra. En otro ejemplo, TF y FIX se pueden administrar en cantidades picomolares o nanomolares. En algunos ejemplos, el dispositivo es útil para el diagnóstico individualizado de pacientes con hemofilia. En algunos ejemplos, el dispositivo es útil para predecir el riesgo de hemorragia en pacientes con defectos congénitos y adquiridos del FVIII:C.

En otro ejemplo, la presente divulgación, pero no parte de la invención reivindicada, proporciona una composición farmacéutica, que comprende una cantidad de una composición que comprende TF y/o FIXa, o un equivalente farmacéutico, derivado, análogo y/o sal del mismo, y una vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento también pueden comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable. "Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil para preparar una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y deseable, e incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario, así como para uso farmacéutico humano. Dichos excipientes pueden ser sólidos, líquidos, semisólidos o, en el caso de una composición de aerosol, gaseosos.

En diversos ejemplos, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación se pueden formular para su administración mediante cualquier ruta de administración. "Ruta de administración" puede referirse a cualquier vía de administración conocida en la técnica, incluyendo, entre otras, aerosol, nasal, oral, transmucosa, transdérmica o parenteral. "Parenteral" se refiere a una ruta de administración que generalmente está asociada con inyección, incluyendo intraorbitaria, infusión, intraarterial, intracapsular, intracardíaca, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal, intrauterina, intravenosa, subaracnoidea, subcapsular, subcutánea, transmucosa o transtraqueal. Por ruta parenteral, las composiciones pueden presentarse en forma de soluciones o suspensiones para infusión o inyección, o como polvos liofilizados.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación también pueden contener cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable. "Vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable que participa en el transporte de un compuesto de interés desde un tejido, órgano o porción del cuerpo a otro tejido, órgano o porción del cuerpo. Por ejemplo, el vehículo puede ser una carga, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante líquido o sólido, o una combinación de los mismos. Cada componente del vehículo debe ser "farmacéuticamente aceptable" en el sentido de que debe ser compatible con los demás ingredientes de la formulación. También debe ser apto para su uso en contacto con cualquier tejido u órgano con el que pueda entrar en contacto, es decir, que no debe conllevar riesgo de toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad o cualquier otra complicación que supere excesivamente sus beneficios terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación también pueden encapsularse, comprimirse o prepararse en una emulsión o jarabe para administración oral. Se pueden añadir vehículos sólidos o líquidos farmacéuticamente aceptables para mejorar o estabilizar la composición, o para facilitar la preparación de la composición. Los vehículos líquidos incluyen jarabe, aceite de maní, aceite de oliva, glicerina, solución salina, alcoholes y agua. Los vehículos sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato de calcio, dihidrato, terra alba, estearato de magnesio o ácido esteárico, talco, pectina, acacia, agar o gelatina. El vehículo también puede incluir un material de liberación sostenida tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o con una cera.

Las preparaciones farmacéuticas se elaboran siguiendo las técnicas convencionales de farmacia que implican molienda, mezcla, granulación y compresión, cuando sea necesario, para formas de tabletas; o molienda, mezcla y llenado para formas de cápsulas de gelatina dura. Cuando se utiliza un vehículo líquido, la preparación estará en forma de jarabe, elixir, emulsión o suspensión acuosa o no acuosa. Dicha formulación líquida se puede administrar directamente por vía oral. o rellenar una cápsula de gelatina blanda.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente divulgación se pueden administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad terapéuticamente eficaz precisa es aquella cantidad de la composición que producirá los resultados más eficaces en términos de eficacia del tratamiento en un sujeto determinado. Esta cantidad variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo, entre otros, las características del compuesto terapéutico (incluyendo actividad, farmacocinética, farmacodinamia y biodisponibilidad), la condición fisiológica del sujeto (incluyendo edad, sexo, tipo de enfermedad y estadio), condición física general, capacidad de respuesta a una dosificación determinada y tipo de medicamento), la naturaleza del vehículo o vehículos farmacéuticamente aceptables en la formulación y la ruta de administración. Un experto en las técnicas clínicas y farmacológicas podrá determinar una cantidad terapéuticamente eficaz mediante experimentación rutinaria, por ejemplo, monitorizando la respuesta de un sujeto a la administración de un compuesto y ajustando la dosificación en consecuencia. Para obtener orientación adicional, véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed. 21.a edición, Williams & Wilkins PA, EE. UU.) (2005).

Las dosis típicas de una composición eficaz pueden estar en los intervalos recomendados por el fabricante cuando se usan compuestos terapéuticos conocidos, y también como se indica al experto en la técnica por las respuestas in vitro o respuestas en modelos animales. Normalmente, dichas dosificaciones se pueden reducir hasta aproximadamente un orden de magnitud en concentración o cantidad sin perder la actividad biológica relevante. Por tanto, la dosificación real dependerá del criterio del médico, del estado del paciente y de la eficacia del método terapéutico basado, por ejemplo, en la capacidad de respuesta in vitro de las células cultivadas primarias relevantes o de la muestra de tejido histocultivado, tal como tumores malignos biopsiados, o las respuestas observadas en los modelos animales apropiados, como se describió anteriormente.

En diversos ejemplos, también se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método de diagnóstico para monitorizar la terapia antitrombótica en un paciente que comprende: (a) añadir a la muestra de sangre de un paciente individual cantidades prescritas de TF y FlXa; (b) determinar el nivel de FVIII:C en la muestra de sangre del paciente; y (c) monitorizar la terapia antitrombótica en el paciente en función del nivel de FVin:C. En algunos ejemplos, se añaden TF y FlXa a la muestra de sangre del paciente en cantidades picomolares o nanomolares. En algunos ejemplos, el método comprende además administrar un fármaco para el tratamiento de la trombosis. En algunos ejemplos, el método comprende además administrar una combinación de fármacos para el tratamiento de la trombosis. En algunos ejemplos, el método es útil para lograr un tratamiento individualizado con diferentes anticoagulantes selectivos de objetivos en términos mecanicistas.

En diversos ejemplos, se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método de diagnóstico para evaluar el riesgo de causar complicaciones hemorrágicas en un paciente, que comprende: (a) añadir a una muestra de sangre de un paciente individual cantidades prescritas de TF y FlXa; (b) determinar el nivel de FVIII:C en el paciente; y (c) evaluar el riesgo de causar complicaciones hemorrágicas en el paciente con base en el nivel de FVIII:C. En algunos de estos ejemplos, se añaden TF y FlXa a la muestra de sangre del paciente en cantidades picomolares o nanomolares.

En diversos ejemplos, se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para evaluar nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos o prohemostáticos que comprende: (a) añadir a la muestra de sangre individual de un paciente que lo necesite, cantidades prescritas de TF y FlXa; (b) determinar el nivel de FVIII:C en el paciente; y (c) evaluar nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos o prohemostáticos con base en el nivel de FVIII:C. En algunos de estos ejemplos, se añaden TF y FlXa a la muestra de sangre del paciente en cantidades picomolares o nanomolares. En algunos ejemplos, evaluar nuevos agentes antitrombóticos o prohemostáticos comprende diseñar o cribar nuevos agentes antitrombóticos o prohemostáticos. En algunas realizaciones, los agentes antitrombóticos o prohemostáticos tienen una eficacia terapéutica mejorada. En algunas realizaciones, los agentes antitrombóticos o prohemostáticos tienen un perfil de seguridad mejorado. En algunos ejemplos, la evaluación de nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos se centra específica y cuantitativamente en la preservación funcional o degradación de los cofactores de la coagulación en el contexto de la coagulación iniciada por TF, diferenciando entre vías protrombóticas y prohemostáticas. En algunas realizaciones, los agentes antitrombóticos o prohemostáticos se evalúan con base en el mejor perfil de efectos antitrombóticos frente al perfil de seguridad con respecto a las complicaciones hemorrágicas.

En diversos ejemplos, se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un ensayo para determinar el riesgo trombótico o hemostático en un paciente que comprende (a) añadir a una muestra de sangre de un paciente individual cantidades prescritas de TF y FlXa; (b) medir el nivel de FVln:C en la muestra de sangre del paciente; y (c) determinar el riesgo trombótico o hemostático en el paciente basándose en el nivel de FVln:C. En algunas realizaciones, se añaden TF y FlXa a la muestra de sangre del paciente en cantidades picomolares o nanomolares. En algunos ejemplos, el paciente está en tratamiento con fármacos anticoagulantes. En algunos ejemplos, el anticoagulante es un anticoagulante oral. En algunos ejemplos, el ensayo puede detectar niveles bajos de FVlRC en pacientes con hemofilia A grave. En algunos ejemplos, el ensayo puede detectar niveles bajos de FVIII:C en individuos con deficiencia adquirida de FVlll. En algunos ejemplos, los ensayos de actividad del FVIII con mayor sensibilidad permiten una caracterización más precisa de los fenotipos de hemorragia. En algunos ejemplos, los ensayos de actividad del FVIII con mayor sensibilidad permiten predecir el riesgo de hemorragia en pacientes con hemofilia A grave. En algunos ejemplos, el ensayo ayuda a identificar variantes del FVIII antihemofílico con ganancia de función y/o mayor estabilidad en la vía de coagulación recientemente identificada, mejorando así la terapia de reemplazo en pacientes con función defectuosa del FVIII antihemofílico.

En diversos ejemplos, en el presente documento se divulga una nueva vía de coagulación en la que el FXa naciente, formado por TF-FVlla, activa directamente el FVIII independientemente de las reacciones de retroalimentación de la trombina. En diversos ejemplos, en el presente documento se divulga una composición que comprende: (a) Factor tisular (TF) y (b) Factor lXa (FlXa), en donde la composición es capaz de desencadenar la generación de trombina cuando se administra en el plasma de un individuo. En algunos ejemplos de esta composición, el individuo es un paciente de hemofilia.

En diversos ejemplos, también se describe en el presente documento una vía en el inicio de la formación de trombos in vivo con amplia importancia para la trombosis y la hemostasia. En algunas realizaciones, este nuevo mecanismo permite mejores enfoques de diagnóstico para monitorizar la terapia antitrombótica y el diseño de nuevos agentes hemostáticos con eficacia terapéutica mejorada. En algunos ejemplos, en el presente documento se divulga una nueva función del complejo de iniciación de la coagulación del factor tisular (TF) para proporcionar factor Xa generado de novo que conduce a la activación de los procofactores de coagulación FV y FVIII en la trombosis. En algunos ejemplos, la generación del cofactor de proteasa FVIIIa necesario para la hemostasia se conserva en presencia de anticoagulantes utilizados clínicamente con perfiles de seguridad favorables. En una realización, se divulgan nuevos ensayos para la identificación de variantes de FVIII y FV antihemofílicos con funcionalidad mejorada en esta vía y utilidad para la terapia de reemplazo. En otro ejemplo, en el presente documento se divulgan nuevos ensayos para la evaluación de fármacos antitrombóticos con eficacia beneficiosa para los perfiles de seguridad. En otros ejemplos más, en el presente documento se divulgan nuevos ensayos para monitorizar la terapia antitrombótica con base en la preservación funcional o degradación de cofactores de coagulación en el contexto de la coagulación iniciada por TF. En algunos ejemplos, los nuevos enfoques de descubrimiento de fármacos y los principios de diagnóstico divulgados en el presente documento son aplicables a grandes poblaciones de pacientes bajo terapia antitrombótica y/o que necesitan terapia hemostática.

En diversos ejemplos, el nuevo mecanismo en el proceso de coagulación como se divulga en el presente documento proporciona un método hasta ahora desconocido para identificar y medir diferencialmente la función de las vías de coagulación protrombótica y prohemostática y, en consecuencia, los distintos efectos de los inhibidores. En algunos ejemplos, la presente divulgación presenta nuevos métodos de diagnóstico para monitorizar la terapia antitrombótica en pacientes individuales, proporcionando parámetros cuantitativos que definen claramente el nivel de efecto antitrombótico y el riesgo de causar complicaciones hemorrágicas. En algunas realizaciones, este nuevo mecanismo puede guiar el proceso de diseño y/o cribado de nuevos agentes antitrombóticos o prohemostáticos con eficacia terapéutica y perfil de seguridad mejorados.

En diversos ejemplos se divulgan en el presente documento novedosos ensayos de coagulación que individualizan la definición de riesgo trombótico y de hemorragia para pacientes tratados con nuevos anticoagulantes orales. En algunos ejemplos, los ensayos descritos en el presente documento identifican objetivamente situaciones que requieren ajuste de dosis para un mejor efecto antitrombótico o para reducir la posibilidad de complicaciones hemorrágicas. En algunos ejemplos, la divulgación proporciona nuevas perspectivas relevantes para la identificación y prueba de nuevos enfoques farmacológicos para la prevención y el tratamiento de la trombosis preservando al mismo tiempo una función hemostática suficiente.

En diversos ejemplos, en el presente documento se describe una vía en el inicio de la formación de trombos in vivo con amplia importancia para la trombosis y la hemostasia. En diversos ejemplos, la presente divulgación divulga una nueva función del complejo de iniciación de la coagulación extrínseca, concretamente proporcionar activación por proalimentación selectiva del cofactor antihemofílico, FVIII, independientemente de los bucles de retroalimentación de trombina (Fig. 1).

En un ejemplo, lo que se divulga en el presente documento es que el complejo de iniciación de la vía TF activa directamente los cofactores de coagulación clave del FVIII que permiten la generación de proteasa procoagulante iniciada en la fase de contacto (CP) o FXIa. En algunos ejemplos, la inhibición ineficaz de TFPI de la activación del cofactor FVIII permite la producción continua de trombina a través de la vía intrínseca cuando la generación de proteasas a través del inicio de la vía extrínseca está fisiológicamente limitada. En algunos ejemplos, como TFPI, el fármaco anticoagulante dirigido por FXa, rivaroxabán, reduce la generación de trombina mediada por TF al tiempo que preserva la activación del FVIII. En un ejemplo, el escape selectivo del control fisiológico de los TFPI permite el rescate de la generación de trombina dependiente de la vía intrínseca y puede explicar la reducción de las complicaciones hemorrágicas mortales en pacientes tratados con rivaroxabán. En algunos ejemplos, este mecanismo de coagulación alternativo define una nueva sinergia TF y CP (vía intrínseca) en la trombosis y tiene amplias implicaciones para el desarrollo de agentes antitrombóticos y hemostáticos mejorados.

En diversos ejemplos, aquí se divulgan experimentos, métodos y resultados que muestran que el FXa naciente generado por el complejo TF-FVIIa activa el cofactor de la vía intrínseca, FVIII, directa e independientemente de los bucles de retroalimentación de trombina. Este mecanismo alternativo que conduce a la generación de trombina evade el control fisiológico del inhibidor de la vía TF (TFPI), así como los inhibidores farmacológicos directos del FXa. En consecuencia, estos fármacos anticoagulantes, a diferencia de los antagonistas de la vitamina K, preservan la formación de fibrina a través del complejo antihemofílico FVIIIa-FIXa cuando las funciones protrombóticas de la vía extrínseca del TF son limitadas. La resistencia a la inhibición del FXa explica cómo este nuevo enlace en la coagulación promueve la formación de coágulos y previene la hemorragia en sitios vulnerables incluso en presencia de concentraciones terapéuticas de anticoagulantes dirigidos al FXa. La presente divulgación proporciona nuevas perspectivas para mejorar la eficacia antitrombótica y al mismo tiempo limitar las consecuencias negativas sobre la hemostasia, así como para la evaluación personalizada del riesgo de hemorragia durante la terapia anticoagulante.

La presente divulgación, pero no forma parte de la invención reivindicada, también está dirigida a un kit que comprende TF y FIXa. Por ejemplo, En diversos ejemplos descritos en el presente documento, la presente divulgación proporciona un kit para determinar la actividad de FVIII:C en un individuo, que comprende TF y FIXa, en el que se pueden administrar cantidades terapéuticamente eficaces de TF y FIXa en el plasma del individuo para determinar actividad de FVIn:C. en el intervalo de 1-0.11 U/dL. En algunos de estos ejemplos, TF y FIXa se administran en el plasma del individuo en cantidades picomolares o nanomolares. En algunos ejemplos, el kit es útil para el diagnóstico individualizado de pacientes con hemofilia. En algunos ejemplos, el kit es útil para predecir el riesgo de hemorragia en pacientes con defectos congénitos y adquiridos del FVIII:C. En algunos ejemplos, el kit es útil para la monitorización y evaluación de regimientos antitrombóticos. En algunos ejemplos, el diagnóstico, monitorización o evaluación se basa en nuevos fármacos o en una combinación de fármacos.

En diversos ejemplos, el kit es útil para practicar el método inventivo de tratamiento, diagnóstico o cribado de nuevos fármacos para la hemofilia y la antitrombosis. El kit es un ensamblaje de materiales o componentes, que incluye al menos una de las composiciones inventivas. Por tanto, en algunos ejemplos el kit contiene una composición que incluye TF y FIXa, como se describió anteriormente.

La naturaleza exacta de los componentes configurados en el kit inventivo depende de su propósito previsto. Por ejemplo, algunos ejemplos están configurados con el propósito de diagnóstico y tratamiento individualizados de pacientes con hemofilia. En un ejemplo, el kit está configurado particularmente con el fin de tratar sujetos mamíferos. En otro ejemplo, el kit está configurado particularmente con el fin de tratar sujetos humanos. En ejemplos adicionales, el kit está configurado para aplicaciones veterinarias, tratando sujetos tales como, entre otros, animales de granja, animales domésticos y animales de laboratorio.

Las instrucciones de uso pueden estar incluidas en el kit. Las "instrucciones de uso" normalmente incluyen una expresión tangible que describe la técnica que se empleará al usar los componentes del kit para lograr un resultado deseado, tal como diagnosticar o tratar a pacientes con hemofilia. Opcionalmente, el kit también contiene otros componentes útiles, tales como diluyentes, tampones, vehículos farmacéuticamente aceptables, jeringas, catéteres, aplicadores, herramientas de pipeteo o medición, materiales para vendajes u otra parafernalia útil que los expertos en la técnica reconocerán fácilmente.

Los materiales o componentes ensamblados en el kit se pueden proporcionar al médico almacenados de cualquier manera conveniente y adecuada que preserve su operatividad y utilidad. Por ejemplo, los componentes pueden estar en forma disuelta, deshidratada o liofilizada; se pueden proporcionar a temperatura ambiente, refrigerada o congelada. Los componentes normalmente están contenidos en materiales de embalaje adecuados. Tal como se emplea en el presente documento, la frase "material de embalaje" se refiere a una o más estructuras físicas utilizadas para alojar el contenido del kit, tales como composiciones inventivas y similares. El material de embalaje se construye mediante métodos bien conocidos, preferiblemente para proporcionar un entorno estéril y libre de contaminantes. Los materiales de embalaje empleados en el kit son los habitualmente utilizados en el campo médico. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "embalaje" se refiere a una matriz o material sólido adecuado tal como vidrio, plástico, papel, lámina y similares, capaz de contener los componentes individuales del kit. Así, por ejemplo, un embalaje puede ser un vial de vidrio usado para contener cantidades adecuadas de una composición inventiva que contiene TF y FIXa y anticuerpos monoclonales o proteínas mutantes que influyen en la activación de la vía hemostática. El material de embalaje generalmente tiene una etiqueta externa que indica el contenido y/o propósito del kit y/o sus componentes.

Hay muchas técnicas disponibles en el campo para detectar la presencia o ausencia de polipéptidos u otros biomarcadores, incluyendo microarreglos de proteínas. Por ejemplo, algunos de los paradigmas de detección que pueden emplearse para este fin incluyen métodos ópticos, métodos electroquímicos (técnicas de voltametría y amperometría), microscopía de fuerza atómica y métodos de radiofrecuencia, por ejemplo, espectroscopia de resonancia multipolar. Son ilustrativos de métodos ópticos, además de la microscopía, tanto confocal como no confocal, la detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia y birrefringencia o índice de refracción (por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, elipsometría, un método de espejo resonante, un método de guía de ondas acoplador de rejilla o interferometría).

De manera similar, existen numerosas técnicas que pueden emplearse para aislar y/o fraccionar biomarcadores. Por ejemplo, se puede capturar un biomarcador usando reactivos de captura bioespecíficos, tales como anticuerpos, aptámeros o anticuerpos que reconocen el biomarcador y sus formas modificadas. Este método también podría dar como resultado la captura de interactuantes de proteínas que están unidos a las proteínas o que de otro modo son reconocidos por anticuerpos y que, en sí mismos, pueden ser biomarcadores. Los reactivos de captura bioespecíficos también pueden estar unidos a una fase sólida. Luego, las proteínas capturadas pueden detectarse mediante espectrometría de masas SELDI o eludiendo las proteínas del reactivo de captura y detectando las proteínas eludidas mediante MALDI tradicional o SELDI. Un ejemplo de SELDI se llama "espectrometría de masas por captura de afinidad" o "captura de afinidad mejorada en superficie" o "SEAC", que implica el uso de sondas que tienen un material en la superficie de la sonda que captura analitos a través de una interacción de afinidad no covalente (adsorción) entre el material y el analito. Algunos ejemplos de espectrómetros de masas son el de tiempo de vuelo, el de sector magnético, el filtro cuadrupolo, el de trampa de iones, el de resonancia de ciclotrón de iones, el analizador de sector electrostático y los híbridos de estos.

Alternativamente, por ejemplo, la presencia de biomarcadores tales como polipéptidos puede detectarse usando técnicas de inmunoensayo tradicionales. El inmunoensayo requiere reactivos de captura bioespecíficos, tales como anticuerpos, para capturar los analitos. El ensayo también puede diseñarse para distinguir específicamente proteínas y formas modificadas de proteínas, lo que se puede realizar empleando un ensayo intercalado en el que un anticuerpo captura más de una forma y segundos anticuerpos, claramente marcados, se unen específicamente y proporcionan una detección distinta de, las diversas formas. Se pueden producir anticuerpos inmunizando animales con las biomoléculas. Los inmunoensayos tradicionales también pueden incluir inmunoensayos tipo intercalado que incluyen ELISA o inmunoensayos basados en fluorescencia, así como otros inmunoensayos enzimáticos.

Antes de la detección, los biomarcadores también se pueden fraccionar para aislarlos de otros componentes en una solución o en sangre que puedan interferir con la detección. El fraccionamiento puede incluir el aislamiento de plaquetas de otros componentes sanguíneos, el fraccionamiento subcelular de componentes plaquetarios y/o el fraccionamiento de los biomarcadores deseados de otras biomoléculas encontradas en las plaquetas usando técnicas tales como cromatografía, purificación por afinidad, mapeo 1D y 2D y otras metodologías de purificación conocidas por los expertos en la técnica. En un ejemplo, se analiza una muestra mediante un biochip. Los biochips generalmente comprenden sustratos sólidos y tienen una superficie generalmente plana, a la que se une un reactivo de captura (también llamado adsorbente o reactivo de afinidad). Con frecuencia, la superficie de un biochip comprende una pluralidad de ubicaciones direccionables, cada una de las cuales tiene el reactivo de captura unido allí.

De acuerdo con diversos ejemplos en el presente documento, un ejemplo de una secuencia de FVII se ilustra en la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con diversos ejemplos en el presente documento, se ilustran ejemplos de diversos mutantes de FVII en las siguientes referencias: Larsen et al (Journal of Biological Chemistry, 2010); y Pike et al (Proc. Natl. Acad. Sci., Aug 1999); y Shobe et al (Biochemistry, 1999).

Como comprenderá fácilmente un experto en la técnica, también se pueden usar diversos ejemplos en el presente documento junto con varias enfermedades y condiciones, y la presente divulgación no se limita de ninguna manera únicamente al campo de la terapéutica sanguínea o las complicaciones sanguíneas. Se pueden usar diversos ejemplos divulgados en el presente documento, solos o en combinación, para el tratamiento, diagnóstico o pronóstico de otras enfermedades relacionadas con las vías de coagulación descritas en el presente documento. Por ejemplo, en un ejemplo, la divulgación en el presente documento puede usarse para la evaluación, pronóstico, diagnóstico o tratamiento de un tumor, cáncer y otras condiciones relacionadas.

De manera similar, también se pueden usar diversos métodos y dispositivos descritos en el presente documento junto con aparatos adicionales. En un ejemplo, la presente divulgación proporciona un método para evaluar las complicaciones sanguíneas y/o la coagulación junto con uno o más dispositivos de microfluidos.

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no limitan en modo alguno el alcance de la invención, que es de acuerdo con las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1

Tanto la vía de coagulación TF como la CP contribuyen a la trombosis inducida por FeCh

En la vista convencional de la cascada de coagulación, ilustrada en la Fig. 1, la vía extrínseca del TF genera cantidades limitadas de trombina que promueve reacciones de retroalimentación en las que los procofactores plasmáticos solubles, FVIII y FV, se activan junto con el FXI. El FXI activado (FXIa) a su vez escinde FIX en FIXa, que también puede generarse mediante TF-FVIIa. Luego, FIXa amplifica la producción de proteasa procoagulante a través de complejos intrínsecos de tenasa (FVIIIa-FIXa) y protrombinasa (FVa-FXa). Este paradigma explica por qué el FVIIa, y no el FXII, es prohemostático, al igual que la eliminación del control del TFPI en la deficiencia de FVIII. Sin embargo, este paradigma actual no puede explicar el reactivo). Con frecuencia, la superficie de un biochip comprende una pluralidad de ubicaciones direccionables, cada una de las cuales tiene el reactivo de captura unido allí.

De acuerdo con diversos ejemplos en el presente documento, un ejemplo de una secuencia de FVII se ilustra en la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con diversos ejemplos en el presente documento, se ilustran ejemplos de diversos mutantes de FVII en las siguientes referencias: Larsen et al (Journal of Biological Chemistry, 2010); yPike et al (Proc. Natl. Acad. Sci., Aug 1999); y Shobe et al (Biochemistry, 1999).

Los ejemplos de la presente divulgación se describen con más detalle en los siguientes ejemplos. Los ejemplos son meramente ilustrativos y no limitan de ninguna manera el alcance de la invención tal como se reivindica.

Ejemplos

Ejemplo 1

En la vista convencional de la cascada de coagulación, ilustrada en la Fig. 1, la vía extrínseca del TF genera cantidades limitadas de trombina que promueve reacciones de retroalimentación en las que los procofactores plasmáticos solubles, FVIII y FV, se activan junto con el FXI. El FXI activado (FXIa) a su vez escinde FIX en FIXa, que también puede generarse mediante TF-FVIIa. Luego, FIXa amplifica la producción de proteasa procoagulante a través de complejos intrínsecos de tenasa (FVIIIa-FIXa) y protrombinasa (FVa-FXa). Este paradigma explica por qué el FVIIa, y no el FXII, es prohemostático, al igual que la eliminación del control del TFPI en la deficiencia de FVIII. Sin embargo, este paradigma actual no puede explicar por qué la activación de FXI mediada por FXIIa dependiente de polianiones es esencial en la trombosis arterial experimental iniciada por TF.

En diversas realizaciones, la presente divulgación aborda este problema. En una realización, la divulgación en el presente documento confirma a través de diversos experimentos y resultados que las vías de coagulación de TF y CP contribuyen a la trombosis inducida por FeCh en la arteria carótida del ratón al mostrar que un anticuerpo monoclonal (MoAb) que inhibe el 80% de la coagulación dependiente de TF y uno que bloquea la activación del FXI por el FXII previno individualmente la oclusión vascular. En otra realización, se obtuvo un efecto similar combinando concentraciones subumbral de los dos anticuerpos, lo que sugiere que tanto la vía intrínseca como la extrínseca coinciden en generar niveles protrombóticos de proteasas de coagulación en este modelo. En algunos experimentos, experimentosex-vivocon plasma humano recalcificado deficiente en FIX suplementado con plaquetas normales, TF recombinante relipidado (rTF) en una concentración individualmente inactiva mejoraron sinérgicamente la generación de trombina por FIXa. En una realización, este hallazgo demostró que la función cooperativa observada de las vías TF y CP no era consecuencia de bucles de proalimentación directos o indirectos que activaban FIX. Además, en el plasma rico en plaquetas (PRP) normal, FXIIa o FXIa añadido con rTF tuvieron el mismo efecto que FIXa, lo que demuestra que la activación de CP era una vía ascendente para la generación de FIXa. En algunas realizaciones, el sinergismo de las vías de TF y CP implicaba tanto a FVII como a FVIII, y las bajas concentraciones de TFPI presentes en plasma fueron responsables de la supresión de la generación de trombina mediante rTF solo.

Ejemplo 2

Generación de proteasas de coagulación en reacciones con componentes purificados.

En algunas realizaciones, se determinó la generación de proteasas de coagulación en reacciones con componentes purificados. En una realización, de acuerdo con los resultados en plasma, rTF produjo solo FXa y trombina (FIIa) mínimas, pero en combinación con FIXa produjo cantidades superiores a las aditivas de cada proteasa. En algunas realizaciones, la activación de FVIII y FV precedió a la ráfaga de actividad de trombina y, inesperadamente, fue mucho más eficaz en presencia de rTF que FIXa solo. En diversas realizaciones, estos resultados sugirieron la posibilidad de que el complejo de inicio de coagulación extrínseco actuara como un activador directo de cofactores de coagulación derivados del plasma antes de una generación significativa de trombina. De acuerdo con este concepto, el rTF provocó una activación del cofactor dependiente de la dosis en presencia de FVIIa y FX en un sistema simplificado sin protrombina con lepirudina añadida para inhibir la posible contaminación por trazas de trombina. En algunas realizaciones, el FVIII se activó preferentemente a pesar de un exceso molar de 4 veces de FV. En algunas realizaciones, la monitorización de la activación de la protrombina en presencia del inhibidor de la trombina, dansilarginina-N-(3-etil-1,5-pentanodiil)amida (DAPA), mostró que esta nueva vía condujo al ensamblaje de un complejo catalítico de protrombinasa sin contribución por reacciones de retroalimentación de trombina convertidora de cofactor.

En algunas realizaciones, TF-FVIIa solo produjo fragmentos de cofactor inactivos conocidos más pequeños que FVIIIa y FVa, pero la adición de FX produjo cofactores procesados adecuadamente, lo que indica que las escisiones activadoras ocurrieron preferentemente cuando se generó FXa durante la coagulación iniciada por TF. La inhibición del FXa con el péptido anticoagulante de garrapata (TAP) revirtió la reacción para generar fragmentos de degradación. En algunas realizaciones, la proteína anticoagulante de nematodos (NAP) c2, un inhibidor similar a TFPI que previene la activación de FX mediante el bloqueo del sitio activo de FVIIa, no generó estos fragmentos. En algunas realizaciones, NAPc2 no afecta el sitio catalítico de FXa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, en un complejo de TF estabilizado con NAPc2 con FVIIa (iFVIIa) mutado en Serl95Ala inactivo y FXa, solo FXa es una proteasa activa. En una realización, el complejo TF-iFVIIa-FXa-NAPc2 era estable, como lo demuestra el hecho de que carecía de actividad protrombinasa. En una realización, este complejo podría activar el FVIII, aunque no el FV. En diversas realizaciones, estos hallazgos establecen el nuevo concepto de que la activación del cofactor es un evento temprano durante la coagulación iniciada por TF, mediada por FXa generadode novotodavía ensamblado dentro del complejo TF-FVIIa-FXa.

Ejemplo 3

Generación de FVIIIa por el complejo de iniciación de la vía TF

En algunas realizaciones, la generación de FVIIIa mediante el complejo de iniciación de la vía TF es un paso clave en el paradigma de coagulación alternativo aquí divulgado. En algunas realizaciones, este concepto se verificó en reacciones iniciadas simultáneamente por t F y FXIIa. Se descubrió que el FVIIIa preactivado, pero no el procofactor FVIII, evitaba el efecto de rTF-FVIIa sobre la generación de FXa después del inicio de la coagulación por FXIIa o FXIa. Además, en un modelo de ratón en el que la administración simultánea de concentraciones subumbrales de MoAb anti-TF y anti-FXI impidió que la trombosis de la vena femoral inducida por FeCh, la infusión de FVIIIa -pero no de FVIII- restauró la oclusión mediante un trombo rico en fibrina. En algunas realizaciones, FVIIIa no logró revertir el efecto antitrombótico de una dosis más alta de anti-FXI MoAb totalmente inhibidora, estableciendo que FVIIIa actuó solo en la vía de coagulación sinérgica dependiente de CP como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, estos hallazgos respaldan la conclusión de que el FVIIIa se activa en un ambientein vivode forma dinámica por la vía de coagulación extrínseca dependiente de TF regulada fisiológicamente por la inhibición de la retroalimentación mediada por TFPI.

Ejemplo 4

Consecuencias de la regulación negativa del TFPI

En diversas realizaciones, para dilucidar en detalle las consecuencias de la regulación negativa del TFPI, los inventores demostraron que el inhibidor de tripsina de maíz (CTI), que bloquea FXIIa, no tenía ningún efecto sobre la generación de trombina iniciada por TF a menos que se añadiera TFPI. En algunas realizaciones, esto ocurrió incluso cuando TFPI estaba en una concentración que, por sí sola, tenía un efecto mínimo en el sistema de ensayo de plasma estático utilizado. En algunas realizaciones, en experimentos realizados para explicar cómo FXIIa adquiere una función en la generación de trombina iniciada por TF, se encontró que TFPI solo inhibía parcialmente la activación de FV por el complejo de iniciación de la vía extrínseca y solo en una concentración muy alta. En algunas realizaciones, la inhibición de la activación del FVIII fue mínima, como lo confirman las mediciones de la actividad del FVIIIa. En algunas realizaciones, el análisis detallado del curso del tiempo reveló que el TFPI, aunque atenuó inicialmente la activación del cofactor, evitó la degradación dependiente del tiempo causada por la exposición al FXa y, por lo tanto, extendió esencialmente la vida media del cofactor funcional.

En una realización, al confirmar la generación de FVIIIa activo, la adición de FIXa evitó la disminución dependiente del tiempo de la actividad de FXa causada por TFPI 40 nM a una concentración fija de rTF-FVIIa en reacciones sin protrombina. Se obtuvieron resultados concordantes con una concentración de TF 8 veces menor con una generación de FXa correspondientemente reducida, excluyendo que se requirió una concentración inicial alta de FXa para una actividad sostenida. En otra realización, la escisión de protrombina (FII) en presencia del inhibidor de trombina DAPA demostró que el FVa generado en presencia de TFPI se ensambló en un complejo de protrombinasa activo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la coagulación iniciada por TF bajo el control de TFPI establece una ruta directa para la generación de trombina sin requerir activación del cofactor mediante reacciones de retroalimentación, y apoya la producción de trombina amplificada dependiente del FIXa generado por CP en el complejo de tenasa intrínseco. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la inhibición del FXa iniciado por rTF y la generación de trombina por TFPI disminuyó notablemente en presencia de FIXa.

En diversas realizaciones divulgadas en el presente documento, el sustrato cofactor preferido para la activación por TF-FVIIa-FXa es FVIII, que desempeña una función clave en la hemostasia como factor antihemofílico. En algunas realizaciones, se determinó que la activación persistente del FVIII ayuda a explicar la menor incidencia informada de complicaciones hemorrágicas en rivaroxabán en comparación con los pacientes tratados con warfarina. En una realización, en concentraciones clínicamente relevantes, rivaroxaban bloqueó la generación de FVa por el complejo ternario TF-FVIIa-FXa mientras permitía la escisión en fragmentos inactivos por TF-FVIIa. En otra realización, rivaroxaban afectó mínimamente la activación del FVIII. Incluso con rivaroxabán 500 nM, la concentración plasmática máxima con la dosificación completa de anticoagulante, la generación de FVIIIa se mantuvo y apoyó la producción dependiente de FIXa de concentraciones de trombina funcionalmente significativas cuando la coagulación extrínseca se desactivó efectivamente mediante el control de TFPI. Por tanto, en una realización, orientarse selectivamente al FXa con rivaroxabán tiene un mecanismo de seguridad incorporado que permite la activación cinéticamente favorecida del FVIII por el producto naciente del complejo de iniciación de la coagulación extrínseca. Como consecuencia, en algunas realizaciones, se produce una generación limitada de trombina que depende selectivamente de factores antihemofílicos de la vía intrínseca y es potencialmente útil para la hemostasia. En diversas realizaciones, los conceptos divulgado en el presente documento proporcionan nuevas perspectivas para desarrollar agentes hemostáticos mejorados y antitrombóticos dirigidos, así como para evaluar sus propiedades.

Ejemplo 5

Interacción recíproca entre la coagulación y los mecanismos de defensa del huésped.

En diversas realizaciones, se identificó que el producto FXa naciente en el complejo de inicio de coagulación extrínseco es un activador del cofactor plasmático, FVIII, que escapa del TFPI, lo que permite la generación de trombina dependiente de la vía intrínseca. En algunas realizaciones, la presente divulgación explica la función concurrente de FXII y TF en el desarrollo de la oclusión vascular y proporciona pistas para comprender cómo el inicio de la coagulación puede diferir en la hemostasia y la trombosis. En este sentido, en algunas realizaciones, TFPI actúa como un interruptor maestro diseñado principalmente para controlar la generación de trombina y mantener la permeabilidad vascular. En algunas realizaciones, en la hemostasia primaria, la exposición de la sangre a abundante TF en los sitios de la herida puede superar directamente la inhibición del TFPI permitiendo la generación inicial de proteasa de coagulación y la amplificación del cofactor principalmente a través de la vía extrínseca. En otras realizaciones, superar el bloqueo del TFPI de la producción extrínseca de FXa puede ser difícil en la trombosis endovascular, particularmente en arterias donde los trombos en desarrollo ricos en plaquetas liberan abundante TFPI. En algunas realizaciones, TF desempeña una función selectiva e inesperado al activar directamente cofactores que preparan la vía de coagulación intrínseca para continuar la generación de trombina iniciada por CP. El mismo mecanismo puede operar en condiciones patológicas cuando señales de peligro secundarias que desencadenan la vía CP, ya sea liberadas por plaquetas activadas, leucocitos, patógenos microbianos o células dañadas, acompañan a la inducción de TF. En una realización, la aterotrombosis puede ser un ejemplo específico de tales condiciones, ya que la oclusión endoarterial a menudo se precipita por la superposición de inflamación o infecciones sobre placas ateroscleróticas vulnerables que exponen el TF. Por lo tanto, en diversas realizaciones, los hallazgos presentados aquí tienen una amplia importancia no solo para la contribución de la coagulación a la trombosis y su tratamiento, sino también para comprender la interacción recíproca entre la coagulación y los mecanismos de defensa del huésped.

Ejemplo 6

La formación de coágulos hemostáticos y trombóticos está regulada de manera diferente.

Desde el punto de vista convencional (Fig. 1), la coagulación depende de la activación por retroalimentación de los procofactores plasmáticos, FVIII y FV, mediante cantidades limitadas de trombina (FIIa) producida inicialmente por FXa, que a su vez se origina a partir de FX activado por el complejo de TF-FVIIa bajo control TFPI negativo. El FIXa generado por TF-FVIIa o FXIa puede luego amplificar la coagulación mediante el ensamblaje secuencial de complejos intrínsecos de tenasa (FVIIIa-FIXa) y protrombinasa (FVa-FXa) que producen más FXa y trombina, respectivamente. La producción de trombina amplificada es crítica para la hemostasia, ya que requiere FVIIa de vía extrínseca, pero no FXIIa de fase de contacto; en consecuencia, la eliminación del control del punto de control TFPI mejora la hemostasia en ratones hemofílicos. Sin embargo, ciertos modelos experimentales de trombosis dependen de la activación del FXIIa en la fase de contacto, lo que sugiere que la formación de coágulos hemostáticos y trombóticos está regulada de manera diferencial. En una realización, los inventores identificaron estas diferencias en la regulación de la formación de coágulos hemostáticos y trombóticos.

En una realización, las vías intrínsecas y extrínsecas cooperan en la generación de proteasas de coagulación a niveles necesarios para provocar la trombosis. Para establecer esto, se utilizó un modelo de arteria carótida de ratón en el que un anticuerpo monoclonal (MoAb) contra TF, al igual que un anti-FXI MoAb que bloquea la activación por FXIIa, redujo significativamente la frecuencia de oclusión vascular estable después de una lesión inducida por 7% FeCl3-6H20. Es importante destacar que, después de una lesión más grave con 8% FeCl36H2O, los dos anticuerpos ya no eran eficaces individualmente en las concentraciones utilizadas, pero inhibían notablemente la oclusión vascular cuando se combinaban. Esto demostró que las vías intrínsecas y extrínsecas cooperan en la generación de proteasas de coagulación en los niveles necesarios para provocar la trombosis. Una mayor concentración de anti-FXI MoAb también evitó la oclusión, de acuerdo con la evidencia genética que implica que la vía de contacto es crucial para la trombosis en este modelo experimental.

En una realización, se examinó la cooperación de las vías de coagulaciónin vitromidiendo la generación de trombina en plasma suplementado con plaquetas normales (PRP reconstituido). La adición de proteasas de la vía de contacto (FXIIa, FXIa o FIXa) junto con TF produjo más trombina que cuando las proteasas o t F se agregaron individualmente. Sin embargo, las concentraciones bajas de TF solo, no produjeron esencialmente trombina cuando el plasma normal contenía el inhibidor de tripsina de maíz (CTI) dirigido por FXIIa para evitar la activación de la vía de contacto artificial. Más bien, TF mejoró sinérgicamente la producción de trombina por FIXa de una manera que requirió tanto FVIIa como FVIII. La misma sinergia ocurrió en el plasma deficiente en FIX, excluyendo que TF contribuyó a la activación adicional de FIX mediante bucles directos o indirectos e indicando la generación del cofactor FVIIIa como el paso habilitante para la generación de trombina dependiente de FIXa en presencia de inhibidores fisiológicos de la coagulación plasmática.

Ejemplo 7

La vía del TF proporciona FVIIIa funcional en reacciones reconstituidas con FVIII, FX, FV y protrombina purificados en las que el TF relipidado proporcionó una superficie de fosfolípidos limitante

En una realización, la vía del TF puede proporcionar FVIIIa funcional en reacciones reconstituidas con FVIII, FX, FV y protrombina purificados en las que el TF recombinante relipidado (rTF) proporcionó una superficie de fosfolípido limitante. La adición de FIXa solo indujo niveles bajos de activación de FVIII y FX que fue abolida por el inhibidor de trombina dansilarginina N-(3-etil-1,5-pentanodiil)amida (DAPA), lo que concuerda con la conocida activación por retroalimentación de FVIII por la trombina producida en este sistema. El FVIIa solo produjo significativamente más FXa y FVIIIa que el FIXa solo. La adición de FIXa junto con FVIIa no cambió apreciablemente la formación de FVIIIa, pero aumentó la cantidad de FXa por encima de la suma de la obtenida con FVIIa y FIXa individualmente. Estos resultados demuestran que la sinergia surge del FVIIIa generado por vía extrínseca que luego forma complejos con FIXa para mejorar aún más la formación de proteasas. Es importante destacar que TF apoyó la activación del cofactor de una manera dependiente de la dosis incluso en ausencia de protrombina y la activación de FVIII en mezclas de reacción completas se redujo, pero no se eliminó, mediante DAPA. Sin embargo, la producción sinérgica de FXa se mantuvo sin cambios en presencia del inhibidor de trombina o cuando la protrombina de tipo silvestre en la reacción fue reemplazada por el mutante de protrombina S195A catalíticamente inactivo. Por lo tanto, en una superficie de fosfolípidos inicial limitada, la activación directa del FVIII por el complejo TF-FVIIa es suficiente para permitir el ensamblaje productivo del complejo de tenasa intrínseca FIXa-FVIIIa incluso en ausencia de activación del cofactor por retroalimentación por la trombina (Fig. 1).

En algunas realizaciones, TFPIa presente en plasma y liberado por plaquetas activadas es el regulador fisiológico de la generación de proteasa y protrombinasa dependiente de TF. En consecuencia, agregar anti-TFPI IgG al PRP citratado recalcificado mejoró la generación de trombina inducida únicamente por una baja concentración de TF, pero la respuesta a FIXa agregado junto con TF se vio mínimamente afectada por el bloqueo de TFPI. Por tanto, la vía recientemente delineada para la generación de FVIIIa no está bajo el control del TFPI. Como se esperaba, el FXa producido por TF-FVIIa en el sistema reconstituido se redujo en >50 % con TFPI solo y en >75 % con TFPI con cofactor de proteína S (PS). Por el contrario, la generación de FXa dependiente de FIXa más allá de la cantidad que se origina a partir de TF-FVIIa (FXa por FVIIIa-FIXa), un reflejo del FVIIIa funcional en la reacción, no se vio afectada por el TFPI agregado solo y solo parcialmente en reacciones que contienen PS. De acuerdo con la generación reducida de proteasas, TFP, TFP/PS y el inhibidor fisiológico antitrombina con el cofactor pentasacárido redujeron significativamente la formación de FVIIIa. Sin embargo, estos inhibidores del FXa no impidieron la generación de FVIIIa por TF-FVIIa en presencia de bloqueo de trombina con DAPA, lo que demuestra que el nuevo enlace funcional independiente de la trombina entre la coagulación extrínseca e intrínseca puede escapar al control de los inhibidores fisiológicos endógenos.

En algunas realizaciones, experimentos adicionales mostraron que, además del FVIIIa, la vía TF era capaz de generar FVa con actividad protrombinasa en ausencia de activación por retroalimentación de trombina y evadir el control por TFPI, lo que coincide con la evidencia farmacológica que implica al FXa en la activación del FV Por lo tanto, la vía TF puede iniciar la formación de fibrina sin los bucles de retroalimentación de trombina de activación del cofactor previamente asumidos. Debido a que las plaquetas estimuladas liberan FVa parcialmente activo en los sitios de lesión vascular, la formación de FVIIIa independiente de trombina es probablemente la función clavein vivodel nuevo enlace de coagulación divulgado en el presente documento. Este concepto se verificó por primera vez en un ensayo de generación de trombina basado en PRP recalcificado iniciado agregando TF y FIXa en presencia de CTI para bloquear FXIIa. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-TF que bloquea la función prolongó significativamente el tiempo de retardo y redujo la cantidad de trombina producida, pero este efecto se revirtió de forma dependiente de la dosis añadiendo FVIIIa.

Ejemplo 8:

Experimentos in vivo que evalúan el depósito de fibrina en la vena femoral del ratón después de una lesión inducida por cloruro férrico.

En algunas realizaciones, se realizaron experimentos in vivo para evaluar la deposición de fibrina en la vena femoral del ratón después de una prueba de lesión inducida por FeCh6H2O. Como se observa en la arteria carótida, la administración simultánea de anti-TF y anti-FXI MoAb en dosis individualmente ineficaces impidió la oclusión estable del vaso y redujo notablemente la deposición de fibrina en el área de la lesión (Fig. 7C, D). En una realización, la infusión de FVIIIa, pero no de FVIII, revirtió este efecto inhibidor, lo que demuestra que la activación de FVIII es un paso limitante de la velocidad en este modelo de trombosis. Sin embargo, FVIIIa no pudo restaurar la oclusión vascular en presencia de la dosis totalmente inhibidora de anti-FXI MoAb (Fig. 7D), excluyendo las contribuciones fuera del enlace dependiente de TF a la vía intrínseca aquí divulgada. Por tanto, el FVIII puede activarse in vivo mediante la vía de coagulación extrínseca dependiente de TF bajo control fisiológico de TFPI.

En una realización, estos resultados ilustraron que la activación de FVIII mediada por TF que escapaba a la inhibición de TFPI era una función del producto FXa todavía ensamblado con el complejo extrínseco TF-FVIIa. Esto se determinó aprovechando las propiedades de la proteína anticoagulante de nematodos (NAP) c2, un inhibidor similar al TFPI que bloquea el sitio activo de FVIIa impidiendo la activación del FX. Debido a que NAPc2 no tiene ningún efecto sobre el sitio catalítico de FXa, se formó un complejo estabilizado con NAPc2 de FXa, TF y un mutante Ser195Ala FVIIa (iFVIIa) catalíticamente inactivo. En este complejo, FXa era la única proteasa activa. Sorprendentemente, el FXa en este complejo, pero no el FXa libre en la misma concentración, generó FVIIIa (Fig. 4A). De acuerdo con la formación de un complejo similar a TFPI de NAPc2, TFPI no inhibió la activación de FVIII por el complejo estabilizado, pero la antitrombina en complejo con pentasacárido (Fig. 4A) u otros inhibidores de FXa disminuyó la formación de FVlIIa, lo que confirma aún más que FVIIIa fue generado por FXa. Estos hallazgos respaldan el nuevo concepto de que la activación del cofactor es un evento temprano durante la coagulación iniciada por TF, mediada por FXa generado de novo, posiblemente todavía ensamblado dentro del complejo TF-FVIIa-FXa.

En una realización, el producto naciente FXa escapa a la inhibición de rivaroxaban y apixaban, dos inhibidores farmacológicos diferentes de molécula pequeña de FXa. Esto es similar a que el FXa escape del punto de control fisiológico del TFPI. Es probable que la activación persistente del FVIII que preserva la hemostasia sea la razón por la cual la eficacia antitrombótica de los inhibidores del FXa se asocia con un riesgo relativamente bajo de complicaciones hemorrágicas. Rivaroxaban y apixaban tuvieron una potencia comparable en el bloqueo de las actividades amidolítica y protrombinasa del FXa purificado, con una IC50dos veces mayor para esta última. En concentraciones terapéuticas, rivaroxaban y apixaban inhibieron la activación del FVIII por el FXa libre en la superficie de los fosfolípidos del TF o por el complejo estabilizado TF/iFVIIa/FXa/NAPc2 en -90%. Por el contrario, la IC50fue al menos 1 orden de magnitud mayor cuando el FVIII fue activado por FXa generado de novo por TF-FVIIa. La inhibición ineficiente de la generación de FVIIIa por el FXa naciente se reflejó en la preservación de la producción de trombina dependiente de FVIII por TF-FVIIa en presencia de FIXa bajo control inhibidor de TFPI en cada una de las concentraciones de rivaroxaban y apixaban analizadas.

Ejemplo 9

Relevancia fisiológica

En una realización, para evaluar la relevancia fisiológica, la generación de trombina inducida por TF en PRP recalcificado contiene CTI para bloquear la fase de contacto FXIIa. Rivaroxaban y apixaban inhibieron la producción de trombina con una diferencia de ~3 veces en la respuesta a la dosis. Es importante destacar que la generación de trombina residual en presencia de estos inhibidores del FXa fue notablemente sensible a un anticuerpo anti-FVIII que bloquea la función. Por el contrario, la generación de trombina en ausencia o presencia de antagonistas farmacológicos del FXa no se vio afectada por un anticuerpo anti-FXI que interrumpió el bucle de retroalimentación de trombina que opera a través del FXIa u otros efectos del FXIa. Estos resultados confirman que, en presencia de todos los inhibidores fisiológicos de la coagulación sanguínea, un componente medible de la generación de trombina iniciada por TF depende del FVIIIa y escapa, al menos parcialmente, a los inhibidores directos del FXa en el uso clínico. El bloqueo de anticuerpos de TFPI aumentó la concentración de rivaroxaban y apixaban requerida para un efecto anticoagulante sobre la generación de trombina en PRP. Sin embargo, independientemente de si el TFPI era funcional, la amplificación de la generación de trombina dependiente del FVIII se conservó en concentraciones inhibidoras clínicamente relevantes de los dos fármacos. Por lo tanto, incluso con un control reducido del TFPI, como puede ocurrir en ambientes trombogénicos, la activación cinéticamente favorecida del FVIII por el producto naciente FXa puede contribuir a la hemostasia a través de este enlace con la vía de coagulación intrínseca.

Ejemplo 10

Nuevos enfoques de diagnóstico

En una realización, para fundamentar este concepto con nuevos enfoques de diagnóstico, los inventores midieron el volumen de agregados de plaquetas y fibrina depositados sobre superficies recubiertas con colágeno o TF después de la perfusión de sangre citratada recalcificada de controles normales y pacientes tratados con rivaroxabán o warfarina. Estos últimos se monitorizaron periódicamente mediante la prueba del Índice Normalizado Internacional (INR); los primeros no recibieron monitorización de laboratorio de acuerdo con las pautas de tratamiento. En una superficie recubierta con una concentración baja de TF, un anti-FVIII MoAb que bloqueaba la función redujo la deposición de fibrina en sangre normal, pero la adición de anti-TFPI IgG alivió este efecto inhibidor sobre la deposición tanto de fibrina como de plaquetas. El aumento del TF en la solución de recubrimiento eliminó la dependencia del FVIII y la regulación del TFPI en sangre normal, lo que demuestra que esta condición imitaba una superficie trombogénica que escapaba del control del punto de control del TFPI. Por el contrario, en una superficie recubierta con colágeno saturado, la inhibición del FVIII no tuvo ningún efecto sobre la agregación plaquetaria -ya que el colágeno inmovilizado es un fuerte agonista plaquetario- pero causó una disminución significativa del volumen de fibrina que se mantuvo sin cambios en presencia de anti-TFPI IgG.

En una realización, este enfoque puede usarse para medir la formación de trombos en el control y la sangre del paciente perfundida sobre una superficie de TF de alta densidad, donde la generación de trombina es impulsada por la vía de coagulación extrínseca independiente del control de TFPI, y en una superficie de colágeno de alta densidad donde la coagulación está impulsada por la vía intrínseca. La deposición de fibrina se redujo significativamente en ambas superficies en la sangre de pacientes tratados con warfarina. Sin embargo, en los pacientes tratados con rivaroxaban, la deposición de fibrina fue tan baja como en los pacientes tratados con warfarina en la superficie del TF, pero no disminuyó significativamente en comparación con los controles no tratados con colágeno. Por lo tanto, ambos tratamientos son eficaces para inhibir la trombogénesis impulsada directamente por la vía extrínseca del TF. Por el contrario, los fármacos orientados al FXa en lugar de afectar a todas las proteasas dependientes de la vitamina K preservan selectivamente la formación de fibrina dependiente del FVIII que puede favorecer la hemostasia en sitios críticos para la hemorragia en pacientes que reciben tratamiento anticoagulante.

En una realización, los resultados experimentales divulgados en el presente documento ilustran aún más el nuevo enlace de coagulación (Fig. 1) en el que el FXa naciente producido a través del complejo de iniciación de la coagulación extrínseco TF-FVIIa proporciona activación por proalimentación de cofactores, en particular FVIII antihemofílico. A diferencia del mecanismo de retroalimentación canónico que depende de la trombina generada inicialmente, la activación del FVIII por el FXa naciente escapa al punto de control del TFPI y se conserva en presencia de anticoagulantes dirigidos al FXa. En algunas realizaciones, este mecanismo de activación del FVIII, específicamente integrado dentro de la vía de coagulación iniciada por TF, puede operar de manera coordinada con la generación de proteasa FIXa por TF-FVIIa que también escapa al control inhibidor de los anticoagulantes fisiológicos. En algunas realizaciones, el nuevo enlace entre las vías de coagulación extrínseca e intrínseca también explica la contribución hasta ahora poco racionalizada pero experimentalmente evidente del FXII en fase de contacto a la formación de fibrina dependiente de TF en modelos animales de trombosis. En algunas realizaciones, estos resultados proporcionan una explicación inesperada de cómo, en marcado contraste con los anticoagulantes orales tradicionales, la orientación específica del FXa puede preservar la generación residual de trombina y fibrina a través de la vía intrínseca antihemófila. Por lo tanto, los conceptos descubiertos aquí ayudan a individualizar la definición de riesgo trombótico y de hemorragia para los pacientes tratados con nuevos anticoagulantes orales, así como a conducir a enfoques refinados para inhibir la trombosis preservando al mismo tiempo una función hemostática suficiente.

Ejemplo 11

Los inhibidores del FXa preservan la formación de trombina y fibrina dependiente del FVIII

En una realización, los inventores han descubierto que los inhibidores del FXa preservan la formación de trombina y fibrina dependiente de FVIII. En una realización, los inventores compararon cómo el anticoagulante selectivo para FXa, rivaroxabán, y el antagonista de la vitamina K, warfarina, influyen en la trombogénesis midiendo la formación de fibrina con agregados de plaquetas en sangre de individuos tratados perfundidos sobre TF recombinante relipidado inmovilizado (rTF). El volumen de fibrina depositada fue notablemente menor en los pacientes que recibieron fármacos anticoagulantes que en los controles no tratados, pero fue significativamente mayor en rivaroxabán que en los pacientes tratados con warfarina cuando la concentración de rTF en la superficie aumentó (Fig. 2 A). Rivaroxabán, añadido a sangre normalin vitroa la concentración plasmática promedio medida en pacientes tratados dos horas después de la ingesta del fármaco, redujo el volumen de fibrina parcialmente, pero casi por completo en presencia de un anticuerpo monoclonal (MoAb) anti-FVIII que por sí solo produjo una inhibición modesta (Fig. 2 B). Si bien estudios anteriores habían observado una inhibición limitada por parte de anticoagulantes específicos de proteasa en ensayos de generación de trombina (TG), estos datos mostraron que la orientación selectiva de FXa preservaba claramente la generación de trombina iniciada por TF a través de la vía de coagulación intrínseca bajo el control de inhibidores de la coagulación en sangre. Debido a que no había células endoteliales en los experimentos, los resultados también indicaron que rivaroxaban preservaba la hemostasia independientemente de las interacciones que involucraban la sangre y la pared del vaso.

Para confirmar estos hallazgos, se midieron TG en plasma rico en plaquetas (PRP) que contenía inhibidor de tripsina de maíz (CTI) para bloquear la activación del FXI mediante el FXIIa en fase de contacto, que no tiene ninguna función en la hemostasia. En las concentraciones utilizadas, CTI no ha reportado efectos sobre las proteasas de coagulación corriente abajo de FXIIa. Dos antagonistas distintos del FXa, rivaroxaban y apixaban, inhibieron las TG inducidas por TF, y las TG residuales en presencia de inhibidores disminuyeron en gran medida mediante el bloqueo adicional de la actividad del FVIII (Fig. 3 A). Además, la respuesta marginal de TG desencadenada por una concentración baja de rTF aumentó sustancialmente después de bloquear TFPI con un anticuerpo específico, lo que muestra que las TG por concentraciones umbral de TF estaban reguladas por TFPI plasmático y/o plaquetario (Fig. 3 B). Aunque el TF bajo no logró inducir TG tempranas mediables, mejoró el efecto de FIXa incluso sin inhibición de TFPI (Fig. 3B) y en PRP deficiente en FIX (Fig. 3 C), excluyendo que el efecto observado fue causado por bucles dependientes de TF que generan FIXa adicional.

En una realización, usando un sustrato de trombina sensible en un ensayo de TG discontinuo, se encontró que TF con FVIIa de tipo silvestre (WT) -pero no con el mutante del sitio activo FVIIa S 195A (iFVIIa)- amplificaba TG inducida por FIXa en plasma deficiente en FVII reconstituido con plaquetas normales incluso cuando la generación inicial de trombina fue <10 pM en 5 min (Fig. 3D). En otra realización, FIXa añadido con iFVIIa produjo niveles bajos similares de trombina, pero ninguna ráfaga de TG como se observa con FVIIa activo. En una realización, TF-FVIIa, a pesar del control de TFPI en PRP, mejoró las TG mediante FIXa independientemente de la trombina. Para excluir cualquier influencia sobre las TG por actividades no reconocidas del complejo TFPI-FVIIa-FXa inhibido por TFPI -tal vez causado por la formulación de la preparación de rTF- se probó un complejo TF funcionalmente inhibido preformado con FVIIa S195A, FXa y TFPI inactivos. El FXa se inhibió eficientemente en este complejo que no pudo inducir TG ni amplificar las TG dependientes de FIXa en plasma deficiente en FVII (Fig. 3E, izquierda). Por el contrario, un complejo similar en el que TFPI fue reemplazado por la proteína anticoagulante nematoda (NAP) c2 aún no logró inducir TG por sí solo, pero mejoró notablemente las TG inducidas por FIXa cuando se agregó a concentraciones de TF similares a las utilizadas para desencadenar TG en PRP ( Figura 3E, derecha). Dado que NAPc2, a diferencia del TFPI, inhibe TF-FVIIa de manera dependiente de FXa sin afectar la función catalítica de FXa, estos datos ilustraron que el FXa naciente, aunque todavía está asociado con TF-FVIIa, es el activador primario de FVIII en presencia de factores fisiológicos de coagulación plasmática e inhibidores.

Ejemplo 12

Activación de FVIII independiente de trombina por TF-FVIIa con FXa naciente.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a la activación de FVIII independiente de trombina por TF-FVIIa con FXa naciente. En diversas realizaciones, se estudió la activación del FVIII con componentes purificados y rTF como superficie fosfolípida primaria. En una realización, el complejo TF-FVIIa S195A preformado estabilizado con NAPc2 con FXa como única proteasa activa activó eficazmente el FVIII (Fig. 4 A). Este complejo similar al TFPI no fue inhibido por el TFPI, pero el FXa en este complejo todavía era accesible para otros inhibidores macromoleculares, tales como la antitrombina (AT) con el cofactor pentasacárido (penta), que impidió la activación del FVIII (Fig. 4 A). En una reacción de coagulación reconstituida que contiene cofactores purificados (FV y FVIII) y zimógenos proteasa (FX, protrombina), el inicio de la coagulación por FIXa condujo a una producción limitada de FXa que, consistente con la activación del FVIII por retroalimentación de trombina, fue inhibida por dansilarginina N-( 3-etil-1,5-pentanodiil)amida (DAPA) o cuando el mutante inactivo S195A sustituyó a la protrombina normal (Fig. 4 B). En algunas realizaciones, la ausencia de trombina activa no tuvo efecto sobre la generación de FXa por TF-FVIIa (Fig. 4 B). En algunas realizaciones, TF-FVIIa y FIXa combinados produjeron más FXa que la suma de las reacciones individuales y la producción adicional de FXa no se vio afectada por el bloqueo de trombina (Fig. 4 B). En una realización, esto ilustró que TF-FVIIa con FXa naciente puede estimular la producción adicional de FXa mediante un complejo activo de FlXa con FVIIIa recién generado. De acuerdo con los resultados en los ensayos de TG en plasma, la generación de actividad<de FVIII independiente de trombina por el complejo de iniciación de>T<f no se vio afectada por la presencia de VWF>(Fig. 4 C).

Usando la misma superficie de fosfolípidos que contiene TF, los inventores compararon la activación de FVIII mediante FXa preactivado 200 pM o FVIIa 20 pM/FX 50 nM que promueve generación de FXade novopor TF-FVIIa (Fig. 4 D). Sin inhibidores añadidos, la activación del FVIII por el FXa naciente o preactivado fue comparable en ausencia (panel<superior) o presencia (panel inferior) del sustrato zimógeno alternativo, FIX, y el cofactor,>F<v>.<Sin embargo, la adición>de AT y cofactor pentasacárido a la reacción provocó una inhibición dependiente de la dosis considerablemente mayor de la generación de FVIIIa por el FXa preactivado que el naciente (Fig. 4 D, E). Por lo tanto, aunque el FXa preformado en complejo con TF-FVIIa era susceptible a la inhibición por AT (Fig. 4A), el FXa generadode novoescapó de este punto de control inhibidor, lo que coincide con que la activación del FVIII es una reacción inmediata rápida y preferida de la coagulación iniciada por TF.

Ejemplo 13

La activación de la vía intrínseca por TF es suficiente para la formación de TG y fibrina bajo flujo.

En algunas realizaciones, la activación de la vía intrínseca por TF es suficiente para la formación de TG y fibrina bajo flujo. En una realización, se identificaron dos mutantes de FVIIa -T99Y y E154A- que conservaban actividad catalítica para la escisión de FX, pero tenían tasas de recambio de sustrato notablemente reducidas. A diferencia de FVIIa WT, los dos mutantes no pudieron mantener la generación de FXa después de una ráfaga inicial en un ensayo libre de fosfolípidos (Fig. 5A) o con TF reconstituido con fosfolípidos (Fig. 5B). A pesar de una generación de FXa notablemente disminuida, los complejos TF-FVIIa mutantes y de tipo silvestre soportaron una activación de FVIII comparable que requería la presencia de FX en la reacción (Fig. 5C). En una realización, TFPIa, que puede estar presente en plasma en concentración variable debido a la liberación de las plaquetas, no inhibió apreciablemente la activación del FVIII por FVIIa WT o mutantes, incluso cuando se añadió a la concentración suprafisiológica de 10 nM (Fig. 5D). En marcado contraste con el FVIII, los mutantes de FVIIa en complejo con TF y la presencia de FX no lograron activar FV; y TFPIa bloqueó la generación de FVa con FVIIa WT (Fig. 5D). Por lo tanto, en una realización, TFPI regula la activación de FV. Experimentos de control adicionales no proporcionaron evidencia de que la proteína S cofactor TFPIa mejorara la inhibición de TFPI de la activación de FVIII por TF-FVIIa con FXa naciente.

En algunas realizaciones, ambos mutantes de FVIIa con generación de FXa deteriorada respaldaron la producción de FXa dependiente de FVIIIa mediante la adición de FIXa (Fig. 5E). Sin embargo, cuando se agregó el zimógeno FIX, solo el mutante E154A del exosito de FVIIa, pero no el T99Y con activación deficiente de FIX, apoyó completamente la formación de un complejo de tenasa intrínseca funcional FVIIIa-FIXa (Fig. 5E). Por lo tanto, además de la capacidad conocida de generar FIXa, el complejo de iniciación de TF activa directamente el cofactor antihemofílico FVIII que permite la coagulación de la vía intrínseca antes del control inhibidor por TFPIa.

En algunas realizaciones, utilizando los mutantes de FVIIa identificados, los inventores verificaron la validez de esta conclusión en presencia de inhibidores del plasma y plaquetas. El FVIIa E154A de tipo silvestre y mutante agregado al plasma deficiente en FVII suplementado con plaquetas lavadas normales produjo niveles comparables de trombina, mientras que el FVIIa T99Y fue menos eficiente (Fig. 5F, izquierda). La inhibición de la generación de FVIIIa esencialmente bloqueó las TG de los dos mutantes, mientras que FVIIa WT produjo TG residuales (Fig. 5F, centro), consistente con el defecto selectivo de los mutantes de FVIIa en el desencadenamiento directo de FXa y, por lo tanto, de la generación de trombina. En algunas realizaciones, el bloqueo de la actividad de FXIa tuvo un efecto modesto sobre las TG por FVIIa E154A en comparación con WT, mientras que redujo notablemente las TG por FVIIa T99Y (Fig. 5F, derecha). Este resultado demostró que la activación tanto de FVIII como de FIX es esencial para la coagulación intrínseca iniciada por TF. El hecho de que el mutante FVIIa E154A, con generación directa limitada de FXa, fuera comparable al FVIIa WT en el apoyo al inicio de la vía intrínseca del TF ilustra aún más que la retroalimentación de la trombina tiene una función limitada en la activación del FVIII durante la coagulación desencadenada por el TF.

En una realización, se estudió la actividad trombogénica de mutantes de FVIIa con recambio de FXa libre reducido en experimentos con sangre fluidaex-vivo.Al limitar la concentración de TF en la superficie de manera que la deposición de fibrina dependiera del FVIIIa cuando la rata de cizallamiento de la pared era de 300 s-1, se encontró que el FVIIa con la mutación E154A, pero no T99Y, soportaba una formación de trombo ligeramente reducida a similar a la del WT FVIIa cuando se reconstituía en sangre con deficiencia de FVII (Fig. 6A). La adición de FIXa 20 pM a sangre que contenía FVIIa T99Y, pero no la misma concentración de FVIIa S195A catalíticamente inactivo, restableció la formación de fibrina dependiente de FVIII a un nivel comparable al observado con FVIIa E154A (Fig. 6B). Esto confirmó que el complejo TF-FVIIa con FXa naciente generó directamente FVIIIa con actividad tenasa intrínseca y el potencial de ser beneficioso para la hemostasia en entornos con bajo contenido de TF.

En algunas realizaciones, la nueva vía descrita en el presente documento se evaluó en modelos de ratón. En una realización, TF-FVIIa de ratón apoyó la generación de FVIIIa funcionalin vitro.En una realización, se generaron micropartículas procoagulantes a partir de macrófagos de ratón. Luego, se analizó esta fuente natural de TF para determinar la activación del FVIII en una reacción con componentes purificados. La incorporación de TF humano o de ratón endógeno en micropartículas en presencia de FVIIa de especies compatibles estimuló la generación de FXa dependiente de FlXa como se observa con TF recombinante reconstituido con fosfolípidos (Fig. 6C). Por lo tanto, la vía de activación directa del FVIII respaldada por TF-FVIIa con FXa naciente ocurre con fuentes biológicamente relevantes de TF y se conserva en el ratón.

Ejemplo 14

TF contribuye a la activación del FVIIIin vivo

En algunas realizaciones de la presente divulgación, TF contribuye a la activación del FVIIIin vivo.A continuación, se evaluó si la función TF contribuía a generar actividad del FVIIIin vivoen un modelo de trombosis inducida por cloruro férrico. De acuerdo con la participación tanto de la fase de contacto como de las vías de coagulación del TF en la trombosis, la administración independiente de MoAb que bloquean la función del TF (tal como 21E10) o la activación del FXI por FXIIa (tal como el anti-FXI 14E11) redujo significativamente la oclusión de la arteria carótida del ratón después de una lesión causada por 7% (0.26 M) FeCh6H2O (Fig. 7A). Las mismas concentraciones de MoAb fueron individualmente ineficaces después de una lesión más grave de 8% (0.3 M) cloruro férrico, pero marcadamente antitrombóticas cuando se combinaron, lo que ilustra la convergencia de la coagulación extrínseca e intrínsecain vivo.Las concentraciones más altas de anti-FXI MoAb solo también previnieron la oclusión arterial, lo que coincide con una función esencial de la activación de FIX por FXIIa-FXIa en este modelo.In vitro,la inhibición de anti-TF MoAb de TG sinérgicas iniciada por TF y FIXa combinados en PRP se revirtió agregando FVIIIa, pero no FVIII (Fig. 7B), lo que confirma una función predominante de TF en la activación de FVIII en plasma. De manera similar, el FVIIIa, pero no el FVIII, revirtió la inhibición de la oclusión de la vena femoral inducida por cloruro férrico mediante dosis subumbrales combinadas de anti-TF y anti-FXI MoAbs. Sin embargo, FVIIIa no tuvo influencia en la inhibición de la generación de FIXa mediada por FXIIa/FXIa mediante anti-FXI MoAb en dosis completa en ausencia de anti-TF (Fig. 7 C, D), excluyendo que TF-FVIIa o vías alternativas pudieran generar FIXa en cantidades suficientes para utilizar FVIIIa proporcionado exógenamente para desencadenar la trombosis. El hallazgo de que el FVIIIa revierte selectivamente el bloqueo del TF ilustra que promover la activación del FVIII es una función clave de la vía de coagulación extrínseca del TF-FVIIain vivo.

Ejemplo 15

El inicio de TF de la vía intrínseca escapa al bloqueo farmacológico del FXa.

En algunas realizaciones divulgadas en el presente documento, el inicio de la vía intrínseca por parte del TF escapa al bloqueo farmacológico del FXa. En una realización, los inventores evaluaron si los inhibidores del FXa en uso clínico (tales como rivaroxaban y apixaban) preservan la activación del FVIII mediante el complejo de iniciación de la coagulación del TF. Ambos inhibidores bloquearon de manera comparable las actividades amidolíticas y protrombinasa del FXa (Fig. 8 A, B). En concentraciones terapéuticas, entre 50-450 nM, ambos inhibidos por -90% de activación del FVIII mediante FXa preactivado, ya sea libre o en un complejo estabilizado con NAPc2 con TFFVIIa S195A (iFVIIa), pero solo redujeron marginalmente la activación del FVIII por el FXa naciente generado por TFFVIIa (Fig. 8 C). Este último fue un efecto específico, ya que rivaroxaban inhibió la activación del FVIII por el FXa que fuede novogenerado a niveles equivalentes utilizando el activador FX del veneno de víbora de Russel (RVV) independiente de TF (Fig. 8D). Además, tanto rivaroxaban como apixaban en dosis terapéuticas inhibieron las TG iniciadas por TF solo en reacciones que contenían FIXa sin FVIII, pero se conservaron significativamente más TG cuando se agregó FVIII (Fig. 8E). La incapacidad de los inhibidores macromoleculares y de molécula pequeña para bloquear la generación de FVIIIa mediante el complejo de iniciación del TF identifica al cofactor antihemofílico FVIII como un sustrato preferido para el FXa naciente. En estudios adicionales con los mutantes de FVIIa identificados, se encontró que las T<g>en presencia de rivaroxaban solo se retrasaron ligeramente con FVIIa E154A en comparación con WT (Fig. 8F), lo que demuestra que la activación de la vía intrínseca en presencia de concentraciones terapéuticas del inhibidor FXa fue preservado por el mutante capaz de generar FIXa. Por el contrario, una disminución significativa de TG con FVIIa T99Y con activación deficiente de FIX en relación con E154A y WT indicó que los anticoagulantes dirigidos a FXa podrían inhibir el bucle de retroalimentación de trombina que conduce a la generación de FIXa dependiente de FXIa.

En diversas realizaciones, los inventores cribaron un panel de anti-FVIIa MoAbs para detectar interferencias con la activación de la vía intrínseca mediada por TF. En algunas realizaciones, los anticuerpos inhibidores, tales como MoAb 3G12, impidieron la activación del FVIII por el complejo de iniciación del TF. En otras realizaciones, MoAb 12C7, que se sabe que reacciona con un epítopo definido cerca del exosito de unión al sustrato macromolecular, no fue inhibidor en esta reacción (Fig. 9A). Este anticuerpo limitó el recambio de FXa mediado por FVIIa WT y requirió FIXa para la generación de FXa amplificada en presencia de FVIIIa generado por la vía TF (Fig. 9B). A diferencia del anti-FVIIa MoAb 3G12 inhibidor, el MoAb 12C7 conservó las TG en PRP normal. Sin embargo, las TG dependientes de FVIII en presencia de MoAb 12C7 se volvieron altamente susceptibles a la inhibición por el anticuerpo anti-FXI (Fig. 9C). Estos resultados ilustraron que MoAb 12C7 inhibe la generación de FIXa por TF-FVIIa, imitando las propiedades de FVIIa T99Y Además, las concentraciones bajas de rivaroxaban produjeron una inhibición más pronunciada de TG en presencia de MoAb 12C7 (Fig. 9D), lo que confirma que los anticoagulantes orientados a FXa inhiben los bucles de retroalimentación de trombina-FXI al tiempo que preservan selectivamente la activación directa de FVIII y FIX por el complejo de iniciación de TF.

Ejemplo 16

Vía de coagulación

En diversas realizaciones, la presente divulgación divulga una nueva función del complejo de inicio de coagulación extrínseco, concretamente proporcionar activación por proalimentación selectiva del cofactor antihemofílico, FVIII, independientemente de los bucles de retroalimentación de trombina (Fig. 1). Esta reacción específica del FXa naciente escapa al control de los inhibidores fisiológicos de la coagulación, TFPIa y AT, así como de los anticoagulantes farmacológicos orientados al FXa. En algunas realizaciones, junto con la capacidad de TF-FVIIa para activar la proteasa antihemófila, FIX, la generación directa de FVIIIa constituye una vía hacia la actividad tenasa intrínseca de FVIIIa-FIXa completamente integrada dentro de la coagulación iniciada por TF.

En algunas realizaciones, como se revela experimentalmente usando mutantes de FVIIa y un complejo estabilizado con la proteína NAPc2 del nematodo, el complejo TF-FVIIa-FXa genera selectivamente el cofactor de FVIIIa para la tenasa intrínseca, pero no el cofactor de FVa para la protrombinasa que requiere el desacoplamiento de TF-FVIIa que expone FXa libre a control inhibidor. Por lo tanto, la función TF-FVIIa-FXa recientemente identificada permite la acumulación de cofactor antihemofílico prohemostático activo sin aumentar el FVa protrombótico. En una realización, esto puede explicar por qué, con una potencia antitrombótica comparable, los inhibidores de trombina y FXa orientados tienen un menor impacto en la hemostasia que los antagonistas de la vitamina K que reducen la disponibilidad de FIXa y, en consecuencia, perjudican la activación directa de la tenasa intrínseca accionado por la vía TF que conduce a la generación de fibrina hemostática. En una realización, dicho mecanismo es independiente de la actividad del FXI y, por lo tanto, puede preservar la hemostasia también en el contexto de estrategias antitrombóticas recientemente validadas orientadas al FXI.

En algunas realizaciones, la selectividad del cofactor ilustra distintas propiedades funcionales de FXa en complejo con TF-FVIIa o liberado de este. Si bien los complejos cofactor-enzima de la coagulación suelen estar orientados a un recambio eficiente de sustrato para una generación rápida de trombina, a lo largo de la evolución el complejo de iniciación del FT parece haber conservado mecanismos que favorecen su estabilidad. FX interactúa con TF-FVIIa a través de una interfaz extendida que se ve mínimamente afectada por la transición de zimógeno a enzima del sustrato. En esta interfaz, el residuo E154 de FVIIa, que se conserva en diversas especies, transmite cambios conformacionales al acoplarse el sustrato al sitio activo de la proteasa, lo que puede regular la liberación posterior del producto. La eliminación de este cambio conformacional fue suficiente para segregar la activación del sustrato macromolecular y el recambio de producto mediante TF-FVIIa. Por lo tanto, el mutante FVIIa E154A permitió el reconocimiento de la función de activación directa del FVIII por el FXa naciente asociado con TF-FVIIa, así como la contribución de esta nueva vía que activa la coagulación intrínseca a la generación de trombina y la trombogénesis en plasma rico en plaquetas y sangre completa bajo flujo.

En algunas realizaciones, la estabilidad del complejo de inicio de la coagulación del TF probablemente representa la ventaja evolutiva de preservar funciones de señalización clave de TF-FVIIa-FXa que enlazan la activación de la coagulación y la inmunidad innata. En línea con la activación eficiente de FVIII, FVIIa T99Y es completamente funcional en la mediación de la activación TF-FVIIa-FXa del receptor activado por proteasa (PAR) 2. Además, como se observa para la generación de FVIIIa, la resistencia a la inhibición funcional por TFPIa también es una característica importante de la señalización de PAR inducida por TFFVIIa-FXa en células endoteliales. Este complejo de señalización se estabiliza adicionalmente mediante el reclutamiento del compañero de unión de FXa, el receptor de proteína C endotelial (EPCR), en ratones y humanos. Las células dendríticas tienen una función clave en la señalización inmune innata para el complejo TF-FVIIa-FXa-EPCR, donde es esencial para la inducción de respuestas del receptor 4 tipo peaje que involucra el dominio TIR que contiene el adaptador que induce la molécula adaptadora 1 que contiene el dominio TIR/interferón-p ( TRIF/TICAM-1). En algunas realizaciones, la regulación negativa de esta vía por el ligando EPCR alternativo, la proteína C activada, utiliza las funciones de cofactor anticoagulante canónicas de<f>V y la proteína S. Por tanto, estas y otras funciones no tradicionales del sistema de coagulación probablemente utilicen las mismas características mecanísticas que simultáneamente cumplen diversas funciones en la inmunidad, la hemostasia y la reparación de lesiones.

Si bien los anticoagulantes orales selectivos son seguros sin una estrecha monitorización terapéutica, como se requiere para los antagonistas de la vitamina K, los nuevos conceptos y enfoques de diagnóstico descritos aquí individualizarían la definición de riesgo trombótico y de hemorragia para los pacientes tratados con estos medicamentos. La presente divulgación proporciona las bases bioquímicas para definir distintas funciones del TF para apoyar la hemostasia o contribuir a la trombosis. De hecho, a través de la activación directa de la vía intrínseca protegida de inhibidores fisiológicos, el TF puede sostener la generación de FXa y trombina para la hemostasia, al tiempo que es susceptible al control del TFPI, lo que limita el riesgo de trombosis causado por la generación directa excesiva de cofactor de protrombinasa FXa y FVa. La selectividad de los anticoagulantes orales FXa para orientar a las vías de coagulación protrombótica versus la activación hemostática favorable del FVIII puede evaluarse mediante nuevas pruebas de diagnóstico basadas en los reactivos descritos aquí. En una realización, esto puede conducir a evaluar selectivamente los efectos de anticoagulantes nuevos recientemente desarrollados y futuros sobre las funciones duales del TF en la hemostasia y la trombosis. En algunas realizaciones, los conceptos novedosos sobre coagulación presentados aquí pueden tener implicaciones para el desarrollo y la evaluación de nuevos agentes hemostáticos, capaces de evitar complicaciones trombóticas adversas en pacientes con patologías vasculares subyacentes y al mismo tiempo brindar protección contra complicaciones hemorrágicas graves.

Ejemplo 17

Materiales

La IgG de ratón y conejo de control, quinacrina-HCl (mepacrina) y apirasa fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Protrombina humana (FII), trombina (FIIa), FV, FVa, FIX, FIXa, FX, FXa, antitrombina (AT), inhibidor de tripsina de maíz (CTI), dansilarginina N-(3-etil-1,5-pentanodiil)amida (DAPA), el activador FX del veneno de víbora de Russel y el anticuerpo monoclonal anti-FV humano (MoAb) AHV-5146 (que se une a los residuos 306-506 en el dominio FV A1-A2) fueron de Haematologic Technologies (Essex Junction, VT). Rivaroxaban y apixaban eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). La albúmina sérica bovina (BSA) era de Calbiochem (San Diego, CA); factor tisular recombinante humano relipidado (rTF; Dade Innovin) de Siemens Healthcare Diagnostics (Deerfield, IL). Dado que el fabricante ya no proporciona la concentración de proteínas y fosfolípidos (PL) de Innovin, todos los lotes utilizados se calibraron frente a un lote (# 53691) de concentración conocida de TF (13.9 nM) utilizando un ensayo de generación de FXa que incluía diversas concentraciones de rTF para obtener una curva dosis-respuesta, FVIIa 100 pM, FX 135 nM, CaCl22.5 mM, incubado durante 60 s a 37 °C. La concentración de procoagulante PL se determinó mediante la actividad de protrombinasa en una reacción que incluía rTF, FXa 12.5 pM, FVa 10 nM, protrombina 1 pM, CaCh 2.5 mM, incubado durante 60 s a 37 °C. Mediante calibración con vesículas PL que consisten en 80% de fosfatidilcolina<(PC) y 20% de fosfatidilserina (PS) mol/mol (Avanti Polar Lipids, Alabaster, a>L)<- sonicadas en NaCl 0.15 M, ácido 4->(2-hidroxietil)piperazina— 1-etanosulfónico (HEPES) 10 mM, pH 7.4- la solución de rTF de referencia contenía PL 101.4 pM. La proteína S humana (PS) procedía de Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN); el pentasacárido de heparina que se une a AT (fondaparinux sódico; Arixtra) de Glaxo-SmithKline S.p.A. (Verona, Italia); anticuerpo antiprotrombina humana de oveja de Affinity Biologicals (Ancaster, ON); Proteína anticoagulante c2 del nematodo (NAPc2) de Corvas International (San Diego, CA). Los FVIII MoAbs anti-humano inhibidores fueron ESH-8 y 8D4, de Sekisui Diagnostics (Stamford, CT) y Dr. Marc Jacquemin (Lovaina, Bélgica), respectivamente - y C5, descrito previamente (56). FVIII fue un regalo de Bayer Healthcare (Berkeley, CA). Se produjeron y caracterizaron TFPI recombinante, FVIIa humano, FVIIa S195A inactivo (numeración de quimotripsina; iFVIIa), FVIIa T99Y y FVIIa E154A mutantes, dominio extracelular de TF soluble (sTF1-218) y protrombina inactiva S195A como se conoce en la técnica. El FVIIIa se preparó incubando FVIII 190 nM con trombina 19 nM y CaCh 5 mM durante 30 segundos a 37 °C, seguido de lepirudina ([Leu1-Thr2]-63-desulfohirudina recombinante 36 nM; Refludan, Bayer Corp, Pittsburgh, PA) para neutralizar la actividad de la trombina.

Ejemplo 18

Experimentos de perfusión sanguínea.

Se recubrieron cubreobjetos de vidrio tratados con poli-L-lisina 0.2 mg/ml durante 6 h a 37 °C con rTF durante 18-20 horas a 37 °C o colágeno tipo I insoluble en ácido 2.5 mg/ml de durante 2 horas a 2225 °C. Luego se enjuagaron con solución salina tamponada a pH 7.4, se ensamblaron en una cámara de flujo rectangular con una junta de silicona de 125 μm de alto y se colocaron en una etapa de microscopio confocal para su análisis. La sangre venosa para la prueba se recogió en citrato trisódico final 10.9 mM usando una jeringa de plástico para voluntarios normales o tubos Vacutainer (Becton Dickinson, Buccinasco, Milán) para pacientes y controles. Antes de la perfusión a un caudal que produzca una rata de cizallamiento inicial de la pared de 300 s_1 mantenido con una bomba de jeringa (Harvard Apparatus, Holliston, MA), se añadió CaCh para obtener Ca2+1.29 mM. En la sangre de los pacientes -potencialmente hipercoagulables- y de los controles relacionados, también se añadió lepirudina (50 nM) para neutralizar la trombina posiblemente generada antes de la prueba. En experimentos preliminares, esta cantidad de lepirudina tuvo un efecto limitado sobre el volumen de fibrina depositado en la cámara de flujo. Para experimentos con WT y FVIIa mutante, se lavaron células del grupo O con sangre citratada, que contenían CTI 50 μg/ml y apirasa (actividad ADPasa) 10 U/ml, para eliminar el plasma mediante pasos de centrifugación secuenciales a 1500 g durante 7 minutos. Después del primero, el plasma se reemplazó con un volumen igual de tampón Tyrode libre de calcio, pH 6.5, con apirasa 5 U/ml; luego con tampón y apirasa 1.25 U/ml; y finalmente con plasma humano deficiente en FVII (George King Bio-Medical, Overland Park, KS) hasta el volumen de sangre original. Los resultados del recuento celular en sangre reconstituida y nativa estuvieron dentro del 90%. Los experimentos en Milán (Italia) se realizaron con un microscopio Leica TCS SP5 y un objetivo de inmersión en aceite HCX PL APO 63x/1.40 NA (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania); en La Jolla (California) con un objetivo de inmersión en aceite Zeiss Axiovert 135M/LSM 410 y Plan-Apochroma 40x/1.40 NA (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania).

Las plaquetas adheridas y agregadas a la superficie se visualizaron añadiendo quinacrina-HCl (mepacrina; 10 μg/ml; Sigma-Aldrich) a la sangre. La fibrina depositada se visualizó con IgG monoclonal de ratón marcada con Alexa Fluor 546 (Invitrogen) (50 μg/ml) específica para la cadena B de fibrina de ratón y humana (HB-8545; ATCC). La sangre se perfundió durante 3-5 minutos a 37 °C con una bomba de jeringa (Harvard Apparatus Inc.) a un caudal que produjo una rata de cizallamiento de la pared inicial (en la ruta de flujo sin obstrucciones) de 300 s-1. A esto le siguió tampón (DMEM) durante 2 minutos para facilitar la cuantificación de fibrina mediante análisis confocal de sección z utilizando un microscopio Zeiss Axiovert 135M/LSM 410 (Carl Zeiss) y un objetivo de inmersión en aceite Plan-Apochroma *63/1.40 NA. El análisis de imágenes se realizó con NIH ImageJ64. El volumen de fibrina depositada se midió a partir de secciones confocales recogidas en 4 posiciones preestablecidas en la cámara de flujo. El volumen total de plaquetas y fibrina depositadas se calculó a partir de la suma de la cobertura del área respectiva por sección multiplicada por el intervalo z (2 |jm). Todos los estudios con sujetos humanos se realizaron siguiendo protocolos aprobados institucionalmente.

Ejemplo 19

Análisis de TG en PRP humano nativo o reconstituido.

Las TG en PRP o PRP reconstituido se evaluaron como saben los expertos en la técnica. Se preparó PRP nativo a partir de sangre recogida en citrato trisódico final 12.9 mM mediante centrifugación a 250gdurante 10 min a 25°C. El recuento de plaquetas se ajustó a 180*103/|jl por dilución con PPP homólogo obtenido centrifugando PRP durante 10 min a 1,500 g. Se añadió CTI a 30-50 μg/ml dependiendo de la potencia calibrada evaluada mediante la inhibición de FXIIa. El PRP reconstituido se preparó con plaquetas lavadas preparadas a partir de PRP normal añadiendo 1/5 del volumen de citrato ácido-dextrosa (ácido cítrico 71 mM, citrato trisódico 85 mM y dextrosa 111 mM, pH 4.5) y apirasa 5 U/ml; después de la centrifugación a 1,500gdurante 10 minutos a 25°C, la pella de plaquetas se resuspendió en PPP sin FVII (George King Bio-Medical) o FIX (Haematologic Technologies) para dar un recuento final de plaquetas de 180. 103/μl. Se mezcló PRP con concentraciones variables de rTF y/o FlXa 20 pM en placas de microtitulación de 96 pocillos. La reacción se inició añadiendo CaCh 18 mM con 360 jM del sustrato de trombina benciloxicarbonil-glicilglicil-L-arginina acoplado al grupo fluorogénico 7-amido-4-metilcumarina (Gly-Gly-Arg-AMC; Bachem Americas, Torrance, CA). La fluorescencia se midió continuamente a 37 °C durante hasta 40 minutos en un espectrofluorómetro (excitación/emisión de 355/460 nm). La tasa de aumento de la intensidad de la fluorescencia en función del tiempo (dF/dt) se calculó con Turbo Delphi 2006 (Borland Software Corporation, Austin, TX) y se convirtió a concentración equivalente de trombina (nM) usando una curva de calibración. El potencial de trombina endógena (ETP) de las muestras, es decir, la actividad total de trombina generada se determinó a partir del área bajo la curva TG. Cuando se especificó, las TG se midieron con un ensayo discontinuo de 2 etapas con un límite de detección de 5 pM. Para ello, se indujo TG con rTF 0.15 pM y CaCh 18 mM en PRP deficiente en FVII reconstituido que incluye CTI 30 μg/ml con FVIIa WT 400 pM o iFVIIa sin o con FlXa 20 pM. Después de la incubación durante hasta 11 minutos a 37°C, las reacciones se terminaron añadiendo EDTA20 mM y la trombina generada se midió utilizando el sustrato de trombina altamente sensible H-D-CHA-Ala-Arg-AMC2AcOH (Pefafluor TH, Pentapharm, Basilea, Suiza) a una concentración de 50 jM . En otros experimentos, la TG fue inducida por TFiFVIIa-FXa-TFPI o TF-iFVIIa-FXa-NAPc2. Estos complejos estables se formaron previamente incubando FXa 5 nM, TF 10 nM, iFVIIa 10 nM y TFPI o NAPc240 nM en presencia de CaCl2 2.5 mM durante 2 min a 37°C. Los complejos se agregaron a PRP deficiente en FVII, seguido de una incubación durante 8 minutos a 37°C.

Ejemplo 20

Análisis de activación de FVIII y FV mediante transferencia Western(WB).

Los productos de la reacción de coagulación se separaron mediante electroforesis reductora en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), excepto el análisis de la activación del FVIII en presencia de anti-FVIIa MoAbs que se realizó en condiciones no reductoras. Después de la transferencia a una membrana de fluoruro de polivinilideno, las transferencias se sondaron con MoAb c 5, biotinilado o no (0.5 μg/ml), para la activación del FVIII; MoAb AHV-5146 (1 μg/ml) para FV. La detección infrarroja cuantitativa de FVIIIa y FVa se obtuvo con IgG anti-ratón conjugada con IRDye 800CW o estreptavidina, seguido del análisis con el generador de imágenes infrarrojas Odyssey (Li-COR, Lincoln, NE). Las concentraciones se calcularon mediante calibración con cantidades conocidas de FVIIIa y FVa.

Ejemplo 21

Activación de la coagulación en reacciones con componentes purificados.

Las mezclas de reacción sintéticas comprendían FVIII 0.7 nM, FV 3 nM, FX 135 nM, protrombina 1 jM en solución salina tamponada con Tris 50 mM, pH 7.4, con BSA al 0.1 %. Se agregaron inhibidores de la coagulación TFPI, PS, AT/pentasacárido, NAPc2 e inhibidores directos del FXa (tales como rivaroxaban y apixaban) en las concentraciones indicadas. Las reacciones para prevenir los efectos de la trombina se llevaron a cabo en presencia de lepirudina 200 nM o DAPA 4 jM . Las reacciones se iniciaron añadiendo rTF de 0.6 a 400 pM, FVIIa de 200 a 500 pM o/y FIXa 10 nM, seguido de CaCh 2.5 mM e incubación a 37 °C durante los tiempos indicados. Luego se añadió EDTA 10 mM para detener la reacción. La generación de FXa, FIIa y trombina se evaluó midiendo la actividad amidolítica hacia el sustrato cromogénico S-2765 (180 jM ; N-a-benciloxicarbonil-D-arginil-L-glicil-L-arginina-p-nitroanilina; DiaPharma, West Chester, OH) y el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg-AMC (360 jM ) respectivamente.

La generación de FXa en fase de contacto se estudió añadiendo FXIIa (500 pM) sin o con TF 0.6 pM/FVIIa 200 pM en reacciones que incluyen DS 0.2 μg/ml, HMWK 100 nM, FXI 30 nM, ZnCl250 jM , FIX 90 nM, FX 135 nM, FVIII o FVIIIa 700 pM, VWF 18 nM, PL 20 jM y CaCh 2.5 mM. La generación de FIIa en presencia de DAPAy la activación de FVIII y FV se determinaron mediante transferencia Western (WB) como se describe a continuación. El complejo de activación de la vía extrínseca (TF-FVIIa-FXa) se estabilizó mezclando NAPc2 (5 o 40 nM) con iFVIIa (100 o 200 pM), FXa (100 o 200 pM) y rTF (50 o 400 pM). La actividad protrombinasa de FXa se midió en reacciones que contenían FVa 10 nM, FII 1 pM y CaCh 2.5 mM. a 37 °C durante los tiempos de incubación indicados. La actividad anti-FXa de rivaroxaban y apixaban se midió como inhibición de las actividades amidolíticas o protrombinasa. Para medir la inhibición de la actividad amidolítica del FXa, se mezcló FXa 1 nM con concentraciones variables de inhibidor y el sustrato cromogénico S-2765 (360 pM); (DO) a 405 nm se midió continuamente a 37 °C durante hasta 10 minutos en un lector de microplacas. La actividad amidolítica de FXa se determinó a partir de la pendiente de la curva OD/min calculada usando GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Para medir la inhibición de la actividad protrombinasa de FXa, se incubó FXa 50 pM con rTF 50 pM, FVa 3 nM y FII 1 pM a 37 °C. Después de 4 minutos, la reacción se apagó con EDTA10 mM y el FIIa generado se determinó utilizando el sustrato fluorogénico Z-GGR-AMC. La mitad de la concentración inhibidora máxima (CI50) de ambos inhibidores se determinó utilizando GraphPad Prism.

Para bloquear la actividad de la trombina, las reacciones se llevaron a cabo en presencia de DAPA 4 pM o con S195A inactivo reemplazando la protrombina WT. En algunos experimentos, se omitió la protrombina de las reacciones y se añadió lepirudina 200 nM para inactivar la trombina potencialmente contaminante. El efecto de rivaroxaban y apixaban sobre la activación del<f>VII por el FXa generado de novo también se examinó añadiendo el activador del FX del veneno de víbora de Russel (13. 5 pM) en reacciones que contienen rTF 50 pM como superficie de fosfolípido, pero sin FVIIa, y TFPI 10 nM, seguido de WB de FVIIIa. Se preparó un complejo estable con FXa como única proteasa activa con rTF 50 pM, FVIIa-S195A (iFVIIa) 100 pM, FXa 100 pM y NAPc25 nM incubados durante 120 segundos a 37 °C. La activación del FVIII por este complejo se examinó en reacciones que incluían FVIII, FV y lepirudina incubadas durante 120 s.

El recambio de sustrato por TF-FVIIa se evaluó monitorizando la generación de FXa en reacciones sin fosfolípidos que incluyen FVIIa 10 nM, sTF1-2182 pM y FX 1 pM. La inhibición de la actividad amidolítica del FXa por rivaroxaban o apixaban se midió mezclando FXa 1 nM con concentraciones variables de inhibidor y el sustrato cromogénico S-2765 (360 pM); La DO a 405 nm se midió continuamente a 37 °C durante hasta 10 minutos en un lector de microplacas. La actividad amidolítica de FXa se determinó a partir de la pendiente del cambio de DO en función del tiempo calculado utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). La inhibición de la actividad protrombinasa se midió incubando FXa 50 pM con rTF 50 pM como superficie de fosfolípido, FVa 3 nM y protrombina 1 pM a 37 °C; después de 240 s, la reacción se apagó con EDTA 10 mM y la trombina generada se cuantificó utilizando el sustrato fluorogénico Z-GGR-AMC (360 pM). La concentración inhibidora media máxima (CI50) para cada sustancia se determinó ajustando la curva dosis-respuesta inhibidora correspondiente utilizando GraphPad Prism.

Ejemplo 22

Trombosis inducida por cloruro férrico en ratones.

Todos los procedimientos con animales cumplieron con Guide for Care and Use of Laboratory Animals y fueron aprobados por la IACUC del Instituto de Investigación Scripps. Se indujo lesión vascular en ratones C57BL/6J utilizando una única gota de 0.8 μl de 7% (0.26 M) o 8% (0.30 M) FeCl36H2O en la arteria carótida durante 3 min; o una gota de 0.4 μl al 4% (0.15 M) durante 1 minuto en la vena femoral, seguido de enjuague.

La trombosis de la arteria carótida se describió mediante dos parámetros: 1) Tiempo hasta la primera oclusión, definido como el momento en el que el flujo sanguíneo en la arteria cayó a 0.1 ml/min o menos; y 2) índice de flujo (FI), definido como la relación entre el volumen sanguíneo total que fluye a través de la arteria 30 minutos después de la lesión (integrado a partir del flujo sanguíneo volumétrico muestreado cada 1 s) y el volumen correspondiente en la arteria ilesa (calculado a partir del flujo medido durante 1 minuto antes de la lesión); por lo tanto, FI = 1 indica que no hay cambios en el flujo. La trombosis venosa se evaluó mediante una evaluación basada en videomicroscopía de epifluorescencia del agregado plaquetario y la formación de fibrina en tiempo real en un vaso lesionado. Plaquetas lavadas marcadas con calceína rojo anaranjado (2*106/g de peso corporal) se inyectaron en la vena yugular del ratón antes de establecer la lesión vascular. La fibrina se visualizó inyectando anticuerpo antifibrina marcado con isotiocianato de fluoresceína (0.8 μg/g de peso corporal) con la suspensión de plaquetas marcada. El tamaño del trombo se evaluó cuantitativamente midiendo la densidad de píxeles integrada en imágenes seleccionadas de agregados de plaquetas fluorescentes y fibrina utilizando el software Image J.

Los anticuerpos contra TF o FXI se administraron mediante inyección en bolo de las cantidades indicadas en la vena yugular cateterizada. El FVIII y el FVIIIa se administraron mediante una inyección en bolo (1.4 μmol) seguida de mantenimiento con infusión continua a una velocidad de 0.47 pmol/min durante 15 minutos. El tiempo hasta la primera oclusión después del inicio de la lesión es el necesario para una disminución del flujo sanguíneo a menos del 10% del valor medido inicialmente en la arteria ilesa. El índice de flujo es la relación entre el volumen sanguíneo total que fluye a través de la arteria después de la lesión (integración del flujo medido en ml/min y muestreado cada segundo durante 30 minutos) y el flujo esperado en la arteria ilesa (calculado a partir del flujo medido durante 1 minuto antes de la lesión multiplicado por 30).

Ejemplo 23

Análisis Estadístico.

Para los análisis estadísticos, se utilizaron GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA) y XLSTAT (Addinsoft, París, Francia). La homogeneidad de la varianza se evaluó con la mediana de Levene y las pruebas de Bartlett. Para comparaciones múltiples entre grupos, se utilizó ANOVA de una vía, después de la transformación de datos y = log10 y cuando fue necesario para la homocedasticidad, seguido de las pruebas de Tukey o Dunnett; o la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de las pruebas de Dunn. En algunas realizaciones, los datos mostrados en esta divulgación son medias con error estándar de la media (SEM) del número indicado de valores experimentales.

Ejemplo 24

Generación de trombina en plasma rico en plaquetas (PRP) humano o PRP reconstituido.

Se preparó PRP a partir de sangre recogida en citrato trisódico (concentración final 0.0129 M) mediante centrifugación a 25ogdurante 10 min a 25 °C; el recuento de plaquetas se ajustó a 180103 por μl diluyendo con plasma pobre en plaquetas (PPP) homólogo obtenido centrifugando PRP durante 10 minutos adicionales a 1.500g.Cuando estaba indicado, se añadió CTI de 30 a 50 μg/ml dependiendo de la potencia calibrada medida por la inhibición de FXIIa. La PRP reconstituida se preparó añadiendo plaquetas lavadas normales en PPP (sin o con CTI) que carecen de FVII, FVIII (ambos de George King Bio-Medical, Overland Park, KS) o FIX (Haematologic Technologies). La generación de TFIIa en PRP se midió como lo describen Hemker et al. Se mezclaron 53 μl de PRP en placas de microtitulación de 96 pocillos con 15 μl de una solución que contenía rTF y/o una de las proteasas de la vía de coagulación intrínseca (FXIIa, FXIa o FlXa) para lograr las concentraciones finales indicadas. En este punto también se añadieron anticuerpos o inhibidores a la concentración indicada para cada caso concreto. La reacción se inició añadiendo entre 15 y 20 μl de CaCl2100 mM y sustrato fluorogénico 2 mM, benciloxicarbonil-glicil-glicil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina (Gly-Gly-Arg-AMC; Bachem Americas, Torrance, CA). La generación de FIIa en PPP también se examinó en presencia de anticuerpo policlonal inhibidor anti-TFPI o IgG de conejo de control (20 μg/ml) con vesículas de fosfolípidos añadidas (5 pM). La intensidad de fluorescencia relativa que se desarrolló durante la reacción se midió continuamente a 37 °C durante hasta 40 minutos en un espectrofluorómetro (excitación 355 nm y emisión 460 nm). El aumento de la velocidad de la intensidad de la fluorescencia en función del tiempo (dF/dt) se calculó utilizando el programa Turbo Delphi 2006 (Borland Software Corporation, Austin, TX) y se convirtió a concentración equivalente de trombina (nM) utilizando una curva de calibración. La generación de FIIa se describió determinando el tiempo de retardo (tiempo hasta que se formó trombina 3 nM) y el potencial de trombina endógena (ETP; actividad total de trombina generada determinada a partir del área bajo la curva de evolución temporal de la generación de trombina).

Ejemplo 25

Análisis de transferencia Western de activación de FII, FVIII y FV.

Las muestras para el análisis de transferencia Western (WB) se sometieron primero a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) y 2-mercaptoetanol 512 nM. Después de la transferencia a una membrana de fluoruro de polivinilideno, las bandas de proteínas se revelaron con anticuerpo policlonal de oveja anti-FII humano (0.5 μg/ml), anti-FVIII MoAb C5 (0.5 μg/ml) o anti-FV MoAb AHV- 5146 (2 μg/ml). Los fragmentos de activación de FII se detectaron mediante quimioluminiscencia utilizando IgG anti-oveja biotinilada (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y conjugado de peroxidasa de rábano picante (HRP)-estreptavidina (Life Technologies, Grand Island, NY). Para la detección cuantitativa por infrarrojos (IR) de FVIIIa y FVa, se utilizó IgG anti ratón conjugada con IRDye 800CW (Li-COR, Lincoln, NE), seguido del análisis con el generador de imágenes infrarrojas Odyssey (Li-COR). Los valores se derivaron de curvas de calibración obtenidas con cantidades conocidas de FVIIIa y FVa.

Ejemplo 26

Función única de FXa

En algunas realizaciones, la divulgación proporcionada en el presente documento proporciona dos líneas importantes de evidencia que demuestran una función única de FXa derivada de TF-FVIIa para respaldar la activación del cofactor VIII. En algunas realizaciones, en la primera línea de evidencia es que TF-FVIIa puede generar FXa que a su vez genera FVIIIa sin efecto significativo del anticoagulante fisiológico TFPo inhibidores farmacológicos directos de FXa tales como rivaroxabán. Sin embargo, el activador FX del veneno de víbora de Russel (RVV-X), que es una metaloproteinasa heterotrimérica con una cadena pesada similar a ADAM de mamífero y dos cadenas ligeras similares a lectina, no puede generar FXa. En algunas realizaciones, incluso en presencia de TFPI y rivaroxaban combinados (este último en una concentración tan alta como 450 nM) hubo una generación sustancial de FVIIIa cuando la coagulación mediada por TF fue iniciada por FVIIa, pero una inhibición sustancial cuando el iniciador fue RVV-X. En algunas realizaciones, todas las reacciones contenían el potente inhibidor de la trombina, lepirudina, para eliminar cualquier retroalimentación sobre la activación del FVIII por la trombina generada. En algunas realizaciones, estos hallazgos proporcionaron apoyo experimental adicional para la identificación de una función de activación del FVIII del FXa naciente asociado con el complejo de iniciación de la coagulación extrínseca (TF-FVIIa) que es distinta de la activación directa conocida del FVIII por el propio FXa.

En algunas realizaciones, este concepto se ve reforzado por la segunda línea de evidencia de que las mutaciones puntuales únicas en FVIIa pueden suprimir la generación directa de FXa por el complejo de tenasa TF-FVIIa extrínseco, en relación con las especies WT, al tiempo que se preserva la activación de FVIII dependiente de TF-FVIIa por FXa naciente y, por tanto, actividad tenasa intrínseca.

En algunas realizaciones, la divulgación proporcionada en el presente documento establece las bases estructurales y bioquímicas para la función recientemente identificada del FXa naciente inducida por el complejo TF-FVIIa asociado que conduce a la generación de FVIIIa. En algunas realizaciones, esta nueva función es distinta de la actividad tenasa extrínseca generalmente reconocida que genera FXa que se incorpora al complejo de protrombinasa. Debido a que esta función permite la actividad tenasa intrínseca, que a su vez depende estrictamente del FVIII antihemofílico esencial para la hemostasia, constituye el bucle hemostático iniciado por TF definido aquí en sus detalles mecanicistas por primera vez.

Ejemplo 27

Medidas cuantitativas

En algunas realizaciones, esta divulgación permite mediciones cuantitativas distintas del potencial protrombótico y la eficiencia hemostática en muestras de sangre individuales en condiciones iniciales o durante el tratamiento anticoagulante y/o antitrombótico. En algunas realizaciones, en el presente documento se divulgan métodos de identificación de nuevas moléculas prohemostáticas para uso terapéutico con menor riesgo de inducir trombosis (es decir, moléculas de FVIIa modificadas que retienen el soporte del bucle hemostático iniciado por TF a través de la tenasa intrínseca, pero disminuyen la generación directa de FXa).

Se sabe comúnmente que la hemostasia es esencial para detener la hemorragia y prevenir la hemorragia espontánea. La coagulación sanguínea juega una función central en el mantenimiento de la hemostasia. En la coagulación sanguínea, el factor (F) VIII funciona como cofactor esencial para la proteasa de coagulación intrínseca, FIXa. Una vez activado a su forma activa (FVIIIa), el FVIIIa se une a FIXa y el complejo FVIIIa-FIXa amplifica la generación de trombina (FIIa) promoviendo la generación de FXa. Finalmente, el FIIa generado convierte el fibrinógeno en un coágulo de fibrina estable, lo que lleva a la hemostasia. En apoyo del concepto, el defecto congénito del FVIII (hemofilia A) se asocia con episodios de hemorragia graves, que en ocasiones ponen en peligro la vida. Los pacientes con hemofilia se han clasificado en tres categorías con base en la actividad coagulante del FVIII plasmático (FVIII:C): grave (<1 IU/dL de FVIII:C), moderada (1-5 IU/dL) y leve (>5 IU/dL). Actualmente, el FVIII:C se determina mediante ensayos basados en la coagulación, tal como el tiempo de tromboplastina activada parcial (TTPA). El ensayo de coagulación convencional es útil para una clasificación general de pacientes, pero entre los casos graves así clasificados existe una considerable heterogeneidad de fenotipos clínicos. Esto se debe a que la baja sensibilidad del ensayo actual de FVIII basado en la coagulación es insuficiente para discriminar el riesgo de hemorragia moderada del grave resultante de niveles de FVIII:C en el intervalo de -1-0.1 IU/dL.

Ejemplo 28

Ensayo novedoso

En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un nuevo ensayo que tiene una mayor sensibilidad y es capaz de discriminar entre riesgo de hemorragia moderado y grave en pacientes. En algunas realizaciones, el ensayo descrito en el presente documento permite una clasificación más detallada de los pacientes, una predicción precisa del riesgo de hemorragia y la asociación con la infusión profiláctica o terapéutica de FVIII. En algunas realizaciones, la sensibilidad del ensayo divulgado es hasta 10 veces mayor que los métodos disponibles actualmente. En otras realizaciones, la sensibilidad del ensayo divulgado es más de 1o veces mayor que los métodos disponibles actualmente.

Basado en el nuevo mecanismo de activación del FVIII divulgado en el presente documento, se describe un nuevo ensayo. En algunas realizaciones de este ensayo, la TG se desencadena mediante la adición combinada de concentraciones extremadamente bajas (por ejemplo, concentraciones picomolares) de TF relipidado y FIXa (concentraciones picomolares o nanomolares) en el plasma del paciente. En algunas realizaciones, la adición de TF o FIXa individualmente no genera FIIa significativa en el plasma de un paciente con hemofilia A debido al control del inhibidor de la vía del TF (TFPI) y a la reacción lenta, respectivamente. En otras realizaciones, la adición combinada de los dos iniciadores de la coagulación en concentraciones individualmente inactivas amplifica sinérgicamente las TG (Fig. 10). En algunas realizaciones, los estudios bioquímicos sobre el mecanismo de sinergia en plasma muestran que TF forma un complejo con FVIIa y FX en el que este último se activa a FXa que, aunque todavía está unido a TF-FVIIa y protegido de la inhibición de TFPI (por lo tanto, con un diferente mecanismo en comparación con el FXa libre) activa FVIII a FVIIIa, que a su vez se une a FIXa amplificando la generación de FXa y TG. En algunas realizaciones, el nuevo método de TG divulgado en el presente documento permite la detección de niveles muy bajos de FVIII en plasma, como se muestra mediante ensayos de plasma de pacientes con hemofilia A enriquecidos con FVIII hasta un límite de detección de 0.07 IU/dL de FVIII:C (Fig. 10 B y C). Por tanto, en una realización, el método divulgado en el presente documento determina específicamente la activación de FVIII accionada por TF y las TG inducidas por el complejo FVIIIa-FIXa.

En algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento un método sensible para determinar niveles bajos de FVIII:C en pacientes con hemofilia A grave e individuos con deficiencia adquirida de<f>VII. En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona un ensayo novedoso que permite una caracterización más precisa de los fenotipos de hemorragia y la predicción del riesgo de hemorragia en pacientes con hemofilia A grave, mejorando así la terapia de reemplazo con productos de FVIII.

En algunas realizaciones, el nuevo ensayo divulgado en el presente documento es útil para monitorizar el tratamiento con concentrados de FVIII y para evaluar la potencia del concentrado. En otras realizaciones, el ensayo se utiliza para identificar variantes de FVIII con funcionalidad mejorada y/o mayor estabilidad, y/o para cribar nuevos agentes hemostáticos con eficacia y seguridad mejoradas para el tratamiento de la hemofilia A.

Ejemplo 29

Mutantes del factor FVIIa

En algunas realizaciones, se obtuvo evidencia adicional que respalda el nuevo mecanismo de activación del cofactor VIII caracterizando dos mutantes de FVIIa, T99Y y E154A. Ambos conservan actividad catalítica para la escisión de FX, pero con tasas de recambio de sustrato notablemente reducidas en comparación con el FVIIa de tipo silvestre (WT), por lo que no pueden sostener la generación de FXa después de la ráfaga inicial. En algunas realizaciones, a pesar de una generación de FXa notablemente disminuida, los complejos TF-FVIIa mutantes y de tipo silvestre soportaron una activación de FVIII dependiente de FXa comparable. En algunas realizaciones, en las mismas condiciones, los dos mutantes, a diferencia de WT FVIIa, no lograron activar el procofactor de protrombinasa FV que es altamente homólogo al FVIII. En algunas realizaciones, a pesar de la generación directa de FXa muy deteriorada, ambos mutantes de FVIIa apoyaron la producción de FXa dependiente de FVIIIa en presencia de FIXa añadido con tanta eficacia como WT. En algunas realizaciones, estos resultados muestran que la generación de FXa puede bloquearse directamente mediante el complejo de tenasa extrínseca TF-FVIIa. En algunas realizaciones, esto genera trombina protrombótica, sin interferir con la vía divulgada en el presente documento a través de la cual el TF-FVIIa-FXa naciente activa el complejo de tenasa intrínseca antihemofílico FVIIIa-FIXa prohemostático.

En algunas realizaciones, en el presente documento se divulgan bases bioquímicas para la nueva función generadora de FVIIIa del FXa naciente dentro del complejo TF-FVIIa que son distintas de la del FXa libre liberado de la tenasa extrínseca para incorporarse al complejo de protrombinasa. En algunas realizaciones, esta nueva función que permite la actividad tenasa intrínseca, que a su vez depende estrictamente del FVIII antihemofílico esencial para la hemostasia, constituye el bucle hemostático iniciado por TF definido aquí en sus detalles mecanicistas por primera vez.

En algunas realizaciones, una diferencia entre los dos mutantes de FVIIa está en la capacidad de convertir FIX en FIXa, una función conocida del complejo TF-FVIIa. En algunas realizaciones, T99Y y E154 FVIIa tienen una capacidad comparable para respaldar la activación de FVIII mediante el producto FXa naciente. Por lo tanto, tanto los mutantes como el WT FVIIa apoyaron la producción de FXa dependiente de FVIIIa mediante la adición de FIXa. En algunas realizaciones, cuando en su lugar se añadió zimógeno FIX, solo el mutante del exosito de FVIIa E154A, pero no T99Y, apoyó la formación de un complejo de tenasa intrínseca FVIIIa-FIXa funcional que conduce a la generación de FXa.

En algunas realizaciones, los dos mutantes de FVIIa se usaron para evaluar la importancia de la conversión de FIX a FIXa mediante TF-FVIIa para la generación de trombina en el contexto de plasma rico en plaquetas (PRP) con inhibidores fisiológicos de la coagulación. Por lo tanto, al agregar FVIIa a plasma deficiente en FVII suplementado con plaquetas lavadas normales, se encontró que WT o E154A FVIIa producían niveles comparables de trombina, pero T99Y FVIIa era menos eficiente (Fig. 5F). En algunas realizaciones, la inhibición de la generación de FVIIIa bloqueó las TG de los dos mutantes, mientras que WT FVIIa produjo TG residuales (Fig. 5). Esto es consistente con el defecto selectivo de los mutantes de FVIIa en el desencadenamiento directo del FXa y, por tanto, de la generación de trombina. En algunas realizaciones, el bloqueo de la actividad de FXIa tuvo un efecto modesto sobre las TG por FVIIa E154A en comparación con WT, mientras que redujo notablemente las TG por FVIIa T99Y (Fig. 5). En algunas realizaciones, estos resultados demostraron que la activación tanto de FVIII como de FIX es esencial para la coagulación intrínseca iniciada por TF. En algunas realizaciones, el hecho de que el mutante FVIIa E154A, con generación directa limitada de FXa, fuera comparable a FVIIa WT en cuanto a apoyar el inicio de la vía intrínseca del TF refuerza el concepto de que la retroalimentación de la trombina tiene una función limitada en la activación del FVIII durante la coagulación desencadenada por el TF.

En una realización, el mutante E 154A permite medir la contribución relativa del bucle de retroalimentación TF-FVIIa o FXIa-trombina a la generación de FIXa, la proteasa que se combina con FVIIIa como cofactor para formar el complejo de tenasa intrínseco que activa FX a FXa escapando al control de TFPI, el inhibidor fisiológico de la generación directa de FXa por TF-FVIIa. Esto también es relevante para la discriminación entre reacciones prohemostáticas y protrombóticas. En una realización, los ensayos divulgados en el presente documento pueden evaluar cuantitativamente la preservación de un mecanismo prohemostático resultante de la generación de FVIIIa a través del TF-FVIIa-FXa naciente.

En una realización, se usó el mutante E154A de FVIIa para estudiar la vía directa de generación de FXa, causada por la incapacidad de liberar FXa generado para el ensamblaje de protrombinasa. Sorprendentemente, el mutante E154A aún puede soportar la generación de FVIIIa mediante FXa naciente en el complejo TF-FVIIa154A-FXa. Se contempla que otras formas mutantes de FVIIa puedan tener un efecto similar. El formato de este ensayo podría incluir las propiedades del anticuerpo monoclonal anti-FVIIa 12C7, que produce un efecto similar al mutante FVIIa Y76F. Este último es similar al FVIIa E154A con respecto al soporte mínimo de la actividad protrombinasa con preservación del mecanismo de activación prohemostática del FVIII por el FXa naciente; pero además hace que el FVIIa pierda la capacidad de activar FIX a FIXa. Esto permite discriminar la vía de generación de FIXa apoyada por el bucle de trombina-FXI, que probablemente es protrombótica, de la apoyada por TF-FVIIa, que está integrado en el complejo TF-FVIIa-FXa con activación de FVIII. Por lo tanto, deberían protegerse los ensayos basados en el uso de anticuerpos como el 12C7.

Ejemplo 30

Cribado de anticuerpos monoclonales anti-FVIIa

En algunas realizaciones, se cribó un panel de anticuerpos monoclonales (MoAb) anti-FVIIa para cribar interferencias con la activación de la vía intrínseca mediada por Tf. Esto permitió aplicar la nueva vía de coagulación a la caracterización de las vías de coagulación prohemostática y protrombótica en diferentes individuos y pacientes tratados con diferentes anticoagulantes. Mientras que la mayoría de los anticuerpos inhibidores, ejemplificados por el MoAb 3G12, impidieron la activación del FVIII por el complejo de iniciación del TF, el MoAb 12C7, que se sabe que reacciona con un epítopo definido cerca del exosito de unión al sustrato macromolecular, no tuvo ningún efecto inhibidor sobre esta reacción (Fig. 9). En algunas realizaciones, el anticuerpo limitó el recambio directo de FXa mediado por FVIIa WT (Fig. 9). En algunas realizaciones, permitió la amplificación de la generación de FXa a través de FVIIIa generado por la vía TF, pero solo cuando se proporcionó FIXa y no zimógeno FIX (Fig. 9B). En algunas realizaciones, este hallazgo demuestra que MoAb 12C7 inhibe la conversión de FIX a FIXa mediante TF-FVIIa. En algunas realizaciones, esto proporciona una herramienta para diseccionar funcionalmente las diferentes vías que potencialmente conducen a la generación de FIXa en sangre y probar su importancia funcional para la hemostasia o la trombosis. De hecho, en diversas realizaciones, a diferencia del anti-FVIIa MoAb 3G12 inhibidor, el MoAb 12C7 conservó TG en PRP normal. En otras realizaciones, las TG dependientes de FVIII en presencia de MoAb 12C7 se volvieron altamente susceptibles a la inhibición por el anticuerpo anti-FXI (Fig. 9C). En algunas realizaciones, MoAb 12C7 imita las propiedades del FVIIa T99Y mutante. Además, las concentraciones bajas de rivaroxabán provocaron una inhibición más pronunciada de la generación de trombina (TG) en presencia de MoAb 12C7 (Fig. 9<d>), lo que confirma que los anticoagulantes dirigidos al FXa inhiben los bucles de retroalimentación trombina-FXI al tiempo que preservan selectivamente la activación directa de FVIII y FIX por parte del complejo de iniciación de TF.

Ejemplo 31

Ensayo o prueba

En algunas realizaciones, la vía de activación del FVIII dependiente de TF recientemente identificada tiene una función clave en la generación inicial de trombina (TG) a través del complejo FVIIIa-FIXa, lo que conduce a la ráfaga secundaria de TG esencial para la hemostasia. En algunas realizaciones, se implementó una prueba en la que la TG se desencadena mediante la adición combinada de concentraciones extremadamente bajas (por ejemplo, 0.15 pM) de TF relipidado y FIXa (por ejemplo, 200 pM) en el plasma del paciente. La adición de TF o FIXa individualmente no genera FIIa significativa en el plasma de pacientes con hemofilia A debido al control del inhibidor de la vía TF (TFPI) y a la reacción lenta, respectivamente. Por el contrario, la adición combinada de los dos iniciadores de la coagulación en concentraciones inactivas individualmente amplifica sinérgicamente las TG (FIG. 10). En algunas realizaciones, el nuevo método divulgado en el presente documento permite la detección de concentraciones muy bajas de FVIII en plasma. Es importante destacar que el mecanismo detectado por este nuevo ensayo difiere del mecanismo conocido de activación del FVIII por el FXa libre. En algunas realizaciones, como lo muestran las mediciones en plasma de pacientes con hemofilia A enriquecidos con FVIII, el límite de detección del nuevo ensayo es FVIII:C 0.07 IU/dL. Por tanto, en una realización, el método inventado determina específicamente la activación del FVIII impulsada por TF y las TG inducidas por el complejo FVIIIa-FIXa.

En algunas realizaciones, la presente divulgación es la base para ensayos de coagulación recientemente diseñados que pueden ayudar a individualizar la definición de riesgo trombótico y de hemorragia para pacientes tratados con nuevos anticoagulantes orales. Por ejemplo, en una realización, el método divulgado en el presente documento puede identificar objetivamente situaciones que requieren ajuste de dosis para un mejor efecto antitrombótico o para reducir la posibilidad de complicaciones hemorrágicas. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona nuevas perspectivas relevantes para la identificación y prueba de nuevos enfoques farmacológicos para la prevención y el tratamiento de la trombosis preservando al mismo tiempo una función hemostática suficiente.

En algunas realizaciones, la presente divulgación permite la evaluación de nuevos candidatos a fármacos antitrombóticos centrándose específica y cuantitativamente en la preservación funcional o degradación de los cofactores de coagulación en el contexto de la coagulación iniciada por TF, diferenciando entre vías protrombóticas y prohemostáticas. En algunas realizaciones, esto mejora la sección de candidatos a fármacos con el mejor perfil de efectos antitrombóticos frente al perfil de seguridad con respecto a las complicaciones hemorrágicas. En algunas realizaciones, los mismos beneficios mejoran la monitorización y evaluación de regímenes antitrombóticos basados en nuevos fármacos o combinación de fármacos, una cuestión clave para lograr el mejor tratamiento individualizado con diferentes anticoagulantes selectivos de objetivo en un terreno mecanicista. Con respecto a la hemostasia, los nuevos ensayos divulgados en el presente documento detectan niveles bajos de FVIII:C en pacientes con hemofilia A grave e individuos con deficiencia adquirida de FVIII. En algunas realizaciones, los ensayos de actividad del FVIII con mayor sensibilidad permiten una caracterización más precisa de los fenotipos de hemorragia y una predicción del riesgo de hemorragia en pacientes con hemofilia A grave, mejorando así la terapia de reemplazo con productos de FVIII. En algunas realizaciones, dichos ensayos también ayudan a identificar variantes del FVIII antihemofílico con ganancia de función y/o mayor estabilidad en la vía de coagulación recientemente identificada, mejorando así la terapia de reemplazo en pacientes con función antihemofílico defectuosa del FVIII.

Ejemplo 32

Generalmente

La coagulación de la sangre en respuesta a una lesión tisular es clave para la hemostasia y la inmunidad innata, pero puede provocar una trombosis vascular que provoque enfermedades graves. En el esquema de coagulación actual (Fig. 1, izquierda), el complejo de iniciación de la vía extrínseca del factor tisular (TF) con el factor activo (F) VIIa promueve una cascada de reacciones proteolíticas que producen FXa que se combina con FVa en el complejo de protrombinasa que convierte protrombina a trombina. La trombina generada inicialmente activa los cofactores FVIII y FV en reacciones de retroalimentación que amplifican la coagulación. Cómo se pueden generar cofactores activos antes de una producción significativa de trombina sigue siendo una cuestión desconcertante y ahora se considera que el FXa es el activador FV relevante durante el inicio de la coagulación. Esta divulgación proporciona la contribución de FXa y/o TF-FVIIa al inicio de la coagulación mediante la activación directa de FVIII.

El inicio de la coagulación extrínseca está controlado por el inhibidor de la vía del TF (TFPI), que al inactivar FVIIa y FXa dentro de un complejo cuaternario con TF atenúa la trombosis. Además, una región carboxilo terminal de TFPIa cargada positivamente interactúa con una secuencia ácida específica en FV parcialmente procesado, lo que interfiere con la formación de protrombinasa activa en FXa. Estos mecanismos que reducen la generación directa de trombina se compensan mediante la activación de TF-FVIIa de la vía intrínseca FIX en una reacción cinéticamente favorecida en presencia de inhibidores plasmáticos fisiológicos. Alternativamente, FIXa se genera mediante FXIa activado en un bucle de retroalimentación de trombina que también promueve la inflamación vascular o mediante FXIIa en fase de contacto. En modelos de ratón, FXIIa contribuye a la generación de trombina amplificada en la trombosis experimental, pero, de acuerdo con los datos en humanos, no tiene ninguna función en la hemostasia.

El paradigma de coagulación actualmente conocido, con la función ampliada del TFPI controlando estrechamente tanto la iniciación dependiente del TF como la generación de protrombinasa, no puede explicar fácilmente cómo la trombina producida inicialmente puede ser el origen del cofactor FVIIIa para el FIXa producido por la vía de contacto o por el propio TF-FVIIa. Por tanto, los inventores han desvelado en el presente documento una nueva función del complejo extrínseco de inicio de la coagulación mediante la cual el FXa naciente asociado con TF-FVIIa activa directamente el control del inhibidor resistente al FVIII mediante TFPI. Tal mecanismo puede ser relevante para la función del FT en la hemostasia y proporciona nuevas perspectivas para interpretar las distintas funciones de las reacciones de coagulación en la formación de trombos fisiológicos y patológicos.

Ejemplo 33

Métodos

Materiales.La IgG de ratón y conejo, la quinacrina-HCl y la apirasa eran de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Protrombina humana (FII), trombina (FIIa), FV, FVa, FX, FIXa, FX, FXa, CTI, dansilarginina N-(3-etil-1,5-pentanedil)amida (DAPA) y FV MoAb AHV-5146 anti- humano (unión a los residuos 306-506 del dominio A1-A2) eran de Hematologic Technologies (Essex Junction, VT). La albúmina sérica bovina era de Calbiochem (San Diego, CA); rTF (Dade Innovin) de Siemens Healthcare Diagnostics (Deerfield, IL); proteína S humana de Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN); proteína anticoagulante de nematodos (NAP) c2 y péptido anticoagulante de garrapatas (TAP) de Corvas International (San Diego, CA). De los FVIII MoAbs anti-humano utilizados, ESH-8 era de Sekisui Diagnostics (Stamford, CT); 8D4 fue un regalo del Dr. Marc Jacquemin (Lovaina, Bélgica); y C5, dirigido contra el dominio A1, se preparó en el laboratorio. FVIII fue un regalo de Bayer Healthcare (Berkeley, CA). TFPI recombinante; TF soluble (residuos 1-218); FVIIa WT humano y mutantes S195A (numeración de quimotripsina; iFVIIa), T99Y y E154A; y protrombina S195A se produjeron y caracterizaron como se describe. Hirugen, MoAbs anti-ratón TF 21E10, FVIIa 12C7 anti-humano, FXI 14E11 anti-ratón y FXI O1A6 anti-humano se caracterizaron previamente. Los inventores produjeron anticuerpo policlonal anti-TFPI inhibidor, FVIIa 3G12 anti-humano y TF 5G9 anti-humano MoAbs.

Experimentos de perfusión sanguínea.Se perfundieron cubreobjetos de vidrio recubiertos con TF con sangre venosa a una rata de cizallamiento de la pared de 300 s-1. Se utilizó un objetivo de inmersión en aceite Zeiss Axiovert 135M/LSM 410 y Plan-Apochroma 40x/1.40 NA (Carl Zeiss a G, Oberkochen, Alemania) para visualizar plaquetas/leucocitos y fibrina teñidas con mepacrina y un anticuerpo específico, respectivamente. El análisis de imágenes para calcular los volúmenes se realizó como se describe en el presente documento.

Análisis de TG en plasma rico en plaquetas(PRP) humano nativo o reconstituido.Las TG en PRP o PRP reconstituido se evaluaron como se describe en el presente documento. Las plaquetas en PRP se ajustaron a 180 103/μl con plasma pobre en plaquetas (PPP) homólogo y se añadió CTI a 30-50 μg/ml. El PRP reconstituido se preparó con plaquetas lavadas resuspendidas a 180 103/μl en PPP. La generación de trombina (TG) se inició añadiendo rTF y/o FlXa en concentraciones definidas con CaCh 18 mM en pocillos de placas de microtitulación que contienen benciloxicarbonilglicil-glicil-L-arginina 360 pM acoplada a 7-amido-4-metilcumarina fluorogénica (Gly-Gly-Arg-AMC; Bachem Americas, Torrance, CA) como sustrato de trombina. La tasa de aumento de la intensidad de la fluorescencia (medida a 355/460 nm de excitación/emisión) en función del tiempo (dF/dt) se calculó con Turbo Delphi 2006 (Borland Software Corporation, Austin, TX) y se convirtió en equivalente de trombina. concentración (nM) usando una curva de calibración. Lass TG también se midieron con un ensayo discontinuo de 2 etapas con un límite de detección de 5 pM. En este ensayo, las reacciones incubadas durante hasta 11 minutos a 37 °C se terminaron con EDTA 20 mM y la trombina generada se midió utilizando el sustrato de trombina sensible H-D-CHA-Ala-Arg-AMC2AcOH (Pefafluor TH, Pentapharm, Basel, Suiza) a 50 pM.

Análisis de activación de FVIII y FV mediante inmunotransferencia.Los productos de coagulación se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en condiciones reductoras, excepto las reacciones que contenían anti-FVIIa MoAbs que se procesaron en condiciones no reductoras para evitar efectos de confusión de cadenas ligeras de IgG con una masa molecular comparable al dominio FVIII A1. Las proteínas transferidas a membranas de fluoruro de polivinilideno se sondaron con anti-FVIII MoAbs C5 (0.5 μg/ml) o anti-FV AHV-5146 (1 μg/ml). El FVIIIa y el FVa se cuantificaron mediante detección infrarroja con el generador de imágenes infrarrojas Odyssey (Li-COR, Lincoln, NE) calibrado con cantidades conocidas de FVlIIa y FVa.

Activación de la coagulación en reacciones con componentes purificados.Las reacciones en solución salina tamponada con Tris 50 mM, pH 7.4, con albúmina sérica bovina al 0.1% incluyeron FVIII 0.7 nM, FV 3 nM, FX 135 nM y protrombina 1 pM sin/con DAPA 4 pM. Se agregaron TFPI y otros inhibidores según se indica. Las reacciones se iniciaron mediante rTF (50 o 400 pM) con FVIIa (200 o 500 pM) y/o FIXa (2 o 10 nM) añadido con CaCl22.5 mM y se incubaron a 37 °C durante los tiempos indicados. Después de apagar la reacción con EDTA 10 mM, el FXa generado se midió con S-2765 (180 pM). La actividad procoagulante del FVIIIa se midió como generación de FXa dependiente de FIXa; La actividad procoagulante de FVIIIa generada por el complejo TF-FVIIa-FXa naciente se calculó restando la cantidad de FXa producida en reacciones iniciadas por FVIIa y FIXa individualmente de la producida en reacciones iniciadas por FVIIa/FIXa combinados. Cuando estaba indicado, se utilizó lepirudina 200 nM para inactivar una posible contaminación por trombina.

Trombosis inducida por cloruro férrico en ratones.Los procedimientos con animales cumplieron con la Guide for Care and Use of Laboratory Animals y fueron aprobados por el TSRI Animal Care and Use Committee. Se indujo lesión vascular en ratones C57BL/6J mediante una gota de 0.8 μl de 7% (0.26 M) o 8% (0.30 M) FeCl36H2O aplicado en la arteria carótida durante 3 minutos; o una gota de 0.4 μl al 4% (0.15 M) durante 1 minuto en la vena femoral, seguido de enjuague. Los anticuerpos se administraron mediante inyección en bolo en la vena yugular cateterizada. El FVIII y el FVIIIa se administraron mediante una inyección en bolo (1.4 pmol) seguida de mantenimiento con infusión continua a una velocidad de 0.47 pmol/min durante 15 minutos. El tiempo hasta la primera oclusión después de la lesión y el índice de flujo se cuantificaron como se describe en la técnica.

Aprobación del estudio.Los estudios con seres humanos fueron aprobados por juntas de revisión institucional designadas. Los voluntarios humanos dieron su consentimiento informado para participar en los estudios antes de que se realizaran la extracción de sangre y los experimentos de acuerdo con los procedimientos establecidos.

Estadísticas.Las varianzas grupales se evaluaron con la mediana de Levene y las pruebas de Bartlett; diferencias con las pruebas ANOVA unidireccional o Kruskal-Wallis seguidas de las pruebas de Tukey y Dunn, respectivamente, para comparaciones múltiples. Los datos se transformaron como y = lógica y cuando fue necesario para obtener homocedasticidad. Los paquetes de software utilizados fueron GraphPad Prism versión 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA) y XLSTAT (Addinsoft, París, Francia).

Ejemplo 34

Resultados

La vía TF activa el FVIII in vivo.Como se mostró anteriormente, la fase de contacto FXII y TF contribuyen a la trombosis experimental en el modelo de oclusión de la arteria carótida inducida por cloruro férrico, pero aún no está claro cómo sucede esto. Los inventores descubrieron que los anticuerpos monoclonales (Mo-Abs) que bloquean la función del TF o la activación del FXI por FXIIa redujeron de forma independiente la oclusión después de una lesión de la pared del vaso causada por 7% (0.26 M) FeCh (Fig. 11A). Después de una lesión con 8% (0.3 M) FeCh las mismas concentraciones de MoAb fueron ineficaces, pero una dosis más alta de anti-FXI MoAb- no de anti-TF- aún previno la trombosis (Fig. 11A). Por lo tanto, incluso después de la lesión más grave, la trombogénesis requirió la generación de FIXa por FXIIa-FXIa. Sorprendentemente, en estas últimas condiciones, la combinación de dosis bajas de anti-TF y anti-FXI MoAbs que individualmente no tenían actividad antitrombótica redujo significativamente la oclusión arterial (Fig. 11A), lo que confirma una función de la vía TF en este modelo intrínseco de formación de trombos dependiente de la coagulación. Por lo tanto, TF podría contribuir a activar FVIII, el cofactor esencial para la proteasa tenasa intrínseca, FlXa. Como se visualiza en la vena femoral, el FVIIIa -pero no el FVIII -impidió la inhibición de la deposición de fibrina inducida por FeCh mediante la combinación de anti-TF/anti-FXI MoAb en dosis bajas, pero no mediante dosis altas de anti-FXI solo (Fig. 11B, C). Estos resultados descartaron que el FIXa generado por TF-FVIIa o vías alternativas utilizaran FVIIIa proporcionado de forma exógena para desencadenar la trombosis, lo que respalda el concepto de que TF-FVIIa contribuye a la activación de FVIII in vivo.

Para obtener evidencia experimental que respalde este concepto, se midió la generación de trombina (TG) en plasma rico en plaquetas (PRP). En reacciones que contienen un anticuerpo policlonal inhibidor que bloquea TFPy un inhibidor de tripsina de maíz (CTI) que previene la activación de fX i por FXIIa, los inventores definieron las concentraciones de FIXa o TF relipidado recombinante (rTF) que producen TG comparables (Fig. 11D, izquierda). A la misma concentración, pero sin bloqueo de TFPI (Fig. 11D, derecha), rTF produjo poca trombina y al final de la reacción, pero mejoró las TG con FIXa agregado al mismo tiempo. Esta amplificación de TG desencadenadas por FIXa requirió FVIII a una concentración plasmática <10 % pero no FIX (Fig. 11E), excluyendo la generación adicional de FIXa dependiente de TF. Dado que las concentraciones de FVIII que se sabe que son suficientes para prevenir hemorragias espontáneas graves en pacientes con deficiencia de FVIII podrían respaldar la amplificación sinérgica de TG, las condiciones de este ensayo parecen ser relevantes para evaluar la competencia hemostática en PRP.

El complejo TF-FVIIa-FXa activa el FVIII.El mecanismo de cebado de la coagulación intrínseca inducido por TF se estudió mediante un ensayo sensible de TG de dos etapas. En plasma deficiente en FVII reconstituido con plaquetas normales, rTF 0.15 pM de con FVIIa de tipo silvestre (WT) produjo poca trombina (<20 pM en 11 min), similar a la generada por el mutante del sitio activo FVIIa S195A (iFVIIa) o FIXa solo (Fig. 12A). Sin embargo, rTF y FVIIa WT-pero no FVIIa S195A inactivo - se combinaron con FIXa amplificado TG -5-20 veces en 5-11 min (Fig. 12A). Por lo tanto, las cantidades aditivas de trombina producidas en este ensayo por TF-FVIIa y FIXa por separado fueron mucho menores que la cantidad producida por los dos combinados, lo que demuestra una interacción sinérgica que enlaza la coagulación intrínseca e iniciada por TF corriente arriba de la generación de trombina.

Para identificar la reacción que, aparte de la trombina, podría producir el FVIIIa necesario para la coagulación dependiente de FIXa, los inventores consideraron TF-FVIIa y FXa como activadores potenciales del FVIII. Primero, se determinó que TF-FVIIa sin FX - o TF-FX sin FVIIa - generaba actividad de FVIIIa nula o mínima, pero TF-FVIIa con FX - generando FXa - producía cantidades sustanciales de FVIIIa cuando todos los reactivos estaban en concentraciones fisiológicamente relevantes (Figura 12B). Para distinguir entre las funciones de FXa después de la liberación de TF-FVIIa en contraposición al FXa asociado con TF-FVIIa, los inventores formaron un complejo estable TF-FVIIa-FXa con la proteína anticoagulante de nematodo (NAP) c2. En el complejo formado, la actividad catalítica del FVIIa fue excluida por la mutación del sitio activo S 195A (iFVIIa), mientras que se sabe que el FXa conserva la función catalítica cuando está atrapado en el complejo NAPc2. Este complejo no logró inducir TG en PRP reconstituido con deficiencia de FVII, pero aumentó notablemente las TG inducidas por FIXa (Fig. 12C), lo que sugiere que el FXa asociado con TF-FVIIa puede activar FVIII. Un complejo similar formado con TFPI, que inhibe el FXa, estaba inactivo solo y no soportaba las TG dependientes de FIXa en PRP (Fig. 12C). Sorprendentemente, el complejo preformado de TF-iFVIIa-FXa estabilizado por NAPc2 podría activar el FVIII purificado, pero no el cofactor homólogo FV (Fig. 12D). La inhibición específica con TAP confirmó que el FXa en el complejo TF-iFVIIa-FXa estabilizado activó el FVIII (Fig. 12D), lo que implica que el FXa naciente todavía asociado con TF-FVIIa puede ejercer la misma función (Fig. 12E).

A continuación, los inventores evaluaron si el FXa libre, que desencadena la coagulación mediante la formación del complejo protrombinasa, podría servir como activador del FVIII en entornos fisiológicos similares a su función de generar el cofactor de protrombinasa, FVa. En la misma membrana procoagulante utilizada en los experimentos anteriores, concentraciones crecientes de FVa estimularon notablemente la conversión de protrombina mediante una baja concentración de FXa (Fig., 12F). Por el contrario, la generación de actividad de FVIIIa (Fig. 12G) o la escisión proteolítica de FVIII (Fig. 12H) por la misma concentración de FXa se inhibió progresivamente al agregar FVa en el mismo intervalo de concentración, lo que indica que el FXa unido a FVa no puede activar de manera eficiente FVIII. Por lo tanto, el FXa naciente asociado con TF-FVIIa activa preferentemente el FVIII, desencadenando la vía de coagulación intrínseca. La transferencia posterior de FXa desde TF-FVIIa al complejo de protrombinasa con FVa marca la transición a la coagulación directa inducida por TF.

El complejo TF-FVIIa-FXa activa el FVIII independientemente de la trombina.Para evaluar las funciones relativas del naciente complejo TF-FVIIa-FXa y la trombina en la generación de FVIIIa, se estudió la activación del procofactor en vesículas de fosfolípidos que contienen rTF mezcladas con FX purificado, protrombina, FVIII y FV. La activación de FVIII después de la adición de FVIIa se inhibió parcialmente bloqueando la trombina con DAPA o reemplazando la protrombina normal con el mutante S195A inactivo, pero aún era detectable -15% de FVIIIa en ambas condiciones (Fig. 13A). Es importante destacar que, aunque la trombina podría generar más FVIIIa, como se esperaba de la escisión eficiente del FVIII en la fase de solución, la cantidad de VIII activada por la reacción iniciada por TF en ausencia de trombina activa fue suficiente para la función completa del complejo de tenasa intrínseca FVIIIa-FIXa ensamblado en membrana (Fig. 13B). De acuerdo con los resultados en PRP que contiene inhibidores endógenos de la coagulación (véase la Fig. 11D), el TFPI que suprimió marcadamente la generación directa de FXa por TF-FVIIa tuvo un efecto limitado sobre la formación del complejo funcional FVIIIa-FIXa en reacciones iniciadas por TF (Fig. 13C). Este último también era resistente a la inhibición por TFPIa con el cofactor proteína S -la inhibición parcial por la proteína S sola probablemente resultó de la competencia por superficies procoagulantes limitadas-. De acuerdo con la activación del FVIII independiente de trombina observada por el FXa naciente en PRP, la activación del FVIII por TF-FVIIa-X no estuvo influenciada por la unión del FVIII al factor von Willebrand (VWF).

Para demostrar directamente que rTF puede soportar la activación de FVIII en un medio plasmático fisiológico independientemente de las reacciones de retroalimentación de trombina, los inventores utilizaron hirugen (63-O-Sulfo-Tyr-hirudina para bloquear el exosito I de trombina requerido para la activación del cofactor). Hirugen inhibió de forma dependiente de la dosis la activación del FVIII por la trombina, pero no el FXa generado por TF-FVIIa-FIXa. En PRP con CTI y anti-FXI MoAb para bloquear la amplificación de TG por retroalimentación a través de una mayor generación de FIXa por FXIa, hirugen 2 pM bloqueó las Tg dependientes de FIXa (Fig. 13D), lo que demuestra que esta reacción requirió la activación por retroalimentación de trombina de FVIII. Por el contrario, la misma concentración de hirugen no logró inhibir las TG mediante FIXa combinado con rTF, aunque no se pudo detectar TG cuando se agregaron FIXa y rTF por separado (Fig. 13E). Por lo tanto, la vía del TF activa el FVIII en plasma cuando se inhiben los bucles de retroalimentación de la trombina. Es de destacar que los experimentos con microvesículas de ratón generadas a partir de macrófagos activados por TF humano o WT mostraron que la generación de FVIIIa independiente de trombina también se produjo en una superficie procoagulante natural con TF-FVIIa humano o de ratón.

La activación de la vía de coagulación intrínseca por el complejo naciente TF-FVIIa-FXa contribuye a la generación de trombina independientemente de la función de la vía extrínseca directa.Para dilucidar mejor cómo la generación de FXa por TF-FVIIa contribuye claramente a la activación de la vía intrínseca en contraposición a la vía extrínseca directa de TG, se estudiaron dos mutantes de FVIIa- T99Y y E154A-. Estos mutantes conservan la actividad de escisión del FX, pero muestran un recambio de sustrato muy bajo debido a la alteración de la liberación del FXa. En un ensayo libre de fosfolípidos o con TF reconstituido con fosfolípidos, los mutantes de FVIIa produjeron una ráfaga inicial, pero, a diferencia de FVIIa WT, no pudieron sostener la generación de FXa (Fig. 14A). Sorprendentemente, los complejos TF con ambos mutantes fueron comparables a FVIIa WT en cuanto a apoyar la activación de FVIII dependiente de FXa y, lo que es más importante, TFPIa en concentraciones suprafisiológicas (10 nM) no influyó apreciablemente en esta vía de generación de FVIIIa (Fig. 14B). En marcado contraste con FVIII, los mutantes de FVIIa no lograron inducir la activación de FV y TFPIa inhibió la generación de FVa inducida por FVIIa WT (Fig. 14C).

Ambos mutantes de FVIIa con recambio de FXa deteriorado apoyaron la formación de un complejo de tenasa intrínseca funcional de FVIIIa-FIXa cuando FIXa estaba disponible, pero solo el mutante del exosito de FVIIa E154A produjo actividad de FVIIIa-IXa cuando el zimógeno FIX estaba presente en su lugar (Fig. 14D). Esto se explica por la incapacidad del FVIIa T99Y, a diferencia del FVIIa E154A, para activar FIX. Por lo tanto, complementando la capacidad de generar FIXa, la activación directa del cofactor antihemofílico FVIII por el producto FXa naciente de TF-FVIIa permite la coagulación de la vía intrínseca antes del control inhibidor de TFPIa.

Estas conclusiones se probaron más a fondo en plasma deficiente en FVII -que contiene inhibidores de la coagulación endógenos. reconstituido con plaquetas normales como fuente potencial de TFPIa adicional. En estas condiciones, FVIIa WT, pero no los mutantes E154A o T99Y, indujeron TG en presencia de un anti-FVIII MoAb neutralizante (Fig. 14E), lo que confirma que los mutantes no podían generar trombina directamente en un medio plasmático. Sin inhibición del FVIII, el FVIIa E154A indujo TG con sólo un ligero retraso en comparación con el WT, mientras que el FVIIa T99Y fue claramente menos eficiente. La inhibición de FXIa redujo aún más las TG por FVIIa T99Y, pero afectó sólo modestamente a FVIIa WT o E154A (Fig. 14F). Estos datos concuerdan con que este último genera tanto FIXa como FVIIIa.

Para demostrar directamente que la activación del FVIII independiente de la trombina se produjo en estas reacciones, los inventores primero verificaron que el bloqueador del exosito de trombina, hirugen, suprimió las TG iniciadas por FIXa en plasma deficiente en FVII (Fig. 14G). En presencia de la misma concentración de hirugen, las TG del mutante FVIIa E154A, no del FVIIa WT, dependían completamente del FVIII mientras que, sin inhibición del FVIII, las TG inducidas por FVIIa WT y E154A eran de magnitud similar, pero las TG de este último estaban claramente retrasadas (Fig. 14H). El retraso probablemente se debió a una alteración en la generación directa de FXa por parte del mutante FVIIa que podría reducir la generación del cofactor FVa para el ensamblaje inicial de protrombinasa. De hecho, agregar FVa normalizó el retraso en las TG dependientes de FVIIIa por parte de FVIIa E154A (Fig. 14I). En consecuencia, agregar FVa PRP normal aceleró las t G iniciadas por TF, pero no más que bloquear la función de TFPI. Estos datos indicaron que la actividad protrombinasa está regulada por el control TFPde la generación de FXa que contribuye a la activación de FV; y reforzar el concepto de que la activación del FVIII durante la coagulación iniciada por el TF genera actividad tenasa intrínseca del FVIIIa-FIXa independientemente de las reacciones de retroalimentación de la trombina y del escape del control del TFPI.

Luego, los inventores cribaron una biblioteca de MoAbs frente a FVIIa para identificar una prueba de inhibidor principal que podría recapitular el cambio en las propiedades funcionales -pérdida de generación eficiente de FXa y FlXa, pero no de activación de FVIII- observado con el mutante T99Y de FVIIa. A diferencia del MoAb 3G12 totalmente inhibidor, el anticuerpo 12C7 no tuvo efecto sobre la activación del FVIII (Fig. 15A). Además, no tuvo ningún efecto significativo sobre la generación de actividad tenasa intrínseca cuando estaba presente FlXa, pero se inhibió notablemente cuando en su lugar se suministró FIX (Fig. 15B). MoAb 12C7 atenuó TG en PRP, pero, como se observa con FVIIa T99Y, hizo que TG FXIa fuera dependiente (Fig. 15C). Por lo tanto, los resultados con moléculas mutantes de FVIIa y anticuerpos inhibidores muestran de manera concordante que el complejo TF-FVIIa puede iniciar vías de coagulación intrínsecas y extrínsecas en distintas reacciones.

La activación de la vía intrínseca por parte del FT conduce a la formación de fibrina en la sangre que fluye.Evaluar si TF-FVIIa puede iniciar la formación de trombos en la sangre que fluyeex-vivocuando la generación inicial directa de trombina es limitada, el TF se inmovilizó en la superficie a una concentración baja suficiente para la formación de fibrina dependiente de FVIII a una rata de cizallamiento de la pared de 300 s-1. En estas condiciones establecidas con WT FVIIa, el FVIIa T99Y tenía una actividad trombogénica deteriorada a pesar de soportar una mayor adhesión plaquetaria que el FVIIa S195A inactivo (Fig. 16A, B). La adición de FIXa 10 pM a sangre que contenía FVIIa T99Y, pero no a sangre que contenía FVIIa S195A inactivo, restableció la formación de fibrina dependiente de FVIII (Fig. 16A, B). Por el contrario, el mutante FVIIa E154A, que es tan defectuoso como T99Y en TG directa (véase la Fig. 14E), apoyó la formación de trombos dependientes de FVIIIa similar a FVIIa WT cuando se agregó sin FIXa a sangre reconstituida deficiente en FVII (Fig. 16A, C). Esto confirmó que el producto FXa naciente de TF-FVIIa puede generar directamente el funcionamiento de FVIIIa en el complejo de tenasa intrínseco con el potencial de mejorar la hemostasia en entornos de TF bajo con generación limitada de trombina directa dependiente de TF que activa los bucles de retroalimentación.

Ejemplo 35

Discusión

Los hallazgos presentados aquí delinean una nueva función del complejo extrínseco TF-FVIIa, es decir, proporcionar activación por proalimentación selectiva del cofactor antihemofílico FVIII independientemente de los bucles de retroalimentación de trombina (Fig. 1B). Esta reacción específica del FXa naciente escapa al control de los inhibidores fisiológicos de la coagulación en PRP o TFPIa en sistemas purificados. Junto con la capacidad previamente reconocida de TF-FVIIa para generar la proteasa antihemófila FIXa, la activación directa de FVIII completa una vía hacia la actividad tenasa intrínseca de FVIIIa-FIXa completamente integrada dentro de la coagulación iniciada por TF/FVIIa y que precede a la activación directa canónica de la vía común de coagulación.

El TF-FVIIa-FXa naciente genera FVIIIa que facilita la formación de tenasa intrínseca, pero sin proporcionar FVa para la actividad protrombinasa. Generar este último requiere el desacoplamiento del FXa del TF-FVIIa, exponiendo así el FXa libre al control inhibidor. Por lo tanto, la función TF-FVIIa-FXa recientemente identificada permite la acumulación del cofactor FVIIIa antihemofílico prohemostático activo sin aumentar el FVa protrombótico. Esto puede ser relevante para los anticoagulantes FXa específicos que, con una potencia antitrombótica comparable, tienen un impacto menor en la hemostasia que los antagonistas de la vitamina K. Es de destacar que dicho mecanismo es independiente de las reacciones de retroalimentación de la trombina y de la actividad del FXI y, por lo tanto, puede respaldar la hemostasia durante el tratamiento con inhibidores de la trombina o estrategias recientemente validadas orientadas al FXI.

La selectividad para la activación del cofactor indica propiedades funcionales distintas del FXa en complejo con TF-FVIIa o liberado de éste. Mientras que los complejos cofactor-enzima de la coagulación suelen estar orientados hacia un recambio eficiente del sustrato para una generación rápida de trombina, a lo largo de la evolución el complejo de iniciación del FT parece haber conservado mecanismos que favorecen su estabilidad. FX interactúa con TF-FVIIa a través de una interfaz extendida que se ve mínimamente afectada por la transición de zimógeno a enzima. En esta interfaz, el residuo E154 de FVIIa, conservado entre especies, transmite cambios conformacionales desde el sitio activo de la proteasa ocupado por el sustrato y, por lo tanto, puede regular la liberación posterior del producto. La eliminación de este cambio conformacional fue suficiente para segregar la activación del sustrato macromolecular FX y el recambio del producto FXa por TF-FVIIa. Por lo tanto, el mutante FVIIa E154A ayudó a informar sobre la activación directa del FVIII por el FXa naciente asociado con TF-FVIIa, así como la contribución de esta nueva vía a la generación de trombina y la trombogénesis en plasma rico en plaquetas y sangre total bajo flujo.

La estabilidad del complejo de inicio de la coagulación del TF probablemente representa la ventaja evolutiva de preservar las funciones de señalización clave de TF-FVIIa-FXa que enlazan la activación de la coagulación y la inmunidad innata. En línea con la activación eficiente del FVIII, el FVIIa T99Y es completamente funcional mediando la activación TF-FVIIa-FXa del receptor activado por proteasa (PAR) 2. Además, como se observa para la generación de FVIIIa, la resistencia a la inhibición funcional por TFPIa también es una característica importante de la señalización de PAR inducida por TF-FVIIa-FXa en células endoteliales. Este complejo de señalización se estabiliza adicionalmente mediante el reclutamiento del compañero de unión de FXa, el receptor de proteína C endotelial (EPCR), en ratones y humanos. Recientemente surgió una función clave de señalización inmune innata para el complejo TF-FVIIa-FXa-EPCR en las células dendríticas, donde es esencial para la inducción del receptor 4 tipo peaje de genes regulados por interferón. La regulación negativa de esta vía por el ligando alternativo de EPCR, la proteína C activada, utiliza las funciones de cofactor anticoagulante canónico de FV y la proteína S. Por lo tanto, estas y otras funciones no tradicionales del sistema de coagulación probablemente utilicen las mismas características mecanísticas que sirven simultáneamente para diversas funciones en la inmunidad, la hemostasia y la reparación de lesiones.

La divulgación en el presente documento proporciona las bases bioquímicas para definir distintas funciones del TF para apoyar la hemostasia o contribuir a la trombosis. Se puede imaginar la aplicación de mutantes de FVIIa o los reactivos de anticuerpos descritos para definir las funciones parciales de TF en el desencadenamiento de la trombogénesis directamente o proporcionar la activación de la vía intrínseca de relevancia para la hemostasia. En última instancia, esto debería conducir a la posibilidad de evaluar selectivamente los efectos de nuevos anticoagulantes recientes y futuros sobre la doble función del TF en la hemostasia y la trombosis. Los novedosos conceptos sobre coagulación presentados aquí también pueden tener implicaciones para el desarrollo y evaluación de agentes hemostáticos, brindando protección contra complicaciones hemorrágicas graves y evitando al mismo tiempo complicaciones trombóticas adversas en pacientes con patologías vasculares subyacentes.

Ejemplo 36

Actividad de coagulación

Materiales.Se calibró Innovin rTF (Siemens Healthcare Diagnostics) con respecto a un lote de referencia (# 53691; rTF 13.9 nM) utilizando un ensayo de generación de FXa que incluía concentraciones variables de rTF, FVIIa 100 pM y FX 135 nM. El lote de referencia contenía fosfolípidos procoagulantes 101.4 jM , medido mediante actividad protrombinasa calibrada con vesículas de fosfolípidos mol/mol de fosfatidilcolina (PC) al 80 %/mol/mol de fosfatidilserina (PS) al 20 % (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), sonicadas en Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico 10 mM (HEPES), NaCl 0.15 M, pH 7.4. Se preparó FVIIIa generado por trombina incubando FVIII 190 nM, Fila 19 nM y CaCl2 5 mM durante 30 s a 37 °C, seguido de lepirudina 36 nM ([Leu1-Thr2]-63-desulfohirudina recombinante; Refludan, Bayer Corp, Pittsburgh, PA) para neutralizar la trombina. PPP normal se preparó localmente mediante centrifugación de sangre venosa que contenía citrato trisódico 10.9 mM a 1,500 g durante 10 minutos a 25 °C. PPP de pacientes con deficiencia congénita grave (<1%) de FVII, FVIII o FIX fue de George King Bio-Medical (Overland Park, KS); PPP con deficiencia de FIX preparada mediante el agotamiento de la inmunoafinidad del plasma normal fue de Haematologic Technologies.

Experimentos de perfusión sanguínea.Se recubrieron cubreobjetos de vidrio tratados con poli-L-lisina 0.2 mg/ml durante 6 h a 37 °C con rTF durante 18-20 horas a 37 °C, se enjuagaron con solución salina tamponada y se ensamblaron en una cámara de flujo rectangular con junta de silicona de 125 jm de altura. Se recogió sangre venosa en citrato trisódico final 10.9 mM utilizando una jeringa de plástico. Se añadió CaCl2 para obtener Ca2+1.29 mM antes de la perfusión a una rata de cizallamiento de la pared de 300 s-1 mantenida con una bomba de jeringa (Harvard Apparatus, Holliston, MA). Para experimentos con WT y FVIIa mutante, se lavaron células de sangre del grupo 0 citratada, suplementadas con 50 μg/ml de CTI y apirasa (10 U/ml de actividad ADPasa), para liberarlas de plasma mediante ciclos secuenciales de centrifugación a 1500 g durante 7 minutos seguidos por resuspensión. En el primer ciclo, el plasma se reemplazó con un volumen igual de tampón Tyrode libre de calcio, pH 6.5, que contenía apirasa 5 U/ml ; luego, con tampón y apirasa 1.25 U/ml ; y, finalmente, con plasma humano deficiente en FVII hasta el volumen sanguíneo original. Los recuentos de hematocrito y plaquetas de la sangre reconstituida y nativa estuvieron dentro de ±10%. Las plaquetas/leucocitos se visualizaron mediante la incorporación de clorhidrato de quinacrina (mepacrina; Sigma) añadido a una concentración de 10 μg/ml y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la perfusión. La fibrina se visualizó mediante la unión de IgG monoclonal de ratón (HB-8545; American Type Culture Collection, Manassas, VA) marcada con Alexa Fluor 546 (Invitrogen) y utilizada a una concentración de 50 μg/ml en sangre; el anticuerpo interactúa con la cadena de fibrina p humana/de ratón, pero no con la cadena de fibrinógeno Bp.

Análisis de TG en PRP humano nativo o reconstituido.PRP se preparó a partir de sangre que contenía citrato trisódico 10.9 mM y se centrifugó a 250 g durante 10 minutos a 25 °C. Las plaquetas se ajustaron a 180-103/μl por dilución con PPP homólogo obtenido a partir de PRP centrifugado a 1,500 g durante 10 min a 25 °C. El PRP reconstituido se preparó con plaquetas lavadas aisladas de PRP normal mezcladas con 1/5 del volumen de ácido-citrato-dextrosa (ácido cítrico 71 mM, citrato trisódico 85 mM y dextrosa 111 mM, pH 4.5) y apirasa 5 U/ml. Después de centrifugar a 1,500 g durante 10 min, la pella de plaquetas se resuspendió en PPP normal o sin factor de coagulación específico y al que se le había añadido previamente 30-50 μg/ml de CTI; el recuento final de plaquetas fue de 180-103/μl. La intensidad de la fluorescencia en las reacciones generadas por la escisión con trombina del sustrato Gly-Gly-Arg-AMC se midió continuamente a 37 °C durante hasta 40 minutos en un espectrofluorómetro. La pendiente de la ráfaga de trombina (nM/min) se calculó dividiendo la altura máxima de la concentración de trombina por el tiempo desde la inducción hasta su aparición menos el tiempo de retardo, definido como el tiempo desde la inducción hasta la generación de trombina 3 nM. El potencial de trombina endógena (ETP, es decir, actividad total de trombina generada) se determinó a partir del área bajo la curva TG. El ensayo de TG de 2 etapas discontinuo se inició añadiendo rTF 0.15 pM y CaCl2 18 mM en PRP deficiente en FVII con 30 μg/ml de CTI y FVNa WT 400 pM o iFVIIa sin/con FIXa 20 pM. En otros experimentos, la TG fue inducida por TF-iFVIIa-FXa-TFPI o TF-iFVIIa-FXa-NAPc2. Los complejos estables se formaron previamente incubando FXa 5 nM, TF 10 nM, iFVIIa 10 nM y TFPI o NAPc240 nM en presencia de CaCh 2.5 mM durante 120 s a 37 °C. Los complejos se agregaron a PRP deficiente en FVII, seguido de una incubación durante 8 minutos a 37 °C.

Activación de la coagulación en reacciones con componentes purificados.La activación del FVIII mediante complejos estables de FXa con TF-FVIIa se probó en reacciones que contenían FVIII, FV y lepirudina con o sin TFPIa, con incubación durante 30-120 s a 37 °C. Se prepararon complejos estables con FXa como única proteasa activa en reacciones incubadas durante 120 s a 37 °C que incluyeron: 1) FXa 200 pM, rTF 400 pM, iFVIIa 500 pM, NAPc240 nM y CaCl22.5 mM; 2) FXa 100 pM, rTF 50 pM, iFVIIa 100 pM, NAPc25 nM y CaCh 2.5 mM. El efecto del FVa añadido sobre la generación de FVIIIa mediante FXa libre se probó en reacciones con FXa 10 pM incubado con rTF 50 pM y sustratos durante 180 s a 37°C. El efecto inhibidor de hirugen sobre la generación de FVIIIa por FIIa se probó en reacciones con FIIa 0.5 nM incubado con rTF 50 pM y FVIII durante 180 s a 37 °C.

El recambio de sustrato por TF-FVIIa se evaluó a partir de la generación de FXa en reacciones sin fosfolípidos que contenían FVIIa 10 nM, FX 1 pM y rTF1-218 soluble 2 pM. FVa se tituló en un ensayo de activación de protrombina en el que se incubó FXa 10 pM con protrombina 1 pM, rTF 50 pM y FVIII 700 pM durante 180 s.

La activación de FIX por TF-FVIIa se probó en reacciones que contenían FIX 150 nM con rTF 50 pM, FVIIa 200 pM y CaCl2 2.5 mM incubados durante 30 minutos a 37 °C. Después de terminar las reacciones con EDTA 10 mM, se determinó la actividad de FIXa en presencia de etilenglicol (37%, volumen/volumen) midiendo cinéticamente la actividad amidolítica con el sustrato cromogénico CH3SO2-(D)-CHG-Gly-Arg-para -nitroanilidaAcOH (Pefacromo FIXa, Pentapharm, Basilea, Suiza; 1 mM). La curva de calibración de FIXa se construyó con concentraciones conocidas de FIXa.

Medición de la actividad de coagulación del FVIIIa.Se añadieron alícuotas de reacciones en las que se generó FVIIIa a plasma deficiente en FVIII (George King Bio-Medical) y después se mezclaron con FIXa 10 nM, PL 20 pM y CaCl2 8 mM. La actividad de coagulación del FVIIIa se cuantificó utilizando una curva de calibración construida con concentraciones conocidas de FVIIIa activado por trombina.

Trombosis inducida por cloruro férrico en ratones.El tiempo hasta la primera oclusión después de la lesión es el necesario para una disminución del flujo sanguíneo a <10% del medido en la arteria ilesa. El índice de flujo es la relación entre el volumen de sangre que fluye a través de la arteria lesionada en 30 minutos (integración del flujo medido en ml/min y muestreado cada segundo) y el esperado en la arteria ilesa (calculado a partir del flujo medido en 1 minuto antes de la lesión multiplicado por 30).

Ejemplo 37

Ensayo de generación de trombina rápido y altamente sensible.

En el presente documento se describen composiciones y métodos de ensayo de generación de trombina rápido y altamente sensible para determinar selectivamente las pequeñas cantidades iniciales de trombina producidas en plasma por la vía intrínseca antihemófila, lo que permite una evaluación más precisa de los trastornos de hemorragia congénitos y adquiridos y de las complicaciones trombóticas.

La enzima trombina de la coagulación sanguínea (FIIa) es responsable de prevenir la hemorragia y detener la hemorragia espontánea (es decir, "hemostasis") mediante la formación de un coágulo de fibrina estable, mientras que la hipergeneración de FIIa puede causar "trombosis" de enfermedades vasculares letales, incluyendo ataques cardíacos y accidentes cerebrovasculares. En el esquema actual sobre la generación de FIIa (TG), el complejo de la vía extrínseca del factor tisular (TF) con el factor activo (F) VIIa inicia una cascada de reacciones proteolíticas que producen FXa en una fase primaria que forma un complejo de protrombinasa con el cofactor activo FVa, generando pequeñas cantidades iniciales de FIIa. El FIIa producido inicialmente amplifica la generación de FIIa (TG) al mejorar la actividad del complejo protrombinasa, lo que lleva a una ráfaga de FIIa generado en una fase secundaria. Los inventores han descubierto que los mecanismos moleculares mediante los cuales el FIIa inicial potencia la actividad del complejo de protrombinasa son los siguientes: 1) el FIIa inicial desencadena la activación plaquetaria proporcionando una superficie de fosfolípidos activa esencial para la actividad de la protrombinasa; 2) FIIa aumenta la formación de complejos de protrombinasa activando directamente FV a FVa; 3) FIIa promueve la generación de FXa mediante la activación de la vía intrínseca FVIIIa-FIXa. FIIa activa directamente el cofactor esencial FVIII para activar FVIIIa para la proteasa FIXa. Además, FIIa activa indirectamente FIX a FIXa mediada por la activación del zimógeno FXI a la enzima FXIa que a su vez activa FIX a FIXa. Finalmente, grandes cantidades de FIIa generada convierten el fibrinógeno en fibrina, que es esencial para la hemostasia y la trombosis. Por lo tanto, el FIIa generado inicialmente funciona como un determinante del grado de coagulación sanguínea, lo que sugiere que determinar las TG iniciales puede proporcionar un enfoque diagnóstico para una evaluación más precisa de los trastornos de hemorragia y las complicaciones trombóticas.

La vía de activación de FVIII dependiente de TF actualmente divulgada, en la que el mecanismo de activación de FVIII está mediado por FXa naciente en el complejo de iniciación TF-FVIIa-FXa antes de la activación por retroalimentación de FVIII, tiene una función clave en las t G iniciales en plasma. Basándose en un concepto mecanicista novedoso, los inventores han divulgado nuevas composiciones y métodos para la determinación de las TG iniciales dependientes de FVIIIa en plasma. En los ensayos,<t>G se inicia mediante la adición combinada de concentraciones extremadamente bajas (por ejemplo, 150 fM) de TF recombinante relipidado (rTF) y FIXa (por ejemplo, 200 pM), seguido de una monitorización continua del FIIa generado utilizando un sustrato de FIIa. durante 40 min a 37°C (el llamado "ensayo continuo de TG"). En el ensayo de TG continuo, el FVIIIa se produce mediante el complejo de iniciación TF-FVIIa-FXa y el FVIIIa generado promueve TG aumentando el FXa generado por FIXa. Por lo tanto, este ensayo de TG proporcionó un enfoque útil para definir una relación entre los niveles funcionales de FVIIIa y los episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia A con defectos congénitos/adquiridos de FVIIIa y sujetos tratados con terapias antitrombóticas.

Además, los inventores han divulgado otro ensayo que proporciona una determinación rápida de la cantidad de TG. En una realización, este nuevo ensayo puede proporcionar un método estandarizado y automatizado para determinar TG en un paciente. Los inventores han divulgado nuevos componentes y métodos de ensayo de TG rápido y altamente sensible para determinar selectivamente las pequeñas cantidades iniciales de FIIa producidas por la vía intrínseca antihemófila. Este nuevo ensayo permite una evaluación más precisa y automatizada de los trastornos de hemorragia congénitos y adquiridos. El ensayo puede utilizarse como prueba de laboratorio de diagnóstico clínico en sustitución de los ensayos de coagulación convencionales.

Para establecer un método de ensayo de TG altamente sensible, los inventores realizaron un cribado de sustratos de FIIa con alta afinidad y tasa de recambio determinando parámetros cinéticos y luego construyeron una curva de calibración con concentraciones conocidas de un calibrador de FIIa. En los estudios, encontraron que dos sustratos fluorogénicos H-D-ciclohexil-alanil-alanil-argininil-amidometilcumarina (AMC) (Pefafluor TH) y butiloxicarbonil-valilprolinil-argininil-AMC (V-P-R-AMC) eran adecuados para cuantificar concentraciones muy bajas de Actividad de FIIa con un límite de detección de -5 pM (Fig. 17). Las TG iniciales se midieron con un "ensayo discontinuo de 2 etapas" utilizando el sustrato de alta sensibilidad. Brevemente, la TG se inició mediante la adición combinada de rTF y FIXa con CaCl2 18 mM en plasma, seguido de incubación durante hasta 5 minutos a 37°C. Después de la incubación, las reacciones se terminaron con EDTA 20 mM y el FIIa generado se midió utilizando el sustrato de FIIa altamente sensible Pefafluor TH o VPR-AMC. En los ensayos, la adición combinada de rTF 150 fM y FIXa 200 pM produjo FIIa de forma dependiente del tiempo en plasma pobre en plaquetas (PPP) normal preparado a partir de donantes sanos (Fig. 18A). Los experimentos de titulación con rTF (9.4-600 fM) y FIXa (6.3-400 pM) mostraron una dependencia de la dosis de dos iniciadores en las TG iniciales (Figs. 18 B,C). Experimentos adicionales indicaron que una adición de vesículas de fosfolípidos (PL) (0.08-20|jM) que consiste en 80% de fosfatidilcolina/20% de fosfatidilserina (mol/mol) mejoró dramáticamente las TG iniciales en PPP (Fig. 18D). Para validar aún más el método de ensayo, se examinó la reproducibilidad del método de ensayo de TG mediante la determinación del coeficiente de variaciones (CV) intraensayo e interensayo utilizando un protocolo de ensayo manual. Se calculó que los valores de CV intraensayo e interensayo eran <15% (Fig. 19), lo que indica que este es un método de ensayo de TG confiable.

Las TG dependientes de FVIIIa se verificaron probando el efecto de anticuerpos monoclonales inhibidores (MoAb) anti-FVIII añadidos sobre las TG iniciales en PPP normal inducido por rTF 150 fM/FIXa 200 pM con PL (Fig. 20). Las TG iniciales se examinaron en PPP con deficiencia de FVIII preparado a partir de pacientes con hemofilia A. En comparación con las TG iniciales en el PPP normal inducido mediante la adición de TF/FIXa y PL, se observaron muchos menos TG en el PPP de pacientes sin y con anticuerpos inhibidores anti-FVIII (96, 133 y 176 unidades Bethesda/ml) (Fig. 21A). Una unidad Bethesda se define como la cantidad de un inhibidor que neutraliza el 50% de 1 unidad de actividad del FVIII en plasma normal. Más importante aún, cuando el PPP deficiente en FVIII sin inhibidor se complementó con FVIII derivado del plasma (0.1-1.6 IU/dL), las TG iniciales mejoraron de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5B). Los resultados indican claramente que el ensayo discontinuo de 2 etapas de TG inicial determina específicamente las TG dependientes de FVIIIa y que tiene una sensibilidad similar en la detección de la actividad de FVIIIa en plasma que el ensayo de TG continuo previamente divulgado (Fig. 5B). Por lo tanto, este ensayo se puede utilizar para predecir con mayor precisión y rapidez el riesgo de hemorragia en pacientes con hemofilia A grave, mejorando así la terapia de reemplazo con productos de FVIII.

Coumadin (warfarina), antagonista de la vitamina K, se usa ampliamente para prevenir enfermedades trombóticas. Debido a que el tratamiento con Coumadin puede causar hemorragias graves y mortales, los pacientes son monitorizados periódicamente mediante la prueba del índice internacional normalizado (INR). Los valores de INR se determinan mediante un ensayo de coagulación convencional (el llamado ensayo de tiempo de protrombina) utilizando rTF. Para aclarar si los valores de INR se correlacionan con las TG iniciales dependientes de FVIIIa, se probaron las TG iniciales en PPP con diferentes valores de INR de los pacientes tratados con Coumadin agregando rTF y FIXa. Las TG iniciales dependientes de FVIIIa se redujeron a ~15 % y ~5 % del plasma normal en el plasma del paciente con 1.5 y 2.9 de INR respectivamente; aunque las TG fueron completamente abolidas en plasma con valores de INR mucho más altos (Fig. 22). Por el contrario, las TG independientes de FVIIIa, que se determinaron añadiendo rTF 1.2 pM solo sin FIXa al plasma, se eliminaron incluso con un INR más bajo. Los resultados sugieren que, a diferencia de las TG independientes de FVIIIa directamente por la vía TF, las<t>G dependientes de FVIIIa por la vía intrínseca antihemófila pueden mantenerse en pacientes tratados con Coumadin, lo que presumiblemente contribuye a la hemostasia. Por tanto, el método de ensayo inventado aquí puede ayudar a una predicción personalizada del riesgo de hemorragia en los pacientes. Los ensayos combinados de TG independientes y dependientes de FVIIIa también pueden proporcionar una determinación más refinada de la dosificación del fármaco para inhibir la trombosis mediante la determinación de TG independientes de FVIIIa y al mismo tiempo preservar suficiente función hemostática mediante la determinación de TG dependientes de FVIIIa. En resumen, la presente divulgación ofrece el kit de pruebas de diagnóstico y métodos de ensayos altamente sensibles para determinar pequeñas cantidades iniciales de FIIa producidas en plasma y sangre específicamente por la vía intrínseca antihemófila a través del complejo FVIIIa-FIXa. El kit está compuesto por factores de coagulación tales como rTF, FIXa y PL y un sustrato FIIa de alta sensibilidad. El nuevo ensayo permitiría una caracterización más precisa de los fenotipos de hemorragia y la predicción del riesgo de hemorragia en pacientes con hemofilia A congénita y adquirida y en personas con tratamiento antitrombótico.

Los ensayos de coagulación convencionales, tales como el tiempo de protrombina (PT) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), se utilizan ampliamente como pruebas de laboratorio automatizadas, pero tienen la desventaja crítica de una menor sensibilidad para caracterizar cambios menores en las reacciones de coagulación y predecir el riesgo de hemorragia y trombogénesis en pacientes. Por otro lado, la prueba de generación continua de FIIa (TG), desarrollada originalmente por el laboratorio de Hemker, es bastante sensible en estos pacientes, lo que ayuda al diagnóstico de estados de hipercoagulabilidad y diátesis hemorrágica. Sin embargo, a diferencia de los ensayos de coagulación, el ensayo no tiene un gran beneficio de ser fácil de automatizar y estar bien estandarizado, ya que el método de ensayo requiere mucho tiempo (por ejemplo, 40 a 60 minutos) y tiene altas variaciones intra e interensayo. El ensayo también requiere una gran cantidad de sustrato FIIa debido a la baja afinidad que provoca un mayor costo de producción de los kits de diagnóstico y un mayor precio de venta de los productos. Por lo tanto, la aplicación de ensayos continuos de TG a la toma de decisiones clínicas todavía se ve obstaculizada por estos problemas.

El novedoso "método de ensayo de TG discontinuo de 2 etapas" divulgado en el presente documento supera los problemas y ofrece ensayos de TG rápidos (en 10 minutos) y más fáciles con alta sensibilidad en la verificación de los factores de coagulación alterados y las reacciones asociadas con la hemorragia al determinar selectivamente las pequeñas cantidades iniciales de FIIa producidas por la vía intrínseca antihemófila. Por ejemplo, los ensayos y métodos divulgados en el presente documento se pueden usar para determinar los niveles de FVIII en pacientes con hemofilia A grave (ver Fig. 21 B) y pueden ser útiles para monitorizar el tratamiento con concentrados de FVIII y para evaluar la potencia del concentrado. El ensayo también se puede utilizar para identificar variantes de FVIII con funcionalidad mejorada y/o mayor estabilidad y para cribar nuevos agentes hemostáticos con eficacia y seguridad mejoradas para el tratamiento de la hemofilia A. Además, el ensayo de TG discontinuo divulgado en el presente documento puede permitir la predicción precisa de trastornos trombóticos mediante la detección de TG iniciales más altos en los pacientes. En conjunto, los ensayos de TG inventivos deberían utilizarse como pruebas de laboratorio de diagnóstico clínico capaces de reemplazar los ensayos de coagulación convencionales.

El ensayo divulgado instantáneamente se basa en el descubrimiento de la vía de activación del FVIII en plasma impulsada por el complejo de iniciación del TF, que respalda la amplificación de la generación de FIIa en una fase inicial y primaria de las reacciones de coagulación esenciales para la hemostasia. Por lo tanto, a diferencia de los ensayos de actividad del FVIII clásicos y convencionales, el presente ensayo tiene la ventaja adicional de evaluar una vía no reconocida previamente del proceso de activación fisiológica del FVIII. Por lo tanto, los métodos altamente sensibles pueden ser útiles para identificar factores y sustancias que inhiben o promueven la activación del FVIII y para una clasificación más precisa de los pacientes con hemofilia A grave, estableciendo una correlación más directa entre la actividad del FVIII y la frecuencia y gravedad de los episodios de hemorragia, lo que lleva a una predicción más precisa del riesgo de hemorragia.

Las pruebas de cribado de laboratorio requieren métodos automatizados y estandarizados. A diferencia de los ensayos de TG continuos anteriores, el nuevo ensayo de TG divulgado en el presente documento puede automatizarse bien y estandarizarse más fácilmente midiendo el FIIa generado en un momento determinado (por ejemplo, 3 min), ofreciendo pruebas de laboratorio rápidas y sencillas de estados de hio e hipercoagulación en pacientes. Además, puede proporcionar un kit de diagnóstico con un costo mucho menor ya que el kit incluye cantidades muy pequeñas de componentes rTF, FIXa, PL y sustrato de FIIa de alta sensibilidad. Esto indica que el kit tiene grandes beneficios en la comercialización.

El objetivo de los inventores era establecer nuevas pruebas de laboratorio que sustituyeran a los ensayos de coagulación convencionales. Para lograr este objetivo, han desarrollado nuevos métodos de ensayo de TG con algunas modificaciones de los métodos clásicos. La aplicación del presente método y ensayo a la prueba de laboratorio de diagnóstico de la actividad del FVIII se ha validado mediante la determinación analítica de la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, y mediante la realización de pruebas de recuperación con plasma enriquecido con FVIII de pacientes con deficiencia grave de FVIII. Otros estudios con Coumadin-plasma también respaldan que el ensayo puede ser muy útil para una predicción personalizada del riesgo trombótico y de hemorragia de los pacientes. Basándose en los resultados de los estudios de validación de ensayos, los inventores han determinado que los kits prototipo consisten en factores de coagulación rTF, FIXa y PL y un sustrato FIIa de alta sensibilidad.

En una realización, los inventores divulgan kits de diagnóstico prototipo liofilizados que incluyen sustrato rTF, FIXa, PL y FIIa y luego validan los nuevos ensayos utilizando muestras de plasma clínico obtenidas en colaboración con instituciones médicas internacionales. El objetivo de estos estudios será demostrar que el nuevo ensayo permite una clasificación más detallada de los pacientes con hemofilia y la predicción del riesgo trombótico y de hemorragia para los pacientes con tratamiento antitrombótico. En otra realización, el ensayo y el kit divulgados en el presente documento se desarrollan adicionalmente para crear dispositivos automáticos y kits de reactivos.

Ejemplo 38

El nuevo mecanismo de coagulación respalda la evaluación personalizada del riesgo de hemorragia/trombosis y la terapia antitrombótica.

La terapia antitrombótica segura y eficaz requiere una mejor comprensión de los mecanismos que pueden orientarse para interrumpir la trombosis y, al mismo tiempo, alterar mínimamente la hemostasia normal. La presente divulgación proporciona una función no reconocida previamente del complejo de iniciación de la coagulación del factor tisular (TF) extrínseco resistente a inhibidores del factor fisiológico (F) Xa. El inhibidor endógeno de la vía del TF (TFPI) controla la activación del cofactor de protrombinasa, FV y la trombogénesis directa inducida por el TF; pero no la activación selectiva del cofactor antihemofílico, FVIII, por el FXa naciente asociado con TF-FVIIa. La activación directa del complejo intrínseco FVIIIa-FIXa por la vía TF no sólo escapa al control de los inhibidores endógenos, sino también de las dosis terapéuticas de anticoagulantes orales dirigidos al FXa. Aunque estos inhibidores del FXa limitan la activación directa de la coagulación por parte del TF, preservan la activación de FVIII y FIX por proalimentación por el complejo de iniciación del TF y, por lo tanto, interfieren menos con la hemostasia durante el tratamiento antitrombótico. Estos hallazgos respaldan el uso de nuevos formatos de ensayo para predecir el riesgo de hemorragia individual frente a la eficacia antitrombótica asociada con antagonistas de la vitamina K ampliamente recetados, inhibidores específicos del FXa y la trombina (FIIa), así como estrategias orientadas al FXI actualmente en desarrollo.

El paradigma de coagulación actualmente conocido (Fig. 1A) no puede explicar fácilmente observaciones bien documentadas de que los fármacos orientados a las proteasas clave de la vía común de la coagulación, FXa y trombina, reducen el riesgo de hemorragia intracraneal grave cuando se dosifican con una eficacia antitrombótica comparable a la de Antagonistas de la vitamina K (AVK) que afectan múltiples factores de coagulación. Las excepciones informadas a esta conclusión, tal como la hemorragia gastrointestinal, pueden resultar de concentraciones específicas de órganos de los fármacos orales activos que exceden los niveles plasmáticos terapéuticos en lugar de la inhibición sistémica de la hemostasia. Actualmente se divulga una función novedosa del complejo extrínseco TF-FVIIa, concretamente proporcionar activación por proalimentación selectiva del cofactor antihemofílico FVIII independientemente de los bucles de retroalimentación de trombina. Esta reacción específica del FXa naciente escapa al control de los inhibidores fisiológicos de la coagulación, incluyendo el TFPIa. Junto con la capacidad previamente reconocida de TF-FVIIa para generar la proteasa antihemófila FlXa, la activación directa de FVIII completa una vía hacia la actividad tenasa intrínseca de FVIIIa-FIXa completamente integrada dentro de la coagulación iniciada por TF/FVIIa y que precede a la activación directa canónica de la vía de coagulación común (Fig. 1B).

En una realización, los inventores han demostrado que la activación de FIXa, la proteasa tenasa intrínseca, sigue patrones individuales distintos cuando la coagulación se inicia en la sangre que fluye sobre una superficie recubierta con una concentración limitante de factor tisular recombinante relipidado (rTF). Además, la activación del FVIII por el FXa naciente en complejo con TF-FVIIa resiste tanto los inhibidores farmacológicos como los endógenos del FXa, lo que puede explicar la preservación de la hemostasia durante la terapia anticoagulante selectiva. Sin embargo, inesperadamente, el efecto de los anticoagulantes orales orientados al FXa y la trombina es individualmente variable cuando se prueban en condiciones que evalúan selectivamente la contribución de distintas vías de coagulación a la generación de trombina. Esto proporciona nuevas perspectivas para la evaluación del riesgo de hemorragia y trombótico basándose en ensayos de laboratorio formateados para evaluar la función relativa de diferentes vías de inicio y propagación de la coagulación. Es importante destacar que los nuevos formatos de ensayo revelan que, contrariamente a lo que se piensa actualmente, los anticoagulantes orales dirigidos pueden no ser igualmente efectivos en dosificaciones constantes en todos los individuos.

Los inventores han divulgado en el presente documento un ensayo basado en flujo con sangre entera citratada recalcificada para comparar la función relativa del bucle de retroalimentación de trombina que genera FXIa y TF-FVIIa en la activación de FIX a FIXa. Con este fin, se perfundió sangre de 10 individuos normales sobre una superficie recubierta con una concentración limitante de rTF que previamente se había demostrado que apoya la activación de la coagulación y la depósito de fibrina dependiente de la actividad de FVIIIa y FIXa (ver Fig. 16); la rata de cizallamiento de la pared durante la perfusión se mantuvo en 300 s-1. Como control, se perfundieron las mismas muestras de sangre sobre una superficie de colágeno fibrilar tipo I que apoyaba la adhesión y agregación de plaquetas independientemente de la generación de trombina. La actividad de FXIa y Tf se bloqueó con anticuerpos monoclonales específicos (MoAb) para inhibir la generación de FIXa selectivamente a través del bucle de retroalimentación de FXIa por trombina o TF-FVIIa, respectivamente. Como se esperaba, en la superficie del colágeno el volumen de los agregados plaquetarios no se vio influenciado por la inhibición de las vías de coagulación, mientras que la deposición de fibrina se redujo notablemente por el anti-FXIa MoAb y esencialmente no se vio afectada por el anti-TF MoAb (Fig. 23 A-B). Estos resultados están de acuerdo con la idea de que la activación de la coagulación en una superficie de colágeno se inicia mediante la generación de FXIa a través de la vía de contacto dependiente de FXIIa.

Sorprendentemente, en la superficie del rTF, los resultados obtenidos delinearon dos patrones distintos de inicio de la coagulación. En 6 de los 10 individuos normales evaluados, la formación de fibrina fue insensible a la inhibición de la actividad de FXIa (Fig. 23A), pero en los 4 restantes el anti-FXIa MoAb redujo significativamente la coagulación iniciada por TF y la formación de fibrina (Fig. 23B). En todas las muestras, el nti-TF MoAb esencialmente abolió la deposición de fibrina (Fig. 23A-B), de acuerdo con la función clave recientemente demostrada del FXa naciente de TF-FVIIa en la activación del FVIIIa requerido para la generación de trombina en las condiciones experimentales elegidas. A diferencia del volumen de fibrina, en ninguna muestra el volumen de agregados plaquetarios disminuyó significativamente en la superficie del TF al inhibir la actividad de FXIa, mientras que disminuyó de manera variable al bloquear la actividad de T<f>, pero de manera significativa solo en las 4 muestras en las que la actividad de FXIa contribuyó a la generación de trombina y formación de fibrina (Fig. 23A-B).

Dado que la coagulación dependiente de FVIIIa está limitada por la disponibilidad de FIXa, estos hallazgos indican que, en -60 % de los individuos normales, la activación por retroalimentación de trombina del FXI no es limitante para la coagulación dependiente de tenasa intrínseca, que deriva FIXa para la formación del complejo FVIIIa-FIXa a partir del TF-FVIIa. En cambio, en -40% de los individuos normales, la generación de FIXa por parte de FXIa es necesaria para la formación de fibrina, por lo que la generación de FIXa por TF-FVIIa no puede contribuir a la coagulación normal. Anteriormente se sugirió que el FIXa producido por la vía extrínseca y su capacidad para funcionar dentro del complejo intrínseco Xasa para activar X puede desempeñar una función importante en la producción de Xa necesario tanto para la fase inicial como para la fase sostenida de la respuesta procoagulante después del daño vascular. Los inventores descubren ahora, utilizando formatos de ensayo de coagulación bajo flujo recientemente desarrollados, que los mecanismos que conducen a la generación de FIXa son una variable individual que puede tener implicaciones sobre el efecto de fármacos anticoagulantes específicos objetivo. El ejemplo más obvio es la nueva categoría de compuestos que disminuyen la concentración plasmática de FXI, desarrollada bajo el supuesto actual de que el FIXa del bucle de retroalimentación FXIa-trombina es clave para la amplificación de la coagulación. Estos datos sugieren que su efecto debería ser variable en pacientes, posiblemente hasta un 60% muestren un efecto limitado del FIXa derivado de TF-FVIIa.

La eficacia de rivaroxaban y apixaban, anticoagulantes orientados al FXa, se evaluó en diferentes individuos tratados. Rivaroxaban y apixaban inhiben de manera comparable la actividad protrombinasa FXa con IC50de 0.43 ± 0.06 y 1.08 ± 0.11 nM, respectivamente (Fig. 24A). En concentraciones terapéuticas de 50-450 nM, ambos inhibidos por -90 % de la generación de FVIIIa en reacciones con componentes purificados que contienen FXa preactivado, ya sea libre o en un complejo con TF y FVIIa mutado en el sitio activo (iFVIIa) estabilizado por la proteína anticoagulante del nematodo (<n>A) c2; por el contrario, la generación de FVIIIa por TF-FVIIa-FXa naciente en reacciones que inicialmente contenían FX se vio sólo marginalmente afectada (Fig. 24B). La resistencia a los dos inhibidores de FXa fue una propiedad específica del FXa recién generado por TF-FVIIa, ya que rivaroxaban inhibió la activación de FVIII mediante concentraciones equivalentes de FXa producidas in situ por el activador de FX del veneno de víbora de Russel (RVV) (Fig. 24C). Para evaluar si la falta de inhibición observada reflejaba una desventaja cinética para los inhibidores que interactúan con FXa en la transición conformacional de zimógeno a proteasa, los inventores probaron FXa con la sustitución V17M que restringe la capacidad de adoptar una conformación de proteasa activa. En un complejo estable con TF-iFVIIa-NApc2, FXa V17M podría generar FVIIIa, aunque de manera menos eficiente que FXa WT. Esta actividad, sin embargo, fue insensible a hasta 5 nM de rivaroxaban, mientras que 1 nM inhibió casi por completo la activación del FVIII por FXa WT (Fig. 24D-E). Por lo tanto, la dinámica de la transición del zimógeno a la proteasa contribuye a la interferencia limitada de los inhibidores directos del FXa con la función del TF-FVIIa-FXa naciente.

Los resultados sugirieron que el efecto antitrombótico de rivaroxabán selectivo para FXa y warfarina AVK -este último afecta la función de FVIIa y FIXa además de FXa y FIIa- podría variar de forma individual en los pacientes tratados. Para probar esta hipótesis, los inventores midieron la agregación plaquetaria y la deposición de fibrina en rTF inmovilizado expuesto al flujo de sangre de pacientes que recibieron los dos fármacos anticoagulantes en comparación con controles no tratados (Fig. 25). Las condiciones del ensayo fueron las utilizadas para los experimentos que se muestran en la Figura 2, pero la concentración de TF en la superficie aumentó de modo que el inicio de la coagulación ya no estuvo completamente limitado por la actividad del FVIIIa en la sangre de los controles no tratados. La concentración molar de TF para el recubrimiento de la superficie se ajustó considerando la diferente actividad procoagulante específica de los lotes individuales de rTF, medida como generación directa de FXa por TF-FVIIa. Al probar dos concentraciones diferentes de FT, se encontró que, con un FT más bajo, el volumen de fibrina depositada era notablemente menor en los pacientes tratados con warfarina o rivaroxabán que en los controles, pero con un FT más alto era significativamente mayor en los pacientes tratados con rivaroxabán que en los pacientes tratados con warfarina (Fig. 25A). Además, en la superficie superior del TF, rivaroxaban agregado a la sangre normal en el intervalo de concentración máxima medido en el plasma del paciente tratado redujo el volumen de fibrina parcialmente, pero casi por completo en presencia de un anti-FVIII MoAb que por sí solo produjo una inhibición modesta (Fig. 25B-C). Estos hallazgos demuestran que, incluso en concentraciones máximas, los inhibidores de orientados al FXa pueden preservar claramente la vía iniciada por TF recientemente revelada que permite directamente la coagulación intrínseca en el flujo sanguíneo bajo el control de inhibidores fisiológicos.

Estos estudios se ampliaron midiendo la agregación plaquetaria y el depósito de fibrina en sangre de una cohorte más grande de pacientes tratados con warfarina, rivaroxabán o el inhibidor directo de la trombina, dabigatrán. Todos los regímenes anticoagulantes fueron a largo plazo y los pacientes recibían dosificaciones de acuerdo con los protocolos actualmente aceptados. Los pacientes tratados con warfarina se monitorizaron periódicamente midiendo el índice de coagulación INR; los pacientes tratados con rivaroxabán o dabigatrán recibieron una dosis fija del fármaco según lo prescrito actualmente, sin medir los cambios en la coagulación. Todos los estudios fueron aprobados y monitorizados por juntas de revisión institucionales y se realizaron de acuerdo con protocolos estándar sobre experimentación en seres humanos. Se utilizó el mismo enfoque experimental para los estudios que se muestran en la Figura 2, perfundiendo sangre entera citratada recalcificada sobre superficies recubiertas con colágeno fibrilar tipo 1 o diferentes concentraciones de rTF a una rata de cizallamiento de la pared de 300 s_1 durante 5 minutos. En la superficie del colágeno, el volumen medio de agregados plaquetarios formados en muestras de control no tratadas o en muestras de pacientes tratados con cualquiera de los tres regímenes anticoagulantes no fue significativamente diferente, aunque en algunos pacientes estuvo por debajo del valor más bajo medido en el grupo de control, particularmente en pacientes tratados con el inhibidor de la trombina, dabigatrán (Fig. 26). Este resultado está de acuerdo con la idea de que las plaquetas se adhieren al colágeno y se activan para formar agregados independientemente de la generación y estimulación de la trombina, que sin embargo puede reforzar la activación y agregación plaquetaria. Por el contrario, el volumen de fibrina depositada se redujo notablemente en los pacientes que recibieron warfarina y dabigatrán -lo que indica una generación de trombina reducida y una inhibición de la actividad de la trombina, respectivamente- pero no en los que recibieron rivaroxabán; de hecho, en este último, el volumen medio de fibrina depositada no fue significativamente diferente de lo normal y fue significativamente mayor que en los grupos de warfarina y dabigatrán (Fig. 26).

En la superficie rTF, los resultados fueron curiosamente diferentes. Se probaron dos concentraciones de recubrimiento (20 y 40 pM), como para los experimentos mostrados en la Figura 25, y se midieron los volúmenes de agregados de plaquetas y fibrina depositada como para los experimentos con colágeno mostrados en la Figura 26. En cualquiera de las superficies del rTF, el volumen de agregados plaquetarios no fue significativamente diferente de los controles en pacientes que recibieron rivaroxaban; en cambio, en aquellos que recibieron warfarina, se redujo significativamente en ambas superficies de rTF, y en aquellos que recibieron dabigatrán solo en la superficie con la concentración más baja de rTF (Fig.27A). Estos resultados están de acuerdo con el concepto de que la adhesión y agregación plaquetaria en el TF inmovilizado requiere la activación proporcionada por la trombina generada como resultado de la coagulación inducida por el TF. Los resultados también muestran que el volumen de agregados plaquetarios es resultado del nivel de trombina generada y de la actividad de la trombina, que es menor en pacientes que reciben warfarina y dabigatrán que rivaroxaban en la dosificación utilizada. Con respecto a la fibrina, todos los pacientes tratados con anticoagulantes, independientemente del fármaco y la dosificación utilizados, tuvieron una deposición marcada y significativamente reducida en comparación con los controles no tratados cuando se perfundió sangre en la superficie con una densidad de rTF más baja (Fig. 27B). Sin embargo, cuando el TF de superficie estaba en una concentración más alta, sólo la sangre de pacientes que recibieron warfarina y dabigatrán todavía mostró una formación de fibrina marcadamente reducida, mientras que muchas muestras tratadas con rivaroxaban exhibieron una formación de fibrina en el intervalo normal (Figura 27B). Este último resultado concuerda con el inhibidor del FXa, rivaroxabán, que no bloquea la activación del FVIII por el TF-FVIIa-FXa naciente y preserva la función del complejo tenasa intrínseco FVIIIa-FIXa evitando también los inhibidores fisiológicos de la vía del TF.

Los diversos métodos y técnicas descritos anteriormente proporcionan varias formas de llevar a cabo la divulgación. Por supuesto, debe entenderse que no necesariamente todos los objetivos o ventajas descritos pueden lograrse de acuerdo con cualquier ejemplo particular descrito en el presente documento. Así, por ejemplo, los expertos en la técnica reconocerán que los métodos se pueden realizar de una manera que logre u optimice una ventaja o grupo de ventajas como se enseña en el presente documento sin necesariamente lograr otros objetivos o ventajas como se pueden enseñar o sugerir en el presente documento. En el presente documento se mencionan una variedad de alternativas ventajosas y desventajosas. Debe entenderse que algunos ejemplos preferidos incluyen específicamente una, otra o varias características ventajosas, mientras que otros excluyen específicamente una, otra o varias características desventajosas, mientras que otros mitigan específicamente una característica desventajosa presente mediante la inclusión de una, otra o varias características ventajosas.

Además, el experto reconocerá la aplicabilidad de diversas características de diferentes ejemplos. De manera similar, los diversos elementos, características y pasos discutidos anteriormente, así como otros equivalentes conocidos para cada elemento, característica o paso, pueden ser mezclados y combinados por un experto en esta técnica para realizar métodos de acuerdo con los principios descritos en el presente documento. Entre los diversos elementos, características y pasos, algunos se incluirán específicamente y otros se excluirán específicamente en diversos ejemplos.

Aunque la divulgación se ha divulgado en el contexto de ciertos ejemplos y ejemplos, los expertos en la técnica entenderán que los ejemplos de la divulgación se extienden más allá de los ejemplos específicamente divulgados a otros ejemplos y/o usos y modificaciones alternativos y equivalentes de los mismos.

Se han divulgado muchas variaciones y elementos alternativos en el ejemplo de la presente divulgación. Aún más variaciones y elementos alternativos serán evidentes para un experto en la técnica. Entre estas variaciones, sin limitación, se encuentran la selección de módulos constituyentes para las composiciones inventivas y las enfermedades y otras condiciones clínicas que pueden diagnosticarse, pronosticarse o tratarse con las mismas. Diversos ejemplos de la divulgación pueden incluir o excluir específicamente cualquiera de estas variaciones o elementos.

En algunos ejemplos, los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como concentración, condiciones de reacción, etc., utilizados para describir y reivindicar ciertos ejemplos de la divulgación deben entenderse modificados en algunos casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, en algunos ejemplos, los parámetros numéricos establecidos en la descripción escrita y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se buscan obtener mediante un ejemplo particular. En algunos ejemplos, los parámetros numéricos deben interpretarse a la luz del número de dígitos significativos informados y aplicando técnicas de redondeo ordinarias. Sin perjuicio de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de algunos ejemplos de la divulgación son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se informan con la mayor precisión posible. Los valores numéricos presentados en algunos ejemplos de la divulgación pueden contener ciertos errores necesariamente resultantes de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.

En algunas realizaciones, los términos "un", "uno, una" y "el/la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de una realización particular de la invención (especialmente en el contexto de algunas de las siguientes reivindicaciones) pueden interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento simplemente pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado con respecto a ciertos ejemplos en el presente documento tiene como objetivo simplemente iluminar mejor la divulgación y no plantea una limitación en el alcance de la divulgación que de otro modo se reivindica. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativo de ningún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la divulgación.

Las agrupaciones de elementos alternativos o ejemplos de la divulgación divulgada en el presente documento no deben interpretarse como limitaciones. Se puede hacer referencia a cada miembro del grupo y reivindicarlo individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo u otros elementos que se encuentran en el presente documento. Uno o más miembros de un grupo pueden incluirse o eliminarse de un grupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se produce dicha inclusión o eliminación, se considera que la memoria descriptiva contiene el grupo modificado, cumpliendo así con la descripción escrita de todos los grupos Markush utilizados en las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se describen ejemplos preferidos de esta divulgación, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la divulgación. Las variaciones de esos ejemplos preferidos resultarán evidentes para los expertos en la técnica al leer la descripción anterior. Se contempla que los expertos en la técnica puedan emplear dichas variaciones según corresponda, y la divulgación se puede practicar de otra manera que la descrita específicamente en el presente documento. En consecuencia, muchos ejemplos de esta divulgación incluyen todas las modificaciones y equivalentes del tema mencionado en las reivindicaciones adjuntas al presente según lo permita la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas sus posibles variaciones está abarcada por la divulgación a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente.

Además, a lo largo de esta especificación se han hecho numerosas referencias a patentes y publicaciones impresas.

Para terminar, debe entenderse que los ejemplos de la invención divulgados en el presente documento son ilustrativos de los principios de la presente divulgación. Otras modificaciones que pueden emplearse pueden estar dentro del alcance de la divulgación. Por lo tanto, a modo de ejemplo, pero no de limitación, se pueden utilizar configuraciones alternativas de la presente divulgación de acuerdo con las enseñanzas del presente documento. En consecuencia, los ejemplos de la presente divulgación no se limitan a lo que se muestra y describe exactamente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ensayo combinado para medir la trombina generada (TG) en una muestra de sangre y determinar tanto la cantidad de TG medida que depende de la activación del factor tisular (TF) de FVIII a FVIIIa como la cantidad de TG medida que es independiente de la activación del TF de FVIII a FVIIIa en la muestra de sangre, que comprende: (i) incubar la muestra de sangre con factor tisular (TF), FIXa y CaCh por hasta 5 minutos; y medir TG en la muestra de sangre usando HD-ciclohexil-alanil-alanil-argininil-amidometilcumarina (AMC) y/o butiloxicarbonil-valil-prolinilargininil-AMC (VPR-AMC), en donde las TG medidas dependen de la activación de TF de FVIII a FVIIIa, y

(ii) incubar la muestra de sangre con factor tisular (TF) y CaCh, pero sin FIXa, hasta por 5 minutos; y medir TG en la muestra de sangre usando HD-ciclohexil-alanil-alanil-argininil-amidometilcumarina (AMC) y/o butiloxicarbonil-valilprolinil-argininil-AMC (VPR-AMC), en donde las TG medidas son independientes de la activación de TF de FVIII a FVIIIa.

2. El ensayo de la reivindicación 1, en el que la concentración de TF añadido en (ii) es 1.2 pM.

3. El ensayo de la reivindicación 1, que comprende, además:

(a) la incubación de la muestra de sangre mediante la adición de EDTA; o

(b) determinar el nivel de FVIII en la muestra de sangre;

opcionalmente en el que el ensayo es útil para identificar variantes de FVIII con funcionalidad mejorada y/o estabilidad aumentada.

4. El ensayo de la reivindicación 1, en el que:

(a) la cantidad de TF agregada a la muestra de sangre en (i) está entre 1 pM y 1 fM;

(b) la cantidad de FIXa añadida a la muestra de sangre en (i) está entre 1 uM y 1 pM;

(c) la cantidad de CaCh agregado a la muestra de sangre está entre 1 mM y 999 mM;

(d) la muestra de sangre es de un paciente con hemofilia grave; o

(e) el TF es factor tisular recombinante (rTF).

5. El ensayo de la reivindicación 1, en el que:

(a) el ensayo es muy sensible y tiene un límite de detección de TG de aproximadamente 5 pM;

(b) el ensayo predice el riesgo de hemorragia y trombogénesis en un paciente;

(c) el ensayo puede completarse en 10 minutos; o

(d) el ensayo es útil para cribar nuevos agentes hemostáticos.