JP7091413B2 - 抗血栓療法および止血療法のための組成物および方法 - Google Patents

抗血栓療法および止血療法のための組成物および方法 Download PDF

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Description

本開示は、医学および生物医学分野に属し、具体的には、出血障害の領域に属する。
血液凝固の活性化は、組織障害への応答に際しての止血および先天免疫の鍵であるが、また、血管の血栓症の一因ともなり、ひいては重大な疾患の病因を与える。現在広まっている凝固スキームでは、第（Ｆ）ＶＩＩａ因子と組織因子（ＴＦ）との外因性経路開始複合体が、タンパク質分解反応のカスケードを促進してＦＸａを産生し、ＦＸａは、ＦＶａと共に活性のプロトロンビナーゼを形成して、プロトロンビン（ＦＩＩ）をトロンビン（ＦＩＩａ）に変換する。最初に生成されたトロンビンは、ＦＶＩＩＩ補因子およびＦＶ補因子のフィードバック活性化による凝固の増幅の鍵であるものと考えられていたが、最近のデータでは、凝固の開始の間のＦＶの活性化にＦＸａが関与する可能性が高いことが示されている。
現存の文献では、追加の反応、例えばＦＸａまたはＴＦ－ＦＶＩＩａによって触媒されるＦＶＩＩＩの活性化などが、凝固を惹起する際に重要な役割を果たすのか否かが不明である。現在の知識によって支持される現在広まっている凝固スキームでは、なぜ、共通凝固経路のプロテアーゼ、ＦＸａ、およびトロンビンを選択的に標的とする薬剤が、複数の凝固因子に影響を及ぼすビタミンＫアンタゴニストと同様の抗血栓効能を達成するように用量投与された際に、重篤および重度の頭蓋内出血のリスクを低減するのかを、説明することができない。
そのため、本分野では、新規のさらに有効な医学的治療ならびに診断試験および予知試験を開発するために、抗血栓ＦＸａ阻害剤により止血性凝固への干渉が低減することについて、機構論的な説明を提供することが依然として求められている。
本明細書に開示される様々な実施形態としては、血液試料中の生成トロンビン（ＴＧ）を測定するための高感度で迅速なアッセイが挙げられ、このアッセイは、血液試料を組織因子（ＴＦ）、ＦＩＸａ、およびＣａＣｌ２と共に５分間までインキュベーションすること；およびＨ－Ｄ－シクロヘキシル－アラニル－アラニル－アルギニル－アミドメチルクマリン（ＡＭＣ）および／またはブチルオキシカルボニル－バリル－プロリニル－アルギニル－ＡＭＣ（Ｖ－Ｐ－Ｒ－ＡＭＣ）を使用することによって、血液試料中のＴＧを測定することを含む。一実施形態では、本アッセイは、ＥＤＴＡの添加による血液試料のインキュベーションをさらに含む。一実施形態では、血液試料に添加されるＴＦの量は、１ｐＭと１ｆＭとの間である。一実施形態では、血液試料に添加されるＦＩＸａの量は、１ｕＭと１ｐＭとの間である。一実施形態では、血液試料に添加されるＣａＣｌ２の量は、１ｍＭと９９９ｍＭとの間である。一実施形態では、血液試料は、重度の血友病患者由来である。一実施形態では、ＴＦは、組換え組織因子（ｒＴＦ）である。一実施形態では、本アッセイは、高感度であり、約５ｐＭのＴＧの検出限界を有する。一実施形態では、本アッセイは、患者における大出血および血栓形成のリスクを予測する。一実施形態では、本アッセイは、１０分以内に完了させることができる。一実施形態では、本アッセイは、血液試料中のＦＶＩＩＩのレベルを決定することをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、機能性が向上しおよび／または安定性が増加したＦＶＩＩＩバリアントを特定するのに有用である。一実施形態では、本アッセイは、新規の止血剤をスクリーニングするのに有用である。
本明細書に開示される様々な実施形態はまた、対象における出血リスクを決定するためのアッセイを含み、このアッセイは、対象から血液試料を取得すること；組織因子（ＴＦ）および／または第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）を含む組成物を、血液試料に添加すること；血液試料中の第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の量を決定すること；ならびに試料中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量が＞５ＩＵ／ｄＬであれば対象での軽度の出血リスクを、試料中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量が１～５ＩＵ／ｄＬであれば対象での中等度の出血リスクを、および対象中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量が＜１ＩＵ／ｄＬであれば対象での重度の出血リスクを、決定することを含む。一実施形態では、本アッセイは、中等度の出血リスクを重度と区別するための高感度の能力がある。一実施形態では、血液試料に添加されるＴＦの量は、１ｆＭから１ｐＭである。一実施形態では、血液試料に添加されるＦＩＸａの量は、１ｐＭから１ｎＭである。一実施形態では、本アッセイは、遊離のＦＸａの生成が減少し、ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＩＸａの生成が遮断された際に、モノクローナル抗体１２Ｃ７を使用することによって、ＦＶＩＩＩの活性化を測定することをさらに含む。一実施形態では、ＦＶＩＩのＴ９９Ｙ変異体または同様の有用な特性について特定された別の変異体を、試料に添加すること、および遊離のＦＸａの生成が減少した際に、ＦＶＩＩＩの活性化を測定することをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、ＦＶＩＩのＥ１５４Ａ変異体または同様の有用な特性について特定された別の変異体を、試料に添加すること、および遊離のＦＸａの生成が減少した際に、ＦＶＩＩＩの活性化を測定することをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、補因子ＦＶＩＩＩとＦＶの活性化を区別することを可能にする。一実施形態では、ＦＶＩＩＩ：Ｃの量の検出限界は０．１ＩＵ／ｄＬ以下である。一実施形態では、ＴＦおよびＦＩＸａは、個々の血液試料に同時に添加される。一実施形態では、ＴＦは再脂質化された形態である。一実施形態では、対象は、重度の血友病Ａであることを以前に診断されている。一実施形態では、対象は、後天性のＦＶＩＩＩ欠乏症であることを以前に診断されている。一実施形態では、本アッセイは、出血の表現型の特徴を正確に明らかにすることをさらに含む。一実施形態では、血液凝固レベルを査定することは、重度の血友病Ａ患者の治療レジメン全体の一部分である。一実施形態では、血液凝固レベルを査定することは、ＦＶＩＩＩ製品を用いた補充療法全体の一部分である。一実施形態では、本アッセイは、現在利用可能な方法よりも少なくとも１０倍の感度を用いて、重度の血友病患者におけるＦＶＩＩＩ：Ｃのレベルを決定する。一実施形態では、本アッセイは、ＦＶＩＩＩ濃縮物を用いた治療のモニタリングのために、および濃縮物の効力の査定のために有用である。一実施形態では、本アッセイは、機能性が向上しおよび／または安定性が増加したＦＶＩＩＩバリアントを特定することをさらに含む。一実施形態では、血友病Ａ治療のための効能および安全性が向上した新規の止血剤をスクリーニングすることをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、個々の患者について抗血栓療法の安全性および効能をモニタリングするための新しい方法およびキットを設計するのに有用である。一実施形態では、本アッセイは、治療効能が向上した新しい抗血栓剤を特定し特徴を明らかにするのに有用である。一実施形態では、本アッセイは、止血への影響が減少した新しい抗血栓剤を特定し特徴を明らかにするのに有用である。一実施形態では、本アッセイは、、自然発生や外傷後の頭蓋内大出血などの、命に関わる出血合併症を低減する。一実施形態では、本アッセイは、効能および安全性が向上した新規の止血剤を特定するのに有用である。一実施形態では、対象は、先天性または後天性のＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの欠乏症（血友病）を有する。一実施形態では、本アッセイは、遊離のＦＸａによるＦＶＩＩＩａの活性化またはトロンビン－フィードバックループとは別個のものとして、活性の補因子ＦＶＩＩＩａの生成に対する天然のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの相対的寄与を測定する。一実施形態では、本アッセイは、ＦＶＩＩＩを活性化するがＦＶを活性化せず、初発のトロンビンの生成を必要とすることなくそのようにする。一実施形態では、遊離のＦＸａは、ＦＶからＦＶａへと活性化する。
本明細書に開示される様々な実施形態はまた、血液凝固を決定するためのキットを含み、そのキットは、組織因子（ＴＦ）、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、凝血原（ＰＬ）、および／もしくは第ＩＩａ因子（ＦＩＩａ）、またはその医薬的な等価体、誘導体、類似体、および／または塩を含む組成物を含む。一実施形態では、本キットは、Ｈ－Ｄ－シクロヘキシル－アラニル－アラニル－アルギニル－アミドメチルクマリン（ＡＭＣ）および／またはブチルオキシカルボニル－バリル－プロリニル－アルギニル－ＡＭＣ（Ｖ－Ｐ－Ｒ－ＡＭＣ）を含む組成物をさらに含む。一実施形態では、本キットは、ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性のレベルを決定するための装置をさらに含む。一実施形態では、本キットは、ＴＧの量を決定するための装置をさらに含む。一実施形態では、ＴＦおよび／またはＦＩＸａの組成物が、ピコモルおよび／またはナノモルの投薬量である。一実施形態では、本キットは、血友病患者の個別化診断に有用である。一実施形態では、本キットは、先天性のおよび後天性のＦＶＩＩＩ：Ｃ欠損症の患者における出血リスクを予測するのに有用である。一実施形態では、本キットは、抗血栓レジメンのモニタリングおよび評価に有用である。一実施形態では、本キットは、薬剤の治療または薬剤の組合せに基づく診断、モニタリング、および／または評価をさらに含む。
本明細書に開示される様々な実施形態は、患者における出血という特徴を有する疾患を診断、モニタリング、または予知する方法をさらに含み、この方法は、患者から血漿試料を取得すること；血液試料を組織因子（ＴＦ）、ＦＩＸａ、および／またはＣａＣｌ２と共にインキュベーションすること；試料をアッセイして、ＦＶＩＩＩ：Ｃおよび／または生成トロンビン（ＴＧ）のレベルを決定すること；ならびに試料中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量に基づき、疾患を診断、モニタリング、または予知することを含み、ここで上記疾患は、ＦＶＩＩＩ：Ｃのレベルが下落するにつれて、重症度が増す。一実施形態では、疾患は出血障害である。一実施形態では、疾患は、抗血栓治療に対する有害反応に関連する障害である。一実施形態では、疾患は止血障害である。一実施形態では、検出されたＦＶＩＩＩ：Ｃ量のレベルが５ＩＵ／ｄＬ超である場合に、患者は軽度の出血リスクを有する。一実施形態では、検出されたＦＶＩＩＩ：Ｃ量のレベルが１～５ＩＵ／ｄＬの間にある場合に、患者は中等度の出血リスクを有する。一実施形態では、検出されたＦＶＩＩＩ：Ｃ量のレベルが１～０．１ＩＵ／ｄＬの間にある場合に、患者は重度の出血リスクを有する。一実施形態では、ＴＦおよび／またはＦＩＸａは、ピコモル量またはナノモル量で患者の血液試料に投与される。一実施形態では、本方法は、適切な抗血栓症治療を投与することによる追加の治療をさらに含む。一実施形態では、本方法は、血栓症の治療のための薬剤の組合せを投与することをさらに含む。一実施形態では、本方法は、機構論的な見地で異なる標的選択的な抗凝血剤を用いた個別化治療を達成するのに有用である。一実施形態では、患者は、抗凝血剤を用いた治療を受けている。一実施形態では、抗凝血剤は、経口の抗凝血剤である。一実施形態では、アッセイは、重度の血友病Ａ患者における低レベルのＦＶＩＩＩ：Ｃを検出することができる。一実施形態では、アッセイは、後天性のＦＶＩＩＩ欠乏症の個体における低レベルのＦＶＩＩＩ：Ｃを検出することができる。一実施形態では、感度の増加したＦＶＩＩＩ活性アッセイによって、出血の表現型の特徴をさらに正確に明らかにすることが可能になる。一実施形態では、感度の増加したＦＶＩＩＩ活性アッセイによって、重度の血友病Ａ患者における出血リスクの予測が可能になる。一実施形態では、アッセイは、新たに特定された凝固経路における機能が増大しおよび／または安定性が増加した抗血友病ＦＶＩＩＩのバリアントを特定する助けとなり、それゆえ、抗血友病ＦＶＩＩＩ機能を欠損している患者の補充療法が改善される。
本明細書に開示される様々な実施形態はまた、新しい抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤候補をスクリーニングおよび／または評価する方法を含み、この方法は、患者から血漿試料を取得すること；ＴＦ、ＦＩＸａ、および／またはＣａＣｌ２を含む組成物を血液試料に添加すること、ならびに試料をアッセイしてＦＶＩＩＩ：Ｃレベルもしくは生成トロンビン（ＴＧ）レベルを決定すること；ならびにＦＶＩＩＩ：ＣレベルまたはＴＧレベルに基づいて、新しい抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤候補をスクリーニングおよび／または評価することを含む。一実施形態では、ＴＦおよびＦＩＸａは、ピコモル量またはナノモル量で血液試料に添加される。一実施形態では、新しい抗血栓剤または止血促進剤を評価することは、新しい抗血栓剤または止血促進剤のために設計またはスクリーニングすることを含む。一実施形態では、抗血栓剤または止血促進剤は、治療効能が向上している。一実施形態では、抗血栓剤または止血促進剤は、安全性プロファイルが向上している。一実施形態では、新しい抗血栓薬剤候補を評価することは、ＴＦ開始性の凝固の状況では、凝固補因子の機能的な保存または分解に特異的におよび定量的に焦点を置き、血栓促進性経路と止血促進性経路とを区別することを含む。一実施形態では、抗血栓剤または止血促進剤は、出血合併症に関する抗血栓効果と安全性プロファイルとの最良のプロファイルに基づいて評価される。
本明細書に開示される様々な実施形態はまた、抗凝血剤の治療効能を査定する方法を含み、この方法は、血液試料を提供すること；コラーゲンで被覆されているかまたはｒＴＦで固相化されている表面上に、前記血液試料を灌流すること；コラーゲンで被覆されているかまたはｒＴＦで固相化されている表面上で、血小板の凝集およびフィブリンの沈着を測定すること；ならびに血小板凝集体および／または沈着フィブリンの体積に基づき、抗凝血剤の治療効能を査定することを含む。一実施形態では、抗凝血剤は、ＦＸａを標的とする凝血剤である。一実施形態では、抗凝血剤は、ヘパリン（抗トロンビン補因子）、ワルファリン（ビタミンＫアンタゴニスト）、ダビガトラン（直接的なトロンビン阻害剤）、リバーロキサバン、および／またはアピキサバン（２種の直接的なＦＸａ阻害剤）である。一実施形態では、凝血剤は、血漿中のＦＸＩのレベルおよびそれゆえ活性を減少させるアプタマーなどの、標的化凝血剤である。一実施形態では、灌流は、壁せん断速度３００ｓ－１で５分間である。
本明細書に開示される他の実施形態は、疾患に対する感受性をf診断する方法をさらに含み、この方法は、患者から試料を取得すること；試料をアッセイして、ＦＶＩＩＩ：Ｃの活性化があるかないかを決定すること；およびＦＶＩＩＩ：Ｃの活性化がないことに基づき、疾患に対する感受性を診断することを含む。一実施形態では、疾患は高出血を伴う。一実施形態では、疾患は、止血障害を伴う。一実施形態では、ＦＶＩＩＩ：Ｃの活性化は、同時にＦＶａを産生することなくＦＶＩＩＩをＦＶＩＩａに活性化するという特徴を有する。一実施形態では、疾患は、血栓症とは対照的な、止血に向けた凝固応答のバイアスという特徴を有する。
本明細書に開示される他の実施形態はまた、患者における異常な出血および／または表現型の有意なリスクの特徴を明らかにする方法を含み、この方法は、患者から試料を取得すること；試料をアッセイして、ＦＶＩＩＩのフィードバック活性化の前にＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ開始複合体中の新生のＦＸによって媒介されるＦＶＩＩＩの活性化があるかないかを決定すること；ならびにＦＶＩＩＩの活性化がないことに基づき、異常な出血の有意なリスクを決定することを含む。
本発明の他の特長および利点は、例として本発明の様々な実施形態を説明する添付の図面と併せて、以下の詳細な記載から明らかになる。
例示的な実施形態は、参照される図に説明されている。本明細書に開示される実施形態および図は、制限的というよりも説明的であるものとみなされることが意図される。
凝固の開始および増幅の各種略図表現を本明細書の実施形態に従って説明する図である。現行のパラダイム（左）では、補因子ＦＶＩＩＩおよびＦＶの活性化は、主にトロンビンによって媒介されるものと考えられているが、尤も、トロンビンに関連するＦＸａの鍵となる役割は、ＦＶの活性化について強調されている。右には、この開示に記載される新規の凝固スキームがある。ＦＶＩＩＩは、ＴＦＰＩによる阻害の前に、外因性ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ開始複合体内の新生のＦＸａによって活性化される。併行してＦＩＸを活性化することによって、外因性ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体は、現在考えられているように内在性の凝固を増幅させるだけでなく、直接的に抗血友病経路を開始することができる。描かれている２種の凝固活性化の経路は、各種刺激に対する応答に際して可変的に統合される。 ＴＦに曝露された血流中で凝固阻害剤が血栓形成に及ぼす影響を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。標示された被覆溶液濃度を用いて固相化されたｒＴＦ上への血小板およびフィブリンの沈着である。対照（Ｃ；ｎ＝９）およびワルファリン（Ｗ；ｎ＝１２、平均ＩＮＲは２．６）またはリバーロキサバン（Ｒ；ｎ＝１０、薬剤摂取の２時間後の平均血漿濃度は３１２ｎＭ）で治療された患者由来の、カルシウム再加された（１．２９ｍＭ Ｃａ２＋）クエン酸塩添加血液を、壁せん断速度３００ｓ１で５分間灌流した。 ＴＦに曝露された血流中で凝固阻害剤が血栓形成に及ぼす影響を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。左：不含であるか（Ｃ）または３００ｎＭリバーロキサバン（Ｒ）および／もしくは抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂ（ＥＳＨ－８、４０μｇ／ｍＬ）を含む正常な血液を、（Ａ）にあるように、固相化されたｒＴＦの上に２分間灌流した。その際に全ての条件でｎ＝３とした。異なる顕微鏡を使用したために、（Ｂ）での定量域が（Ａ）よりも４．６５倍大きいことに留意されたい。右：緑色（血小板または白血球）および赤色（フィブリン）の蛍光チャネルを用いて重ね合わせたシグナルを有した代表的な共焦点画像（辺＝３１２μｍ）である。ここでは、共局在は黄色を生じている。結果を、最小値から最大値のひげを付した２５～７５パーセンタイルのバー（Ａ）で、または（ｎ≦３である際には）最小値から最大値のバー（Ｂ）で示す。ここでは、横線は中央値を標示する。統計的評価は、クラスカル－ウォリス／ダン検定（Ａ）またはＡＮＯＶＡ／テューキー検定（Ｂ）を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 （Ａ）閾値下のＴＦ－ＦＶＩＩａによる内在性経路のＴＧの増幅を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。不含であるかまたはリバーロキサバンもしくはアピキサバンおよび抗ＦＶＩＩＩＭｏＡｂ（ＥＳＨ－８、４０μｇ／ｍＬ）を含み、３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩを含有する、カルシウム再加されたクエン酸添加ＰＲＰ（１８０×１０３血小板数／μＬ）中において、０．６ｐＭ ＴＦによって誘導されたＴＧ（２連を表す）である。（Ｂ）閾値下のＴＦ－ＦＶＩＩａによる内在性経路のＴＧの増幅を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。４０μｇ／ｍＬのウサギ非免疫（左）または抗ＴＦＰＩＩｇＧ（右）を含み、３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩを含む、カルシウム再加されたクエン酸添加ＰＲＰ中に添加された０．１５ｐＭ ｒＴＦまたは／および２０ｐＭ ＦＩＸａによって、誘導されたＴＧ（３連を表す）である。（Ｃ）閾値下のＴＦ－ＦＶＩＩａによる内在性経路のＴＧの増幅を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１８０×１０３正常血小板数／μＬを用いて再構成されたＦＩＸ欠損血漿中、５０μｇ／ｍＬ ＣＴＩの共存下、０．１５ｐＭ ｒＴＦによって誘導されたＴＧ（２連を表す）である。（Ｄ）閾値下のＴＦ－ＦＶＩＩａによる内在性経路のＴＧの増幅を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩを含むＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中、２０ｐＭ ＦＩＸａの不在／存在下で、０．１５ｐＭ ｒＴＦによって誘導されたＴＧの高感度アッセイである。ＦＶＩＩ欠損ＰＲＰは、４００ｐＭのＷＴ ＦＶＩＩａまたはＳ１９５Ａ不活性変異体（ｉＦＶＩＩａ）を用いて再構成したかまたはせず、３７℃で５分間（ｎ＝２～５）、８分間（ｎ＝２～５）、または１１分間（ｎ＝３）インキュベーションした。結果を、最小値から最大値のひげおよび中央値の線を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、データをｙ＝ｌｏｇ１０ｙに転換した後にＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｅ）閾値下のＴＦ－ＦＶＩＩａによる内在性経路のＴＧの増幅を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１０ｎＭ ＴＦ、１０ｎＭ ｉＦＶＩＩａ、５ｎＭＦＸａ、４０ｎＭＴＦＰＩまたはＮＡＰｃ２、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２と共にプレインキュベーション（２分間、３７℃）された安定な複合体によって誘導された、ＴＧの高感度アッセイである。１０ｐＭ ＦＩＸａの不在／存在下での複合体を、標示されたＴＦ濃度およびＦＸａでＦＶＩＩ欠損血漿（ＣＴＩを含む）に添加した。ＦＶＩＩ欠損血漿は、正常血小板を用いて再構成し、３７℃で８分間（ｎ＝３～５）インキュベーションした。結果を、最小値から最大値のひげおよび中央値の線を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、データをｙ＝ｌｏｇ１０ｙに転換した後にＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 （Ａ）ＴＦ－ＦＶＩＩａ由来の新生ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩ活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。５０ｐＭ ＴＦ（０．３７μＭ 凝血原リン脂質）と１００ｐＭ 不活性ｉＦＶＩＩａ、１００ｐＭ ＦＸａ、５ｎＭ ＮＡＰｃ２との安定な複合体による、ＦＶＩＩＩ活性化のＷＢ分析（２連を表す）であり、複合体は、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、２００ｎＭ レピルジンと共に、１０ｎＭ ＴＦＰＩαまたは２．５μＭ アンチトロンビン（ＡＴ）／５μＭ五糖補因子（ペンタ）の不在下／存在下で、１２０秒間インキュベーションされた。（Ｂ）ＴＦ－ＦＶＩＩａ由来の新生ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩ活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。４μＭ ＤＡＰＡの不在下（ｎ＝７）または存在下（ｎ＝１３）、５０ｐＭ ＴＦ、１３５ｎＭ ＦＸ、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、１μＭプロトロンビン、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２中に１０ｎＭ ＦＩＸａまたは２００ｐＭ ＦＶＩＩａまたは２種の組合せを添加し、３７℃で１８０秒間インキュベーションして誘導された、ＦＸａの生成である。４つの実験で、不活性Ｓ１９５Ａ変異体をＷＴプロトロンビンに置き換えた（ＤＡＰＡなし）。ＦＶＩＩａおよびＦＩＸａそれぞれによって生成されたＦＸａを共添加されたＦＶＩＩａ／ＦＩＸａから差し引くことによって、ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ当たりのＦＸａを算出した。結果を、最小値から最大値のひげおよび中央値の線を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡの後、テューキー検定を用いて評価した。データをｙ＝ｌｏｇ１０ｙに転換した後に解析した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＴＦ－ＦＶＩＩａ由来の新生ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩ活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１８ｎＭ ＶＷＦの存在下（ｎ＝５）または不在下（ｎ＝４）、５００ｐＭ ＦＶＩＩａ、４００ｐＭ ＴＦ、１０ｎＭ ＦＩＸａ、１３５ｎＭ ＦＸ、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭＦＶ、１μＭ プロトロンビン、４０ｎＭ ＴＦＰＩα、４μＭ ＤＡＰＡ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む反応中で１８０秒後の、ＴＦ－ＦＶＩＩａまたはＦＩＸａ－ＦＶＩＩＩａによるＦＸａの生成である。結果を、最小値から最大値のひげおよび中央値の線を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡを用いて評価した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＴＦ－ＦＶＩＩａ由来の新生ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩ活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。予備活性化またはｄｅ ｎｏｖｏ生成されたＦＸａによるＦＶＩＩＩａの生成、およびＡＴ／ペンタ濃度の増加によるその阻害のＷＢ分析（２連を表す）である。反応（３７℃）は、４００ｐＭ ＴＦ、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、２００ｎＭレピルジンを含みかつ３ｎＭ ＦＶ／５０ｎＭ ＦＩＸを含まない（上、インキュベーション６０秒）かまたは含む（下インキュベーション１２０秒）混合物中で、５０ｎＭ ＦＸを含む２００ｐＭ ＦＸａまたは２０ｐＭＦＶＩＩａによって開始した。（Ｅ）既知のＦＶＩＩＩａ量（新生ＦＸａ当たりｎ＝６～８、予め形成されたＦＸａ当たり４～６）を用いて較正した、Ｄ（下）の生成ＦＶＩＩＩａの定量値（非阻害対照に対する）である。結果を、最小値から最大値のひげおよび中央値の線を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡの後、ダネット検定を用いて評価した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 （Ａ）ＦＸａ産物放出不全性のＦＶＩＩａ変異体が、依然として新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートできるという実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。２μＭ可溶性ｒＴＦと１０ｎＭ ＦＶＩＩａＷＴ、Ｔ９９Ｙ、またはＥ１５４Ａとの複合体による、ＦＸ（１μＭ）からＦＸａへの変換に関するリン脂質不含アッセイである。（Ｂ）ＦＸａ産物放出不全性のＦＶＩＩａ変異体が、依然として新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートできるという実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。２００ｐＭ ＦＶＩＩａＷＴ、Ｔ９９Ｙ、またはＥ１５４Ａを１３５ｎＭ ＦＸ、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶおよび２００ｎＭレピルジンに添加して（２分間、ｎ＝２～３；４分間、ｎ＝４～５；６分間、ｎ＝６～９）、５０ｐＭリン脂質により再構成されたｒＴＦによる、ＦＸａの生成である。結果を、最小値から最大値のひげ（中央値に線あり）を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した。４分および６分の結果は、ｙ＝ｌｏｇ１０ｙに転換した後に解析した（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ＦＸａ産物放出不全性のＦＶＩＩａ変異体が、依然として新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートできるという実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１３５ｎＭ ＦＸの不在下／存在下、５０ｐＭ ＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａＷＴまたは変異体、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、および２００ｎＭレピルジンの反応中の、ＦＶＩＩＩ活性化のＷＢ（２連を表す）であり、反応は、３７℃で１２０秒間インキュベーションした。留意すべきは、ＦＸ（１１）の不在下では、ＦＶＩＩａＷＴによって、不活性のＦＶＩＩＩＡ１３３７－３７２ドメインがより少なく生成することであり、このことは、切断の活性化が新生ＦＸａに優先的であることを示す。（Ｄ）ＦＸａ産物放出不全性のＦＶＩＩａ変異体が、依然として新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートできるという実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１０ｎＭ ＴＦＰＩαの不在または存在下で５０ｐＭ ＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａＷＴまたは変異体、１３５ｎＭ ＦＸによって誘導された、ＦＶＩＩＩ活性化（上；インキュベーション１８０秒）およびＦＶ活性化（下；インキュベーション４２０秒）のＷＢ（２連を表す）である。（Ｅ）ＦＸａ産物放出不全性のＦＶＩＩａ変異体が、依然として新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートできるという実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＴＦＰＩα不在下で、１０ｎＭ ＦＩＸａ（左、インキュベーション１８０秒；ｎ＝５～６、Ｅ１５４Ａについて＝２を除く）または９０ｎＭＦＩＸ（右、インキュベーション３６０秒間；ｎ＝５～６）の存在下、（Ｄ）の反応で測定された、ＦＸａの生成である。結果を、最小値から最大値のひげ（中央値に線あり）を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した。（Ｅ、右）のＦＩＸを用いた反応の結果は、ｙ＝ｌｏｇ１０ｙに転換した後に解析した（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｆ）ＦＸａ産物放出不全性のＦＶＩＩａ変異体が、依然として新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートできるという実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩを含有するＦＶＩＩ欠損の再構成ＰＲＰ中での、２．５ｐＭ ＴＦによるＴＧ（３連を表す）であり、ＰＲＰは、４００ｐＭ ＦＶＩＩａＷＴまたは変異体を補充され、抗体不含（左）、抗ＦＶＩＩＩ（８Ｄ４、８μｇ／ｍＬ；中央）または抗ＦＸＩ（Ｏ１Ａ６、２０μｇ／ｍＬ；右）を含む。 （Ａ）ｅｘ ｖｉｖｏで、ＦＶＩＩＩａ依存的な血栓形成が、血流中のＴＦ凝固開始複合体によって誘導されることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。洗浄した正常なＯ型血液細胞を本来の体積のＦＶＩＩ欠損クエン酸添加ＰＰＰに再懸濁し、抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂ Ｃ５（２５μｇ／ｍＬ）を添加するかまたはせずに、２００ｐＭのＷＴまたは変異体のＦＶＩＩａを補充した後、カルシウム再加（１．２９ｍＭ Ｃａ２＋）および３００ｓ－１の壁せん断速度で３．５分間の灌流を行った。ＦＶＩＩａＴ９９Ｙ変異体により再構成された血液にＦＩＸａ（２０ｐＭ）を添加することの影響も評価した。代表的な共焦点画像を、緑色（血小板凝集体および白血球）および赤色（フィブリン）の蛍光チャネルの重ね合わせを用いて示す。画像の辺＝３１２μｍ。（Ｂ）ｅｘ ｖｉｖｏで、ＦＶＩＩＩａ依存的な血栓形成が、血流中のＴＦ凝固開始複合体によって誘導されることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＴＦにより被覆された表面上に沈着した血小板凝集体およびフィブリンの体積の定量値である（各種条件についてｎ＝４～６）。結果を、中央値に線を有する最小値から最大値のひげを付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ｅｘ ｖｉｖｏで、ＦＶＩＩＩａ依存的な血栓形成が、血流中のＴＦ凝固開始複合体によって誘導されることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ノックインされたヒトＴＦ（左）または内在性マウスＴＦ（右）を発現するマウスマクロファージから得られた凝血原マイクロパーティクル（ＭＰ）上の、機能的ＦＶＩＩＩａの生成である。ＦＶＩＩＩａの生成は、２ｎＭ ＦＩＸａの不在または存在下、１０ｎＭ ヒトまたはマウス種適合型ＦＶＩＩａおよび０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、１３５ｎＭ ＦＸ、２００ｎＭレピルジンを含有する反応中に、ＭＰ懸濁液を添加することによって誘導した。ＦＶＩＩＩａ－ＩＸａによるＦＸの活性化を、総反応速度および個々の反応速度から算出した。結果を、中央値に線を有する最小値から最大値のバー（Ｃ、ｎ＝２～３）を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 （Ａ）Ｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＦが血栓形成におけるＦＶＩＩＩａの生成に寄与することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。標示された濃度の抗ＴＦ２１Ｅ１０および抗ＦＸＩ１４Ｅ１１を受けたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで、７％（０．２６Ｍ）または８％（０．３Ｍ）のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏで傷害を与えた後の頸動脈の閉塞である。最初の閉塞の時間および流動指数（各種の群でｎ＝５～２０）を測定した。ドットプロットは、中央値および四分位数範囲（Ａ、上）または９５％ＣＩを伴う平均値（Ａ、下）を示す。統計的評価は、クラスカル－ウォリス／ダン（Ａ、上）またはＡＮＯＶＡ／テューキー検定（Ａ、下）を用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）Ｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＦが血栓形成におけるＦＶＩＩＩａの生成に寄与することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＶＩＩＩａ（どちらも４０ｐＭ）は、抗ＴＦ５Ｇ９（５０μｇ／ｍＬ）ＭｏＡｂにより誘導されるＴＧ阻害を逆進させたが、ＦＶＩＩＩは逆進させなかった。ＴＧは、ヒトＰＲＰ中でＴＦ／ＦＩＸａ（０．１５／２０ｐＭ）によって開始された。（Ｃ）Ｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＦが血栓形成におけるＦＶＩＩＩａの生成に寄与することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウス（各種の群でｎ＝３～７）で４％（０．１５Ｍ）ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏにより傷害を与えた後の大腿静脈の閉塞であり、マウスは、標示された抗体を用いて処理し、傷害を与える前にＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａを輸注した（１．４ｐｍｏｌｅボーラス／０．４７ｐｍｏｌｅ／分で１５分間）。ドットプロットは、中央値および四分位数範囲を示す。統計的評価は、クラスカル－ウォリス／ダンを用いて実施した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）Ｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＦが血栓形成におけるＦＶＩＩＩａの生成に寄与することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＭｏＡｂを用いた抗血栓処理後にＦＶＩＩＩａの輸注により凝固修復を示したがＦＶＩＩＩでは示さなかった、大腿静脈のフィブリンの代表的な画像である。左上、抗体なし／ＦＶＩＩＩ（ａ）輸注なし；右上、ａ－ＦＸＩ ６５ｎｇ／ｇ＋ａ－ＴＦ ９μｇ／ｇ＋ＦＶＩＩＩ；左下、同じＭｏＡｂであるが＋ＦＶＩＩＩａ；右下、ａ－ＦＸＩ １２５ｎｇ／ｇ＋ＦＶＩＩＩａ。 （Ａ）直接的なＴＦによる内在性凝固の開始は、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。リバーロキサバンおよびアピキサバンによる、ＦＸａのアミド分解活性の阻害である。ＦＸａ（１ｎＭ）を、標示された濃度のリバーロキサバンまたはアピキサバン（各ｎ＝３）と共にインキュベーションし、残存するＦＸａ活性を、発色基質Ｓ－２７６５（３６０μＭ）を３７℃で用いて測定し、％阻害（平均値±ＳＥＭ）を算出した。ＩＣ５０値（ｎＭ）は、：リバーロキサバンが１．９±０．０９；アピキサバンが３．５６±０．３２であった。（Ｂ）直接的なＴＦによる内在性凝固の開始は、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。リン脂質表面として５０ｐＭ ｒＴＦ、３ｎＭ ＦＶａ、および１μＭプロトロンビンを含有する反応中で、標示された濃度のリバーロキサバンまたはアピキサバン（各ｎ＝３）と共に３７℃で４分間インキュベーションした後の、ＦＸａ（５０ｐＭ）のプロトロンビナーゼ活性の阻害である。トロンビンを、発光発生基質を用いて定量し、％阻害を算出した。ＩＣ５０値（ｎＭ）は、リバーロキサバンが０．４３±０．０６；アピキサバンが１．０８±０．１１であった。（Ｃ）直接的なＴＦによる内在性凝固の開始は、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＶＩＩＩａ生成およびリバーロキサバンまたはアピキサバン濃度の増加によるその阻害に関するＷＢ分析である。反応は、１００ｐＭ ＦＸａによって開始し、リン脂質表面として５０ｐＭ ｒＴＦ（上）；または予め形成させた５０ｐＭ ＴＦ、１００ｐＭ ｉＦＶＩＩａ、１００ｐＭ ＦＸａ、５ｎＭＮＡＰｃ２の複合体（中央）；または５０ｐＭ ＴＦ／２００ｐＭ ＦＶＩＩａ／１３５ｎＭ ＦＸ（下）を含み、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、２００ｎＭレピルジン、１０ｎＭ ＴＦＰＩ、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２の混合物中、３７℃で１２０秒間インキュベーションされた。（Ｄ）直接的なＴＦによる内在性凝固の開始は、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ラッセルマムシ毒（ＲＶＶ）ＦＸアクティベーター（１３．５ｐＭ）により生成されたＦＸａ、またはＴＦ－ＦＶＩＩａを生成する１．２５および１．２３ｎＭ ＦＸａそれぞれによるＦＶＩＩＩの活性化にリバーロキサバンが及ぼす影響に関する、ＷＢ分析である。（Ｃ）の反応の１２０秒のインキュベーションの後である。（Ｅ）直接的なＴＦによる内在性凝固の開始は、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩの不在または存在下で３７℃、２４０秒間で、２００ｐＭ ＦＶＩＩａ、１０ｎＭ ＦＩＸａ、５０ｐＭ ｒＴＦ、１３５ｎＭ ＦＸ、３ｎＭ ＦＶ、１μＭプロトロンビン、１０ｎＭ ＴＦＰＩαによって誘導された、ＴＧの阻害である（ｎ＝３～４）。結果を、中央値に線を有する最小値から最大値までのひげまたは最小値から最大値のバー（ｎ≦３である際に）を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した（Ｅに示されるデータは、ｌｏｇ１０に転換した後に実施した）；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｆ）直接的なＴＦによる内在性凝固の開始は、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。リバーロキサバン（左、非添加；中央、５０ｎＭ）によるＴＧの阻害を示すトロンボグラムであり、阻害は、４００ｐＭ ＷＴまたは変異体ＦＶＩＩａＴ９９ＹもしくはＥ１５４Ａを用いて再構成されたＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中、２．５ｐＭ ＴＦによって開始した。内在性トロンビン生成能（ＥＴＰ、右）を、ＴＧ曲線下の面積から算出した（ｎ＝２）。結果を、中央値に線を有する最小値から最大値までのひげまたは最小値から最大値のバー（ｎ≦３である際に）を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 （Ａ）本明細書に示される開示の一実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。５０ｐＭ ＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａ、１３５ｎＭ ＦＸ、３．５ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、および２００ｎＭレピルジンを含む反応中で１２０秒後に、抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂの３Ｇ１２および１２Ｃ７（２０μｇ／ｍＬ）がＴＦ依存的なＦＶＩＩＩａ生成に及ぼす影響に関する、ＷＢ分析（３連を表す）である。定量値は、図４Ｅの通りである。差は、ウェルチ補正を伴う両側ｔ検定を用いて評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｂ）本明細書に示される開示の一実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＶＩＩＩａ依存的なＦＸａ生成の保持である。ＭｏＡｂ ３Ｇ１２による阻害とは対照的に、１０ｎＭ ＦＩＸａ（１８０秒インキュベーション、ｎ＝３）の存在下では、抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂ １２Ｃ７によって保持されたが、９０ｎＭ ＦＩＸ（３６０秒インキュベーション；ｎ＝３～５）では保持されなかった。反応は、５０ｐＭ ＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａ、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、１３５ｎＭ ＦＸ、１０ｎＭ ＴＦＰＩ、２００ｎＭレピルジン、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有した。抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂまたは対照のマウスＩｇＧは２０μｇ／ｍＬとした。機能遮断用の抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂ ８Ｄ４は８μｇ／ｍＬとした。結果を、中央値に線を有する最小値から最大値までのひげまたは最小値から最大値のバー（ｎ≦３である際に）を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｃ）本明細書に示される開示の一実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂ ８Ｄ４（８μｇ／ｍＬ）または抗ＦＸＩ ＭｏＡｂ Ｏ１Ａ６（２０μｇ／ｍＬ）の不在または存在下で、正常ＰＲＰ中、抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂの３Ｇ１２および１２Ｃ７（２０μｇ／ｍＬ）がＴＧに及ぼす影響である。（Ｄ）本明細書に示される開示の一実施形態を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。標示されるような抗ＦＶＩＩａ １２Ｃ７、抗ＦＶＩＩＩ、および抗ＦＸＩ ＭｏＡｂの存在下で、ＰＲＰ中、リバーロキサバンがＴＦ依存的なＴＧに及ぼす用量依存的な効果である（各種の群でｎ＝２～１３）。結果を、中央値に線を有する最小値から最大値までのひげまたは最小値から最大値のバー（ｎ≦３である際に）を付した２５～７５パーセンタイルのバーで示す。差は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いて評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 （Ａ）重度の血友病Ａ患者の血漿中のスパイクされたＦＶＩＩＩの凝血剤活性を測定するためのＴＧ試験を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。再脂質化ＴＦ（０．１５ｐＭ）、ＦＩＸａ（２００ｐＭ）、または２種の組合せを添加した後、カルシウム再加することによって、ＴＧを誘導した。患者血漿中のＴＧである。ここでは、０．１ＩＵ／ｄＬ組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）をスパイクした。（Ｂ）重度の血友病Ａ患者の血漿中のスパイクされたＦＶＩＩＩの凝血剤活性を測定するためのＴＧ試験を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。再脂質化ＴＦ（０．１５ｐＭ）、ＦＩＸａ（２００ｐＭ）、または２種の組合せを添加した後、カルシウム再加することによって、ＴＧを誘導した。リン脂質（５μＭ）の存在下ＴＦとＦＩＸａとの組合せによって誘導された患者血漿中のＴＧである。ここでは、０．０７～０．５６ＩＵ／ｄＬ血漿由来のＦＶＩＩＩをスパイクした。（Ｃ）重度の血友病Ａ患者の血漿中のスパイクされたＦＶＩＩＩの凝血剤活性を測定するためのＴＧ試験を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。再脂質化ＴＦ（０．１５ｐＭ）、ＦＩＸａ（２００ｐＭ）、または２種の組合せを添加した後、カルシウム再加することによって、ＴＧを誘導した。ＴＧパラメーターである内在性トロンビン生成能（ＥＴＰ）を用いて作製されたＦＶＩＩＩについての較正曲線である。ＥＴＰは、パネルＢに示される曲線下の面積を算出することによって決定した。 （Ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＦ経路およびＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。標示されるように抗ＴＦ２１Ｅ１０および／または抗ＦＸＩ １４Ｅ１１ ＭｏＡｂを用いて処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、７％（０．２６Ｍ）または８％（０．３Ｍ）のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏにより傷害を与えた後の頸動脈の閉塞である（各種の群でｎ＝５～２０）。その際に、対照マウス（Ｃ）には、緩衝液またはアイソタイプの適合する非免疫マウスＩｇＧを注射した。Ａ、上の結果（ドットプロット、中央値および四分位数範囲）は、クラスカル－ウォリス／ダン検定を用いて解析した。Ａ、下（ドットプロット、平均値および９５％ＣＩ）では、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定を用いた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＦ経路およびＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。マウスに４％（０．１５Ｍ）ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏにより傷害を与えた後の大腿静脈の閉塞である。マウスは、傷害およびＭｏＡｂ処置の前に、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａ（１．４ｐｍｏｌｅボーラス／０．４７ｐｍｏｌｅ／分で１５分間）を受けた（ｎ＝３～７）。結果（ドットプロット、中央値および四分位数範囲）は、クラスカル－ウォリス／ダン検定を用いて解析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＦ経路およびＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。大腿静脈のフィブリン形成である。左上、リン酸緩衝生理食塩水を注射された対照マウス；右上、ＦＶＩＩＩ注射は、９μｇ／ｇ抗ＴＦ／６５ｎｇ／ｇ抗ＦＸＩ ＭｏＡｂの組合せの抗血栓効果を阻害しない；左下、ＦＶＩＩＩａ注射は、この抗体の組合せによる阻害をバイパスする；右下，ＦＶＩＩＩａは、大量の用量（１２５ｎｇ／ｇ）の抗ＦＸＩ ＭｏＡｂのみによる阻害をバイパスできない。（Ｄ）ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＦ経路およびＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。クエン酸添加ヒトＰＲＰ（１８０・１０３血小板数／μＬ）中、０．１５ｐＭ ｒＴＦおよび／または２０ｐＭＦＩＸａによって誘導された、代表的なＴＧ（ｎ＝３）である。ＰＲＰは、１８ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて３７℃でカルシウム再加され、ＦＸＩＩａを遮断するために３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩと、（左）４０μｇ／ｍＬウサギ抗ＴＦＰＩ ＩｇＧまたは（右）非免疫ＩｇＧとを含有していた。（Ｅ）ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＦ経路およびＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。５０μｇ／ｍＬ ＣＴＩおよび１８０・１０３洗浄済み正常血小板数／μＬを含有する、カルシウム再加されたＦＩＸ欠損ＰＰＰ中で、上記のようにｒＴＦおよび／またはＦＩＸａによって誘導された、代表的なＴＧ（ｎ＝２）である。 （Ａ）ＴＦ開始複合体がＦＶＩＩＩを活性化することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。２０ｐＭ ＦＩＸａ；または４００ｐＭ ＦＶＩＩａ ＷＴもしくは不活性Ｓ１９５Ａ変異体（ｉＦＶＩＩａ）；またはＦＩＸａとＦＶＩＩａＷＴもしくはｉＦＶＩＩａとの組合せを、３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩ、０．１５ｐＭ ｒＴＦおよび１８ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する再構成されたＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ（１８０・１０３血小板数／μＬ）中に添加した後、３７℃で５分間（ｎ＝２～５）、８分間（ｎ＝２～５）、または１１分間（ｎ＝３）インキュベーションすることによって、ＴＧを誘導した。結果を、２５～７５パーセンタイルのバー（最小値から最大値のひげ、中央値に線あり）で、またはｎ≦３である際には最小値から最大値の浮動バー（ｍｅａに線で示す。ここでは、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定によって解析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＴＦ開始複合体がＦＶＩＩＩを活性化することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１３５ｎＭ ＦＸの存在／不在下、４００ｐＭ ｒＴＦ－５００ｐＭ ＦＶＩＩａによるＦＶＩＩＩ（１．４ｎＭ）の活性化である。４０ｎＭ ＴＦＰＩαおよび２００ｎＭレピルジンを含有する反応を、３７℃で３０秒間インキュベーションした。残存するＦＸａおよびＴＦ－ＦＶＩＩａを７０ｎＭ マダニ抗凝血ペプチド（ＴＡＰ）と各２０μｇ／ｍＬのＭｏＡｂ ５Ｇ９および１２Ｃ７とによりそれぞれ遮断した後、１０ｎＭ ＦＩＸａ、２０μＭ ＰＬ、および８ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＦＶＩＩＩ欠損血漿に反応混合物を添加することによって、ＦＶＩＩＩａ凝固活性（ｎ＝２～４）を測定した。結果を、２５～７５パーセンタイルのバー（最小値から最大値のひげ、中央値に線あり）で、またはｎ≦３である際には最小値から最大値の浮動バー（ｍｅａに線で示す。ここでは、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定によって解析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）ＴＦ開始複合体がＦＶＩＩＩを活性化することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。（Ａ）にあるようではあるが、１０ｎＭ ＴＦ／１０ｎＭ ｉＦＶＩＩａ／５ｎＭ ＦＸａおよび４０ｎＭ ＴＦＰＩまたはＮＡＰｃ２からなる予め形成された複合体によって、誘導されたＴＧである。複合体には、１０ｐＭＦＩＸａの不在（左）または存在（右）下で、標示されたＴＦ／ＦＸａ濃度を添加した。３７℃で８分間インキュベーションした（ｎ＝３～５）。結果を、２５～７５パーセンタイルのバー（最小値から最大値のひげ、中央値に線あり）で、またはｎ≦３である際には最小値から最大値の浮動バー（ｍｅａに線で示す。ここでは、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定によって解析した（ｙ＝ｌｏｇ１０ｙの転換後）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＴＦ開始複合体がＦＶＩＩＩを活性化することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。反応の３０秒または６０秒後のＦＶＩＩＩａおよびＦＶａの生成の代表的なイムノブロットである（ｎ＝２）。反応は、標示された組合せの２００ｐＭ ＦＸａ、５００ｐＭ ｉＦＶＩＩａ、４０ｎＭ ＮＡＰｃ２、および１μＭ ＴＡＰを、４００ｐＭ ｒＴＦ、７００ｐＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、および２００ｎＭレピルジンに添加したものである。（Ｅ）ＴＦ開始複合体がＦＶＩＩＩを活性化することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。上。ＴＦ－ＦＶＩＩａ（それぞれ４００および５００ｐＭ）および１３５ｎＭ ＦＸによるＦＶＩＩＩの活性化にＴＡＰ（１μＭ）が及ぼす影響を示す、代表的なイムノブロットである。さらに７００ｐＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、および２００ｎＭレピルジンも含有する反応を、３７℃で３０秒間インキュベーションした。下。上のパネルに示される実験の定量値であり（ｎ＝４）、この値は、２５～７５パーセンタイルのバーで示され、両側ｔ検定により解析された。＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｆ）ＴＦ開始複合体がＦＶＩＩＩを活性化することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１μＭ プロトロンビンからトロンビンへの変換にＦＶａが及ぼす影響に関する用量応答である。反応は、１０ｐＭ ＦＸａ、５０ｐＭ ｒＴＦ、および７００ｐＭ ＦＶＩＩＩを含有し、３７℃で１８０秒インキュベーションした。平均値±９５％ＣＩ（ｎ＝４）。（Ｇ）ＴＦ開始複合体がＦＶＩＩＩを活性化することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１０ｐＭ ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化にＦＶａが及ぼす影響に関する用量応答である。５０ｐＭ ｒＴＦ、７００ｐＭ ＦＶＩＩＩ、および２００ｎＭレピルジンを含む反応を、３７℃で１８０秒インキュベーションした。ＦＶＩＩＩａ活性（平均値±９５％ＣＩ、ｎ＝４）を、２ｎＭ ＦＩＸａ存在下の生成ＦＸａとして測定し、ＦＶａ不在下での測定値のパーセントとして表現した。（Ｈ）ＴＦ開始複合体がＦＶＩＩＩを活性化することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。左。Ｇにあるような反応におけるＦＶＩＩＩａ生成の代表的なイムノブロット（ｎ＝３）である。右。生成ＦＶＩＩＩａの定量値であり（ｎ＝３）、（Ｇ）に表現され、最小値から最大値までの浮動バーによって示されている。解析は１標本ｔ検定による。 （Ａ）新生ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。上。ＦＶＩＩＩａ Ａ１活性化断片の生成が２００ｐＭ ＦＶＩＩａ／５０ｐＭ ｒＴＦ（０．３７μＭリン脂質）によって誘導されることを示す代表的なイムノブロットである。反応は、７００ｐＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、１３５ｎＭ ＦＸ，１μＭプロトロンビン（ＦＩＩ）－４μＭ ＤＡＰＡ（ｎ＝４）または不活性Ｓ１９５Ａ変異体（ｎ＝３）の不在／存在下でのＷＴ－および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有し、３７℃で１２０秒間インキュベーションした。下。既知の量の断片を用いて較正された生成ＦＶＩＩＩａ－Ａ１の定量値である。Ａ（下）の結果－２５～７５パーセンタイルのバー、最小値から最大値のひげ、中央値の線で示すか；または、ｎ≦３の際には、中央値の線を付した最小値から最大値の浮動バーで示される－は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定によって解析した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意ではない。（Ｂ）新生ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＸａ生成から算出されたＦＶＩＩＩａ活性である。反応は、（Ａ）のようではあるが１０ｎＭ ＦＩＸａが添加されており、３７℃で１８０秒間インキュベーションした（ｎ＝４－１２）。個別に添加されたＦＶＩＩａおよびＦＩＸａによって生成したＦＸａを、共添加されたＦＶＩＩａ／ＦＩＸａのものから差し引くことによって、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ活性に依存したＦＸａ生成を算出した。結果－２５～７５パーセンタイルのバー、最小値から最大値のひげ、中央値の線で示すか；または、ｎ≦３の際には、中央値の線を付した最小値から最大値の浮動バーで示される－は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定によって解析した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意ではない。（Ｃ）新生ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。（Ａ，Ｂ）のようではあるが１０ｎＭ ＴＦＰＩαを添加された反応で生成され算出された、ＦＶＩＩＩａ活性である。結果－２５～７５パーセンタイルのバー、最小値から最大値のひげ、中央値の線で示すか；または、ｎ≦３の際には、中央値の線を付した最小値から最大値の浮動バーで示される－は、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定によって解析した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＮＳ、有意ではない。（Ｄ）新生ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。正常ＰＲＰ（１８０・１０３血小板数／μＬ）中で１０ｐＭ ＦＩＸａによって開始されるＴＧに各種のヒルゲン濃度が及ぼす影響である。ＰＲＰは、３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩ、および２０μｇ／ｍＬ抗ＦＸＩａ遮断ＭｏＡｂ Ｏ１Ａ６を含有していた（ｎ＝３）。（Ｅ）新生ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩの活性化を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。２μＭヒルゲンの不在（左）または存在（右）下、正常ＰＲＰ－（Ｄ）にあるようなＣＴＩおよび抗ＦＸＩａ ＭｏＡｂを含有－中で０．１５ｐＭ ｒＴＦおよび／または１０ｐＭ ＦＩＸａによって開始された代表的なトロンボグラムである（ｎ＝３）。 （Ａ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。左。１０ｎＭ ＦＶＩＩａ ＷＴ（ｎ＝４～７）、Ｔ９９Ｙ変異体（ｎ＝２～３）またはＥ１５４Ａ変異体（ｎ＝３～４）存在下の２μＭ リン脂質不含可溶性組換えＴＦによる、１μＭ ＦＸの活性化の経時変化（平均値±ＳＥＭ）である。３７℃でインキュベーションした。右。５０ｐＭ リン脂質で再構成されたｒＴＦ、２００ｐＭＦＶＩＩａ ＷＴまたは変異体、１３５ｎＭ ＦＸ、および７００ｐＭ ＦＶＩＩＩを含む反応における、ＦＸａ生成である。２分間（ｎ＝２～３）、４分間（ｎ＝４～５）、または６分間（ｎ＝６～９）インキュベーションした。（Ｂ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１０ｎＭ ＴＦＰＩαの不在／存在下、５０ｐＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａ ＷＴまたは変異体、１３５ｎＭ ＦＸ、７００ｐＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、２００ｎＭレピルジンによる、ＦＶＩＩＩの活性化の代表的なイムノブロット（ｎ＝２）である。１８０秒間インキュベーションした。（Ｃ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。（Ｂ）にあるような反応におけるＦＶ活性化の代表的なイムノブロット（ｎ＝２）である。４２０秒間インキュベーションした。（Ｄ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。左。（Ｂ）のようではあるがＴＦＰＩαを含まずに生成されたＦＶＩＩＩａ活性（２５～７５パーセンタイルのバー、最小値から最大値のひげ、中央値の線あり）を、１０ｎＭ ＦＩＸａによって産生されるＦＸａ（ＦＶＩＩａ ＷＴおよびＴ９９Ｙについてｎ＝９；Ｅ１５４Ａについてｎ＝５）として測定した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）ＡＮＯＶＡ／テューキー検定による。右。９０ｎＭ ＦＩＸのＦＩＸａとの置き換えにより生成されたＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ活性である。３６０秒インキュベーションした（ｎ＝５～６）。（Ｅ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩ、８μｇ／ｍＬ抗ＦＶＩＩＩａ ＭｏＡｂ ８Ｄ４を含有する再構成されたＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中、２．５ｐＭ ｒＴＦ／４００ｐＭ ＦＶＩＩａ ＷＴまたは変異体によって開始された、代表的なＴＧ（ｎ＝３）である。（Ｆ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。（Ｅ）のようではあるが抗ＦＶＩＩＩａ ＭｏＡｂを含まず、２０μｇ／ｍＬ抗ＦＸＩａ ＭｏＡｂ Ｏ１Ａ６の不在（左）／存在（右）下での、代表的なＴＧ（ｎ＝３）である。（Ｇ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。４μＭヒルゲン、３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩ、２０μｇ／ｍＬ抗ＦＸＩａ ＭｏＡｂを含有する再構成されたＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中、２０ｐＭ ＦＩＸａによって開始された、代表的なＴＧ（ｎ＝３）である。（Ｈ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。（Ｇ）のようではあるが８μｇ／ｍＬ抗ＦＶＩＩＩａ ＭｏＡｂの存在（左；ｎ＝３）／不在（右；ｎ＝５）下で２．５ｐＭ ｒＴＦ／４００ｐＭ ＦＶＩＩａ ＷＴまたはＥ１５４Ａによって開始された、代表的なＴＧである。（Ｉ）トロンビンフィードバックが遮断された際に、ＦＸａ生成物代謝回転不全性のＦＶＩＩａ変異体が、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。（Ｈ）のようではあるが抗ＦＶＩＩＩａＭｏＡｂの存在（左；ｎ＝４）または不在（右；ｎ＝５）下で３ｎＭ ＦＶａを添加された、代表的なＴＧである。 （Ａ）抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂ １２Ｃ７がＦＶＩＩａ Ｙ９９Ａの機能的な特性を模倣することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。左。抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂ ３Ｇ１２および１２Ｃ７（２０μｇ／ｍＬ）がＴＦ依存的なＦＶＩＩＩａ生成に及ぼす影響を示す、代表的なイムノブロットである。反応は、５０ｐＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａ、１３５ｎＭ ＦＸ、３．５ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、２００ｎＭレピルジンを含み、３７℃で１２０秒間インキュベーションした。右。左のデータの定量値である（ｎ＝３；最小値から最大値の浮動バー、中央値に線あり）。ウェルチ補正を伴う両側ｔ検定によって、差を評価した。（Ｂ）抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂ １２Ｃ７がＦＶＩＩａ Ｙ９９Ａの機能的な特性を模倣することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂ １２Ｃ７－しかし３Ｇ１２ではない－は、１０ｎＭ ＦＩＸａ（左；ｎ＝３）によるＦＶＩＩＩａ依存的なＦＸａ生成を保持するが、９０ｎＭ ＦＩＸ（右；ｎ＝３～５）では保持されない。反応は、５０ｐＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａ、７００ｐＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、１３５ｎＭ ＦＸ、１０ｎＭ ＴＦＰＩα、２００ｎＭレピルジン、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有し、それぞれ３７℃で１８０秒または３６０秒インキュベーションした。抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂまたは対照マウスＩｇＧを、２０μｇ／ｍＬで添加した。結果（最小値－最大値の浮動バー、中央値に線あり）を、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定により解析した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂ １２Ｃ７がＦＶＩＩａ Ｙ９９Ａの機能的な特性を模倣することを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。１．２ｐＭ ｒＴＦで誘導されたＴＧに抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂの３Ｇ１２および１２Ｃ７（２０μｇ／ｍＬ）が及ぼす影響を示す、代表的なトロンボグラムである（ｎ＝２）。誘導は、ＦＸＩａによるＦＩＸの活性化を遮断する抗ＦＸＩ ＭｏＡｂ Ｏ１Ａ６（２０μｇ／ｍＬ）を添加しないか（左）または添加して（右）、ＣＴＩ（３０μｇ／ｍＬ）を含む正常ＰＲＰ中で行った。 （Ａ）血流中、ＴＦ－ＦＶＩＩａ開始複合体によって誘導されたＦＶＩＩＩａ依存的な血栓形成を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。血液を、洗浄したＯ型血液細胞を用いて再構成し、阻害性の抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂのＣ５（２５μｇ／ｍＬ）の不在／存在下で２００ｐＭ ＷＴまたは変異体のＦＶＩＩａを含むＦＶＩＩ欠損クエン酸添加ＰＰＰ中に、本来のカウントとなるように添加して、１．２９ｍＭ Ｃａ２＋にカルシウム再加し、３００ｓ－１壁せん断速度で３．５分間灌流した。標示されているところでは、ＦＩＸａ（２０ｐＭ）を血液に添加した。代表的な共焦点画像を、緑色（血小板凝集体および白血球）ならびに赤色（フィブリン）の蛍光チャネルの重ね合わせで示す。画像の辺＝３１２μｍ。（Ｂ）血流中、ＴＦ－ＦＶＩＩａ開始複合体によって誘導されたＦＶＩＩＩａ依存的な血栓形成を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂの不在／存在下でＦＶＩＩａ ＷＴ、Ｔ９９ＹまたはＳ１９５Ａを添加した後の、血小板凝集体および沈着フィブリンの体積の定量値である（各種条件についてｎ＝４～６）。結果－２５～７５パーセンタイルのバー、最小値から最大値のひげ、中央値の線として；またはｎ≦３の際には中央値に線を付した最小値から最大値の浮動バーとして示される－を、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定によって評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）血流中、ＴＦ－ＦＶＩＩａ開始複合体によって誘導されたＦＶＩＩＩａ依存的な血栓形成を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＢのようではあるがＦＶＩＩａ ＷＴまたはＥ１５４Ａを添加した後である（各種条件についてｎ＝３～８）。結果－２５～７５パーセンタイルのバー、最小値から最大値のひげ、中央値の線として；またはｎ≦３の際には中央値に線を付した最小値から最大値の浮動バーとして示される－を、ＡＮＯＶＡ／テューキー検定によって評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＦＩＩａ基質（５０μＭ）を使用したＦＩＩａキャリブレーターを用いて作製された較正曲線を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。 （Ａ）初発ＴＧの不連続２段階アッセイを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。初発ＴＧを、正常血小板欠乏血漿中、ｒＴＦとＦＩＸａとを組み合わせた添加によって誘導した後、３７℃で５分間までインキュベーションした。１５０ｆＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＩＸａ、および１．３μＭ ＰＬによるＴＧである。各データは、３つの実験の平均値±ＳＥＭを示す。（Ｂ）初発ＴＧの不連続２段階アッセイを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。初発ＴＧを、正常血小板欠乏血漿中、ｒＴＦとＦＩＸａとを組み合わせた添加によって誘導した後、３７℃で３分間インキュベーションした。２００ｐＭ ＦＩＸａと１．３μＭ ＰＬとによるＴＧにおける添加されたｒＴＦの力価測定である。各データは、３つの実験の平均値±ＳＥＭを示す。（Ｃ）初発ＴＧの不連続２段階アッセイを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。初発ＴＧを、正常血小板欠乏血漿中、ｒＴＦとＦＩＸａとを組み合わせた添加によって誘導した後、３７℃で３分間インキュベーションした。１５０ｆＭ ｒＴＦと１．３μＭ ＰＬとによるＴＧにおける添加されたＦＩＸａの力価測定である。各データは、３つの実験の平均値±ＳＥＭを示す。（Ｄ）初発ＴＧの不連続２段階アッセイを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。初発ＴＧを、正常血小板欠乏血漿中、ｒＴＦとＦＩＸａとを組み合わせた添加によって誘導した後、３７℃で３分間インキュベーションした。１５０ｆＭ ｒＴＦおよび２００ｐＭ ＦＩＸａによるＴＧに、添加されたＰＬが及ぼす亢進効果である。各データは、３つの実験の平均値±ＳＥＭを示す。 （Ａ）ＴＧアッセイの再現性を試験することによるアッセイの検証を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。プールの正常血漿中、１５０ｆＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＩＸａ、および１．３μＭ ＰＬによって、３７℃で３分間、ＴＧを誘導した。アッセイ内の変動の決定である。結果（ｎ＝７～８）を、３つの実験の最小値／最大値のひげおよび中央値の線を付した２５～７５パーセンタイルのバーとして示す。（Ｂ）ＴＧアッセイの再現性を試験することによるアッセイの検証を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。プールの正常血漿中、１５０ｆＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＩＸａ、および１．３μＭ ＰＬによって、３７℃で３分間、ＴＧを誘導した。アッセイ内の変動の決定である。表は、変動係数（ＣＶ）が＜１５％と低いことから、アッセイ内の精度が高いことを標示する。（Ｃ）ＴＧアッセイの再現性を試験することによるアッセイの検証を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。プールの正常血漿中、１５０ｆＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＩＸａ、および１．３μＭ ＰＬによって、３７℃で３分間、ＴＧを誘導した。アッセイ間の変動の決定である（ｎ＝４）。アッセイ間のＣＶ値はまた、＜１５％であることが観察された。 正常ＰＰＰ中、１５０ｆＭ ｒＴＦ／２００ｐＭ ＦＩＸａおよび１．３μＭ ＰＬによる初発ＴＧに抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）が及ぼす影響を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＭｏＡｂを１２５ｎＭで添加した。各カラムは、インキュベーションの３分後の生成ＦＩＩａの平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を標示する。 （Ａ）抗ＦＶＩＩＩ阻害剤の不在または存在下、ＦＶＩＩＩ欠損ＰＰＰ中でのＴＧアッセイを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。不連続２段階アッセイにおける初発ＴＧを、１５０ｆＭ ｒＴＦ／２００ｐＭ ＦＩＸａ および５μＭ ＰＬの添加によって誘導した後、３７℃で５分間インキュベーションした。各カラムは、生成ＦＩＩａの平均値＋ＳＥＭ（ｎ＝３）を標示する。（Ｂ）抗ＦＶＩＩＩ阻害剤の不在または存在下、ＦＶＩＩＩ欠損ＰＰＰ中でのＴＧアッセイを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。不連続２段階アッセイによる、ＦＶＩＩＩ欠損血漿中のＴＧに対する添加されたＦＶＩＩＩの用量応答曲線を、連続アッセイのものと比較している。連続的なＴＧも、１５０ｆＭ ｒＴＦ／２００ｐＭ ＦＩＸａ、および５μＭＰＬを添加した後に３７℃で４０分間インキュベーションすることによって誘導した。 クマジン治療された患者由来の血漿中のＦＶＩＩＩａ依存的なおよび非依存的なＴＧを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＶＩＩＩａ依存的なＴＧを、１５０ｆＭ ｒＴＦ／２００ｐＭ ＦＩＸａおよび１．３μＭＰＬの添加によって誘導し、一方、ＦＶＩＩＩａ非依存的なＴＧを、１．２ｐＭ ｒＴＦおよび１．３μＭ ＰＬによって誘導した。各カラムは、インキュベーションの３分後の生成ＦＩＩａの平均値＋ＳＥＭ（ｎ＝３）を標示する。 線維コラーゲンＩ型またはｒＴＦを用いて被覆された表面上の血小板凝集およびフィブリン沈着にＦＸＩａまたはＴＦの機能の遮断が及ぼす影響を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。カルシウム再加されたクエン酸添加全血を、壁せん断速度３００ｓ－１で５分間灌流した。メパクリン取り込みによって可視化された血小板凝集体、および蛍光抗体によって可視化されたフィブリンの体積を、共焦点顕微鏡によって測定した。 （Ａ）ＴＦによる内在性凝固の開始が、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＸａ（５０ｐＭ）のプロトロンビナーゼ活性にリバーロキサバンまたはアピキサバンが及ぼす効果である。反応は、リン脂質表面として５０ｐＭ ｒＴＦ、３ｎＭ ＦＶａ、および１μＭプロトロンビンを含み、３７℃で４分間インキュベーションした（ｎ＝３）。（Ｂ）ＴＦによる内在性凝固の開始が、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＶＩＩＩａ生成のリバーロキサバン（ｎ＝５）またはアピキサバン（ｎ＝３）による用量依存的な阻害を示す、代表的なＷＢである。反応は、７００ｐＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、２００ｎＭレピルジン、１０ｎＭ ＴＦＰＩα（ＦＸａを除く、上）、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む反応中、１００ｐＭ ＦＸａおよび５０ｐＭｒＴＦ（上）；または５０ｐＭ ｒＴＦ、１００ｐＭ ｉＦＶＩＩａ、１００ｐＭ ＦＸａ、５ｎＭ ＮＡＰｃ２複合体（中央）；または５０ｐＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａ、１３５ｎＭ ＦＸ（下）によって開始し、３７℃で１２０秒インキュベーションした。（Ｃ）ＴＦによる内在性凝固の開始が、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＶＩＩＩａ生成のリバーロキサバン（ｎ＝２）による用量依存的な阻害を示す代表的なＷＢである。１３５ｎＭ ＦＸを含む反応を、１．２５および１．２３ｎＭ ＦＸａをそれぞれ生成するＴＦ－ＦＶＩＩａまたはラッセルマムシ毒（ＲＶＶ）ＦＸアクティベーター（１３．５ｐＭ）によって、１２０秒で開始した。（Ｄ）ＴＦによる内在性凝固の開始が、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。リバーロキサバン（ｎ＝３～４）による、ＦＶＩＩＩａ生成の用量依存的な阻害の定量的なＷＢ評価である。反応は、ＦＸａ ＷＴ（２５ｐＭ）またはＶ１７Ｍ変異体（５００ｐＭ）を１ｎＭ ｒＴＦ、１ｎＭ ｉＦＶＩＩａ、５ｎＭ ＮＡＰｃ２、２００ｎＭレピルジン、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２と共に含有し、３７℃で１２０秒インキュベーションした。（Ｅ）ＴＦによる内在性凝固の開始が、薬理的なＦＸａ阻害剤を逃れることを、本明細書の実施形態に従って説明する図である。ＦＸａ ＷＴまたはＶ１７Ｍ変異体によるＦＶＩＩＩａ生成の、リバーロキサバンによる阻害の代表的なＷＢ（ｎ＝３）である。反応は（Ｄ）のようなものとした。 （Ａ）血小板およびフィブリンの沈着の実験を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。図２３のようではあるが標示された被覆濃度でｒＴＦを固相化した実験における、血小板およびフィブリンの沈着である。Ｃ（ｎ＝９）、対照；Ｗ（ｎ＝１２）、ワルファリン治療（平均ＩＮＲ２．６）；Ｒ（ｎ＝１０）、リバーロキサバン治療（平均血漿濃度３１２ｎＭ、摂取の２時間後）。結果を、最小値／最大値のひげおよび中央値の線を付した２５～７５パーセンタイルのバーとして示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、一元ＡＮＯＶＡおよびテューキーの事後検定によって評価した。（Ｂ）血小板およびフィブリンの沈着の実験を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。（Ａ）のようではあるが、リバーロキサバンの不在下－Ｃ－もしくは存在下－Ｒ－および／または抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂの存在下の血液を用いた２分間の灌流である（ｎ＝３）。結果－（Ａ）よりも４．６５倍大きな面積で定量された－を、最小値／最大値のバーおよび中央値の線を付した２５～７５パーセンタイルのバーとして示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１は、一元ＡＮＯＶＡおよびテューキーの事後検定によって評価した。（Ｃ）血小板およびフィブリンの沈着の実験を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。解析された表面の代表的な共焦点画像であり（辺＝３１２μｍ）、血小板／白血球（緑色）、フィブリン（赤色）、および共局在（黄色）を示す。 カルシウム再加されたクエン酸添加血液の灌流を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。血液は、正常対照（ｎ＝２５）、およびワルファリン（ｎ＝１５）、リバーロキサバン（ｎ＝１５）、またはダビガトラン（ｎ＝１０）を用いて治療された患者から得て、灌流は、線維コラーゲンＩ型の上を、壁せん断速度３００ｓ－１で５分間行った。血小板凝集体および沈着フィブリンの体積を、共焦点顕微鏡によって測定した。統計的解析は、一元ＡＮＯＶＡおよびテューキーの事後検定によって行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 （Ａ）標示されているように、カルシウム再加されたクエン酸添加血液のｒＴＦ被覆表面での灌流を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。血小板凝集体の体積である。２０または４０ｐＭ ｒＴＦを被覆した表面でのアッセイについて、供試した試料の数は、それぞれ、正常対照が２２、１４；ワルファリンが１２、１３；リバーロキサバンが２８、１４；ダビガトランが２７、１１であった。（Ｂ）標示されているように、カルシウム再加されたクエン酸添加血液のｒＴＦ被覆表面での灌流を、本明細書の実施形態に従って説明する図である。沈着フィブリンの体積である。
本明細書に引用される全ての参考文献、刊行物、および特許は、それらが完全に記載されているかのように、参照によりその全体を組み込まれる。特段に定義のない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、この発明の属する分野の当業者が通例理解するものと同じ意味を有する。Ｈｏｒｎｙａｋら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ（２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（ニューヨーク、ニューヨーク州、２００１）；Ｍａｒｃｈ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第７版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（ニューヨーク、ニューヨーク州、２０１３）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、２０１２）は、本願に使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。当業者は、本発明の実践に使用することのできる、本明細書に記載されるものと同様または等価の多くの方法および材料を認識することになろう。実に、本発明は、記載される方法および材料に全く限定されない。
本明細書に使用される際に，用語「対象」は、哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類などの脊椎動物とすることができる。そのため、本開示の対象は、ヒト、ヒトでない霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、モルモット、または齧歯類とすることができる。用語は、具体的な年齢または性別を意味しない。そのため、成人および新生児の対象、ならびに胎児は、男女に関わらず、カバーされることが意図される。一態様では、対象は哺乳動物である。
本明細書に使用される際に、用語「患者」とは、疾患または障害に罹っている対象を指す。用語「患者」は、ヒトおよび獣医学の対象を含む。開示される方法の態様によっては、対象は、血液障害および関連の疾患について治療の必要があるものと診断されており、そのようなものとしては、以下に限定されないが、出血障害、例えば血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏症）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症）、フォン・ヴィルブランド疾患、および因子Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩなどを含めた稀少因子欠乏症が挙げられる。
本明細書に使用される際に、用語「ＦＶＩＩＩ：Ｃ」は、血漿のＦＶＩＩＩの凝血活性を想定する。実施形態によっては、用語ＦＶＩＩＩ：Ｃは、血漿中のＦＶＩＩＩａの濃度を指すことがある。実施形態によっては、用語ＦＶＩＩＩ：Ｃは、ＦＶＩＩＩの凝血原機能を指すことがある。この開示を通して記載されるように、以前は未知であったＦＶＩＩＩ活性化経路が開示されており、そこでは、ＦＶＩＩＩプロ補因子は、ＦＩＩａフィードバック活性化とは独立して、ＦＶＩＩＩａ活性補因子に変換される。実施形態によっては、ＦＶＩＩＩ：Ｃは、この開示の実施例、アッセイ、方法、およびキットに記載されるように測定されてもよい。この開示の実施形態によっては、血友病患者は、血漿のＦＶＩＩＩの凝血活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）に基づいて、３つのカテゴリーに分類されている。すなわち、ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが１ＩＵ／ｄＬ未満であれば重度；ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが１ＩＵ／ｄＬと５ＩＵ／ｄＬとの間であれば中等度；およびＦＶＩＩＩ：Ｃレベルが５ＩＵ／ｄＬ超であれば軽度である。
本明細書に使用される際に、本明細書に互換的に使用される用語「第ＩＩａ因子」、「ＦＩＩａ」および「生成トロンビン」（ＴＧ）とは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換することによって血液の凝固を引き起こす、血漿中の酵素を指す。ＴＧとは、本明細書に開示されるアッセイの結果として生成されるトロンビンの量をも指すことがある。
本明細書に開示されるように、本発明者らは、対象での血液凝固を査定するために使用されることがある、様々なアッセイおよび方法を開発している。本発明者らは、新しい凝固開始経路を開示しており、その経路では、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－新生ＦＸａ複合体が、トロンビンフィードバックとは別にＦＶＩＩＩを直接的に活性化する。ＴＦによる内在性経路の直接的な活性化は、トロンビン増幅を標的とした抗凝血療法下で、止血を保持することがある。
一実施形態では、本明細書に開示されるのは、血液試料中の生成トロンビン（ＴＧ）を測定するための高感度で迅速なアッセイであり、このアッセイは、血液試料を組織因子（ＴＦ）、ＦＩＸａ、およびＣａＣｌ２と共に５分間までインキュベーションすること；ならびにＨ－Ｄ－シクロヘキシル－アラニル－アラニル－アルギニル－アミドメチルクマリン（ＡＭＣ）および／またはブチルオキシカルボニル－バリル－プロリニル－アルギニル－ＡＭＣ（Ｖ－Ｐ－Ｒ－ＡＭＣ）を使用することによって、血液試料中のＴＧを測定することを含む。一実施形態では、本アッセイは、ＥＤＴＡの添加によってステップ（a）での反応を終了させることをさらに含む。一実施形態では、血液試料に添加されるＴＦの量は、１ｐＭと１ｆＭとの間である。一実施形態では、血液試料に添加されるＦＩＸａの量は、１ｕＭと１ｐＭとの間である。一実施形態では、血液試料に添加されるＣａＣｌ２の量は、１ｍＭと９９９ｍＭとの間である。一実施形態では、血液試料は、重度の血友病患者由来である。一実施形態では、ＴＦは、組換え組織因子（ｒＴＦ）である。一実施形態では、本アッセイは、高感度であり、約５ｐＭのＴＧの検出限界を有する。一実施形態では、本アッセイは、患者における大出血および血栓形成のリスクを予測する。一実施形態では、本アッセイは、１０分以内に完了させることができる。一実施形態では、本アッセイは、前記血液試料中のＦＶＩＩＩのレベルを決定することをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、機能性が向上しおよび／または安定性が増加したＦＶＩＩＩバリアントを特定するのに有用である。一実施形態では、本アッセイは、新規の止血剤をスクリーニングするのに有用である。
一実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象における出血リスクを決定するためのアッセイであり、このアッセイは、対象から血液試料を取得すること；組織因子（ＴＦ）および／または第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）を、血液試料に添加すること；血液試料中の第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の量を決定すること；ならびに（ａ）試料中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量が＞５ＩＵ／ｄＬであれば対象での軽度の出血リスクを、および（ｂ）試料中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量が１～５ＩＵ／ｄＬであれば対象での中等度の出血リスクを、および（ｃ）対象中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量が＜１ＩＵ／ｄＬであれば対象での重度の出血リスクを、決定することを含む。一実施形態では、本アッセイは、中等度の出血リスクを重度と区別するための高感度の能力がある。一実施形態では、血液試料に添加されるＴＦの量は、１ｆＭから１ｐＭである。一実施形態では、血液試料に添加されるＦＩＸａの量は、１ｐＭから１ｎＭである。一実施形態では、本アッセイは、遊離のＦＸａの生成が減少した際に、モノクローナル抗体１２Ｃ７を使用することによって、ＦＶＩＩＩの活性化を測定することをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、ＦＶＩＩのＴ９９Ｙ変異体を試料に添加すること、および遊離のＦＸａの生成が減少した際に、ＦＶＩＩＩの活性化を測定することをさらに含む。別の実施形態では、本アッセイは、ＦＶＩＩのＥ１５４Ａ変異体を試料に添加すること、および遊離のＦＸａの生成が減少した際に、ＦＶＩＩＩの活性化を測定することをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、補因子ＦＶＩＩＩとＦＶの活性化を区別することを可能にする。一実施形態では、ＦＶＩＩＩ：Ｃの量の検出限界は０．１ＩＵ／ｄＬ以下である。一実施形態では、ＴＦおよびＦＩＸａは、個々の血液試料に同時に添加される。一実施形態では、ＴＦは再脂質化された形態である。一実施形態では、対象は、重度の血友病Ａであることを以前に診断されている。一実施形態では、対象は、後天性のＦＶＩＩＩ欠乏症であることを以前に診断されている。一実施形態では、本アッセイは、出血の表現型の特徴を正確に明らかにすることをさらに含む。一実施形態では、血液凝固レベルを査定することは、重度の血友病Ａ患者の治療レジメン全体の一部分である。一実施形態では、血液凝固レベルを査定することは、ＦＶＩＩＩ製品を用いた置き換え療法全体の一部分である。一実施形態では、本アッセイは、現在利用可能な方法よりも少なくとも１０倍の感度を用いて、重度の血友病患者におけるＦＶＩＩＩ：Ｃのレベルを決定する。一実施形態では、本アッセイは、ＦＶＩＩＩ濃縮物を用いた治療のモニタリングのために、および濃縮物の効力の査定のために有用である。一実施形態では、本アッセイは、機能性が向上しおよび／または安定性が増加したＦＶＩＩＩバリアントを特定することをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、血友病Ａ治療のための効能および安全性が向上した新規の止血剤をスクリーニングすることをさらに含む。一実施形態では、本アッセイは、個々の患者について抗血栓療法の安全性および効能をモニタリングするための新しい方法およびキットを設計するのに有用である。一実施形態では、本アッセイは、治療効能が向上した新しい抗血栓剤を特定し特徴を明らかにするのに有用である。一実施形態では、本アッセイは、止血への影響が減少した新しい抗血栓剤を特定し特徴を明らかにするのに有用である。一実施形態では、本アッセイは、自然発生や外傷後の頭蓋内大出血などの、命に関わる出血合併症を低減する。一実施形態では、本アッセイは、効能および安全性が向上した新規の止血剤を特定するのに有用である。一実施形態では、対象は、先天性または後天性のＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの欠乏症を有する。
一実施形態では、本明細書に開示されるアッセイは、遊離のＦＸａによるＦＶＩＩＩａの活性化またはトロンビン－フィードバックループとは別個のものとして、活性のＦＶＩＩＩａ補因子の生成に対する天然のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａｔの相対的寄与を測定する。一実施形態では、アッセイは、ＦＶＩＩＩを活性化するがＦＶを活性化せず、初発のトロンビン生成を必要とすることなくそのようにする。一実施形態では、遊離のＦＸａは、ＦＶをＦＶａに活性化する。それゆえ、本明細書に記載されるアッセイのフォーマットは、遊離のＦＸａによるＦＶＩＩＩａの活性化またはトロンビン－フィードバックループとは別個のものとして、活性の補因子ＦＶＩＩＩａの生成に対する天然のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの相対的寄与を、血漿または血液試料中で測定することができる。
「天然の」ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａとは、本明細書に使用される際には、初発のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸ複合体（ＦＸが不活性である）から、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ（ＴＦに会合しているＦＶＩＩａがＦＸをＦＸａ活性プロテアーゼに変換している）への変換が起こっているが、ＦＸａがＴＦ－ＦＶＩＩａに会合したままであることを指す。これまで認識されていなかったこの複合体のユニークな特性とは、生理的ならびに薬理的なＦＸａ阻害剤による阻害を逃れるとともに、選択的にＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化する能力である。一実施形態では、この知見の重要性とは、遊離のＦＸａ－すなわち、ＴＦ－ＦＶＩＩａによって活性化されているが、複合体から放出されているＦＸ－がまた、ＦＶＩＩＩに加えて、ＦＶをＦＶａに活性化することである。ＦＶａは、プロトロンビンをトロンビンに効率良く変換するのに不可欠なプロトロンビナーゼ複合体（ＦＶａ－ＦＸａ複合体）の必須の補因子であり、凝固系の最終的な活性プロテアーゼ産物である。トロンビンは、フィブリノーゲンを凝固させ、血小板を活性化させ、この両方が正常な止血に不可欠であるが、病理学的な血栓症の原因でもある。正常な状態では、特異的な生理的阻害剤による制御によって、止血をサポートするために正しい場所で正しい時間に充分なトロンビンが産生されるようにするバランスが確保される。トロンビン生成が制御されなければ、病理的な状態では血管内血栓症が引き起こされてゆく。そのため、ＦＶＩＩＩを活性化するがＦＶを活性化せず、かつ初発のトロンビン生成を必要とすることなくそのようにするという反応の発見、この反応の発生に感受性を持つ方法の記載は、本開示の１つの重要な態様であり、なぜなら、それは、トロンビン生成を鈍らせて血栓症を治癒または防止しなければならない抗凝血剤を使用する状況で、止血の保持を説明し正確に測定することのできる、経路の定量的な査定を可能にするためである。同時にＦＶａを産生することなくＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化することは、血栓症とは反対に止血の方へと凝固応答を偏らせることができる機構である。この経路の相対的な機能を定量的に査定することは、非処理個体または異なる種類の抗凝血剤を受けている患者で出血のリスクｖｓ血栓症のリスクを確かめる際に重要である。
一実施形態では、本明細書に開示されるのは、血液凝固を決定するのに有用なキットであり、このキットは、組織因子（ＴＦ）、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、凝血原（ＰＬ）、および／もしくは第ＩＩａ因子（ＦＩＩａ）、またはその医薬的な等価体、誘導体、類似体、および／または塩を含む組成物を含む。一実施形態では、本キットは、Ｈ－Ｄ－シクロヘキシル－アラニル－アラニル－アルギニル－アミドメチルクマリン（ＡＭＣ）および／またはブチルオキシカルボニル－バリル－プロリニル－アルギニル－ＡＭＣ（Ｖ－Ｐ－Ｒ－ＡＭＣ）を含む組成物をさらに含む。一実施形態では、本キットは、ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性のレベルを決定するための装置をさらに含む。一実施形態では、本キットは、ＴＧの量を決定するための装置をさらに含む。一実施形態では、ＴＦおよび／またはＦＩＸａの組成物が、ピコモルおよび／またはナノモルの投薬量である。一実施形態では、本キットは、血友病患者の個別化診断に有用である。一実施形態では、本キットは、先天性のおよび後天性のＦＶＩＩＩ：Ｃ欠損症の患者における出血リスクを予測するのに有用である。一実施形態では、本キットは、抗血栓レジメンのモニタリングおよび評価に有用である。一実施形態では、本キットは、薬剤の治療または薬剤の組合せに基づく診断、モニタリング、および／または評価をさらに含む。
一実施形態では、本明細書に開示されるのは、患者における疾患を診断、モニタリング、または予知する方法であり、この方法は、患者から血漿試料を取得すること；血液試料を組織因子（ＴＦ）、ＦＩＸａ、および／またはＣａＣｌ２と共にインキュベーションすること；試料をアッセイして、ＦＶＩＩＩ：Ｃおよび／または生成トロンビン（ＴＧ）のレベルを決定すること；ならびに試料中のＦＶＩＩＩ：Ｃの量に基づき、疾患を診断、モニタリング、または予知することを含む。一実施形態では、疾患は出血障害である。一実施形態では、疾患は、血栓障害である。一実施形態では、疾患は止血障害である。一実施形態では、検出されたＦＶＩＩＩ：Ｃ量のレベルが５ＩＵ／ｄＬ超である場合に、患者は軽度の出血リスクを有する。一実施形態では、検出されたＦＶＩＩＩ：Ｃ量のレベルが１～５ＩＵ／ｄＬの間にある場合に、患者は中等度の出血リスクを有する。一実施形態では、検出されたＦＶＩＩＩ：Ｃ量のレベルが１～０．１ＩＵ／ｄＬの間にある場合に、前記患者は重度の出血リスクを有する。一実施形態では、ＴＦおよび／またはＦＩＸａは、ピコモル量またはナノモル量で前記患者の血液試料に投与される。一実施形態では、本方法は、適切な抗血栓症治療を投与することによる追加の治療をさらに含む。一実施形態では、本方法は、血栓症の治療のための薬剤の組合せを投与することをさらに含む。一実施形態では、本方法は、機構論的な見地で異なる標的選択的な抗凝血剤を用いた個別化治療を達成するのに有用である。一実施形態では、患者は、抗凝血剤を用いた治療を受けている。一実施形態では、抗凝血剤は、経口の抗凝血剤である。一実施形態では、アッセイは、重度の血友病Ａ患者における低レベルのＦＶＩＩＩ：Ｃを検出することができる。一実施形態では、アッセイは、後天性のＦＶＩＩＩ欠乏症の個体における低レベルのＦＶＩＩＩ：Ｃを検出することができる。一実施形態では、感度の増加したＦＶＩＩＩ活性アッセイによって、出血の表現型の特徴をさらに正確に明らかにすることが可能になる。一実施形態では、感度の増加したＦＶＩＩＩ活性アッセイによって、重度の血友病Ａ患者における出血リスクの予測が可能になる。一実施形態では、アッセイは、新たに特定された凝固経路における機能が増大しおよび／または安定性が増加した抗血友病ＦＶＩＩＩのバリアントを特定する助けとなり、それゆえ、抗血友病ＦＶＩＩＩ機能を欠損している患者の補充療法が改善される。
一実施形態では、本明細書に開示されるのは、新しい抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤候補をスクリーニングおよび／または評価する方法であって、この方法は、患者の血漿試料を提供すること；ＴＦ、ＦＩＸａ、および／またはＣａＣｌ２を含む組成物を血液試料に添加すること、ならびに試料をアッセイしてＦＶＩＩＩ：Ｃレベルもしくは生成トロンビン（ＴＧ）レベルを決定すること；ならびにＦＶＩＩＩ：Ｃレベルまたは生成トロンビン（ＴＧ）レベルに基づいて、新しい抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤候補をスクリーニングおよび／または評価することを含む。一実施形態では、ＴＦおよびＦＩＸａは、ピコモル量またはナノモル量で前記血液試料に添加される。一実施形態では、新しい抗血栓剤または止血促進剤を評価することは、新しい抗血栓剤または止血促進剤のために設計またはスクリーニングすることを含む。一実施形態では、抗血栓剤または止血促進剤は、治療効能が向上している。一実施形態では、抗血栓剤または止血促進剤は、安全性プロファイルが向上している。一実施形態では、新しい抗血栓薬剤候補を評価することは、ＴＦ開始性の凝固の状況では、凝固補因子の機能的な保存または分解に特異的におよび定量的に焦点を置き、血栓促進性経路と止血促進性経路とを区別することを含む。一実施形態では、抗血栓剤または止血促進剤は、出血合併症に関する抗血栓効果と安全性プロファイルとの最良のプロファイルに基づいて評価される。
一実施形態では、本明細書に開示されるのは、抗凝血剤の治療効能を査定する方法であり、この方法は、血液試料を提供すること；コラーゲンで被覆されているかまたはｒＴＦで固相化されている表面上に、前記血液試料を灌流すること；前記コラーゲンで被覆されているかまたはｒＴＦで固相化されている表面上で、血小板の凝集およびフィブリンの沈着を測定すること；ならびに血小板凝集体および／または沈着フィブリンの体積に基づき、抗凝血剤の治療効能を査定することを含む。一実施形態では、抗凝血剤は、ＦＸａを標的とする凝血剤である。一実施形態では、抗凝血剤は、ヘパリン（抗トロンビン補因子）、ワルファリン（ビタミンＫアンタゴニスト）、ダビガトラン（直接的なトロンビン阻害剤）、リバーロキサバン、および／またはアピキサバン（２種の直接的なＦＸａ阻害剤）である。一実施形態では、凝血剤は、血漿中のＦＸＩレベルとそれゆえに活性を低下させるアプタマーなどの、標的凝血剤である。一実施形態では、灌流は、壁せん断速度３００ｓ－１で５分間である。
安全で有効な抗血栓療法は、病理学的な血栓症に寄与するが止血に及ぼす影響が小さい機構の理解を必要とする。本明細書に記載されるように、および本明細書に開示される様々な実施形態に従って、本発明者らは、外因性組織因子（ＴＦ）凝固開始複合体が、トロンビンフィードバックループとは独立して止血性の内在性凝固経路を惹起する抗血友病補因子であるＦＶＩＩＩを、選択的に活性化できることを見出した。比較的軽度の血栓形成性の傷の付いたマウスモデルでは、ＴＦ依存的なＦＶＩＩＩの活性化によって、接触相による生成ＦＩＸａを通じた血栓形成の閾値が定められる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、安定的にＴＦ－ＦＶＩＩａと会合しているＦＸａは、ＦＶＩＩＩを活性化するが、ＦＶを活性化しない。さらに、ＴＦ－ＦＶＩＩａの新生ＦＸａ産物は、ＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）によるＫｕｎｉｔｚ型阻害の緩やかなカイネティクスを一過的に逃れ、ＦＶよりもＦＶＩＩＩを優先的に活性化することができる。それゆえ、ＴＦは、トロンビンによる補因子の活性化とは独立して、ＦＩＸａ依存的なトロンビン生成を相乗的にプライミングする。したがって、直接的なＴＦ依存的トロンビン生成を欠損するが新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩａ生成を保持するＦＶＩＩａ変異体は、内在性経路による凝固をサポートすることができる。ｅｘ ｖｉｖｏの血流中では、遊離ＦＸａ生成不全ではあるがｂｏｔｈＦＶＩＩＩとＦＩＸの両方を活性化するＴＦ－ＦＶＩＩａ変異体複合体は、効率の良いＦＶＩＩＩ依存的な血栓形成をサポートする。そのため、以前に認識されていなかった、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ複合体を直接的に産生するＴＦ開始性経路は、トロンビン依存的なフィードバックループによるさらに進んだ凝固増幅によって血栓症のリスクが増大する前に、止血促進性となる可能性がある。
一実施形態では、本開示は、血友病の対象における血液凝固を査定する方法を提供し、この方法は、組織因子（ＴＦ）および／または第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）を含む有効な投薬量の組成物を、個体から得られた血液試料に添加すること；および試料をアッセイして、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）のレベルを決定することを含む。本方法は、中等度の出血リスクを、約１～０．１ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩ：Ｃレベルの結果として生じる重度と区別することが可能であり、それは、ＦＶＩＩＩ：Ｃが＜１ＩＵ／ｄＬである際に重度の出血リスクが生じ、ＦＶＩＩＩ：Ｃが１～５ＩＵ／ｄＬである際に中等度の出血リスクが生じ、ＦＶＩＩＩ：Ｃが＞５ＩＵ／ｄＬである際に軽度の出血リスクが生じることによる。一実施形態では、本方法は、中等度の出血リスクを、１～０．１ＩＵ／ｄＬ範囲のＦＶＩＩＩ：Ｃレベルの結果として生じる重度と区別することが可能である。実施形態によっては、ＴＦおよびＦＩＸａは、患者の血液試料に同時に添加される。実施形態によっては、ＴＦは、再脂質化された形態である。実施形態によっては、ＴＦおよびＦＩＸａは、患者の血漿（ＰＲＰまたはＰＰＰ）中に添加される。実施形態によっては、ＴＦおよびＦＩＸａは、ピコモル量またはナノモル量で添加される。一実施形態では、本方法は、重度の血友病Ａ患者に使用される。実施形態によっては、本方法は、後天性のＦＶＩＩＩ欠乏症の患者に使用される。実施形態によっては、本方法は、出血の表現型の特徴をさらに正確に明らかにすることができる。実施形態によっては、本方法は、重度の血友病Ａ患者における出血リスクを予測するのに有用である。一実施形態では、本方法は、ＦＶＩＩＩ産物を用いて補充療法を改善する。実施形態によっては、本方法は、少なくとも１０倍超の感度で、重度の血友病患者におけるＦＶＩＩＩ：Ｃのレベルを決定する。実施形態によっては、本方法は、ＦＶＩＩＩ濃縮物を用いた治療のモニタリングのために、および濃縮物の効力の査定のために有用である。実施形態によっては、本方法は、機能性が向上しおよび／または安定性が増加したＦＶＩＩＩバリアントを特定することをさらに含む。実施形態によっては、本方法は、血友病Ａまたは他の出血障害の治療のための効能および安全性が向上した新規の止血剤をスクリーニングすることをさらに含む。実施形態によっては、本方法は、個々の患者について抗血栓療法の安全性および効能をモニタリングするための新しい方法およびキットを設計するのに有用である。実施形態によっては、本方法は、治療効能が向上した新しい抗血栓剤を特定し特徴を明らかにするのに有用である。実施形態によっては、本方法は、止血への影響が減少した新しい抗血栓剤を特定し特徴を明らかにするのに有用である。実施形態によっては、本方法は、自然発生や外傷後の頭蓋内大出血などの、命に関わる出血合併症を低減する。実施形態によっては、本方法は、効能および安全性が向上した新規の止血剤を特定するのに有用である。これらの実施形態のいくつかでは、患者は、先天性または後天性のＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの欠乏症である（血友病）。
様々な実施形態では、本明細書に開示されるのは、対象での血液 凝固を査定する方法であり、この方法は、対象から適した血液試料を取得すること；個々の試料に所定の濃度の組織因子（ＴＦ）および／または第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）を添加すること；および試料をアッセイして、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）のレベル決定することを含み、ここでは、ＦＶＩＩＩ：Ｃが＞５ＩＵ／ｄＬである際に軽度の出血リスクが生じ；ＦＶＩＩＩ：Ｃが１～５ＩＵ／ｄＬである際に中等度の出血リスクが生じ；ＦＶＩＩＩ：Ｃが＜１ＩＵ／ｄＬである際に重度の出血リスクが生じる。そのため、このアッセイは、中等度の出血リスクを、約１～０．１ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩ：Ｃレベルの結果として生じる重度と区別することが可能である。これらの実施形態のいくつかでは、モノクローナル抗体１２Ｃ７および任意のＴ９９Ｙ変異の等価体を使用することによって、遊離のＦＸａの生成が減少した際にＦＶＩＩＩの活性化を測定することが可能になる。実施形態によっては、本方法によって、補因子ＦＶＩＩＩとＦＶの活性化を区別することを可能にする。実施形態によっては、モノクローナル抗体１２Ｃ７を使用することによって、遊離のＦＸａの生成が減少した際にＦＶＩＩＩの活性化を測定することが可能になる。実施形態によっては、ＦＶＩＩのＴ９９Ｙ変異体またはその任意の等価体を使用することによって、遊離のＦＸａの生成が減少した際にＦＶＩＩＩの活性化を測定することが可能になる。実施形態によっては、ＦＶＩＩのＴ９９Ｙ変異体またはその任意の等価体を使用して、モノクローナル抗体１２Ｃ７を用いるアッセイフォーマットと同様のＦＸＩループを査定する。
さらに本明細書に開示されるのは、血液ＦＶＩＩのＴＦへの結合で競り勝つためのアッセイであり、このアッセイは、（ａ．）個体から血液試料を取得すること；（ｂ）凝固因子ＶＩＩａの変異体を高濃度で添加すること；および（ｃ）血液ＦＶＩＩのＴＦへの結合で競り勝つことを含む。実施形態によっては、凝固因子ＶＩＩａの変異体は、Ｅ１５４Ａまたは実質的に同様の機能を果たす同様の変異体である。
さらに本明細書に開示されるのは、新しい止血性の薬剤候補を評価するための方法であり、この方法は、（ａ）ＴＦ開始性反応においてモノクローナル抗体１２Ｃ７を存在させてＴＧを開始させること；（ｂ）１２Ｃ７の存在下ではＴＧが無効であることを決定すること；（ｃ）止血性の薬剤候補を添加すること；および（ｄ）１２Ｃ７の存在によるＴＦ開始性反応において無効なＴＧを補完する場合に、止血性の薬剤候補が有効であるものと評価することを含む。
さらに本明細書に開示されるように、本発明者らは、血液凝固の査定に使用される可能性がある様々なデバイスおよび装置を開発している。例えば、一実施形態では、本開示は、血液凝固を査定するためのデバイスを提供し、このデバイスは、１種または複数種のＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを試料から測定するのに適応された装置を含む。別の実施形態では、ＴＦおよびＦＩＸは、ピコモル量またはナノモル量で投与されてもよい。実施形態によっては、デバイスは、血友病患者の個別化診断に有用である。実施形態によっては、デバイスは、先天性および後天性のＦＶＩＩＩ：Ｃ欠損症の患者における出血リスクを予測するのに有用である。
別の実施形態では、本開示は、ＴＦおよび／もしくはＦＩＸａまたはその医薬的な等価体、誘導体、類似体、および／または塩と、医薬的に許容可能な担体とを含む、ある量の組成物を含む医薬組成物を提供する。本明細書に開示される医薬組成物はまた、医薬的に許容可能な賦形剤を含むことがある。「医薬的に許容可能な賦形剤」とは、概ね安全で毒性がなく望ましい医薬組成物を調製する際に有用な賦形剤を意味し、ヒトの医薬用途のみでなく獣医学的用途にも許容され得る賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、準固体、またはエアロゾル組成物の場合はガス性であってもよい。
様々な実施形態では、本開示による医薬組成物は、任意の投与経路を介したデリバリのために製剤化されることがある。「投与経路」とは、当技術分野に公知の任意の投与経路を指すことがあり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、エアロゾル、鼻、経口、経粘膜、経皮、または非経口が挙げられる。「非経口」とは、一般に注射に関連する投与経路を指し、そのようなものとしては、眼窩内、輸注、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、くも膜下腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、嚢下、皮下、経粘膜、または経気管が挙げられる。非経口経路を介して、組成物は、輸注用もしくは注射用に溶液もしくは懸濁液の形態で、または凍結乾燥粉末とされることがある。
本開示による医薬組成物は、任意の医薬的に許容可能な担体も含有することができる。本明細書に使用される際の「医薬的に許容可能な担体」とは、医薬的に許容可能な材料、組成物、または媒体を指し、この媒体は、ある組織、器官、または身体の一部から別の組織、器官、または身体の一部への目的の化合物の運搬または輸送に関与する。例えば、担体は、液体または固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、、もしくは被包化材、またはそれらの組合せとしてもよい。担体の各構成成分は、製剤の他の成分と必ず適合するという点で「医薬的に許容可能」でなければならない。それは、接触することがある任意の組織または器官との接触での使用に適していなければならず、このことは、毒性、刺激、アレルギー応答、免疫原性、または治療上のメリットよりも過度に重さのある任意の他の合併症のリスクを持ち込んではならないことを意味する。
本開示による医薬組成物はまた、経口投与のために、被包化、錠剤化、またはエマルジョンもしくはシロップに調製することができる。医薬的に許容可能な固体または液体担体は、組成物を増強または安定化するか、または組成物の調製を容易にするために添加されることがある。液体担体としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、および水が挙げられる。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アラビアゴム、寒天、またはゼラチンが挙げられる。担体としてはまた、モノステアリン酸グリセリルやジステアリン酸グリセリルなどの持続性放出材が単独で、またはろうとともに挙げられることがある。
医薬調製物は、薬学の従来の手法に従って作製され、そのような手法としては、錠剤形態では摩砕、混合、顆粒化、および必要に応じて圧縮；または硬ゼラチンカプセル形態では摩砕、混合、および充填が挙げられる。液体担体が使用される際には、調製物は、シロップ、エリキシル、エマルジョン、または水性もしくは非水性の懸濁液の形態となる。そのような液体製剤は、直接的に経口で投与されるか、または軟ゼラチンカプセル内に充填されることがある。
本開示による医薬組成物は、治療有効量でデリバリされてもよい。的確な治療有効量は、所与の対象における治療の効能という観点から、最も有効な結果を生じることになる組成物の量である。この量は、種々の因子に応じて変わるものとなり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、治療化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能）、対象の生理的な状態（年齢、性別、疾患のタイプおよびステージ、全身的な身体状態、所与の投薬量に対する応答性、および薬物治療のタイプが挙げられる）、製剤中の医薬的に許容可能な１つまたは複数の担体の性質、および投与経路が挙げられる。臨床的または薬理的な技術分野の当業者は、定型的な実験作業を通じて、例としては、化合物の投与に対する対象の応答をモニタリングして投薬量を相応に調整することによって、治療有効量を決定することが可能となる。補足的な指針については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ編、第２１版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ペンシルベニア州、米国）（２００５）を参照されたい。
有効な組成物の典型的な投薬量は、製造業者の推奨する範囲内とすることができ、その範囲とは、公知の治療化合物が使用され、また、動物モデルでのｉｎ ｖｉｔｒｏの１種または複数種の応答により当業者に標示されるようなものである。そのような投薬量について、典型的には、意義ある生物学活性を失うことなく、濃度または量を約１桁までは低減することができる。そのため、実際の投薬量は、医師の判断、患者の状態、および治療方法の有効性に応じたものとなり、治療方法の有効性は、例えば、以前に記載されているような、関連の初代培養細胞もしくは組織培養された組織試料、例えば生検された悪性腫瘍などのｉｎ ｖｉｔｒｏでの応答性、または適切な動物モデルに観察される応答に基づく。
様々な実施形態で、また、本明細書に開示されるのは、患者で抗血栓療法をモニタリングするための診断方法であり、この方法は、（ａ）所定量のＴＦおよびＦＩＸａを個々の患者の血液試料に添加すること；（ｂ）患者血液試料中のＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを決定すること；および（ｃ）ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルに基づき、患者で抗血栓療法をモニタリングすることを含む。実施形態によっては、ＴＦおよびＦＩＸａが、患者血液試料にピコモル量またはナノモル量で添加される。実施形態によっては、本方法は、血栓症の治療のために薬剤を投与することをさらに含む。実施形態によっては、本方法は、血栓症の治療のために薬剤の組合せを投与することをさらに含む。実施形態によっては、本方法は、機構論的な見地で異なる標的選択的な抗凝血剤を用いた個別化治療を達成するのに有用である。
様々な実施形態で、本明細書に開示されるのは、患者における出血合併症を引き起こすリスクを査定するための診断方法であり、この方法は、（ａ）所定量のＴＦおよびＦＩＸａを個々の患者の血液試料に添加すること；（ｂ）患者のＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを決定すること；および（ｃ）ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルに基づき、患者における出血合併症を引き起こすリスクを査定することを含む。これらの実施形態のいくつかでは、ＴＦおよびＦＩＸａが、患者血液試料にピコモル量またはナノモル量で添加される。
様々な実施形態で、本明細書に開示されるのは、新しい抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤候補を評価する方法であり、この方法は、（ａ）それを必要とする患者の個々の血液試料に、所定量のＴＦおよびＦＩＸａを添加すること；（ｂ）患者のＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを決定すること；および（ｃ）ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルに基づき、新しい抗血栓性または止血促進性の薬剤候補を評価することを含む。これらの実施形態のいくつかでは、ＴＦおよびＦＩＸａが、患者血液試料にピコモル量またはナノモル量で添加される。実施形態によっては、新しい抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤を評価することは、新しい抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤について設計またはスクリーニングすることを含む。実施形態によっては、抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤は、治療効能が向上している。実施形態によっては、抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤は、安全性プロファイルが向上している。実施形態によっては、新しい抗血栓性の薬剤候補の特異的かつ定量的な評価は、ＴＦ開始性凝固のコンテクストでは、凝固補因子の機能的な保持または分解に焦点が置かれ、これによって、血栓促進性経路と止血促進性経路とが区別される。実施形態によっては、抗血栓性のまたは止血促進性の薬剤は、抗血栓効果についての最も良いプロファイルｖｓ出血合併症に関する安全性プロファイルに基づき評価される。
様々な実施形態で、本明細書に開示されるのは、患者における血栓性または止血性のリスクを決定するためのアッセイであり、このアッセイは、（ａ）所定量のＴＦおよびＦＩＸａを個々の患者の血液試料に添加すること；（ｂ）患者血液試料中のＦＶＩＩＩ：Ｃレベルを測定すること；および（ｃ）ＦＶＩＩＩ：Ｃレベルに基づき、患者における血栓性または止血性のリスクを決定することを含む。実施形態によっては、ＴＦおよびＦＩＸａが、患者血液試料にピコモル量またはナノモル量で添加される。実施形態によっては、患者は、抗凝血薬剤を用いた治療を受けている。実施形態によっては、抗凝血剤は、経口の抗凝血剤である。実施形態によっては、本アッセイは、重度の血友病Ａ患者で、低レベルのＦＶＩＩＩ：Ｃを検出することができる。実施形態によっては、本アッセイは、後天性のＦＶＩＩＩ欠乏症の個体で、低レベルのＦＶＩＩＩ：Ｃを検出することができる。実施形態によっては、感度の増加したＦＶＩＩＩ活性アッセイによって、出血の表現型の特徴をさらに正確に明らかにすることが可能になる。実施形態によっては、感度の増加したＦＶＩＩＩ活性アッセイによって、重度の血友病Ａ患者における出血リスクの予測が可能になる。実施形態によっては、本アッセイは、新たに特定された凝固経路における機能が増大しおよび／または安定性が増加した抗血友病ＦＶＩＩＩのバリアントを特定する助けとなり、それゆえ、抗血友病ＦＶＩＩＩ機能を欠損している患者の補充療法が改善される。
様々な実施形態で、本明細書に開示されるのは、新規の凝固経路であり、そこでは、ＴＦ－ＦＶＩＩａによって形成される新生ＦＸａが、トロンビンフィードバック反応とは独立して、ＦＶＩＩＩを直接的に活性化する。様々な実施形態で、本明細書に開示されるのは、（ａ）組織因子（ＴＦ）および（ｂ）第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）を含む組成物であり、そこでは、組成物は、個体の血漿中に投与された際に、トロンビン生成を惹起することが可能である。この組成物の実施形態によっては、個体とは血友病患者である。
様々な実施形態で、また、本明細書に記載されるのは、血栓症および止血に広範な意義を持つ、ｉｎ ｖｉｖｏでの血栓形成の開始内にある経路である。実施形態によっては、この新規の機構は、抗血栓療法のモニタリングおよび治療効能の向上した新しい止血剤の設計のための、より良好な診断アプローチを可能にする。実施形態によっては、本明細書に開示されるのは、血栓症において凝固プロ補因子ＦＶおよびＦＶＩＩＩの活性化に繋がるｄｅ ｎｏｖｏ生成された因子Ｘａをもたらすような、組織因子（ＴＦ）凝固開始複合体の新規の機能である。実施形態によっては、止血に必要とされるプロテアーゼ補因子ＦＶＩＩＩａの生成は、好ましい安全性プロファイルを有した臨床で使用される抗凝血剤の存在下で保持される。一実施形態では、新規のアッセイが、この経路での機能性が向上し補充療法のための有用性を有した抗血友病ＦＶＩＩＩおよびＦＶのバリアントを特定するために開示される。別の実施形態では、本明細書に開示されるのは、安全性プロファイルへの有益な効能を有した抗血栓性の薬剤を評価するための、新規のアッセイである。さらに他の実施形態では、本明細書に開示されるのは、ＴＦ開始性凝固のコンテクストでの凝固補因子の機能的な保持または分解に基づき抗血栓療法をモニタリングするための、新規のアッセイである。実施形態によっては、本明細書に開示される新規の薬剤の探索アプローチおよび診断の原理は、抗血栓療法下のおよび／または止血療法を必要とする大規模な患者集団に適用可能である。
様々な実施形態では、 〆 新規の 機構 in 〆 凝固 process as 本明細書に開示される provides a hitherto unknown 方法 to identify and measure differentially 〆 機能 of 血栓促進性の and 止血促進性の 凝固経路s and, consequently, 〆 distinct effects of 阻害剤ｓ. 実施形態によっては、 本開示 presents 新しい 診断の 方法ｓ for モニタリング 抗血栓 療法 in individual 患者ｓ, providing 定量的な パラメーターｓ that distinctly define 〆 レベル of 抗血栓 effect and 〆 リスク of causing 出血合併症ｓ. 実施形態によっては、 this 新規の 機構 may guide 〆 process of 設計すること および／または スクリーニングすること for 新しい 抗血栓 or 止血促進剤ｓ with 向上され 治療効能 and 安全性 プロファイル.
様々な実施形態で、本明細書に開示されるのは、新しい経口の抗凝血剤を用いて治療される患者について、血栓と出血とのリスクの定義を個別化する新規の凝固アッセイである。実施形態によっては、本明細書に開示されるアッセイは、より良好な抗血栓効果のための、または出血合併症の可能性を低減するための、投薬量の調整を必要とする状況を客観的に特定する。実施形態によっては、本開示は、充分な止血機能を保持するとともに血栓症を阻害および治療するための新しい薬理的なアプローチの特定および試験に適切な、新しい展望を提供する。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるのは、血栓症および止血のための広範な意義を持つｉｎ ｖｉｖｏでの血栓形成の開始における経路である。様々な実施形態で、本開示は、外因性凝固開始複合体の新規の機能を描き出しており、すなわち、トロンビンフィードバックループとは独立した抗血友病補因子ＦＶＩＩＩの選択的なフィードフォワード活性化を示している（図１）。
一実施形態では、本明細書に開示されるのは、接触相（ＣＰ）開始性またはＦＸＩａ開始性の凝血原プロテアーゼの生成を可能にする鍵となるＦＶＩＩＩ凝固補因子を、ＴＦ経路開始複合体が直接的に活性化することである。実施形態によっては、外因性経路の開始を介したプロテアーゼ生成が生理的に制限されている際に、ＴＦＰＩによる補因子ＦＶＩＩＩ活性化の阻害が不十分であることによって、内在性経路を通じたトロンビン産生の継続が可能になる。実施形態によっては、ＴＦＰＩと同様に、ＦＸａ指向性の抗凝血薬剤であるリバーロキサバンは、ＴＦ媒介性のトロンビン生成を低減するとともに、ＦＶＩＩＩの活性化を保持する。一実施形態では、生理的なＴＦＰＩの制御を選択的に回避することによって、内在性経路依存的なトロンビン生成のレスキューが可能になり、この回避は、リバーロキサバン治療患者で致命的な出血合併症が低減されることを説明する。実施形態によっては、この代替的な凝固機構は、血栓症における新規のＴＦとＣＰ（内在性経路）との相乗効果を定義し、改善された抗血栓剤および止血剤の開発に広範な意味を有する。
様々な実施形態で、ここに開示されるのは、ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体により生成される新生ＦＸａが、トロンビンフィードバックループとは独立して直接的に、内在性経路補因子であるＦＶＩＩＩを活性化することを示す、実験、方法、および結果である。トロンビン生成に繋がるこの代替的な機構は、生理的なＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の制御だけでなく直接的なＦＸａ薬理的な阻害剤をも逃れる。その結果、これらの抗凝血薬剤は、ビタミンＫアンタゴニストとは異なり、外因性ＴＦ経路の血栓形成促進機能が制限されている際に、抗血友病ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体を通じたフィブリン形成を保持する。Ｆｘａによる阻害に対する抵抗性は、どのように、この新規の凝固における連係が、脆弱な部位で、治療濃度のＦＸａ指向性の抗凝血剤の存在下であっても、凝塊の形成を促進し出血を防止するのかを説明する。本開示は、止血への負の結果を制限するとともに抗血栓効能を増強するための、ならびに抗凝血療法中の出血リスクの個別化評価を行うための、新しい展望を提供する。
本開示はまた、ＴＦおよびＦＩＸａを含むキットに向けられている。例えば、本明細書に開示される様々な実施形態では、本開示は、個体でＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を決定するためのキットを提供し、このキットは、ＴＦおよびＦＩＸａを含み、ここでは、治療有効量のＴＦおよびＦＩＸａは、個体の血漿中に投与されて、ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を１～０．１ＩＵ／ｄＬの範囲で決定することがある。これらの実施形態のいくつかでは、ＴＦおよびＦＩＸａは、個体の血漿中にピコモル量またはナノモル量で投与される。実施形態によっては、本キットは、血友病患者の個別化診断に有用である。実施形態によっては、本キットは、先天性のおよび後天性のＦＶＩＩＩ：Ｃ欠損症の患者における出血リスクを予測するのに有用である。実施形態によっては、本キットは、抗血栓レジメンのモニタリングおよび評価に有用である。実施形態によっては、診断、モニタリング、または評価は、新しい薬剤または薬剤の組合せに基づく。
様々な実施形態では、本キットは、血友病および抗血栓症について治療するか、診断するか、または新しい薬剤をスクリーニングする、本発明の方法を実践するのに有用である。本キットは、本発明の組成物のうち少なくとも１つを含む材料または構成成分の組合せである。それゆえ、実施形態によっては、本キットは、上に記載されるように、ＴＦおよびＦＩＸａを含む組成物を含有する。
発明のキットに構成される構成成分の正確な性質は、その意図される目的に依存する。例えば、いくつかの実施形態は、血友病患者の個別化診断および治療の目的のために構成される。一実施形態では、本キットは、具体的には、哺乳動物対象を治療するために構成される。別の実施形態では、本キットは、具体的にはヒト対象を治療する目的で構成される。さらに別の実施形態では、本キットは、以下に限定されないが、家畜動物、飼育動物や、実験動物などの対象を治療する獣医学の適用のために構成される。
使用のための指示書が、キットに含まれていることがある。「使用のための指示書」とは、典型的には、血友病患者を診断または治療するなどの所望のアウトカムをもたらすためのキットの構成成分を使用する際に採用される手法を記載する、明確な表現を含む。任意選択で、本キットはまた、他の有用な構成成分、例えば、希釈剤、緩衝剤、医薬的に許容可能な担体、シリンジ、カテーテル、アプリケーター、ツールをピペッティングまたは測定すること、材料を当てること、または当業者が容易に認識することになるような他の有用な道具を含有する。
キットに組み合わされた材料または構成成分は、実務者に提供されて、それらの操作性および有用性を保持する簡便かつ適した方法で保存することができる。例えば、構成成分は、溶解形態、脱水形態、または凍結乾燥形態とすることができる。そして、それらは、室温で、冷蔵温度で、または凍結温度で提供することができる。構成成分は、典型的には、適したパッケージング材（複数可）に含有させることができる。本明細書に採用されるように、節「パッケージング材」とは、発明の組成物などのキットの内容物を格納するのに使用される、１種または複数種の物理的構造を指す。パッケージング材は、好ましくは混入物のない滅菌済みの環境を与えるように、周知の方法によって構築される。キットで使用されるパッケージング材は、医療分野で慣習的に利用されるものである。本明細書に使用される際に、用語「パッケージ」とは、個々のキットの構成成分を支持することが可能なガラス、プラスチック、紙、ホイルなどの適した固体マトリックスまたは材料を指す。そのため、例えば、パッケージは、ＴＦとＦＩＸａと止血性経路の活性化に影響を与えるモノクローナル抗体または変異体タンパク質とを含有する、適した量の本発明の組成物を含有するために使用されるガラスバイアルとすることができる。パッケージング材は、一般に、キットおよび／またはその構成成分の内容物および／または目的を標示する外装ラベルを有する。
ポリペプチドまたは他のバイオマーカーの存在または不在を検出するための、当技術分野で利用可能な様々な手法があり、そのようなものとしては、タンパク質マイクロアッセイが挙げられる。例えば、この目的のために利用できるいくつかの検出のパラダイムとしては、光学的な方法、電気化学的な方法（ボルタンメトリーおよび電流滴定法）、原子間力顕微鏡法、および無線周波数法、例えば、多極共鳴分光法が挙げられる。共焦点と非共焦点の両方の顕微鏡法に加えて、光学的な方法の例証は、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析、共振ミラー法、格子カプラー導波管法、または干渉分光法）である。
同様に、バイオマーカーを単離および／または分画するために採用される、任意の数の手法がある。例えば、バイオマーカーは、抗体、アプタマー、またはバイオマーカーおよびその修飾形態を認識する抗体など、生体分子特異的な捕捉試薬を用いて捕捉されてもよい。また、この方法の結果、タンパク質相互作用物質を捕捉することができ、これらの相互作用物質は、タンパク質に結合されるかまたはその他抗体により認識され、それら自体でバイオマーカーとなることができる。生体分子特異的な捕捉試薬はまた、固相に結合されることがある。次いで、捕捉されたタンパク質は、ＳＥＬＤＩ質量分析によって、または捕捉試薬からタンパク質を溶出して古典的なＭＡＬＤＩによりまたはＳＥＬＤＩにより溶出タンパク質を検出することによって、検出することができる。ＳＥＬＤＩの一例は、「アフィニティ捕捉質量分析」または「表面増強アフィニティ捕捉」または「ＳＥＡＣ」とよばれ、プローブを使用することを含み、このプローブは、材料と分析物との間の非共有結合アフィニティ相互作用（吸着）を通じて分析物を捕捉する材料をプローブ表面に有する。質量分析計のいくつかの例は、飛行時間型、磁場セクター型、四重極フィルター型、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電場セクター型の解析装置およびこれらのハイブリッドである。
あるいは、例えば、ポリペプチドなどのバイオマーカーの存在は、古典的なイムノアッセイ手法を用いておそらくは検出した。イムノアッセイは、分析物を捕捉するための抗体などの生体分子特異的な捕捉試薬を必要とする。本アッセイはまた、タンパク質と修飾形態のタンパク質とを特異的に区別するために設計されることがあるが、その区別を、サンドイッチアッセイを採用することによって行うことができ、そのアッセイでは、ある抗体が２種以上の形態を補足し、第２の別個に標識された抗体が特異的に結合して、様々な形態の別個の検出を可能にする。抗体は、生体分子を用いて、免疫された動物によって生産することができる。古典的なイムノアッセイはまた、ＥＬＩＳＡまたは蛍光ベースイムノアッセイを含めたサンドイッチイムノアッセイ、ならびに他の酵素イムノアッセイを含む。
検出前に、バイオマーカーはまた、溶液中の、または検出に干渉することのある血液の他の構成成分から、それらを単離するために分画されることがある。分画としては、クロマトグラフィー、アフィニティ精製、１Ｄおよび２Ｄマッピング、および当業者に公知の精製のための他の手順などの手法を用いた、他の血液構成成分からの血小板の単離、血小板構成成分の細胞内分画、および／または血小板中に見られる他の生体分子からの所望のバイオマーカーの分画が挙げられる。一実施形態では、試料は、バイオチップを用いて分析される。バイオチップは、一般に固体基質を含み、概ね平面の表面を有し、その表面に補足試薬（吸着試薬またはアフィニティ試薬ともよばれる）を付加させる。しばしば、バイオチップの表面は、複数のアドレス指定可能な場所を含み、それらの場所ではそれぞれ、補足試薬がそこに結合されている。
本明細書の様々な実施形態に従って、ＦＶＩＩの配列の一例が、配列番号１に図説されている。本明細書の様々な実施形態に従って、ＦＶＩＩの様々な変異体の例が、参照によりここに組み込まれる以下の文献：Ｌａｒｓｅｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１０年）；およびＰｉｋｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８月、１９９９年）；およびＳｈｏｂｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年）に説明されている。
当業者に容易に理解されるように、本明細書の様々な実施形態はまた、様々な疾患および状態と併せて使用されてもよく、その開示は、決して血液療法または血液合併症の分野にのみに限定されない。本明細書に開示される様々な実施形態は、本明細書に記載される凝固経路に関連する他の疾患の治療、診断、または予知に、単独でまたは組合せで使用されてもよい。例えば、一実施形態では、本明細書の開示は、腫瘍、がん、および他の関連の状態の評価、予知、診断、または治療のために使用されてもよい。
同様に、本明細書に記載される様々な方法およびデバイスもまた、追加の装置と併せて使用されることがある。一実施形態では、本開示は、１種または複数種のマイクロ流体デバイスと併せて、血液合併症および／または凝固査定する方法を提供する。
本開示の実施形態は、以下の実施例にさらに記載される。実施例は、説明的なものに過ぎず、形はどうあれ特許請求の範囲にあるような本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ＴＦ凝固経路およびＣＰ凝固経路の両方が、ＦｅＣｌ ３ 誘導性の血栓症に寄与する
従来の凝固カスケードの観点では、図１に説明されるように、外因性ＴＦ経路が、フィードバック反応を促進する限定量のトロンビンを生成し、その反応では、可溶性の血漿プロ補因子であるＦＶＩＩＩおよびＦＶが、ＦＸＩと併せて活性化される。活性化されたＦＸＩ（ＦＸＩａ）は、次々にＦＩＸをＦＩＸａに切断するが、このＦＩＸａはまた、ＴＦ－ＦＶＩＩａによっても生成できる。ＦＩＸａは、次いで、内在性のテナーゼ複合体（ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ）およびプロトロンビナーゼ複合体（ＦＶａ－ＦＸａ）を通じて、凝血原プロテアーゼの産生を増幅する。このパラダイムは、なぜＦＸＩＩではなくＦＶＩＩａが、ＦＶＩＩＩ欠乏症におけるＴＦＰＩ制御の除去のように、止血促進性であるのかを説明する。しかし、この現行のパラダイムでは、なぜポリアニオン依存的なＦＸＩＩａ媒介性のＦＸＩ活性化が、ＴＦ開始性の実験的な動脈血栓症に必須であるのかを説明することができない。
様々な実施形態で、本開示はこの課題に対処する。一実施形態では、本明細書の開示は、様々な実験および結果を通じて、ＴＦ凝固経路とＣＰ凝固経路の両方が、マウス頸動脈におけるＦｅＣｌ３誘導性の血栓症に寄与することを確定し、それは、ＴＦ依存的な凝固を８０％阻害するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）およびＦＸＩＩによるＦＸＩの活性化を遮断するＭｏＡｂが、全て個別に血管の閉塞を阻害したことを示すことによる。別の実施形態では、同様の効果が、閾値下の濃度の２つの抗体を組み合わせることによって得られ、このことは、このモデルで、内在性と外因性の両方の経路が、血栓形成促進性のレベルの凝固プロテアーゼを生成することに一致する。いくつかの実験、すなわち正常血小板を補充してカルシウム再加されたヒトＦＩＸ欠損血漿を用いたｅｘ ｖｉｖｏ実験では、再脂質化された組換えＴＦ（ｒＴＦ）は、個別の不活性な濃度で、ＦＩＸａによるトロンビン生成を相乗的に増強した。一実施形態では、この知見は、観察されたＴＦ経路とＣＰ経路との協働機能が、ＦＩＸを活性化する直接的または間接的なフィードフォワードループの結果ではなかったことを実証する。さらに、正常な血小板に富む血漿（ＰＲＰ）では、ｒＴＦと共に添加されたＦＸＩＩａまたはＦＸＩａは、ＦＩＸａと同じ効果を有し、このことは、ＣＰの活性化が、ＦＩＸａ生成の上流経路であることを実証する。いくつかの実施形態で、ＴＦおよびＣＰの経路の相乗作用は、ＦＶＩＩとＦＶＩＩＩの両方を含み、血漿中に存在する低濃度のＴＦＰＩは、ｒＴＦのみによるトロンビン生成の抑制に関与した。
実施例２
精製構成成分を含む反応における凝固プロテアーゼの生成
いくつかの実施形態で、精製され構成成分を含む反応における凝固プロテアーゼの生成を決定した。一実施形態では、血漿における結果と一致して、ｒＴＦは、最小限のＦＸａおよびトロンビン（ＦＩＩａ）しか生じなかったが、ＦＩＸａとの組合せでは、各プロテアーゼの相加的な量よりも多く産生した。いくつかの実施形態で、ＦＶＩＩＩおよびＦＶの活性化は、トロンビン活性のバーストを続行させ、思いがけないことに、ＦＩＸａのみよりもｒＴＦの存在の方がはるかに効率が良かった。様々な実施形態では、これらの結果は、外因性凝固開始複合体が、重要なトロンビン生成の前に、血漿由来の凝固補因子の直接的なアクティベーターとしての役割を果たす可能性があることを示唆する。この概念に一致して、潜在的な痕跡量のトロンビンの混入を阻害するためにレピルジンを添加した単純化したプロトロンビン不含の系において、ＦＶＩＩａおよびＦＸの存在下、ｒＴＦは、用量依存的な補因子の活性化を引き起こした。いくつかの実施形態で、ＦＶＩＩＩは、４倍モル過剰のＦＶであっても優先的に活性化された。いくつかの実施形態で、トロンビン阻害剤のダンシルアルギニン－Ｎ－（３－エチル－ｌ，５－ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）の存在下でのプロトロンビンの活性化をモニタリングしたところ、この新規の経路は、補因子を変換するトロンビンフィードバック反応による寄与がなくても、触媒性プロトロンビナーゼ複合体のアセンブリを導くことが示された。
いくつかの実施形態では、ＴＦ－ＦＶＩＩａのみでは、ＦＶＩＩＩａおよびＦＶａよりも小さな不活性の補因子断片が生じたが、ＦＸの添加によって、適切にプロセッシングされた補因子が産生し、このことは、ＴＦ開始性の凝固の間にＦＸａが生成された際に、切断の活性化が優先的に起こったことを標示する。マダニ抗凝血ペプチド（ＴＡＰ）を用いたＦＸａの阻害によって、反応は分解断片を生成する方に逆戻りした。いくつかの実施形態で、ＦＶＩＩａ活性部位を遮断することによってＦＸの活性化を防止するＴＦＰＩ様阻害剤である線虫抗凝血タンパク質（ＮＡＰ）ｃ２は、これらの断片を生成しなかった。いくつかの実施形態で、ＮＡＰｃ２は、ＦＸａの触媒部位に影響を及ぼさない。そのため、いくつかの実施形態で、不活性のＳｅｒ１９５Ａｌａ変異型ＦＶＩＩａ（ｉＦＶＩＩａ）およびＦＸａの存在下、ＮＡＰｃ２安定性のＴＦ複合体では、ＦＸａのみが活性プロテアーゼである。一実施形態では、ＴＦ－ｉＦＶＩＩａ－ＦＸａ－ＮＡＰｃ２複合体は安定であったが、このことは、それがプロトロンビナーゼ活性を失ったという事実に示される通りである。一実施形態では、この複合体は、ＦＶではないもののＦＶＩＩＩを活性化することができた。様々な実施形態で、これらの知見は、補因子の活性化が、ＴＦ開始性の凝固の間の早期のイベントであり、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体内に依然としてアセンブルされているｄｅ ｎｏｖｏ生成されたＦＸａによって媒介されるという、新規の概念を確立する。
実施例３
ＴＦ経路開始複合体によるＦＶＩＩＩａの生成
いくつかの実施形態で、ＴＦ経路開始複合体によるＦＶＩＩＩａ生成は、ここに開示される代替の凝固のパラダイムにおいて鍵となるステップである。いくつかの実施形態で、この概念は、ＴＦおよびＦＸＩＩａによって同時に開始される反応で検証された。予め活性化されたＦＶＩＩＩａは、ＦＸＩＩａまたはＦＸＩａによる凝固の開始後、ｒＴＦ－ＦＶＩＩａがＦＸａ生成に及ぼす影響をバイパスしたが、プロ補因子ＦＶＩＩＩはバイパスしないことが見出された。さらに、閾値下の濃度の抗ＴＦ ＭｏＡｂおよび抗ＦＸＩ ＭｏＡｂの同時投与によってＦｅＣｌ３誘導性の大腿静脈血栓症を防止されたマウスモデルにおいて、ＦＶＩＩＩａ－しかしＦＶＩＩＩではなく－の輸注によって、フィブリンに富む血栓による閉塞が復活する。いくつかの実施形態で、ＦＶＩＩＩａは、より高く完全に阻害性の抗ＦＸＩ ＭｏＡｂの用量の持つ抗血栓効果を逆進させることができなかったが、このことは、ＦＶＩＩＩａが、本明細書に開示されるＣＰ依存的な相乗的な凝固経路でのみ作用したことを確定するものである。いくつかの実施形態で、これらの知見は、ＦＶＩＩＩａが、動的なｉｎ ｖｉｖｏ環境では、ＴＦＰＩ媒介性のフィードバック阻害によって生理的に調節されたＴＦ依存的な外因性凝固経路によって、活性化されるという結論を支持する。
実施例４
負のＴＦＰＩ調節の結果
様々な実施形態で、負のＴＦＰＩ調節の結果を詳細に解明するために、本発明者らは、ＦＸＩＩａを遮断するトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）が、ＴＦＰＩの添加がない限り、ＴＦ開始性のトロンビン生成に影響を及ぼさなかったことを示した。いくつかの実施形態で、このことは、ＴＦＰＩが、使用された静置血漿アッセイ系にそれ自体で最小限の影響を及ぼした濃度であった場合でさえ、起こった。いくつかの実施形態では、どのようにＦＸＩＩａがＴＦ開始性のトロンビン生成における役割を獲得するのかを説明するために実施された実験において、ＴＦＰＩが、外因性経路開始複合体によるＦＶ活性化を部分的に、および非常に高い濃度で、阻害したに過ぎないことが見出された。いくつかの実施形態で、ＦＶＩＩＩの活性化の阻害は、ＦＶＩＩＩａ活性の測定によって確定されたように最小限であった。いくつかの実施形態で、詳細な経時変化分析によって、ＴＦＰＩが、最初は補因子の活性化を弱めるものの、ＦＸａへの曝露によって引き起こされる時間依存的な分解を防止し、それゆえに機能的な補因子の半減期を本質的に延長させることが明らかになった。
一実施形態では、プロトロンビン不含の反応中、固定濃度のｒＴＦ－ＦＶＩＩａで４０ｎＭ ＴＦＰＩによって引き起こされたＦＸａ活性の時間依存的な減少が、ＦＩＸａの添加によって防止されたことで、活性ＦＶＩＩＩａの生成が確認された。符合する結果は、高い初発のＦＸａ濃度が活性の持続に必要であったことを除けば、８倍低いＴＦ濃度で、ＦＸａ生成が対応して低減したことに得られた。別の実施形態では、トロンビン阻害剤ＤＡＰＡの存在下でのプロトロンビン（ＦＩＩ）の切断において、ＴＦＰＩの存在下で生成されたＦＶａが、活性のプロトロンビナーゼ複合体中にアセンブリされることが実証された。そのため、いくつかの実施形態では、ＴＦＰＩ制御下でのＴＦ開始性の凝固は、フィードバック反応による補因子の活性化を必要とすることなく、トロンビン生成への直接路を確立し、内在性テナーゼ複合体中のＣＰ由来ＦＩＸａに依存したトロンビン産生の増幅を支援する。したがって、いくつかの実施形態では、ｒＴＦ開始性のＦＸａおよびトロンビンの生成のＴＦＰＩによる阻害は、ＦＩＸａの存在下で著しく減少した。
本明細書に開示される様々な実施形態で、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによる活性化のための好適な補因子基質とは、ＦＶＩＩＩであり、このＦＶＩＩＩは、抗血友病因子として、止血において鍵となる役割を果たす。いくつかの実施形態で、永続的なＦＶＩＩＩの活性化は、リバーロキサバンで報告されている出血合併症の発生率がワルファリン治療患者に比べてさらに低いことを説明する一助となることが確定された。一実施形態では、臨床的意義のある濃度では、リバーロキサバンは、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ三成分複合体によるＦＶａ生成を遮断し、一方で、ＴＦ－ＦＶＩＩａによる不活性断片への切断を可能にした。別の実施形態では、リバーロキサバンは、ＦＶＩＩＩの活性化に最小限に影響を及ぼした。完全な抗凝血投薬量でのピーク血漿濃度である５００ｎＭリバーロキサバンであっても、外因性凝固がＴＦＰＩ制御によって有効にオフにされた際に、ＦＶＩＩＩａ生成は持続し、機能的に意味のあるトロンビン濃度のＦＩＸａ依存的な産生をサポートした。それゆえ、一実施形態では、リバーロキサバンを用いて選択的にＦＸａを標的とすることは、外因性凝固開始複合体の新生の産物による動態学的に好都合なＦＶＩＩＩ活性化を可能にする、本来的に備わった安全性機構を有する。結果として、いくつかの実施形態では、内在性経路抗血友病因子に選択的に依存し、止血に有用となる可能性がある、限定的なトロンビン生成が起こる。様々な実施形態では、本明細書に開示される概念は、改善された止血剤および標的化された抗血栓剤を開発するための、ならびにそれらの特性を評価するための、新しい展望を提供する。
実施例５
凝固と宿主防御機構との間の補完的な相互作用
様々な実施形態で、外因性凝固開始複合体中の新生のＦＸａ産物は、内在性経路依存的なトロンビン生成を可能にする血漿補因子であるＦＶＩＩＩの、ＴＦＰＩ回避アクティベーターであることが特定された。いくつかの実施形態で、本開示は、血管閉塞の進展におけるＦＸＩＩとＴＦとの同時発生的な役割を説明し、止血および血栓症でどのように凝固開始が異なることがあるのかについて理解するための糸口を提供する。この点について、いくつかの実施形態では、ＴＦＰＩは、主にトロンビン生成を制御し、血管の開通性を維持するように設計されたマスタースイッチとして作用する。いくつかの実施形態で、一次止血では、傷害部位で血液を豊富なＴＦに曝露することによって、ＴＦＰＩの阻害を直接的に乗り越えることができ、主に外因性経路を通じて初発の凝固プロテアーゼの生成および補因子の増幅が可能になる。他の実施形態では、外因性ＦＸａ産生に対するＴＦＰＩによる封鎖を乗り越えることは、血管内血栓症では難しいことがあり、具体的には、血小板に富む発達中の血栓によって豊富なＴＦＰＩが放出される動脈では難しい。いくつかの実施形態で、ＴＦは、ＣＰ開始性のトロンビン生成を継続するための内在性凝固経路をプライミングする補因子を直接的に活性化することによって、予期しない選択的な役割を果たす。同じ機構は、病理的な状態で作動することがあり、それは、ＣＰ経路を惹起する二次的な危険信号が、活性化された血小板、白血球、微生物病原体、または損傷細胞のいずれから放出されるかに関わらず、ＴＦの誘導を伴う際に起こる。一実施形態では、アテローム血栓症は、そのような状態の具体的な例であることがあり、それはなぜなら、動脈内の閉塞が、多くの場合、ＴＦに曝露されている脆いアテローム硬化性のプラークの上に炎症または感染が重なり合うことによって沈殿形成するためである。そのため、様々な実施形態で、ここに報告される知見は、血栓症およびその治療への凝固の寄与についてのみならず、凝固と宿主防御機構との間の補完的な相互作用を理解することについても、広い意義を有する。
実施例６
止血性および血栓性の凝塊形成は、区別的に調節される。
従来の観点（図１）では、凝固は、血漿中のプロ補因子であるＦＶＩＩＩおよびＦＶのフィードバック活性化に依存し、このフィードバック活性化は、ＦＸａによって最初に産生される限定量のトロンビン（ＦＩＩａ）によって起こり、そのＦＸａは、負のＴＦＰＩ制御の下、ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体によって活性化されるＦＸから順次生じる。ＴＦ－ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａによって生成されるＦＩＸａは、次いで、さらに多くのＦＸａおよびトロンビンをそれぞれ産生する内在性のテナーゼ複合体（ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ）およびプロトロンビナーゼ（ＦＶａ－ＦＸａ）複合体を連続的にアセンブリすることを通じて、凝固を増幅することができる。トロンビン産生の増幅は、止血に不可欠であり、この止血は、外因性経路のＦＶＩＩａを必要とするが、接触相のＦＸＩＩａを必要としない。したがって、ＴＦＰＩチェックポイント制御を取り除くことによって、血友病マウスでは、止血が向上する。しかし、ある種の実験的な血栓症モデルは、接触相のＦＸＩＩａによるＦＸＩａの活性化に依存し、このことは、止血性および血栓性の凝塊の形成が、区別的に調節されることを示唆する。一実施形態で、本発明者らは、止血性および血栓性の凝塊の形成におけるこれらの違いを特定した。
一実施形態では、血栓症を引き起こすのに必要なレベルで凝固プロテアーゼが生成される際に、内在性経路および外因性経路が、協働する。このことを確立するため、マウス頸動脈モデルを使用したところ、そこでは、ＴＦに対するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）は、ＦＸＩＩａによる活性化を遮断する抗ＦＸＩ ＭｏＡｂと同様に、７％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏによって誘導された付傷の後の安定な血管閉塞の頻度を有意に減少させた。重要なことに、さらに重度の８％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏによる付傷の後では、２つの抗体は、もはや使用された濃度では個々で有効ではなかったが、組み合わせると血管閉塞を著しく阻害した。このことは、血栓症を引き起こすのに必要なレベルで凝固プロテアーゼが生成される際に、内在性経路および外因性経路が協働することを実証する。また、高濃度の抗ＦＸＩ ＭｏＡｂも閉塞を阻害し、このことは、この実験的モデルでの血栓症に不可欠であるものとして接触経路を結び付ける遺伝子的なエビデンスと一致する。
一実施形態で、正常血小板を補充された血漿（再構成されＰＲＰ）中のトロンビン生成を測定することによって、凝固経路の協働をｉｎ ｖｉｔｒｏで調べた。接触経路プロテアーゼ（ＦＸＩＩａ、ＦＸＩａ、またはＦＩＸａ）をＴＦと共に添加することによって、プロテアーゼまたはＴＦが個別に添加された際よりも多くのトロンビンが産生した。しかし、人工的な接触経路の活性化を阻害するために、正常血漿がＦＸＩＩａ指向性のトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）を含有していた際には、低濃度のＴＦのみでは、トロンビンは本質的には産生されなかった。むしろ、ＴＦは、ＦＶＩＩａおよびＦＶＩＩＩの両方を必要とする様式では、ＦＩＸａによるトロンビン産生を相乗的に増大させた。直接的または間接的なループによる追加的なＦＩＸの活性化にＴＦが寄与したことを除けば、同じ相乗効果が、ＦＩＸ欠損血漿に起こり、このことは、生理的な血漿凝固阻害物質の存在下でのＦＩＸａ依存的なトロンビン生成のための実現化ステップとして、ＦＶＩＩＩａ補因子の生成を標示する。
実施例７
再脂質化された組換えＴＦ（ｒＴＦ）が限定的なリン脂質表面を提供した、精製ＦＶＩＩＩ、ＦＸ、ＦＶ、およびプロトロンビンを用いて再構成された反応において、ＴＦ経路は、機能的なＦＶＩＩＩａを提供する
一実施形態では、再脂質化されたＴＦが限定的なリン脂質表面を提供した、精製ＦＶＩＩＩ、ＦＸ、ＦＶ、およびプロトロンビンを用いて再構成された反応において、ＴＦ経路は、機能的なＦＶＩＩＩａを提供することがある。ＦＩＸａのみの添加によって、低レベルのＦＶＩＩＩおよびＦＸの活性化が誘導され、それらは、トロンビン阻害剤であるダンシルアルギニンＮ－（３－エチル－１，５－ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）によって無効化された。このことは、この系で産生されたトロンビンによる公知のＦＶＩＩＩのフィードバック活性化に一致する。ＦＶＩＩａのみでは、ＦＩＸａのみよりも有意に多くのＦＸａおよびＦＶＩＩＩａを産生した。ＦＩＸａをＦＶＩＩａと共に添加することによって、ＦＶＩＩＩａの形成ははっきりとは変化しなかったが、ＦＸａの量は、ＦＶＩＩａおよびＦＩＸａにより個々に得られたものの和を上回って増加した。これらの結果は、相乗効果が、外因性経路で生成されたＦＶＩＩＩａから起こり、次いで、ＦＩＸａと複合体を形成して、プロテアーゼの形成をさらに亢進することを実証する。重要なことに、完全反応混合物中でプロトロンビンおよびＦＶＩＩＩの活性化が不在であっても、用量依存的な様式でＴＦによってサポートされる補因子の活性化は、ＤＡＰＡによって低減したが消失はしなかった。しかし、相乗的なＦＸａ産生は、トロンビン阻害剤の存在下では、または反応中の野生型プロトロンビンが触媒的に不活性のＳ１９５Ａプロトロンビン変異体に置き換えられた際には、変化しなかった。そのため、限定的な開始リン脂質表面では、ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体による直接的なＦＶＩＩＩ活性化は、トロンビンによるフィードバック補因子の活性化がない場合でさえ、ＦＩＸａ－ＦＶＩＩＩａ内在性テナーゼ複合体の産出型アセンブリを可能にするのに充分である（図１）。
いくつかの実施形態では、血漿中に存在しかつ活性化血小板によって放出されるＴＦＰＩαは、ＴＦ依存的なプロテアーゼの生成およびプロトロンビナーゼの生理的な調節因子である。したがって、抗ＴＦＰＩ ＩｇＧをカルシウム再加されたクエン酸添加ＰＲＰに添加することにより、低いＴＦ濃度によってのみ誘導されるトロンビンの生成が亢進したが、ＴＦと共に添加されたＦＩＸａへの応答は、ＴＦＰＩの封鎖により最小限の影響を受けた。このように、新たに描き出されたＦＶＩＩＩａ生成の経路は、ＴＦＰＩの制御下にはない。期待されるように、再構成系でＴＦ－ＦＶＩＩａによって産生されるＦＸａは、ＴＦＰＩのみで＞５０％低減し、ＴＦＰＩとプロテインＳ（ＰＳ）補因子とを合わせることによって＞７５％低減した。これに対し、反応中の機能的なＦＶＩＩＩａを反映する、ＴＦ－ＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａによるＦＸａ）から生じた量を超えるＦＩＸａ依存的なＦＸａの生成は、ＰＳを含有する反応に単独でおよび部分的にのみ添加されたＴＦＰＩによる影響を受けなかった。プロテアーゼ生成の低減に一致して、ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ／ＰＳ、および五糖を伴う生理的な阻害物質アンチトロンビンは、ＦＶＩＩＩａの形成を有意に低減した。しかし、これらのＦＸａ阻害剤は、ＤＡＰＡによるトロンビン封鎖がある際には、ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＶＩＩＩａの生成を防止せず、このことは、新規の外因性凝固と内在性凝固との間のトロンビン非依存的な機能的な連係が、内在性の生理的な阻害物質による制御を逃れることができることを実証する。
いくつかの実施形態で、追加の実験では、ＦＶＩＩＩａの他に、ＴＦ経路が、トロンビンフィードバック活性化の不在下で、プロトロンビナーゼ活性を有するＦＶａを生成し、ＴＦＰＩによる制御を免れることができることが示され、このことは、ＦＶの活性化にＦＸａを結び付ける薬理学的なエビデンスに一致する。そのため、ＴＦ経路は、既に想定された補因子活性化のトロンビンフィードバックループの不在下で、フィブリン形成を開始することができる。部分的に活性のＦＶａが、血管傷害部位で、刺激された血小板によって放出されることから、トロンビン非依存的なＦＶＩＩＩａの形成は、本明細書に開示される新規の凝固の連係のとなるｉｎ ｖｉｖｏ機能である可能性がある。この概念は、カルシウム再加されたＰＲＰベースのトロンビン生成アッセイにおいて最初に検証され、このアッセイは、ＦＸＩＩａを遮断するために、ＣＴＩの存在下、ＴＦおよびＦＩＸａを添加することによって開始された。いくつかの実施形態で、機能を遮断する抗ＴＦ抗体は、遅延時間を有意に延長し、産生されるトロンビンの量を低減したが、この効果は、ＦＶＩＩＩａを添加することによって用量依存的に逆転した。
実施例８：
塩化鉄により誘導された傷害の後のマウス大腿静脈におけるフィブリン沈着を評価するＩｎ－ｖｉｖｏ実験
いくつかの実施形態で、ｉｎ－ｖｉｖｏ実験を実施して、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏにより誘導された傷害の後のマウス大腿静脈におけるフィブリン沈着を評価した。頸動脈に見られるように、個別では無効な用量の抗ＴＦおよび抗ＦＸＩのＭｏＡｂを同時投与することによって、血管の安定な閉塞が防止され、傷の範囲におけるフィブリン沈着が著しく低減した（図７Ｃ、Ｄ）。一実施形態では、ＦＶＩＩＩａを輸注することによってこの阻害効果は逆転するが、ＦＶＩＩＩでは逆転せず、このことは、ＦＶＩＩＩの活性化が、この血栓症のモデルにける律速段階であることを実証する。しかし、ＦＶＩＩＩａは、完全阻害の用量の抗ＦＸＩ ＭｏＡｂの存在下で、ここに開示される内在性経路とのＴＦ依存的な連係以外の寄与を除いて、血管の閉塞を復活させることができた（図７Ｄ）。そのため、ＦＶＩＩＩを、ｉｎ ｖｉｖｏで、生理的なＴＦＰＩ制御の下、ＴＦ依存的な外因性凝固経路によって活性化することができる。
一実施形態では、これらの結果は、ＴＦＰＩによる阻害を逃れるＴＦ媒介性のＦＶＩＩＩの活性化が、外因性ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体とアセンブリされたままの産物ＦＸａの機能であったことを説明した。このことは、ＦＸの活性化を防止するＦＶＩＩａ活性部位を遮断するＴＦＰＩ様阻害剤である線虫抗凝血タンパク質（ＮＡＰ）ｃ２の特性を活用することによって決定した。ＮＡＰｃ２がＦＸａ触媒部位に影響を及ぼさないことから、ＮＡＰｃ２により安定化されたＦＸａとＴＦと触媒的に不活性のＳｅｒ１９５Ａｌａ ＦＶＩＩａ（ｉＦＶＩＩａ）変異体との複合体が形成された。この複合体では、ＦＸａは、唯一の活性プロテアーゼであった。注目すべきことに、この複合体中のＦＸａはＦＶＩＩＩａを生成したが、同濃度の遊離のＦＸａは生成しなかった（図４Ａ）。ＮＡＰｃ２のＴＦＰＩ様複合体の形成と同様に、ＴＦＰＩは、安定化された複合体によるＦＶＩＩＩの活性化を阻害しなかったが、五糖を伴う複合体中のアンチトロンビン（図４Ａ）または他のＦＸａ阻害剤は、ＦＶＩＩＩａの形成を減少し、このことは、ＦＶＩＩＩａがＦＸａによって生成されることをさらに確定している。これらの知見は、補因子の活性化が、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体内にアセンブリされたままである可能性があるｄｅ ｎｏｖｏ生成ＦＸａによって媒介される、ＴＦ開始性の凝固中における早期のイベントであるという、新規の概念をサポートする。
一実施形態では、新生産物ＦＸａは、ＦＸａの異なる２種の薬理的な小分子阻害剤リバーロキサバンおよびアピキサバンによる阻害を逃れる。このことは、ＦＸａが生理的なＴＦＰＩチェックポイントを逃れるのと同様である。止血を保持するＦＶＩＩＩの永続的な活性化は、なぜＦＸａ阻害剤の抗血栓効能が、比較的低リスクの出血合併症に関連するのかに対する理由である可能性がある。リバーロキサバンおよびアピキサバンは、精製ＦＸａのアミド分解活性およびプロトロンビナーゼ活性の遮断において互角の効力を有し、後者については約２倍のＩＣ５０がある。治療濃度では、リバーロキサバンおよびアピキサバンは、ＴＦリン脂質表面の遊離のＦＸａによる、または安定化されたＴＦ／ｉＦＶＩＩａ／ＦＸａ／ＮＡＰｃ２複合体による、ＦＶＩＩＩの活性化を約９０％阻害した。これに対して、ＩＣ５０は、ＴＦ－ＦＶＩＩａによりｄｅ ｎｏｖｏ生成されたＦＸａによってＦＶＩＩＩが活性化された場合よりも、少なくとも１桁高かった。新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩａ生成の阻害の効率の悪さは、供試されたリバーロキサバンおよびアピキサバンの各濃度で、ＴＦＰＩ阻害的な制御の下、ＦＩＸａの存在下で、ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＶＩＩＩ依存的なトロンビン産生の維持に反映された。
実施例９
生理的な妥当性
一実施形態では、生理的な妥当性を評価するために、接触相のＦＸＩＩａを遮断するようにＣＴＩを含有するカルシウム再加ＰＲＰにおける、ＴＦ誘導性のトロンビン生成。リバーロキサバンおよびアピキサバンは、トロンビン産生を用量応答において約３倍の差で阻害した。重要なことに、これらのＦＸａ阻害剤の存在下での残りのトロンビン生成は、機能を遮断する抗ＦＶＩＩＩ抗体に対する著しい感受性を有した。これに対して、薬理的なＦＸａアンタゴニストの不在または存在下でのトロンビン生成は、ＦＸＩａまたは他のＦＸＩａ効果を通じて作動するトロンビンフィードバックループを妨げる抗ＦＸＩ抗体による影響を受けなかった。これらの結果は、全ての生理的な血液凝固阻害剤の存在下では、ＴＦ開始性のトロンビン生成の測定可能な構成成分は、ＦＶＩＩＩａに依存し、臨床用途において、少なくとも部分的には、直接的なＦＸａ阻害剤を逃れることを確定される。抗体によるＴＦＰＩの封鎖によって、ＰＲＰ中でトロンビン生成に及ぼされる抗凝血効果に必要とされるリバーロキサバンおよびアピキサバン濃度が増加した。しかし、ＴＦＰＩが機能的であるか否かに関わらず、ＦＶＩＩＩ依存的なトロンビン生成の増幅は、臨床的意義のある阻害濃度の２種の薬剤で保持された。そのため、ＴＦＰＩ制御が低減した場合でさえ、血栓形成性の環境で起こるように、新生産物ＦＸａによる動態学的に好都合なＦＶＩＩＩ活性化が、内在性凝固経路とのこの連係を通じて止血に寄与することがある。
実施例１０
新規の診断のアプローチ
一実施形態では、新しい診断のアプローチを用いてこの概念を具体化するために、本発明者らは、コラーゲンまたはＴＦで被覆された表面に沈着している血小板凝集体およびフィブリンの体積を測定した。上記表面は、被覆後に、正常な対照由来の、およびリバーロキサバンまたはワルファリンにより治療された患者由来の、カルシウム再加されたクエン酸添加血液を灌流したものであった。後者は、国際標準比（ＩＮＲ）試験によって、定期的にモニタリングした。前者は、治療ガイドラインに従う検査モニタリングを受けなかった。低いＴＦ濃度で被覆された表面では、機能を遮断する抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂは、正常な血液中のフィブリン沈着を低減したが、抗ＴＦＰＩ ＩｇＧの添加によって、フィブリンと血小板の両方の沈着へのこの阻害効果は軽減された。被覆溶液中のＴＦの増加によって、正常な血液中のＦＶＩＩＩ依存性およびＴＦＰＩの制御は消失し、このことは、この状態が、血栓形成表面がＴＦＰＩチェックポイント制御を逃れることを模倣していたことを実証する。これに対して、コラーゲンの飽和した被覆による表面では、ＦＶＩＩＩの阻害は、－固相化コラーゲンが強力な血小板作動剤であることから－血小板の凝集に影響を及ぼさなかったが、フィブリン体積の大幅な低下を引き起こし、それは抗ＴＦＰＩ ＩｇＧの存在下で変化しなかった。
一実施形態ではこのアプローチを使用して、対照および患者の血液中における血栓形成を測定してもよい。上記血液は、ＴＦＰＩ制御とは独立した外因性凝固経路によってトロンビン生成が駆動される高密度のＴＦ表面の上を、および内在性経路によって凝固が駆動される高密度のコラーゲン表面の上を、灌流される。フィブリン沈着は、ワルファリン治療患者由来の血液中、両方の表面で有意に低減した。しかし、リバーロキサバン治療患者は、フィブリン沈着が、ＴＦ表面でのワルファリン治療患者と同様に低かったが、コラーゲン上の非処理対照に比べて有意に減少しなかった。そのため、両治療は、外因性ＴＦ経路によって直接的に駆動される血栓形成を阻害するのに有効である。これに対し、ビタミンＫ依存的プロテアーゼ全てに影響を及ぼす代わりにＦＸａを標的とする薬剤は、抗凝血療法を受けている患者において出血に不可欠な部位で止血をサポートすることがあるＦＶＩＩＩ依存的なフィブリン形成を、選択的に保持する。
一実施形態では、本明細書に開示される実験結果は、新規の凝固連係（図１）をさらに説明し、そこでは、外因性ＴＦ－ＦＶＩＩａ凝固開始複合体を通じて産生された新生ＦＸａが、補因子、具体的には抗血友病ＦＶＩＩＩのフィードフォワード活性化をもたらす。最初に生成されるトロンビンに依存する古典的なフィードバック機構とは対照的に、新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化は、ＴＦＰＩチェックポイントを逃れ、ＦＸａを標的とする抗凝血剤の存在下で保持される。いくつかの実施形態で、このＦＶＩＩＩ活性化の機構、具体的にはＴＦ開始性の凝固経路内に組み込まれているものは、ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＩＸａプロテアーゼ生成と協調する様式で作動することがあり、このＴＦ－ＦＶＩＩａはまた、生理的な抗凝血物質による阻害性の制御を逃れる。いくつかの実施形態で、外因性凝固経路と内在性凝固経路との間の新規の連係はまた、血栓症の動物モデルにおいて、従来は合理的な説明が不充分であったものの実験的には明らかであった、接触相ＦＸＩＩのＴＦ依存的なフィブリン形成に及ぼす寄与をも説明する。いくつかの実施形態で、これらの結果は、どのように、古くからある経口の抗凝血剤とは全く対照的に、ＦＸａを特異的に標的とすることが、抗血友病内在性経路を通じた残りのトロンビンおよびフィブリンの生成を保持することができるのかについて、予期しない説明を提供する。このように、ここに覆いを外された概念は、新しい経口の抗凝血剤を用いて治療される患者について、血栓および出血のリスクの定義を個別化する助けとなるだけでなく、充分な止血機能を保持するとともに血栓症を阻害するための洗練されたアプローチに導く助けとなる。
実施例１１
ＦＶＩＩＩ依存的なトロンビンおよびフィブリンの形成を保持するＦＸａ阻害剤
一実施形態では、本発明者らは、ＦＸａ阻害剤がＦＶＩＩＩ依存的なトロンビンおよびフィブリンの形成保持することを見出している。一実施形態では、本発明者らは、どのようにＦＸａ選択的な抗凝血剤であるリバーロキサバン、およびビタミンＫアンタゴニストであるワルファリンが血栓形成に影響を与えるかについて、固相化された再脂質化組換えＴＦ（ｒＴＦ）の上に灌流された治療患者由来の血液中の血小板凝集体を用いて、フィブリン形成を測定することによって比較した。沈着フィブリンの体積は、抗凝血薬剤を受けている患者では非処理対照よりも著しく小さかったが、表面のｒＴＦ濃度が増加すると、リバーロキサバン治療患者ではワルファリン治療患者よりも有意に大きかった（図２Ａ）。リバーロキサバンを、薬剤摂取の２時間後の治療患者で測定された平均血漿濃度でｉｎ ｖｉｔｒｏで正常な血液に添加し、それによって、フィブリンの体積が部分的に低減したが、それ自体で中程度の阻害を生じる抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）の存在下ではほぼ完全に低減した（図２Ｂ）。先行研究では、トロンビン生成（ＴＧ）アッセイにおいて、プロテアーゼ特異的な抗凝血剤により限定的な阻害が観察されたが、一方、これらのデータでは、ＦＸａを選択的に標的とすることによって、血液中、凝固阻害剤の制御の下で、内在性凝固経路を通じたＴＦ開始性のトロンビン生成が明瞭に保持されることが示された。上記実験には内皮細胞がなかったことから、この結果はまた。リバーロキサバンが、血液と血管壁とを含む相互作用とは独立して止血を保持したことを標示した。
これらの知見を確定するために、接触相ＦＸＩＩａによるＦＸＩの活性化を遮断するように、止血に役割を持たないトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）を含有する血小板に富む血漿（ＰＲＰ）中で、ＴＧを測定した。使用された濃度では、ＣＴＩは、報告されているＦＸＩＩａの下流の凝固プロテアーゼへの効果を持たなかった。別個の２つのＦＸａアンタゴニストであるリバーロキサバンおよびアピキサバンは、ＴＦ誘導性のＴＧを阻害し、阻害剤の存在下では、残りのＴＧは、追加のＦＶＩＩＩ活性の封鎖によって大きく減少した（図３Ａ）。さらに、低いｒＴＦ濃度によって惹起されたごく僅かなＴＧ応答は、特異的抗体によるＴＦＰＩの遮断の後に、実質的に増加し、このことは、閾値濃度のＴＦによるＴＧが、血漿および／または血小板のＴＦＰＩによって調節されたことを示す（図３Ｂ）。低いＴＦは、測定可能な早期のＴＧ誘導できなかったものの、ＴＦＰＩの阻害がない場合であっても（図３Ｂ）、およびＦＩＸ欠損ＰＲＰ中でも（図３Ｃ）、観察された効果が追加のＦＩＸａを生成するＴＦ依存的なループによって引き起こされたことを除いて、ＦＩＸａの効果を増強した。
一実施形態では、不連続ＴＧアッセイにて感度の高いトロンビン基質を用いて、ＦＶＩＩａ野生型（ＷＴ）―しかし活性部位変異体ＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａ（ｉＦＶＩＩａ）ではなく―を伴うＴＦが、正常血小板で再構成されたＦＶＩＩ欠損血漿中で、初発のトロンビン生成が５分間で＜１０ｐＭであった場合でさえ、ＦＩＸａ誘導性のＴＧを増幅したことが見出された（図３Ｄ）。別の実施形態では、ｉＦＶＩＩａとともに添加されＦＩＸａが、同様の低レベルのトロンビンを産生したが、活性のＦＶＩＩａで見られたようなＴＧのバーストはなかった。一実施形態では、ＴＦ－ＦＶＩＩａは、ＰＲＰ中のＴＦＰＩ制御があるにも関わらず、トロンビンとは独立したＦＩＸａによるＴＧを増強する。ＴＦＰＩ阻害性複合体ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの認識されていない活性－おそらくはｒＴＦ製剤の配合に起因する－によるＴＧへのいかなる影響も除外するために、不活性のＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａ、ＦＸａ、およびＴＦＰＩにより予め形成された、機能的に阻害されたＴＦ複合体を供試した。ＦＸａは、この複合体中で効率良く阻害され、複合体は、ＦＶＩＩ欠損血漿中でＴＧの誘導またはＦＩＸａ依存的なＴＧの増幅をできなかった（図３Ｅ、左）。これに対して、ＴＦＰＩが線虫抗凝血タンパク質（ＮＡＰ）ｃ２によって置き換えられた同様の複合体は、やはりそれ自体ではＴＧを誘導できなかったが、ＰＲＰ中でＴＧを惹起するのに使用されたものと同様のＴＦ濃度で添加された際に、ＦＩＸａ誘導性のＴＧを著しく増強した（図３Ｅ、右）。ＴＦＰＩとは異なり、ＮＡＰｃ２は、ＦＸａの触媒機能に影響を及ぼすことなく、ＴＦ－ＦＶＩＩａをＦＸａ依存的な様式で阻害することから、これらのデータは、新生ＦＸａが、ＴＦ－ＦＶＩＩａと会合したままである一方で、生理的な血漿凝固因子および阻害剤の存在下では主要なＦＶＩＩＩアクティベーターであることを説明する。
実施例１２
新生ＦＸａを含むＴＦ－ＦＶＩＩａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩ活性化
いくつかの実施形態で、本開示は、新生ＦＸａを伴うＴＦ－ＦＶＩＩａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩ活性化に関する。様々な実施形態で、精製構成成分と主要なリン脂質表面としてｒＴＦとを用いた、ＦＶＩＩＩの活性化を試験した。一実施形態では、ＮＡＰｃ２により安定化された、唯一の活性プロテアーゼとしてのＦＸａとともに予め形成されたＴＦ－ＦＶＩＩａＳ１９５Ａ複合体は、ＦＶＩＩＩを効率良く活性化した（図４Ａ）。このＴＦＰＩ様複合体は、ＴＦＰＩによって阻害されなかったが、この複合体中のＦＸａは、ＦＶＩＩＩの活性化を防止する五糖補因子（ペンタ）を伴うアンチトロンビン（ＡＴ）などの他の巨大分子阻害剤が依然としてアクセス可能であった（図４Ａ）。精製された補因子（ＦＶおよびＦＶＩＩＩ）およびプロテアーゼ酵素原（ＦＸ、プロトロンビン）を含有する再構成された凝固反応では、ＦＩＸａによる凝固開始によって、限定的なＦＸａ産生が生じ、そのＦＸａ産生は、トロンビン－フィードバックによるＦＶＩＩＩの活性化に一致して、ダンシルアルギニンＮ－（３－エチル－１，５－ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）によって、または不活性の変異体Ｓ１９５Ａが正常なプロトロンビンと置き換えられた場合に、阻害された（図４Ｂ）。いくつかの実施形態で、活性のトロンビンがないことは、ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＸａ生成に影響を及ぼさなかった（図４Ｂ）。いくつかの実施形態で、ＴＦ－ＦＶＩＩａとＦＩＸａとの組合せは、個別の反応の和よりも多くのＦＸａを生じ、追加のＦＸａ産生は、トロンビン封鎖によって影響されなかった（図４Ｂ）。一実施形態では、このことは、新生ＦＸａを伴うＴＦ－ＦＶＩＩａが、新たに生成されたＦＶＩＩＩａを伴うＦＩＸａの活性複合体による追加のＦＸａ産生をプライミングすることができることを説明した。血漿中ＴＧアッセイでの結果に一致して、ＴＦ開始複合体によるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩ活性の生成は、ＶＷＦの存在によって影響されなかった（図４Ｃ）。
ＴＦを含有する同じリン脂質表面を用いて、本発明者らは、２００ｐＭの予め活性化されたＦＸａまたは２０ｐＭ ＦＶＩＩａ／５０ｎＭ ＦＸのどちらかが促進するＴＦ－ＦＶＩＩａによるｄｅ ｎｏｖｏのＦＸａ生成によって起こる、ＦＶＩＩＩの活性化を比較した（図４Ｄ）。阻害剤の添加がない場合、新生のまたは予め活性化されたＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化は、代替の酵素原基質であるＦＩＸと補因子であるＦＶの不在下（上のパネル）でも存在下（下のパネル）でも互角であった。しかし、予め活性化されたものでは、ＡＴおよび五糖補因子を反応に添加することによって、新生ＦＸａよりも非常に大きな用量依存的なＦＶＩＩＩａ生成の阻害が引き起こされた（図４Ｄ、Ｅ）。このように、ＴＦ－ＦＶＩＩａとともに複合体中に予め形成されたＦＸａはＡＴによる阻害を受けやすく（図４Ａ）、ｄｅ ｎｏｖｏ生成されたＦＸａは、この阻害性のチェックポイントを逃れ、このことは、ＦＶＩＩＩの活性化が、ＴＦ開始性凝固の迅速かつ好適な即時反応であることに一致する。
実施例１３
ＴＦによる内在性経路の活性化は、流れの下でのＴＧおよびフィブリン形成に充分である。
いくつかの実施形態で、ＴＦによる内在性経路の活性化は、流れの下でのＴＧおよびフィブリンの形成に充分である。一実施形態では、２種のＦＶＩＩａ変異体が特定され―Ｔ９９ＹおよびＥ１５４Ａ―これらは、ＦＸの切断のための触媒活性を保持していたが、基質のターンオ－バー速度が著しく低減していた。ＦＶＩＩａ ＷＴとは異なり、この２種の変異体は、リン脂質不含のアッセイにおいて初発のバースト後（図５Ａ）、またはリン脂質で再構成されたＴＦ中で（図５Ｂ）、ＦＸａ生成を持続できなかった。ＦＸａ生成が著しく減少したとはいえ、変異体および野生型のＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体は、反応ではＦＸの存在を必要とするＦＶＩＩＩの活性化を、互角にサポートした（図５Ｃ）。一実施形態では、血小板からの放出に起因して血漿中に様々な濃度で存在する可能性のあるＴＦＰＩαは、前掲の生理的な濃度の１０ｎＭで添加された場合であっても、ＦＶＩＩａ ＷＴまたは変異体によるＦＶＩＩＩの活性化をはっきりとは阻害しなかった（図５Ｄ）。ＦＶＩＩＩとは際だって対照的に、ＦＸの存在下、ＴＦを伴う複合体中のＦＶＩＩａ変異体は、ＦＶを活性化できなかった。そして、ＦＶＩＩａ ＷＴを伴うＦＶａの生成は、ＴＦＰＩαによって遮断された（図５Ｄ）。このように、一実施形態では、ＴＦＰＩは、ＦＶの活性化を調節した。追加の対照実験では、エビデンスが提供されなかった。ＴＦＰＩα補因子であるプロテインＳは、新生ＦＸａを伴うＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＶＩＩＩ活性化に及ぼされるＴＦＰＩによる阻害を亢進した。
いくつかの実施形態で、ＦＸａ生成不全性の両方のＦＶＩＩａ変異体は、添加されたＦＩＸａによるＦＶＩＩＩａ依存的なＦＸａ産生をサポートした（図５Ｅ）。しかし、酵素原ＦＩＸが代わりに添加された際には、ＦＶＩＩａエキソサイト変異体のＥ１５４Ａのみが、機能的なＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ複合体の形成を完全にサポートしたが、ＦＩＸ活性化能を欠損したＴ９９Ｙは、そのようにサポートしなかった（図５Ｅ）。したがって、ＦＩＸａを生成する既知の能力に加えて、ＴＦ開始複合体は、ＴＦＰＩαによる阻害性の制御の前に内在性経路の凝固を可能にする抗血友病ＦＶＩＩＩ補因子を、直接的に活性化する。
いくつかの実施形態で、特定されたＦＶＩＩａ変異体を用いて、本発明者らは、血漿阻害剤および血小板の存在下でのこの結論の妥当性を検証した。野生型および変異体のＦＶＩＩａ Ｅ１５４Ａが、洗浄済みの正常血小板を補充されたＦＶＩＩ欠損血漿に添加され、それによって、互角のレベルのトロンビンが産生された一方で、ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙは、効率が低かった（図５Ｆ、左）。ＦＶＩＩＩａ生成を阻害することによって、２種の変異体によるＴＧが本質的に遮断されたのに対し、ＷＴ ＦＶＩＩａは、残りのＴＧを産生し（図５Ｆ、中央）、このことは、ＦＸａおよびそれによるトロンビン生成を直接的に惹起する際に、ＦＶＩＩａ変異体で選択的に欠陥があったことに一致する。いくつかの実施形態で、ＦＸＩａ活性の遮断によって、ＷＴに比べて中程度の影響がＦＶＩＩａ Ｅ１５４ＡによるＴＧに生じたのに対し、ＦＶＩＩａ Ｔ９９ＹによるＴＧは著しく低減した（図５Ｆ、右）．この結果は、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの両方の活性化が、ＴＦ開始性の内在性凝固に不可欠であることを実証する。 限定的な直接のＦＸａ生成をもたらす変異体ＦＶＩＩａ Ｅ１５４Ａが、ＴＦによる内在性経路の開始をサポートする際にＦＶＩＩａ ＷＴと互角であったことは、トロンビンフィードバックが、ＴＦ惹起性の凝固の間のＦＶＩＩＩの活性化に限定的な役割を有することをさらに説明する。
一実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏの血流実験で、遊離のＦＸａのターンオ－バーが低減したＦＶＩＩａ変異体の血栓形成活性を試験した。壁せん断速度が３００ｓ－１の際にフィブリンの沈着がＦＶＩＩＩａに依存するように表面ＴＦ濃度を限定することによって、Ｅ１５４Ａ変異を持つＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩ欠損血液中に再構成された際に、ＷＴ ＦＶＩＩａと同様に軽度な血栓形成の減少をサポートしたが、Ｔ９９Ｙはサポートしないことが見出された（図６Ａ）。同じ濃度の触媒的に不活性のＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａではなく、ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙを含有する血液に２０ｐＭ ＦＩＸａを添加することによって、ＦＶＩＩＩ依存的なフィブリン形成が、ＦＶＩＩａ Ｅ１５４Ａで見られるものと互角のレベルに復活した（図６Ｂ）。このことにより、新生ＦＸａを伴うＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体が、内在性テナーゼ活性とＴＦの低い環境での止血に有益となる能力とを有するＦＶＩＩＩａを、直接的に生成したことが確定された。
いくつかの実施形態で、本明細書に記載される新規の経路を、マウスモデルで評価した。一実施形態では、マウスのＴＦ－ＦＶＩＩａは、機能的なＦＶＩＩＩａの生成をｉｎ ｖｉｔｒｏでサポートした。一実施形態では、マウスマクロファージ由来の凝血原マイクロパーティクルを生成した。次いで、この天然のＴＦの供給源を、精製構成成分を含む反応中で、ＦＶＩＩＩ活性化について分析した。種に適合しているＦＶＩＩａの存在下、ノックインヒトＴＦまたは内在性マウスＴＦのどちらかをマイクロパーティクルに組み込むことによって、リン脂質により再構成された組換えＴＦで見られるように、ＦＩＸａ依存的なＦＸａ生成が刺激された（図６Ｃ）。このように、新生ＦＸａを伴うＴＦ－ＦＶＩＩａによってサポートされる直接的なＦＶＩＩＩ活性化経路は、生物学的に関連のあるＴＦの供給源を用いて起こり、マウスに保存されている。
実施例１４
ＴＦはｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩの活性化に寄与する
本開示のいくつかの実施形態で、ＴＦは、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩ活性化に寄与する。次に、ＴＦ機能が、塩化鉄により誘導された血栓症のモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＦＶＩＩＩ活性の生成に寄与するか否かを評価した。血栓症に接触相およびＴＦ凝固経路の両方が関与することに一致して、ＴＦ機能（２１Ｅ１０など）またはＦＸＩＩａによるＦＸＩの活性化（抗ＦＸＩ １４Ｅ１１など）を遮断するＭｏＡｂを独立して投与することによって、７％（０．２６Ｍ）ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏに起因する付傷後のマウス頸動脈の閉塞が、有意に低減した（図７Ａ）。同じ濃度のＭｏＡｂは、さらに重度の８％（０．３Ｍ）塩化鉄による付傷の後、個別には無効であったが、組み合わせると顕著に抗血栓性があり、このことは、ｉｎ ｖｉｖｏでの外因性と内在性の凝固の収束を説明する。さらに高濃度の抗ＦＸＩ ＭｏＡｂのみもまた、動脈の閉塞を防止し、このことは、このモデルでは、ＦＸＩＩａ－ＦＸＩａによるＦＩＸの活性化が必須の役割を果たすことに一致する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＰＲＰ中でＴＦとＦＩＸａとの組合せによって開始される相乗的なＴＧに対する、抗ＴＦ ＭｏＡｂによる阻害は、ＦＶＩＩＩａを添加することによって逆転されたが、ＦＶＩＩＩでは逆転されず（図７Ｂ）、このことは、血漿中でのＦＶＩＩＩ活性化においてＴＦが支配的な役割を持つことを確定する。同様に、ＦＶＩＩＩａは、塩化鉄により誘導された大腿静脈の閉塞に対する、閾値下の用量の抗ＴＦ ＭｏＡｂおよび抗ＦＸＩ ＭｏＡｂの組合せによる阻害を逆転したが、ＦＶＩＩＩは逆転しなかった。しかし、ＦＶＩＩＩａは、ＦＸＩＩａ／ＦＸＩａ媒介性のＦＩＸａ生成に対する抗ＴＦ（図７Ｃ、Ｄ）不在下での完全用量の抗ＦＸＩ ＭｏＡｂによる阻害には影響を及ぼさなかった。もっともその場合、ＴＦ－ＦＶＩＩａまたは代替経路が、血栓症を惹起するために外因的に供給されるＦＶＩＩＩａを利用するのに充分な量で、ＦＩＸａを生成することができたことを除く。ＦＶＩＩＩａがＴＦによる封鎖を選択的に逆転するという知見は、ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＦＶＩＩＩの活性化を促進することが、ＴＦ－ＦＶＩＩａ外因性凝固経路の鍵となる役割であることを説明する。
実施例１５
ＴＦによる内在性経路の開始は、薬理的なＦＸａの封鎖を逃れる。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態で、ＴＦによる内在性経路の開始は、薬理的なＦＸａの封鎖を逃れる。一実施形態で、本発明者らは、臨床用途のＦＸａ阻害剤（リバーロキサバンやアピキサバンなど）が、ＴＦ凝固開始複合体によるＦＶＩＩＩの活性化を保持するか否かを評価した。両方の阻害剤が、ＦＸａのアミド分解活性およびプロトロンビナーゼ活性を互角に遮断した（図８Ａ、Ｂ）。両方とも、治療濃度、すなわち５０～４５０ｎＭの間では、遊離であるかまたはＮＡＰｃ２により安定化されたＴＦＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａ（ｉＦＶＩＩａ）を伴う複合体中にあるかのどちらかの予め活性化されたＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化を、約９０％阻害したが、ＴＦＦＶＩＩａにより生成された新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩ活性化を、ごく僅かに低減したに過ぎなかった（図８Ｃ）。後者は特異的な効果であったが、それはなぜなら、リバーロキサバンが、ＴＦ非依存的なラッセルマムシ毒（ＲＶＶ）ＦＸアクティベーターを用いて等しいレベルにｄｅ ｎｏｖｏ生成されたＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化を、阻害したためである（図８Ｄ）。さらに、治療用量のリバーロキサバンとアピキサバンの両方が、ＦＶＩＩＩを含まずＦＩＸａを含有する反応中で、ＴＦのみによって開始されたＴＧを阻害したが、ＦＶＩＩＩが添加されると、有意に多くのＴＧが保持された（図８Ｅ）。小分子阻害剤と巨大分子阻害剤の両方がＴＦ開始複合体によるＦＶＩＩＩａ生成を遮断する能力を持たないということは、抗血友病補因子ＦＶＩＩＩが新生ＦＸの好適な基質であるということを確定する。特定されたＦＶＩＩａ変異体を用いた追加の試験では、リバーロキサバン存在下でのＴＧが、ＦＶＩＩａ Ｅ１５４Ａを用いた場合にはＷＴに比べて僅かに遅れるに過ぎないことが見出され（図８Ｆ）、このことは、治療濃度のＦＸａ阻害剤の存在下での内在性経路の活性化が、ＦＩＸａを生成可能な変異体によって保持されることを実証する。これに対して、ＦＩＸ活性化欠損型のＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙを用いた場合にＥ１５４ＡおよびＷＴに比べてＴＧが有意に減少することは、ＦＸａを標的とする抗凝血剤が、ＦＸＩａ依存的なＦＩＸａ生成に繋がるトロンビンフィードバックループを阻害することができたことを標示する。
様々な実施形態で、本発明者らは、ＴＦ媒介性の内在性経路の活性化に干渉するための抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂのパネルをスクリーニングした。いくつかの実施形態で、ＭｏＡｂ ３Ｇ１２などの阻害性抗体は、ＴＦ開始複合体によるＦＶＩＩＩの活性化を防止した。他の実施形態では、巨大分子基質結合エキソサイトの近くの画定されたエピトープに反応することが公知であるＭｏＡｂ １２Ｃ７は、この反応では阻害性を示さなかった（図９Ａ）。この抗体は、ＦＶＩＩａ ＷＴによって媒介されるＦＸａのターンオ－バーを制限し、ＴＦ経路により生成されたＦＶＩＩＩａの存在下では、ＦＸａ生成の増幅にＦＩＸａを必要とした（図９Ｂ）。阻害性の抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂ ３Ｇ１２とは異なり、ＭｏＡｂ １２Ｃ７は、正常なＰＲＰ中でＴＧを保持した。しかし、ＭｏＡｂ １２Ｃ７存在下でのＦＶＩＩＩ依存的なＴＧは、抗ＦＸＩ抗体による阻害を大きく受けやすくなっていた（図９Ｃ）。これらの結果は、ＭｏＡｂ １２Ｃ７が、ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙの特性を模倣してＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＩＸａ生成を阻害することを説明する。さらに、低いリバーロキサバン濃度では、ＭｏＡｂ １２Ｃ７の存在下でさらに顕著なＴＧの阻害が生じ（図９Ｄ）、このことは、ＦＸａを標的とする抗凝血剤が、トロンビン－ＦＸＩフィードバックループを阻害するとともに、ＴＦ開始複合体による直接的なＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの活性化を選択的に保持することを確定する。
実施例１６
凝固経路
様々な実施形態で、本開示は、外因性凝固開始複合体の新規の機能を描き出し、言い換えれば、トロンビンフィードバックループとは独立した、選択的な抗血友病補因子ＦＶＩＩのフィードフォワード活性化を提供する（図１）。この新生ＦＸａの特異的な反応は、生理的な凝固阻害剤であるＴＦＰＩαおよびＡＴによる制御、ならびにＦＸａを標的とする薬理的な抗凝血剤による制御を逃れる。いくつかの実施形態で、抗血友病プロテアーゼＦＩＸを活性化するＴＦ－ＦＶＩＩａの能力と併せて、直接的なＦＶＩＩＩａ生成は、ＴＦ開始性の凝固の中に完全に組み込まれたＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａの内在性テナーゼ活性への経路を構成する。
いくつかの実施形態で、ＦＶＩＩａ変異体と線虫ＮＡＰｃ２タンパク質により安定化された複合体とを用いて実験的に明らかにされたように、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体は、内在性テナーゼに用いられるＦＶＩＩＩａ補因子を選択的に生成するが、遊離ＦＸａを阻害的な制御に曝露するＴＦ－ＦＶＩＩａからドッキング解除されたＦＸａを必要とするプロトロンビナーゼに用いられるＦＶａ補因子を生成しない。したがって、新たに特定されたＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの機能は、血栓形成促進性のＦＶａを増加することなく、活性かつ止血促進性の抗血友病補因子の蓄積を可能にする。一実施形態では、これは、なぜ、互角の抗血栓効力を有しＦＸａおよびトロンビンを標的とする阻害剤が、ビタミンＫアンタゴニストよりも小さな影響を止血に与えるのか説明することができる。上記でビタミンＫアンタゴニストとは、ＦＩＸａの利用可能性を低減して、その結果、止血性のフィブリン生成に繋がるＴＦ経路により駆動される内在性テナーゼの直接的な活性化を減じるものである。一実施形態では、そのような機構は、ＦＸＩの活性とは独立しており、それゆえ、最近検証されたＦＸＩを標的とする抗血栓ストラテジーの状況でも、止血を保持する可能性がある。
いくつかの実施形態で、補因子の選択性は、ＴＦ－ＦＶＩＩａとの複合体であるかまたはそこから放出されているＦＸａの有する、別個の機能的な特性を説明する。凝固補因子－酵素複合体は、典型的には、迅速なトロンビン生成のための効率の良い基質ターンオ－バーの方にギアを入れられるが、ＴＦ開始複合体は、進化を通じて、その安定性に有利となるような機構を保持しているようである。ＦＸは、酵素原から酵素への基質の転移による影響を最小限に受ける延伸した境界面を通じて、ＴＦ－ＦＶＩＩａと相互作用する。この境界面では、様々な種を通じて保存されているＦＶＩＩａの残基Ｅ１５４が、プロテアーゼの活性部位にドッキングしている基質に立体配座の変化を伝え、このプロテアーゼは、次の産物の放出を調節することがある。この立体配座のスイッチの排除は、ＴＦ－ＦＶＩＩａによる巨大分子基質の活性化と産物のターンオ－バーとを分離するには充分である。そのため、変異体ＦＶＩＩａのＥ１５４Ａによって、流れの下の血小板に富む血漿および全血中における、ＴＦ－ＦＶＩＩａに会合している新生ＦＸａによる直接的なＦＶＩＩＩ活性化の機能、ならびに内在性凝固を活性化するこの新規の経路のもたらすトロンビン生成および血栓形成への寄与を認識することが可能となった。
いくつかの実施形態では、ＴＦ凝固開始複合体の安定性は、凝固の活性化と先天免疫とを連係するというＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの持つ重要なシグナル伝達の役割を保持することの、進化上の利点を表す可能性がある。効率良くＦＶＩＩＩを活性化することに一致して、ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙは、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）２の活性化を媒介する際に、完全に機能性である。さらに、ＦＶＩＩＩａ生成に見られるように、ＴＦＰＩαによる機能阻害に対する抵抗性もまた、内皮細胞中でＴＦＦＶＩＩａ－ＦＸａによって誘導されるＰＡＲシグナル伝達の重要な特長である。このシグナル伝達複合体は、マウスおよびヒトでは、ＦＸａ結合パートナーである内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）の動員によって、さらに安定化される。樹状細胞は、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ－ＥＰＣＲ複合体に対し先天免疫シグナル伝達の重要な役割を有し、その際、それは、ＴＩＲドメイン含有アダプター誘導インターフェロン－β／ＴＩＲドメイン含有アダプター分子１（ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ－１）を含む応答のｔｏｌｌ様受容体４による誘導に不可欠である。いくつかの実施形態で、代替的なＥＰＣＲリガンドである活性化プロテインＣによるこの経路の負の制御は、ＦＶおよびプロテインＳの持つ古典的な抗凝血補因子機能を利用する。このように、これらのおよび他の従来になかった凝固系の機能は、多様な役割を免疫、止血、傷害修復に同時に提供する、同じ機構論の特長を利用する可能性がある。
標的選択的な経口の抗凝血剤は、ビタミンＫアンタゴニストに必要とされるように、周到な治療モニタリングを行うことなく安全であるのに対し、ここに開示される新しい概念および診断のアプローチは、これらの薬剤を用いて治療される患者について血栓および出血のリスクの定義を個別に設定することになる。本開示は、止血をサポートするかまたは血栓症に寄与する際のＴＦの別個の役割を定義するための、生化学的なベースを提供する。実際に、生理的な阻害物質から保護されている内在性経路の直接的なフィードフォワード活性化を通じて、ＴＦは、止血のためのＦＸａおよびトロンビンの生成を持続することができる一方で、ＦＸａおよびＦＶａのプロトロンビナーゼ補因子の直接的な過剰生成に起因する血栓症のリスクを制限する、ＴＦＰＩによる制御を受けやすい。血栓形成促進性の凝固経路ｖｓ止血に有利なＦＶＩＩＩ活性化を標的とする際のＦＸａ経口抗凝血剤の選択性は、ここに記載される試薬に基づく新しい診断検査によって評価することができる。一実施形態では、このことは、最近開発されたおよび将来の新しい抗凝血剤が止血および血栓症におけるＴＦの二重の役割に及ぼす効果を、選択的に査定することに繋がることがある。いくつかの実施形態で、ここに提示された凝固に関する新規の概念は、新しい止血剤の開発および評価のための潜在的な意義を有する可能性があり、このような止血剤は、血管性の基礎疾患を有する患者において、有害な血栓性の合併症を回避するとともに、重度の出血合併症からの保護を同時にもたらすことが可能である。
実施例１７
材料
対照のマウスおよびウサギのＩｇＧ、キナクリン－ＨＣｌ（メパクリン）、およびアピラーゼは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から得た。ヒトプロトロンビン（ＦＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩａ）、ＦＶ、ＦＶａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＸ、ＦＸａ、アンチトロンビン（ＡＴ）、トウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、ダンシルアルギニンＮ－（３－エチル－１，５－ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）、ラッセルマムシ毒ＦＸアクティベーター、および抗ヒトＦＶモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）ＡＨＶ－５１４６（ＦＶのＡ１－Ａ２ドメインの残基３０６～５０６に結合）は、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（エセックス・ジャンクション、バーモント州）から得た。リバーロキサバンおよびアピキサバンは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ、カリフォルニア州）から得た。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から；再脂質化されたヒト組換え組織因子（ｒＴＦ；デイドイノビン）は、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ディアフィールド、イリノイ州）から得た。製造業者が今ではイノビンのタンパク質およびリン脂質（ＰＬ）濃度を提供していないため、ＦＸａ生成アッセイを用いて、全ての使用バッチを既知のＴＦ濃度（１３．９ｎＭ）のロット（＃５３６９１）に対して較正した。アッセイは、用量応答曲線を得るための様々なｒＴＦ濃度、１００ｐＭ ＦＶＩＩａ、１３５ｎＭ ＦＸ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有し、３７℃で６０秒インキュベーションした。凝血原のＰＬ濃度は、反応中のプロトロンビナーゼ活性によって決定し、その反応は、ｒＴＦ、１２．５ｐＭ ＦＸａ、１０ｎＭ ＦＶａ、１μＭ プロトロンビン、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含み、３７℃で６０秒インキュベーションされた。８０％ホスファチジルコリン（ＰＣ）および２０％ホスファチジルセリン（ＰＳ）ｍｏｌ／ｍｏｌからなるＰＬベシクル（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、アラバスター、アラバマ州）－０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．４中で超音波処理された－を用いた較正により、参照ｒＴＦ溶液は１０１．４μＭ ＰＬを含有していた。ヒトプロテインＳ（ＰＳ）は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（サウスベンド、インディアナ州）から；ヘパリンのＡＴ結合性五糖（フォンダパリヌクス塩；アリクストラ）は、Ｇｌａｘｏ－ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｓ．ｐ．Ａ．（ヴェローナ、イタリア）から；ヒツジ抗ヒトプロトロンビン抗体は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（アンカスター、オンタリオ州）から；線虫抗凝血プロテインＣ２（ＮＡＰｃ２）は、Ｃｏｒｖａｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から得た。阻害性の抗ヒトＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂは、ＥＳＨ－８および８Ｄ４－それぞれＳｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（スタンフォード、コネチカット州）およびマーク・ジャックマン（Ｍａｒｃ Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ）博士（ルーヴェン、ベルギー）から得た－ならびに既に記載されているＣ５（５６）である。ＦＶＩＩＩは、Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（バークレー、カリフォルニア州）から寄贈された。組換えＴＦＰＩ、ヒトＦＶＩＩａ、不活性ＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａ（キモトリプシンナンバリング；ｉＦＶＩＩａ）、変異体ＦＶＩＩａ Ｔ９９ＹおよびＦＶＩＩａ Ｅ１５４Ａ、可溶性ＴＦ細胞外ドメイン（ｓＴＦ１－２１８）、および不活性のプロトロンビンＳ１９５Ａは、当技術分野に公知の通りに生産し、特性解析を行った。ＦＶＩＩＩａは、１９ｎＭトロンビンおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２の共存下で１９０ｎＭ ＦＶＩＩＩを３７℃で３０秒間インキュベーションした後、３６ｎＭレピルジン（組換え［Ｌｅｕ１－Ｔｈｒ２］－６３－ジスルホヒルジン；レフルダン、ＢａｙｅｒＣｏｒｐ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）でインキュベーションしてトロンビン活性を中和することによって調製した。
実施例１８
血液灌流実験
０．２ｍｇ／ｍＬポリ－Ｌ－リジンを用いて３７℃で６時間処理したガラスカバースリップを、ｒＴＦを用いて３７℃で１８～２０時間、または２．５ｍｇ／ｍＬ酸不溶性Ｉ型コラーゲンを用いて２２～２５℃で２時間、被覆した。次いで、それらをｐＨ７．４緩衝生理食塩水でリンスし、１２５μｍ高のシリコンガスケットの付いた矩形のフローチャンバーに取り付け、共焦点顕微鏡の解析用ステージ上に配置した。試験用の静脈血は、正常ボランティアにはプラスチックシリンジを、または患者および対照にはバキュテナーチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ブッチナスコ、ミラノ）を用いて、終濃度１０．９ｍＭのクエン酸三ナトリウム中に採集した。ＣａＣｌ２を添加して１．２９ｍＭ Ｃａ２＋を得た後に、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、ホリストン、マサチューセッツ州）を用いて初発の壁せん断速度３００ｓ－１を生じる流速で灌流を維持した。患者－凝固亢進性である可能性あり－および関連の対照の血液中、レピルジン（５０ｎＭ）も添加して、試験前に生成された可能性があるトロンビンを中和した。予備実験では、この量のレピルジンは、フローチャンバー中で、沈着フィブリンの体積に限定的な効果を及ぼした。ＷＴおよび変異体のＦＶＩＩａを用いた実験については、５０μｇ／ｍＬ ＣＴＩおよび１０Ｕ／ｍＬ（ＡＤＰａｓｅ活性）アピラーゼを含有するＯ型のクエン酸添加血液由来の細胞を、１５００ｇで７分間の遠心分離ステップの連続により、洗浄して血漿不含とした。血漿は、１回目の後、５Ｕ／ｍＬアピラーゼを含む等体積のカルシウム不含のタイロード緩衝液、ｐＨ６．５に置換し；次いで、１．２５Ｕ／ｍＬアピラーゼを含む緩衝液に置換し；最後に、ヒトＦＶＩＩ欠損血漿（Ｇｅｏｒｇｅ ＫｉｎｇＢｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ、オーバーランドパーク、カンザス州）に本来の血液の体積になるまで置換した。再構成された血液または天然の血液中の細胞の計数の結果は、９０％以内であった。実験は、ミラノ（イタリア）では、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５顕微鏡およびＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ６３×／１．４０ＮＡ油浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、ヴェッツラー、ドイツ）を用いて；ラホヤ（カリフォルニア州）では、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５Ｍ／ＬＳＭ ４１０およびＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ４０×／１．４０ＮＡ油浸対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ、オーバーコッヘン、ドイツ）を用いて、実施された。
表面上に接着または凝集している血小板は、キナクリン－ＨＣｌ（メパクリン；１０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を血液に添加することによって可視化した。沈着フィブリンは、マウスのＢ鎖に特異的なＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６標識（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）マウスモノクローナルＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ）およびヒトフィブリン（ＨＢ－８５４５；ＡＴＣＣ）を用いて可視化した。シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．）を用いて、初発の（流路が妨げられていない状態で）壁せん断速度３００ｓ－１を生じる流速で、血液を３７℃で３～５分間灌流した。これに続いて、フィブリン定量を容易に行うために緩衝液（ＤＭＥＭ）を２分間流した。定量は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５Ｍ／ＬＳＭ ４１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）およびＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ×６３／１．４０ＮＡ油浸対物レンズを用いた、共焦点ｚ切片化解析によって行った。画像解析は、ＮＩＨ画像Ｊ６４を用いて実施した。沈着フィブリンの体積は、フローチャンバー内の４つのプリセットされた位置で採集した共焦点切片から測定した。沈着した血小板およびフィブリンの総体積は、区画当たりのそれぞれの面積範囲にｚ間隔（２μｍ）を乗じた和から算出した。ヒト対象を含む全ての試験は、研究施設で認可されたプロトコールに従って実施した。
実施例１９
ヒトの天然のまたは再構成されたＰＲＰ中のＴＧの分析
ＰＲＰまたは再構成されたＰＲＰ中のＴＧは、当業者に公知の通りに評価した。天然のＰＲＰは、終濃度１２．９ｍＭ クエン酸三ナトリウム中に採集した血液から、２５℃、２５０ｇで１０分間遠心分離することによって調製した。ＰＲＰを１，５００ｇで１０分間遠心分離することによって得た相同なＰＰＰを用いて希釈することによって、血小板数を１８０×１０３／μＬに調整した。ＦＸＩＩａによる阻害により査定して較正された効力を基準に、３０～５０μｇ／ｍＬでＣＴＩを添加した。再構成されたＰＲＰを、洗浄済みの血小板を用いて調製した。この血小板は、正常なＰＲＰから、１／５体積の酸性クエン酸デキストロース（７１ｍＭクエン酸、８５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１１１ｍＭデキストロース、ｐＨ４．５）および５Ｕ／ｍｌアピラーゼを添加し；続いて２５℃、１，５００ｇで１０分間遠心分離することによって調製された。血小板ペレットを、ＦＶＩＩ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ）またはＦＩＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を欠失したＰＰＰ中に再懸濁して、最終血小板数１８０・１０３／μＬを得た。ＰＲＰを、９６穴マイクロタイタープレート中で様々な濃度のｒＴＦおよび／または２０ｐＭ ＦＩＸａと混合した。３６０μＭの発光発生基７－アミド－４－メチルクマリン（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ；Ｂａｃｈｅｍ Ａｍｅｒｉｃａｓ、トーランス、カリフォルニア州）にカップリングされたトロンビン基質ベンジルオキシカルボニル－グリシル－グリシル－Ｌ－アルギニンを含む、１８ｍＭ ＣａＣｌ２を添加することによって、この反応を開始した。蛍光を、分光蛍光光度計にて、３７℃で４０分間まで継続的に測定した（３５５／４６０ｎｍ励起／放出）。時間の関数としての蛍光強度の増加率（ｄＦ／ｄｔ）を、Ｔｕｒｂｏ Ｄｅｌｐｈｉ２００６（Ｂｏｒｌａｎｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オースティン、テキサス州）を用いて算出し、較正曲線を用いてトロンビン当量濃度（ｎＭ）に変換した。試料の内在性トロンビン生成能（ＥＴＰ）、すなわち総生成トロンビン活性を、ＴＧ曲線下の面積から決定した。指定の場合には、ＴＧは、不連続２段階アッセイを用いて、検出限界５ｐＭで測定した。このために、４００ｐＭ ＷＴ ＦＶＩＩａまたはｉＦＶＩＩａの存在下、２０ｐＭ ＦＩＸａの不在または存在下で、３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩを含んで再構成されたＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中、０．１５ｐＭ ｒＴＦおよび１８ｍＭ ＣａＣｌ２によって、ＴＧを誘導した。３７℃で１１分間までのインキュベーション後、２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって反応を終了し、高感度のトロンビン基質Ｈ－Ｄ－ＣＨＡ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＭＣ・２ＡｃＯＨ（ＰｅｆａｆｌｕｏｒＴＨ，Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，バーゼル、スイス）を５０μＭ濃度で用いて、生成トロンビンを測定した。他の実験では、ＴＦｉＦＶＩＩａ－ＦＸａ－ＴＦＰＩまたはＴＦ－ｉＦＶＩＩａ－ＦＸａ－ＮＡＰｃ２によって、ＴＧを誘導した。これらの安定な複合体を、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、５ｎＭ Ｆｘａ、１０ｎＭ ＴＦ、１０ｎＭ ｉＦＶＩＩａ、および４０ｎＭ ＴＦＰＩまたはＮＡＰｃ２を、３７℃で２分間インキュベーションすることによって予め形成した。複合体をＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中に添加した後、３７℃で８分間インキュベーションした。
実施例２０
ウェスタンブロット（ＷＢ）によるＦＶＩＩＩおよびＦＶの活性化の分析
凝固反応の産物を、還元ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離したが、抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂの存在下でのＦＶＩＩＩの活性化の分析のみ、非還元条件下で実施した。ポリフッ化ビニルピロリドン膜に転写した後、ＦＶＩＩＩの活性化についてはビオチン化があるかまたはないＭｏＡｂ Ｃ５（０．５μｇ／ｍＬ）を用いて；ＦＶについてはＭｏＡｂ ＡＨＶ－５１４６（１μｇ／ｍＬ）を用いて、ブロットをプロービングした。ＦＶＩＩＩａおよびＦＶａの定量的な赤外線検出を、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷコンジュゲート抗マウスＩｇＧまたはストレプトアビジンを用いて得た後、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像装置（Ｌｉ－ＣＯＲ、リンカーン、ネブラスカ州）を用いて解析した。既知のＦＶＩＩＩａおよびＦＶａの量を用いた較正によって、濃度を算出した。
実施例２１
精製構成成分を用いた反応中の凝固の活性化
合成の反応混合物は、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、１３５ｎＭ ＦＸ、１μＭプロトロンビンから構成された。凝固阻害剤であるＴＦＰＩ、ＰＳ、ＡＴ／五糖、ＮＡＰｃ２、および直接的なＦＸａ阻害剤（リバーロキサバンやアピキサバンなど）を、標示された濃度で添加した。トロンビン効果を防止するための反応を、２００ｎＭレピルジンまたは４μＭ ＤＡＰＡの存在下で実施した。０．６から４００ｐＭのｒＴＦ、２００から５００ｐＭのＦＶＩＩａまたは／および１０ｎＭ ＦＩＸａを添加することによって反応を開始し、続いて２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を添加し、標示された時間の間、３７℃でインキュベーションした。次いで、１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加して、反応をクエンチした。ＦＸａ、ＦＩＩａ、およびトロンビンの生成を、発色基質Ｓ－２７６５（１８０μＭ；Ｎ－α－ベンジルオキシカルボニル－Ｄ－アルギニル－Ｌ－グリシル－Ｌ－アルギニン－ｐ－ニトロアニリン；ＤｉａＰｈａｒｍａ、ウェストチェスター、オハイオ州）および発光発生基質Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（３６０μＭ）それぞれに対するアミド分解活性を測定することによって評価した。
０．２μｇ／ｍＬ ＤＳ、１００ｎＭ ＨＭＷＫ、３０ｎＭ ＦＸＩ、５０μＭ ＺｎＣｌ２、９０ｎＭ ＦＩＸ、１３５ｎＭ ＦＸ、７００ｐＭ ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａ、１８ｎＭ ＶＷＦ、２０μＭ ＰＬ、および２．５ｍＭＣａＣｌ２を含む反応中に、０．６ｐＭ ＴＦ／２００ｐＭ ＦＶＩＩａの不在または存在下でＦＸＩＩａ（５００ｐＭ）を添加することによって、接触相のＦＸａの生成を試験した。ＤＡＰＡならびにＦＶＩＩＩおよびＦＶの活性化の存在下でのＦＩＩａの生成を、下記に記載されるようなウェスタンブロッティング（ＷＢ）により決定した。ＮＡＰｃ２（５または４０ｎＭ）をｉＦＶＩＩａ（１００または２００ｐＭ）、ＦＸａ（１００または２００ｐＭ）およびｒＴＦ（５０または４００ｐＭ）と混合することによって、外因性経路活性化複合体（ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ）を安定化した。ＦＸａのプロトロンビナーゼ活性は、１０ｎＭ ＦＶａ、１μＭ ＦＩＩ、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する、標示されたインキュベーション時間の３７℃の反応中で測定した。リバーロキサバンおよびアピキサバンの抗ＦＸａ活性を、アミド分解活性またはプロトロンビナーゼ活性の阻害として測定した。ＦＸａのアミド分解活性の阻害を測定するために、１ｎＭ ＦＸａを様々な阻害剤濃度と発色基質Ｓ－２７６５（３６０μＭ）と混合し；４０５ｎｍでの（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダー中３７℃で１０分間まで継続的に測定した。ＦＸａのアミド分解活性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて算出したＯＤ／分曲線の傾きから決定した。ＦＸａのプロトロンビナーゼ活性の阻害を測定するために、５０ｐＭ ＦＸａを、５０ｐＭ ｒＴＦ、３ｎＭ ＦＶａ、および１μＭ ＦＩＩとともに３７℃でインキュベーションした。４分後、１０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて反応をクエンチし、発光発生基質Ｚ－ＧＧＲ－ＡＭＣを用いて生成ＦＩＩａを決定した。両阻害剤について半分の最大阻害性を示す濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて決定した。
トロンビン活性を遮断するために、４μＭ ＤＡＰの存在下で、または不活性のＳ１９５ＡをＷＴプロトロンビンと置き換えて、反応を実施した。いくつかの実験では、プロトロンビンを反応から省略し、２００ｎＭレピルジンを添加して、混入した可能性のあるトロンビンを不活性化した。ｄｅ ｎｏｖｏ生成されたＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化にリバーロキサバンおよびアピキサバンが及ぼす影響も検討し、この検討は、５０ｐＭ ｒＴＦをリン脂質表面として含有するがＦＶＩＩａを含まず１０ｎＭ ＴＦＰＩを含む反応に、ラッセルマムシ毒ＦＸアクティベーター（１３．５ｐＭ）を添加した後、ＦＶＩＩＩａのＷＢを行うことによった。唯一の活性プロテアーゼとしてＦＸａを含む安定な複合体は、５０ｐＭ ｒＴＦ、１００ｐＭ ＦＶＩＩａ－Ｓ１９５Ａ（ｉＦＶＩＩａ）、１００ｐＭ ＦＸａおよび５ｎＭ ＮＡＰｃ２を用い、３７℃で１２０秒間インキュベーションして調製した。この複合体によるＦＶＩＩＩの活性化は、ＦＶＩＩＩ、ＦＶ、およびレピルジンを１２０秒インキュベーションした反応中で検討した。
リン脂質を含まず１０ｎＭ ＦＶＩＩａ、２μＭ ｓＴＦ１－２１８、および１μＭ ＦＸを含む反応中、ＦＸａ生成をモニタリングすることによって、ＴＦ－ＦＶＩＩａによる基質のターンオ－バーを評価した。リバーロキサバンまたはアピキサバンによるＦＸａアミド分解活性の阻害を、１ｎＭ ＦＸａを様々な阻害剤濃度と発色基質Ｓ－２７６５（３６０μＭ）と混合することによって測定した。すなわち、４０５ｎｍでのＯＤを、マイクロプレートリーダー．中、３７℃で１０分間まで継続的に測定した。ＦＸａのアミド分解活性を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて算出された時間の関数としてのＯＤ変化の傾きから決定した。プロトロンビナーゼ活性の阻害は、リン脂質表面として５０ｐＭ ｒＴＦと、３ｎＭ ＦＶａおよび１μＭプロトロンビンとともに５０ｐＭＦＸａを３７℃でインキュベーションし；２４０秒後、１０Ｍｍ ＥＤＴＡを用いて反応をクエンチし、発光発生基質Ｚ－ＧＧＲ－ＡＭＣ（３６０μＭ）を用いて生成トロンビンを定量することによって、測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて対応の阻害性の用量応答曲線をフィッティングさせることによって、各基質について、半分の最大阻害性を示す濃度（ＩＣ５０）を決定した。
実施例２２
マウスにおける塩化鉄により誘導された血栓症
全ての動物の処置は、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）を満たし、スクリプス研究所のＩＡＣＵＣによって承認された。１滴の０．８μＬの７％（０．２６Ｍ）または８％（０．３０Ｍ）のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを頸動脈に３分間；または０．４μＬの４％（０．１５Ｍ）液滴を大腿静脈に１分間用いた後に、リンスすることによって、血管の傷害をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに誘導した。
頸動脈血栓症は、２つのパラメーターによって記載される。それらはすなわち、１）動脈中の血流が０．１ｍＬ／分以下に低下する時間として定義される、最初の閉塞までの時間；および２）傷害後３０分間に動脈を通って流れる総血液体積（１秒毎にサンプリングされた血流の体積測定から積分される）と対応の非傷害の動脈の体積（傷害前に１分間にわたって測定された流量から算出される）との間の比として定義される、流動指数（ＦＩ）であり；それゆえ、ＦＩ＝１は、流量に変化がないことを標示する。静脈血栓症は、傷害された血管中、リアルタイムに、落射蛍光ビデオ顕微鏡ベースの血小板凝集体およびフィブリンの形成の評価によって査定された。カルセインレッド－オレンジを用いて標識した洗浄済みの血小板（２×１０６／ｇ体重）を、マウス頸静脈に注射した後、血管の傷を構築した。フルオレセインイソチオシアネート標識抗フィブリン抗体（０．８μｇ／ｇ体重）を標識化血小板懸濁液とともに注射することによって、フィブリンを可視化した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、蛍光性の血小板凝集体およびフィブリンについて選択画像上の画素密度を統合して測定することによって、血栓のサイズを定量的に査定した。
ＴＦまたはＦＸＩに対する抗体を、カテーテル挿管された頸静脈内に、標示された量のボーラス注射によって投与した。ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩａを、ボーラス注射（１．４ｐｍｏｌｅｓ）によって投与した後、０．４７ｐｍｏｌｅｓ／分の速度の継続的な輸注を１５分間維持した。傷害の開始後の最初の閉塞までの時間とは、非傷害の動脈で最初に測定された値の１０％未満にまで血流が減少するのに必要な時間である。流動指数とは、傷害後に動脈を通って流れる総血液体積（ｍＬ／分で測定された流量および３０分間毎秒サンプリングされた流量の積分）と、非傷害の動脈における流量の期待値（傷害前の１分間に測定される流量に３０を乗じて算出される）との比である。
実施例２３
統計解析
統計解析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ、ラホヤ、カリフォルニア州）およびＸＬＳＴＡＴ（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、パリ、フランス）を使用した。等分散性は、ルビーンの中央値およびバートレット検定を用いて評価した。群間の多重比較には、一元ＡＮＯＶＡを使用し、等分散性に必要な場合はｙ＝ｌｏｇ１０ｙデータを転換した後にそれを行い、続いて、テューキー検定もしくはダネット検定を行うか；またはクラスカル－ウォリス・ノンパラメトリック検定に続いてダン検定を行った。いくつかの実施形態で、この開示に示されるデータは、標示された数の実験値の標準誤差（ＳＥＭ）を伴う平均値である。
実施例２４
ヒト血小板に富む血漿（ＰＲＰ）または再構成されたＰＲＰにおけるトロンビン生成
ＰＲＰは、クエン酸三ナトリウム中（終濃度０．０１２９Ｍ）に採集した血液から、２５℃、２５０ｇで１０分間遠心分離することによって調製した。ＰＲＰを１，５００ｇで追加的に１０分間遠心分離することによって得た相同な血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）を用いて希釈することによって、血小板数をμＬ当たり１８０・１０３に調整した。標示されている場合には、ＦＸＩＩａによる阻害により測定して較正された効力を基準に、３０から５０μｇ／ｍＬでＣＴＩを添加した。ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ（どちらもＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ、オーバーランドパーク、カンザス州から入手）かまたはＦＩＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を欠いたＰＰＰ（ＣＴＩを含むかまたは含まない）中に、洗浄済みの正常血小板を添加することによって、再構成されたＰＲＰを調製した。ＰＲＰ中のＴＦＩＩａ生成は、Ｈｅｍｋｅｒ ｅｔ ａｌ．に記載されているように測定した。５３μＬのＰＲＰを、９６穴マイクロタイタープレート中、標示された終濃度を達成するようにｒＴＦおよび／または内在性凝固経路プロテアーゼ－ＦＸＩＩａ、ＦＸＩａ、またはＦＩＸａ－のうち１つを含有する１５μＬの溶液と混合した。抗体または阻害剤も、この時点で、各特定の場合について標示された濃度で添加した。１５と２０μＬの間の１００ｍＭ ＣａＣｌ２および２ｍＭ発光発生基質ベンジルオキシカルボニル－グリシル－グリシル－Ｌ－アルギニン－７－アミド－４－メチルクマリン（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ；Ｂａｃｈｅｍ Ａｍｅｒｉｃａｓ、トーランス、カリフォルニア州）を添加することによって、反応を開始した。阻害性の抗ＴＦＰＩポリクローナル抗体または対照のウサギＩｇＧ（２０μｇ／ｍＬ）の存在下、リン脂質ベシクル（５μＭ）を添加したＰＰＰ中での、ＦＩＩａ生成も検討した。反応中に発達した相対蛍光強度を、分光蛍光光度計にて、３７℃で４０分間まで継続的に測定した（励起３５５ｎｍおよび放出４６０ｎｍ）。時間の関数としての蛍光強度速度の増加（ｄＦ／ｄｔ）を、プログラムＴｕｒｂｏ Ｄｅｌｐｈｉ２００６（Ｂｏｒｌａｎｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オースティン、テキサス州）を用いて算出し、較正曲線を用いてトロンビン当量濃度（ｎＭ）に変換した。ＦＩＩａ生成は、遅延時間（３ｎＭ トロンビンが形成されるまでの時間）および内在性トロンビン生成能（ＥＴＰ；トロンビン生成経時曲線下の面積から決定した総生成トロンビン活性）を決定することによって表現した。
実施例２５
ＦＩＩ、ＦＶＩＩＩ、およびＦＶの活性化のウェスタンブロッティング分析
ウェスタンブロッティング（ＷＢ）分析用の試料は、まず、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および５１２ｎＭ ２－メルカプトエタノールの存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供した。ポリフッ化ビニルピロリドン膜に転写した後、抗ヒトＦＩＩヒツジポリクローナル抗体（０．５μｇ／ｍＬ）、抗ＦＶＩＩＩＭｏＡｂ Ｃ５（０．５μｇ／ｍＬ）、または抗ＦＶ ＭｏＡｂ ＡＨＶ－５１４６（２μｇ／ｍＬ）を用いて、タンパク質のバンドを露出させた。ＦＩＩの活性化断片を、ビオチン化抗ヒツジＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、イリノイ州）および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ニューヨーク州）を用いた化学発光によって検出した。ＦＶＩＩＩａおよびＦＶａの定量的な赤外線（ＩＲ）検出には、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｌｉ－ＣＯＲ、リンカーン、ネブラスカ州）を使用した後、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像装置（Ｌｉ－ＣＯＲ）を用いて解析した。既知のＦＶＩＩＩａおよびＦＶａの量を用いた得た較正曲線によって、値を導き出した。
実施例２６
ＦＸａのユニークな機能
いくつかの実施形態で、本明細書に示される開示は、補因子ＶＩＩＩの活性化をサポートする際のＴＦ－ＦＶＩＩａ由来のＦＸａのユニークな機能を実証する、２つの重要なエビデンスの筋道を提供する。いくつかの実施形態で、エビデンスの第１の筋道では、ＴＦ－ＦＶＩＩａは、生理的なＴＦＰＩ抗凝血剤またはリバーロキサバンなどの薬理的な直接的ＦＸａ阻害剤の有意な影響を受けることなく、ＦＶＩＩＩａを順次生成するＦＸａを生成することができる。しかし、哺乳動物のＡＤＡＭ様重鎖および２つのレクチン様軽鎖を有するヘテロ三量体のメタロプロテイナーゼであるラッセルマムシ毒ＦＸアクティベーター（ＲＶＶ－Ｘ）は、ＦＸａを生成できない。いくつかの実施形態では、ＴＦＰＩおよびリバーロキサバンが組合せで存在する際であっても－後者は４５０ｎＭの高さの濃度である－、ＦＶＩＩａによるＴＦ媒介性凝固が開始された際には実質的なＦＶＩＩＩａ生成があるが、開始物質がＲＶＶ－Ｘである際には実質的な阻害があった。いくつかの実施形態で、生成トロンビンによってＦＶＩＩＩの活性化に及ぼされるいかなるフィードバックも排除するために、全ての反応は、強力なトロンビン阻害剤であるレピルジンを含有していた。いくつかの実施形態で、これらの知見によって、既知のＦＸａ自体による直接的なＦＶＩＩＩの活性化とは別個に、外因性凝固開始複合体（ＴＦ－ＦＶＩＩａ）に会合している新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩ活性化機能を特定することの、さらに実験的なサポートが提供された。
いくつかの実施形態で、この概念は、ＦＶＩＩａ中の単一の点変異が、ＷＴ種に比べて外因性ＴＦ－ＦＶＩＩａテナーゼ複合体による直接的なＦＸａ生成を消失させるとともに、新生ＦＸａおよびそれゆえの内在性テナーゼ活性によるＴＦ－ＦＶＩＩａ依存的なＦＶＩＩＩの活性化を保持することができるという、第２のエビデンスの筋道によって強化される。
いくつかの実施形態で、本明細書に示される開示は、ＦＶＩＩＩａ生成に繋がる会合しているＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体によって誘導される、新生ＦＸａの新たに特定された機能について、構造的および生化学的な基礎を確立する。いくつかの実施形態で、この新しい機能は、プロトロンビナーゼ複合体内に組み込まれてゆくＦＸａを生成する、一般に認識される外因性テナーゼ活性とは別個である。この機能は、止血に不可欠な抗血友病ＦＶＩＩＩに厳密に依存する内在性テナーゼ活性を作動させることから、初めてここにその機構論の詳細にて定義されるＴＦ開始性の止血ループを構成する。
実施例２７
定量的な測定
いくつかの実施形態で、この開示は、ベースライン条件下または抗凝血および／もしくは抗血栓治療の間に、個々の血液試料中の血栓形成促進能および止血効率を別個に定量的に測定することを可能にする。いくつかの実施形態で、本明細書に開示されるのは、血栓症を誘導するリスクを減少した治療用途のための、新しい止血促進性の分子を特定するための方法である（すなわち、内在性テナーゼを通じてＴＦ開始性の止血ループのサポートを保持するが直接的なＦＸａ生成を減少した改変型ＦＶＩＩａ分子）。
止血は、大出血を阻止することおよび自然発生の出血を防止することが不可欠であることが、通例知られている。血液凝固は、止血を持続する際に中心的な役割を果たす。血液凝固では、因子（Ｆ）ＶＩＩＩは、内在性凝固プロテアーゼであるＦＩＸａに不可欠な補因子として機能する。その活性形態（ＦＶＩＩＩａ）に活性化されると、ＦＶＩＩＩａはＦＩＸａに結合し、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体は、ＦＸａ生成を促進することによって、トロンビン（ＦＩＩａ）生成を増幅する。最終的に、生成されたＦＩＩａは、フィブリノーゲンを安定なフィブリン凝塊に変換し、止血に繋げる。この概念の裏付けとして、ＦＶＩＩＩの先天性の欠損症（血友病Ａ）は、重度の、時には命に関わる、出血のエピソードに関連する。血友病患者は、血漿中のＦＶＩＩＩ凝血活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）に基づき３つのカテゴリー：重度（＜１ＩＵ／ｄＬ ＦＶＩＩＩ：Ｃ）、中等度（１－５ＩＵ／ｄＬ）、および軽度（＞５ＩＵ／ｄＬ）に分類されている。ＦＶＩＩＩ：Ｃは、現在では、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）などの凝固ベースのアッセイによって決定される。従来の凝固アッセイは、患者の大まかな分類には有用であるが、そのように分類される重度の症例間では、臨床的な表現型の大幅な不均一性がある。これは、現行の凝固ベースＦＶＩＩＩアッセイの低感度が、約１～０．１ＩＵ／ｄＬのＦＶＩＩＩ：Ｃレベルに起因する重度の出血リスクから中等度を区別するには不充分であるためである。
実施例２８
新規のアッセイ
いくつかの実施形態で、高感度を有し、患者で中等度と重度との出血リスクの間を区別することが可能な新規のアッセイが、本明細書に開示されている。いくつかの実施形態で、本明細書に記載されるアッセイによって、さらに詳細な患者の分類、出血リスクの正確な予測、およびＦＶＩＩＩの予防的または治療的な輸注との連関が可能になる。いくつかの実施形態で、開示されるアッセイの感度は、現在利用可能な方法の１０倍までの大きさである。他の実施形態では、開示されるアッセイの感度は、現在利用可能な方法の１０倍を超える大きさである。
本明細書に開示される新規のＦＶＩＩＩ活性化機構に基づき、新しいアッセイが記載される。このアッセイのいくつかの実施形態で、極端に低い濃度（例えば、ピコモル濃度）の再脂質化ＴＦおよびＦＩＸａ（ピコモル濃度またはナノモル濃度）を組み合わせて患者血漿中に添加することによって、ＴＧが惹起される。いくつかの実施形態で、ＴＦまたはＦＩＸａの個別の添加では、それぞれＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）による制御および緩やかな反応があるために、血友病Ａ患者の血漿中には有意なＦＩＩａが生成しない。他の実施形態では、２種の凝固開始物質を個々に不活性な濃度で組み合わせて添加することによって、ＴＧが相乗的に増幅された（図１０）。いくつかの実施形態で、血漿中の相乗効果の機構の関する生化学的な研究では、ＴＦがＦＶＩＩａおよびＦＸと複合体を形成し、その複合体では、後者はＦＸａに活性化され、ＦＸａは、ＴＦ－ＦＶＩＩａに結合されたままＴＦＰＩ阻害から保護されるとともに（それゆえに遊離ＦＸａに比べて異なる機構を用いて）ＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩａに活性化し、ＦＶＩＩＩａは順次にＦＩＸａに結合してＦＸａ生成およびＴＧを増幅する。いくつかの実施形態で、本明細書に開示される新規のＴＧ方法によって、血漿中の非常に低いＦＶＩＩＩレベルの検出が可能になり、それは、ＦＶＩＩＩによりスパイクされた血友病Ａ患者血漿のアッセイにより検出限界０．０７ＩＵ／ｄＬ ＦＶＩＩＩ：Ｃに示される通りである（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。このように、一実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＴＦ駆動性のＦＶＩＩＩの活性化と、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体によって誘導されるＴＧとを、特異的に決定する。
いくつかの実施形態で、本明細書に提供されるのは、重度の血友病Ａ患者および後天性のＦＶＩＩＩ欠乏症の個体で低レベルのＦＶＩＩＩ：Ｃを決定するための感度の高い方法である。いくつかの実施形態で、本明細書に提供されるのは、重度の血友病Ａ患者でさらに正確な出血の表現型の特徴付けと出血リスクの予測を可能にして、それによってＦＶＩＩＩ産物を用いた補充療法を改善する、新規のアッセイである。
いくつかの実施形態で、本明細書に開示される新規のアッセイは、ＦＶＩＩＩ濃縮物を用いた治療のモニタリングおよび濃縮物の効力の査定に有用である。他の実施形態では、本アッセイは、機能性が向上しおよび／もしくは安定性が増加したＦＶＩＩＩバリアント特定するために、ならびに／または血友病Ａ治療のための効能および安全性が向上した新規の止血剤をスクリーニングするために、利用される。
実施例２９
因子ＦＶＩＩａの変異体
いくつかの実施形態で、補因子ＶＩＩＩの活性化に関する新規の機構をサポートするさらに別のエビデンスが、２種のＦＶＩＩａ変異体Ｔ９９ＹおよびＥ１５４Ａの特徴を明らかにすることによって得られた。どちらもＦＸを切断するための触媒活性を保持するが、野生型（ＷＴ）のＦＶＩＩａに比べて基質のターンオ－バー速度が顕著に遅く、そのため、最初のバースト後にＦＸａ生成を持続することができない。いくつかの実施形態で、ＦＸａ生成が顕著に減少していたにも関わらず、変異体および野生型のＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体は、互角にＦＸａ依存的なＦＶＩＩＩの活性化をサポートした。いくつかの実施形態で、同じ条件下で、２種の変異体は、ＷＴ ＦＶＩＩａとは異なり、ＦＶＩＩＩに高度に相同なＦＶプロトロンビナーゼプロ補因子を活性化することができなかった。いくつかの実施形態で、直接的なＦＸａ生成を大きく損なっているにも関わらず、ＦＶＩＩａ変異体はどちらも、添加されたＦＩＸａの存在下で、ＷＴと同等に効率良くＦＶＩＩＩａ依存的なＦＸａ産生をサポートした。いくつかの実施形態で、これらの結果は、ＦＸａ生成をＴＦ－ＦＶＩＩａ外因性テナーゼ複合体によって直接的に遮断できることを示す。いくつかの実施形態で、これは、新生のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａが止血促進性の抗血友病ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ複合体を活性化する本明細書に開示の経路に干渉することなく、血栓促進性のトロンビンを生成する。
いくつかの実施形態で、本明細書に開示されるのは、ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体内の新生ＦＸａに関する、新規のＦＶＩＩＩａの生じる機能についての生化学的な基礎であり、この基礎は、プロトロンビナーゼ複合体中に組み込まれるように外因性テナーゼから放出される遊離のＦＸａのものとは別個のものである。いくつかの実施形態で、止血に不可欠な抗血友病ＦＶＩＩＩに厳密に依存する内在性テナーゼ活性を作動させるこの新規の機能は、初めてここにその機構論の詳細にて定義されるＴＦ開始性の止血ループを構成する。
いくつかの実施形態で、２種のＦＶＩＩａ変異体の間の違いが、ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体の公知の機能であるＦＩＸをＦＩＸａに変換する能力にある。いくつかの実施形態で、Ｔ９９ＹおよびＥ１５４のＦＶＩＩａは、新生ＦＸａ産物によるＦＶＩＩＩの活性化をサポートする互角の能力を有する。そのため、両変異体ならびにＷＴのＦＶＩＩａは、添加されたＦＩＸａによるＦＶＩＩＩａ依存的なＦＸａ産生をサポートした。いくつかの実施形態で、酵素原であるＦＩＸが代わりに添加された際に、ＦＶＩＩａエキソサイト変異体であるＥ１５４Ａのみが、ＦＸａ生成に繋がる機能的なＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ複合体の形成をサポートしたが、Ｔ９９Ｙはサポートしなかった。
いくつかの実施形態で、２種のＦＶＩＩａ変異体を使用して、生理的な凝固阻害剤を含む血小板に富む血漿（ＰＲＰ）の状況下で、トロンビン生成について、ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＩＸのＦＩＸａへの変換の重要性を評価した。そのため、洗浄済みの正常な血小板を補充したＦＶＩＩ欠損血漿にＦＶＩＩａを添加することによって、ＷＴまたはＥ１５４ＡのＦＶＩＩａが、互角のレベルのトロンビンを産生するが、Ｔ９９Ｙ ＦＶＩＩａは、それより効率が低いことが見出された（図５Ｆ）。いくつかの実施形態で、ＦＶＩＩＩａ生成を阻害することによって、２種の変異体によるＴＧが遮断されたのに対し、ＷＴ ＦＶＩＩａは残りのＴＧを産生した（図５）。このことは、ＦＸａとそれゆえの直接的なトロンビン生成とを惹起する際の、ＦＶＩＩａ変異体の選択的な欠陥に一致する。いくつかの実施形態で、ＦＸＩａ活性を遮断することによって、ＷＴに比べてＦＶＩＩａ Ｅ１５４ＡによるＴＧに中程度の効果が及ぼされるのに対し、ＦＶＩＩａ Ｔ９９ＹによるＴＧは顕著に低減される（図５）。いくつかの実施形態で、これらの結果は、ＦＶＩＩＩとＦＩＸの両方の活性化が、ＴＦ開始性の内在性の凝固に不可欠であることを実証する。いくつかの実施形態で、直接的なＦＸａ生成が制限された変異体ＦＶＩＩａＥ１５４Ａが、ＴＦによる内在性経路の開始をサポートする際にＦＶＩＩａ ＷＴと互角であるということは、トロンビンフィードバックがＴＦ惹起性の凝固の間のＦＶＩＩＩの活性化において限定的な役割を有するという概念を補強するものである。
一実施形態では、変異体Ｅ１５４Ａは、ＦＩＸａ生成に対するＴＦ－ＦＶＩＩａまたはＦＸＩａ－トロンビンフィードバックループの相対的寄与を測定することを可能にする。ここでＦＩＸａは、補因子としてＦＶＩＩＩａと組み合わさって内在性テナーゼ複合体を形成するプロテアーゼであり、この複合体は、ＦＸをＦＸａに活性化して、ＴＦ－ＦＶＩＩａによる直接的なＦＸａ生成の生理的な阻害剤であるＴＦＰＩの制御を逃れる。また、これは、止血促進反応ｖｓ．血栓促進反応の区別に適切である。一実施形態では、本明細書に開示されるアッセイは、新生のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａを通じたＦＶＩＩＩａ生成に起因する止血促進機構の保持を定量的に査定することができる。
一実施形態では、ＦＶＩＩａの変異体Ｅ１５４Ａを、プロトロンビナーゼのアセンブリのための生成ＦＸａを放出できないことによって引き起こされるＦＸａ生成の直接的な経路を研究する際に使用した。驚くべきことに、そうであるにも関わらず、Ｅ１５４Ａ変異体は、複合体ＴＦ－ＦＶＩＩａ１５４Ａ－ＦＸａ中の新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩａ生成をサポートすることができた。ＦＶＩＩａの他の変異体の形態は、同様の効果を持つ可能性があることが想定される。このアッセイのフォーマットには、ＦＶＩＩａ Ｙ７６Ｆ変異体と同様の効果を生じる抗ＦＶＩＩａモノクローナル抗体１２Ｃ７の特性を含めることができた。後者は、プロトロンビナーゼ活性を最小限サポートする点で、新生ＦＸａによる止血促進性のＦＶＩＩＩの活性化の機構を保持するＦＶＩＩａ Ｅ１５４Ａと類似するが、さらに、ＦＶＩＩａがＦＩＸをＦＩＸａに活性化する能力を失う原因となる。このことにより、血栓形成促進性となる可能性のあるトロンビン－ＦＸＩループによってサポートされるＦＩＸａ生成の経路を、ＦＶＩＩＩの活性化を伴うＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体中に組み込まれるＴＦ－ＦＶＩＩａによってサポートされるものと区別することが可能になる。それゆえ、１２Ｃ７のような抗体の使用に基づくアッセイは、保護されるべきものである。
実施例３０
抗ＦＶＩＩａモノクローナル抗体のスクリーニング
いくつかの実施形態で、抗ＦＶＩＩａモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）のパネルを、ＴＦ媒介性の内在性経路の活性化への干渉についてスクリーニングした。これによって、異なる抗凝血剤で治療された異なる個体および患者で、止血促進性凝固経路および血栓促進性凝固経路の特徴を明らかにするために、新規の凝固経路を適用することが可能になった。ＭｏＡｂ ３Ｇ１２に例示される殆どの阻害性抗体が、ＴＦ開始複合体によるＦＶＩＩＩの活性化を防止したのに対し、巨大分子基質結合エキソサイトの近くの画定されたエピトープに反応することが知られるＭｏＡｂ １２Ｃ７は、この反応に阻害効果を及ぼさなかった（図９）。いくつかの実施形態で、抗体は、ＦＶＩＩａ ＷＴによって媒介される直接的なＦＸａのターンオ－バーを制限した（図９）。いくつかの実施形態で、それによって、ＴＦ経路により生成されたＦＶＩＩＩａを通じたＦＸａ生成の増幅が可能になったが、これはＦＩＸａの場合にのみ示され、酵素原ＦＩＸでは示されなかった（図９Ｂ）。いくつかの実施形態で、この知見は、ＭｏＡｂ １２Ｃ７が、ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＩＸからＦＩＸａへの変換を阻害することを実証する。いくつかの実施形態で、このことにより、血液中のＦＩＸａ生成に繋がる可能性がある異なる経路を機能的に切り分けるためのツールが提供され、止血または血栓症についてそれらの機能的な意義を試験することが可能になる。実際に、様々な実施形態では、阻害性の抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂ ３Ｇ１２とは異なり、ＭｏＡｂ １２Ｃ７は、正常なＰＲＰ．中でＴＧを保持した。他の実施形態では、ＭｏＡｂ １２Ｃ７の存在下でのＦＶＩＩＩ依存的なＴＧは、抗ＦＸＩ抗体による阻害を大きく受けやすくなっていった（図９Ｃ）。いくつかの実施形態で、ＭｏＡｂ １２Ｃ７は、変異体ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙの特性を模倣する。さらに、低いリバーロキサバン濃度によって、ＭｏＡｂ １２Ｃ７の存在下でさらに顕著なトロンビン生成（ＴＧ）の阻害が引き起こされ（図９Ｄ）、このことは、ＦＸａを標的とする抗凝血剤が、トロンビン－ＦＸＩフィードバックループを阻害するのに対し、ＴＦ開始複合体による直接的なＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの活性化を選択的に保持することを確定する。．
実施例３１
アッセイまたは試験
いくつかの実施形態で、新たに特定されたＴＦ依存的なＦＶＩＩＩ活性化経路は、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体を介した初発のトロンビン生成（ＴＧ）で鍵となる役割を有し、このＴＧは、止血に不可欠な二次的なＴＧのバーストに繋がる。いくつかの実施形態で、極端に低い濃度（例えば０．１５ｐＭ）の再脂質化ＴＦおよびＦＩＸａ（例えば２００ｐＭ）を組み合わせて患者血漿中に添加することによってＴＧを惹起する試験を実施した。ＴＦまたはＦＩＸａを個別に添加することでは、それぞれＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）による制御および緩やかな反応に起因して、血友病Ａ患者の血漿中に有意なＦＩＩａを生成しない。これに対して、２種の凝固開始物質を個々に不活性な濃度で組み合わせて添加することによって、ＴＧが相乗的に増幅された（図１０）。いくつかの実施形態で、本明細書に開示される新規の方法によって、血漿中の非常に低いＦＶＩＩＩ濃度の検出が可能になる。重要なことに、この新しいアッセイによって検出された機構は、公知の遊離のＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化の機構とは異なる。いくつかの実施形態で、ＦＶＩＩＩによりスパイクされた血友病Ａ患者の血漿中の測定によって示されるように、新しいアッセイの検出限界は、０．０７ＩＵ／ｄＬ ＦＶＩＩＩ：Ｃである。そのため、一実施形態では、本発明の方法は、ＴＦ駆動性のＦＶＩＩＩの活性化と、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体により誘導されたＴＧとを、特異的に決定する。
いくつかの実施形態で、本開示は、新しい経口の抗凝血剤を用いて治療される患者について血栓および出血のリスクの定義を個別に設定する助けとすることができる、新たに設計された凝固アッセイの基盤である。例えば、一実施形態では、本明細書に開示される方法は、より良好な抗血栓効果のための、または出血合併症の可能性を低減するための、投薬量の調整に必要な状況を客観的に特定することができる。いくつかの実施形態で、本開示は、充分な止血機能を保持するとともに血栓症の防止または治療のために新しい薬理的なアプローチを特定および試験するのに適切な、新しい展望を提供する。
いくつかの実施形態で、本開示によって、ＴＦ開始性の凝固の状況で凝固補因子の機能的な保持または分解に特異的かつ定量的に焦点を置いた新しい抗血栓薬剤候補の評価が可能になり、それにより血栓促進性経路と止血促進性経路とが区別される。いくつかの実施形態で、このことによって、抗血栓効果について最も良好なプロファイルｖｓ出血合併症に関する安全性プロファイルを有する薬剤候補の区分が改善される。いくつかの実施形態では、同じメリットによって、新しい薬剤または薬剤の組合せに基づく抗血栓レジメンのモニタリングおよび評価が、すなわち機構論的な見地で異なる標的選択的な抗凝血剤を用いた最良の個別化治療を達成する鍵となる課題が、改善される。止血に関しては、本明細書に開示される新規のアッセイは、重度の血友病Ａ患者および後天性のＦＶＩＩＩ欠乏症の個体で、低レベルのＦＶＩＩＩ：Ｃを検出する。いくつかの実施形態で、感度の増加したＦＶＩＩＩ活性アッセイによって、出血の表現型の特徴をさらに正確に明らかにすること、および重度の血友病Ａ患者で出血リスクを予測することが可能になり、それゆえ、ＦＶＩＩＩ産物を用いた補充療法が改善される。いくつかの実施形態で、そのようなアッセイはまた、抗血友病ＦＶＩＩＩのバリアントを特定する助けとなり、このバリアントは、新たに特定された凝固経路における機能が増大しおよび／または安定性が増加して、それゆえに抗血友病ＦＶＩＩＩ機能を欠損している患者での補充療法を改善する。
実施例３２
全般
組織傷害への応答における血液凝固は、止血および先天性免疫のための鍵であるが、重篤な疾患に繋がる血管の血栓症の一因となる可能性がある。現在広まっている凝固スキームでは（図１、左）、組織因子（ＴＦ）と活性因子（Ｆ）ＶＩＩａとの外因性経路開始複合体が、タンパク質分解反応のカスケードを促進してＦＸａを産生し、ＦＸａは、ＦＶａとともにプロトロンビナーゼ複合体中に組み合わさって、プロトロンビンをトロンビンに変換する。最初に生成されたトロンビンは、凝固を増幅するフィードバック反応においてＦＶＩＩＩ補因子およびＦＶ補因子を活性化する。重要なトロンビン産生の前にどのように活性の補因子が生成され得るのかは、依然として不可解な問題であり、今のところＦＸａが、該当する凝固開始のＦＶアクティベーターであるものとみなされている。この開示では、直接的なＦＶＩＩＩの活性化を通じた凝固開始へのＦＸａおよび／またはＴＦ－ＦＶＩＩａの寄与を示す。
外因性の凝固の開始は、ＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）によって制御され、このＴＦＰＩは、ＦＶＩＩａおよびＦＸａをＴＦとの４つ組の複合体内で不活性化することによって血栓症を減じる。さらに、正電荷を持つＴＦＰＩαのカルボキシル末端領域は、活性のプロトロンビナーゼのＦＸａの形成に干渉する部分的にプロセッシングされたＦＶ中の、特異的な酸性配列に相互作用する。直接的なトロンビン生成を低減するこれらの機構は、生理的な血漿阻害剤の存在下、動態学的に好都合な反応で、内在性経路のＦＩＸを活性化するＴＦ－ＦＶＩＩａによって相殺される。あるいは、ＦＩＸａは、血管の炎症をも促進するトロンビンフィードバックループ中で活性化されたＦＸＩａによって、または接触相のＦＸＩＩａによって生成される。マウスモデルでは、ＦＸＩＩａは、実験的な血栓症でのトロンビン生成の増幅に寄与するが、ヒトデータに一致して、止血には役割を持たない。
現在広く知られている凝固のパラダイムは、ＴＦ依存的な開始とプロトロンビナーゼの生成との両方を厳密に制御するＴＦＰＩの幅広い機能を擁しており、最初に生じたトロンビンがどのようにして接触経路またはＴＦ－ＦＶＩＩａ自体により生じるＦＩＸａのためのＦＶＩＩＩａ補因子の起源となり得るのかを、容易に説明することができない。そのため、本発明者らは、外因性凝固開始複合体の新規の機能を本明細書に開示しており、その機能により、ＴＦ－ＦＶＩＩａに会合している新生ＦＸａは、ＴＦＰＩによる阻害剤性の制御に抵抗性のあるＦＶＩＩＩを直接的に活性化する。そのような機構は、止血におけるＴＦの機能に妥当であることがあり、生理的および病理学的な血栓形成の際の凝固反応の別個の役割を解釈するための新しい展望を提供する。
実施例３３
方法
材料 マウスおよびウサギのＩｇＧ、キナクリン－ＨＣｌ、およびアピラーゼは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から得た。ヒトプロトロンビン（ＦＩＩ）、トロンビン（ＦＩＩａ）、ＦＶ、ＦＶａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＸ、ＦＸａ、ＣＴＩ、ダンシルアルギニンＮ－（３－エチル－１，５－ペンタンジイル）アミド（ＤＡＰＡ）、および抗ヒトＦＶ ＭｏＡｂ ＡＨＶ－５１４６（Ａ１－Ａ２ドメインの残基３０６～５０６に結合）は、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（エセックス・ジャンクション、バーモント州）から得た。ウシ血清アルブミンは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から；ｒＴＦ（デイドイノビン）は、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｄｎｏｓｔｉｃｓ（ディアフィールド、イリノイ州）から；ヒトプロテインＳは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（サウスベンド、インディアナ州）から；線虫抗凝血タンパク質（ＮＡＰ）ｃ２およびマダニ抗凝血ペプチド（ＴＡＰ）は、Ｃｏｒｖａｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から得た。使用した抗ヒトＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂｓのうち、ＥＳＨ－８は、Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（スタンフォード、コネチカット州）から；８Ｄ４は、ａｇｉｆｔｏｆマーク・ジャックマン博士（ルーヴェン、ベルギー）から；Ａ１ドメインに対し指向性のあるＣ５は、実験室で調製した。ＦＶＩＩＩは、Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（バークレー、カリフォルニア州）から寄贈された。組換えＴＦＰＩ；可溶性ＴＦ（残基１～２１８）；ヒトＦＶＩＩａのＷＴおよび変異体Ｓ１９５Ａ（キモトリプシンナンバリング；ｉＦＶＩＩａ）、Ｔ９９Ｙ、およびＥ１５４Ａ；およびプロトロンビンＳ１９５Ａは、記載されるように生産し、特性解析を行った。ヒルゲン、ＭｏＡｂである抗マウスＴＦ ２１Ｅ１０、抗ヒトＦＶＩＩａ １２Ｃ７、抗マウスＦＸＩ １４Ｅ１１および抗ヒトＦＸＩ Ｏ１Ａ６は、以前に特性解析を行った。阻害性の抗ＴＦＰＩポリクローナル抗体、抗ヒトＦＶＩＩａ ３Ｇ１２、および抗ヒトＴＦ ５Ｇ９ ＭｏＡｂは、本発明者らが作製した。
血液灌流実験 ＴＦで被覆されたガラスカバースリップを、壁せん断速度３００ｓ－１で静脈血により灌流した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５Ｍ／ＬＳＭ４１０およびＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ４０×／１．４０ＮＡ油浸対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ、オーバーコッヘン、ドイツ）を用いて、メパクリンおよび特異的抗体でそれぞれ染色した血小板／白血球およびフィブリンを可視化した。体積を算出するための画像解析を、本明細書に記載されるように実施した。
ヒト未処理または再構成された血小板に富む血漿（ＰＲＰ）でのＴＧ分析 ＰＲＰまたは再構成されたＰＲＰ中のＴＧを、本明細書に記載されるように評価した。ＰＲＰ中の血小板を、相同な血小板欠乏血漿（ＰＰＰ）を用いて１８０・１０３／μＬに調整し、ＣＴＩを３０～５０μｇ／ｍＬで添加した。再構成されたＰＲＰは、洗浄済み血小板を１８０・１０３／μｌでＰＰＰ中に再懸濁して調製した。トロンビン生成（ＴＧ）は、３６０μＭ蛍光発生性の７－アミド－４－メチルクマリンにカップリングされたベンジルオキシカルボニル－グリシル－グリシル－Ｌ－アルギニンｃｏｕｐｌｅｄｔｏ（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ；Ｂａｃｈｅｍ Ａｍｅｒｉｃａｓ、トーランス、カリフォルニア州）をトロンビン基質として含有するマイクロタイタープレートウェル中に、規定濃度のｒＴＦおよび／またはＦＩＸａを１８ｍＭ ＣａＣｌ２とともに添加することによって開始した。Ｔｕｒｂｏ Ｄｅｌｐｈｉ２００６（Ｂｏｒｌａｎｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オースティン、テキサス州）を用いて、時間の関数として蛍光強度増加の速度（３５５／４６０ｎｍの励起／放出で測定）（ｄＦ／ｄｔ）を算出し、較正曲線を用いて、トロンビン－等価物濃度（ｎＭ）に変換した。検出限界５ｐＭの不連続２段階アッセイを用いて、ＴＧも測定した。このアッセイでは、３７℃で１１分間までインキュベーションされた反応を、２０ｍＭＥＤＴＡを用いて終了させ、感受性トロンビン基質Ｈ－Ｄ－ＣＨＡ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＭＣ・２ＡｃＯＨ（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ，Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ、バーゼル、スイス）を５０μＭで用いて生成トロンビンを測定した。
イムノブロッティングによるＦＶＩＩＩおよびＦＶの活性化の分析 凝固産物を、還元条件下、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離したが、抗ＦＶＩＩａ ＭｏＡｂを含有する反応のみ、ＦＶＩＩＩ Ａ１ドメインに匹敵する分子量を持つＩｇＧ軽鎖由来の混同の影響を回避するために非還元下で処理した。ポリフッ化ビニルピロリドン膜に転写したタンパク質を、抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂｓ Ｃ５（０．５μｇ／ｍＬ）または抗ＦＶ ＡＨＶ－５１４６（１μｇ／ｍＬ）を用いてプロービングした。既知のＦＶＩＩＩａおよびＦＶａの量を用いて較正したＯｄｙｓｓｅｙ赤外線撮像装置（Ｌｉ－ＣＯＲ，リンカーン、ネブラスカ州）を用いた赤外線検出によって、ＦＶＩＩＩａおよびＦＶａを定量した。
精製構成成分を含む反応中での凝固の活性化 ０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４の反応は、４μＭ ＤＡＰＡの不在／存在下、０．７ｎＭ ＦＶＩＩＩ、３ｎＭ ＦＶ、１３５ｎＭ ＦＸ、および１μＭプロトロンビンを含んでいた。ＴＦＰＩおよび他の阻害剤を標示の通りに添加した。反応を、ＦＶＩＩａ（２００もしくは５００ｐＭ）および／またはＦＩＸａ（２もしくは１０ｎＭ）を含むｒＴＦ（５０または４００ｐＭ）に２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を添加して開始し、３７℃で標示された時間の間インキュベーションした。１０ｍＭ ＥＤＴＡで反応をクエンチした後、Ｓ－２７６５（１８０μＭ）を用いて生成ＦＸａを測定した。ＦＶＩＩＩａ凝血原活性をＦＩＸａ依存的なＦＸａ生成として測定した。すなわち、新生のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体によって生じたＦＶＩＩＩａ凝血原活性は、ＦＶＩＩａおよびＦＩＸａにより個々に開始された反応中で生産されたＦＸａの量を、ＦＶＩＩａ／ＦＩＸａを組み合わせて開始された反応中のものから差し引くことによって算出した。標示されている場合には、２００ｎＭレピルジンを使用して、混入した可能性のあるトロンビンを不活性化した。
マウスにおける塩化鉄により誘導された血栓症 動物の処置は、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）を満たし、ＴＳＲＩ動物管理使用委員会によって承認された。１滴の０．８μＬの７％（０．２６Ｍ）または８％（０．３０Ｍ）のＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを頸動脈に３分間；または０．４μＬの４％（０．１５Ｍ）液滴を大腿静脈に１分間用いた後に、リンスすることによって、血管の傷害をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに誘導した。抗体を、カテーテル挿管された頸静脈内に、ボーラス注射によって投与した。ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩａを、ボーラス注射（１．４ｐｍｏｌｅｓ）によって投与した後、０．４７ｐｍｏｌｅｓ／分の速度の継続的な輸注を１５分間維持した。傷害の開始後の最初の閉塞までの時間および流動指数を、当技術分野に記載されるように定量した。
試験の承認 ヒト対象を含む試験は、任命された治験審査委員会によって承認された。ヒトボランティアから試験に参加するためのインフォームドコンセントを得た後に、血液を採集し、確立された手順に従って実験を実施した。
統計 群の分散は、ルビーンの中央値およびバートレット検定を用いて評価し；差は、一元ＡＮＯＶＡ検定またはクラスカル－ウォリス検定の後に、多重比較のためにテューキー検定およびダン検定をそれぞれ用いて評価した。データは、等分散性を得る必要があった場合には、ｙ＝ｌｏｇ１０ｙとして変換した。使用したソフトウェアパッケージは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）およびＸＬＳＴＡＴ（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、パリ、フランス）である。
実施例３４
結果
ＴＦ経路はｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩを活性化する。 以前に示されているように、接触相のＦＸＩＩおよびＴＦは、塩化鉄により誘導された頸動脈閉塞モデルで、実験的な血栓症に寄与するが、どのようにしてこれが起こるのかは依然として不明である。本発明者らは、ＴＦ機能かまたはＦＸＩＩａによるＦＸＩの活性化を遮断するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）が独立して、７％（０．２６Ｍ）ＦｅＣｌ３に起因する血管壁の付傷後の閉塞を低減することを見出した（図１１Ａ）。８％（０．３Ｍ）ＦｅＣｌ３による付傷の後では、同じＭｏＡｂ濃度は効果がなかったが、さらに高い用量の抗ＦＸＩ ＭｏＡｂ－抗ＴＦのそれではなく－は、やはり血栓症を防止した（図１１Ａ）。このように、さらに重度の付傷の後であっても、血栓形成は、ＦＸＩＩａ－ＦＸＩａによるＦＩＸａの生成を必要とした。注目すべきことに、後者の条件下では、個々では抗血栓活性を持たない低用量の抗ＴＦおよび抗ＦＸＩ ＭｏＡｂを組み合わせることによって、動脈の閉塞が有意に低減し（図１１Ａ）、このことは、血栓形成のこの内在性凝固依存的なモデルにおけるＴＦ経路への役割を確定する。このように、ＴＦは、内在性テナーゼプロテアーゼであるＦＩＸａに不可欠な補因子であるＦＶＩＩＩの活性化に寄与する可能性がある。大腿静脈に可視化されたように、ＦＶＩＩＩａ－しかしＦＶＩＩＩではなく－は、ＦｅＣｌ３誘導性のフィブリン沈着に対する低用量の抗ＴＦ／抗ＦＸＩ ＭｏＡｂの組合せによる阻害を防止したが、高用量の抗ＦＸＩのみによる阻害を防止しなかった（図１１Ｂ、図１１Ｃ）。これらの結果は、ＴＦ－ＦＶＩＩａまたは代替経路により生成されたＦＩＸａが、外因的に供給されたＦＶＩＩＩａを使用して血栓症を惹起したことを除外するものであり、このことは、ＴＦ－ＦＶＩＩａがｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩの活性化に寄与するという概念を支持する。
この概念を支持する実験的なエビデンスを得るために、血小板に富む血漿（ＰＲＰ）中のトロンビン生成（ＴＧ）を測定した。ＴＦＰＩを遮断する阻害性ポリクローナル抗体と、ＦＸＩＩａによるＦＸＩの活性化を防止するトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）とを含有する反応中、本発明者らは、互角のＴＧを産生するＦＩＸａまたは組換え再脂質化ＴＦ（ｒＴＦ）の濃度範囲を定めた（図１１Ｄ、左）。同じ濃度で、しかしＴＦＰＩによる封鎖の不在下では（図１１Ｄ、右）、ｒＴＦは、殆どトロンビンを生産せず反応が遅かったが、ＦＩＸａの同時添加ではＴＧを増強した。このＦＩＸａ惹起性のＴＧの増幅は、ＦＶＩＩＩを＜１０％血漿濃度で必要としたが、ＦＩＸを必要とせず（図１１Ｅ）、このことは、追加のＴＦ依存的なＦＩＸａ生成を除外する。Ｓｉｎｃｅ ＦＶＩＩＩ欠損患者で重度の自然発生の出血を防止するのに充分であることが知られているＦＶＩＩＩ濃度によって、相乗的なＴＧ増幅をサポートすることができ、このアッセイの条件は、ＰＲＰ中の止血能を査定するために適切であるように思われる。
ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体は、ＦＶＩＩＩを活性化する。 ＴＦ誘導性の内在性凝固のプライミングの機構を、感度の高い２段階ＴＧアッセイを用いて研究した。正常な血小板を用いて再構成されたＦＶＩＩ欠損血漿では、野生型（ＷＴ）ＦＶＩＩａの存在下の０．１５ｐＭ ｒＴＦは、トロンビンを殆ど生産せず（１１分で＜２０ｐＭ）、活性部位変異体ＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａ（ｉＦＶＩＩａ）またはＦＩＸａのみによって生成されたものと同様であった（図１２Ａ）。しかし、ｒＴＦおよびＦＶＩＩａＷＴ－しかし不活性のＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａではなく－は、ＦＩＸａとの組合せで、ＴＧを５～１１分で約５～２０倍に増幅した（図１２Ａ）。そのため、このアッセイでＴＦ－ＦＶＩＩａおよびＦＩＸａにより別々に生産されたトロンビンの付加的な量は、２種の組合せにより産生された量よちもはるかに少なく、このことは、トロンビン生成の上流に、ＴＦ開始性凝固と内在性凝固とを連係する相乗的な相互作用があることを実証する。
トロンビンとは別に、ＦＩＸａ依存的な凝固に必要なＦＶＩＩＩａを産生できた反応を特定するために、本発明者らは、ＴＦ－ＦＶＩＩａおよびＦＸａを潜在的なＦＶＩＩＩアクティベーターであるものと考えた。まず、全ての反応物が生理的に妥当な濃度であった際に、ＦＸを含まないＴＦ－ＦＶＩＩａ－またはＦＶＩＩａを含まないＴＦ－ＦＸ－は、ＦＶＩＩＩａ活性を生じないかまたは最小限生じるが、ＦＸを含むＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａを生成する－は、実質的な量のＦＶＩＩＩａを生産することを決定した（図１２Ｂ）。ＴＦ－ＦＶＩＩａと会合しているＦＸａとは対照的に、ＴＦ－ＦＶＩＩａから放出された後のＦＸａの機能を区別するために、本発明者らは、線虫抗凝血タンパク質（ＮＡＰ）ｃ２を含む安定なＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体を形成した。形成された複合体中では、ＦＶＩＩａの触媒活性は、Ｓ１９５Ａ活性部位変異（ｉＦＶＩＩａ）によって除外されたが、一方で、ＦＸａは、ＮＡＰｃ２複合体に捕捉された際に触媒機能を保持することが知られている。この複合体は、再構成されたＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中ではＴＧを誘導できないが、ＦＩＸａ誘導性のＴＧを顕著に増強し（図１２Ｃ）、このことは、ＴＦ－ＦＶＩＩａと会合しているＦＸａがＦＶＩＩＩを活性化することができることを示唆している。ＦＸａを阻害するＴＦＰＩを用いて形成された同様の複合体は、不活性であったに過ぎず、ＰＲＰ中でＦＩＸａ依存的なＴＧをサポートしなかった（図１２Ｃ）。驚くべきことに、ＮＡＰｃ２により安定化された予め形成された複合体ＴＦ－ｉＦＶＩＩａ－ＦＸａは、精製ＦＶＩＩＩを活性化することができたが、相同な補因子ＦＶを活性化できなかった（図１２Ｄ）。ＴＡＰを用いた特異的な阻害は、安定化されたＴＦ－ｉＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体中のＦＸａが、ＦＶＩＩＩを活性化すること（図１２Ｄ）を確定し、このことは、ＴＦ－ＦＶＩＩａと会合したままの新生ＦＸａが、同じ機能を発揮できること（図１２Ｅ）を暗示している。
次に、本発明者らは、プロトロンビナーゼ複合体を形成することによって凝固を惹起する遊離のＦＸａが、プロトロンビナーゼ補因子であるＦＶａを生成する際のその機能と類似して、生理的な状況でＦＶＩＩＩアクティベーターとしての役割を果たすことができたのか否かを検討した。上記の実験で使用された同じ凝血原膜上では、ＦＶａの濃度を増加させてゆくと、低濃度のＦＸａによるプロトロンビンの変換を顕著に刺激した（図１２Ｆ）。これに対して、同じＦＸａ濃度によるＦＶＩＩＩａ活性の生成（図１２Ｇ）またはＦＶＩＩＩのタンパク質分解性切断（図１２Ｈ）は、同じ濃度範囲でＦＶａを添加することによって次第に阻害され、このことは、ＦＶａに結合しているＦＸａが、ＦＶＩＩＩを効率良く活性化することができないことを標示する。このように、ＴＦ－ＦＶＩＩａと会合している新生ＦＸａは、ＦＶＩＩＩを優先的に活性化して、内在性凝固経路を惹起する。それに続いて起こるＴＦ－ＦＶＩＩａからＦＶａを含むプロトロンビナーゼ複合体内へのＦＸａの移送は、直接的なＴＦ－誘導性の凝固への遷移を指し示す。
ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体は、トロンビンとは独立してＦＶＩＩＩを活性化する。 ＦＶＩＩＩａを生成する際の新生のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体およびトロンビンの相対的な役割を査定するために、精製ＦＸ、プロトロンビン、ＦＶＩＩＩ、およびＦＶと混合した、ｒＴＦを帯びたリン脂質ベシクル上における、プロ補因子の活性化を研究した。ＦＶＩＩａの添加後のＦＶＩＩＩの活性化は、ＤＡＰＡを用いてトロンビンを遮断することによって、または正常なプロトロンビンを不活性のＳ１９５Ａ変異体に置き換えることによって、部分的に阻害されたが、両方の条件下で、約１５％のＦＶＩＩＩａが依然として検出可能であった（図１３Ａ）。重要なことに、トロンビンは、溶液相での効率の良いＦＶＩＩＩ切断から予想されたように、さらに多くのＦＶＩＩＩａを生成できたにも関わらず、活性トロンビンの不在下でＴＦ開始性の反応により活性化されたＶＩＩＩの量は、膜にアセンブリされたＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ複合体の全機能に用いられるのに充分であった（図１３Ｂ）。内在性凝固阻害剤を含有するＰＲＰでの結果に一致して（図１１Ｄを参照）、ＴＦ－ＦＶＩＩａによる直接的なＦＸａ生成を顕著に抑制するＴＦＰＩは、ＴＦ開始性の反応において機能的なＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体の形成に限定的な効果を及ぼした（図１３Ｃ）。後者はまた、補因子プロテインＳと併せたＴＦＰＩαによる阻害に抵抗性を有した－プロテインＳのみによる部分的な阻害は、限られた凝血原表面に対する競合に起因する可能性がある。ＰＲＰ中、新生ＦＸａによるトロンビン非依存的なＦＶＩＩＩの活性化が観察されたことに一致して、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＸによるＦＶＩＩＩの活性化は、ＦＶＩＩＩに結合するフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）による影響を受けなかった。
ｒＴＦが、生理的な血漿の環境中で、トロンビンフィードバック反応とは独立してＦＶＩＩＩの活性化をサポートできることを直接的に実証するために、本発明者らは、ヒルゲン（６３－Ｏ－スルホ－Ｔｙｒ－ヒルジンを使用して、補因子の活性化に必要なトロンビンエキソサイトＩを遮断した。ヒルゲンは、トロンビンによるＦＶＩＩＩの活性化を用量依存的に阻害したが、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＩＸａによって生成されたＦＸａを阻害しなかった。ＣＴＩと、ＦＸＩａによるＦＩＸａ生成の増加を通じたフィードバックＴＧ増幅を遮断するための抗ＦＸＩ ＭｏＡｂとを含むＰＲＰ中では、２μＭヒルゲンは、ＦＩＸａ依存的なＴＧを遮断し（図１３Ｄ）、このことは、この反応が、トロンビンフィードバックによるＦＶＩＩＩの活性化を必要としたことを実証する。これに対して、同じヒルゲン濃度では、ｒＴＦと組み合わせたＦＩＸａによるＴＧを阻害できず、ＦＩＸａおよびｒＴＦを別々に添加した際にＴＧを検出できなかった場合でさえも阻害できなかった（図１３Ｅ）。このように、ＴＦ経路は、トロンビンフィードバックループが阻害されると、血漿中のＦＶＩＩＩｉｎを活性化する。注目すべきことに、ＷＴまたはヒトのＴＦのノックインマクロファージから生成されたマウスのマイクロベシクルを用いた実験によって、トロンビン非依存的なＦＶＩＩＩａ生成が、ヒトまたはマウスのＴＦ－ＦＶＩＩａを用いて天然の凝血原表面にも起こったことが示された。
新生のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ複合体による内在性凝固経路の活性化は、直接的な外因性経路の機能とは独立してトロンビン生成に寄与する。 どのようにしてＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＸａ生成が、直接的な外因性経路のＴＧとは対照的に、内在性経路の活性化に別個に寄与するのかを、さらに明らかにするために、２種のＦＶＩＩａ変異体を試験した－Ｔ９９ＹおよびＥ１５４Ａ。これらの変異体は、ＦＸ切断活性を保持するが、ＦＸａ放出が不全であるために非常に僅かな基質ターンオ－バーを呈示する。リン脂質不含のアッセイで、またはリン脂質が再構成されたＴＦを用いると、ＦＶＩＩａ変異体は、最初のバーストを生じたが、ＦＶＩＩａＷＴとは対照的に、ＦＸａ生成を持続することができなかった（図１４Ａ）。注目すべきことに、両方の変異体を含むＴＦ複合体は、ＦＸａ依存的なＦＶＩＩＩの活性化をサポートすることにおいてＦＶＩＩａ ＷＴと互角であり、重要なことに、ＴＦＰＩαは、上記の生理的な濃度（１０ｎＭ）では、このＦＶＩＩＩａ生成の経路にはっきりとした影響を与えなかった（図１４Ｂ）。ＦＶＩＩＩとは大きく対照的に、ＦＶＩＩａ変異体は、ＦＶの活性化を誘導できず、ＴＦＰＩαは、ＦＶＩＩａＷＴにより誘導されたＦＶａ生成を阻害した（図１４Ｃ）。
ＦＸａターンオ－バー不全のどちらのＦＶＩＩａ変異体も、ＦＩＸａが利用可能である際には、機能的なＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ複合体の形成をサポートしたが、ＦＶＩＩａエキソサイト変異体であるＥ１５４Ａのみが、酵素原ＦＩＸが代わりに存在した際に、ＦＶＩＩＩａ－ＩＸａ活性を生じた（図１４Ｄ）。このことは、ＦＶＩＩａ Ｔ９９ＹがＦＶＩＩａ Ｅ１５４Ａとは異なり、ＦＩＸを活性化する能力を持たないことによって説明される。このように、ＦＩＸａを生成する能力を補完することから、ＴＦ－ＦＶＩＩａの新生ＦＸａ産物による抗血友病ＦＶＩＩＩ補因子の直接的な活性化は、ＴＦＰＩαによる阻害性制御に先立ち、内在性経路の凝固を可能にする。
これらの結論を、追加のＴＦＰＩαの潜在的な供給源として正常な血小板を用いて再構成されたＦＶＩＩ欠損血漿中－内在性凝固阻害物質を含有する－で、さらに試験した。これらの条件下、ＦＶＩＩａ ＷＴは、抗ＦＶＩＩＩ中和ＭｏＡｂの存在下でＴＧを誘導したが、Ｅ１５４Ａ変異体またはＴ９９Ｙ変異体は誘導せず（図１４Ｅ）、このことは、変異体が、血漿環境中でトロンビンを直接的に生成できなかったことを確定する。ＦＶＩＩＩの阻害がない場合、ＦＶＩＩａ Ｅ１５４Ａは、ＷＴに比べてほんの僅かに遅れてＴＧを誘導したのに対し、ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙは、明らかに効率が低下した。ＦＸＩａの阻害によって、ＦＶＩＩａ Ｔ９９ＹによるＴＧがさらに低減したが、ＦＶＩＩａ ＷＴまたはＥ１５４Ａには中程度に影響を及ぼしたに過ぎなかった（図１４Ｆ）。これらのデータは、後者のＦＩＸａならびにＦＶＩＩＩａの生成に一致する。
トロンビン非依存的なＦＶＩＩＩ活性化がこれらの反応で起こったことを直接的に証明するために、本発明者らは、まず、トロンビンエキソサイト遮断剤であるヒルゲンが、ＦＶＩＩ欠損血漿中でＦＩＸａ誘導性のＴＧを消失させることを立証した（図１４Ｇ）。同じヒルゲン濃度の存在下、変異体ＦＶＩＩａ Ｅ１５４ＡによるＴＧは、全体的にＦＶＩＩＩ依存的であったが、ＦＶＩＩａ ＷＴではそのような依存性はなく、それに対し、ＦＶＩＩＩの阻害がない場合、ＦＶＩＩａ ＷＴおよびＥ１５４Ａによって誘導されたＴＧは同様の規模であったが、後者によるＴＧは明らかに遅延した（図１４Ｈ）。この遅延は、変異体ＦＶＩＩａによる直接的なＦＸａ生成の不全が、初発のプロトロンビナーゼアセンブリに用いられるＦＶａ補因子の生成を低減できたことに起因した可能性がある。実際に、ＦＶａの添加によって、ＦＶＩＩａ Ｅ１５４ＡによるＦＶＩＩＩａ依存的なＴＧでは、この遅延は正常化された（図１４Ｉ）。したがって、ＦＶａを正常なＰＲＰに添加することによって、ＴＦ開始性のＴＧが加速されたが、ＴＦＰＩ機能の遮断を超えるものではなかった。これらのデータは、ＦＶの活性化に寄与するＦＸａ生成に対するＴＦＰＩによる制御によって、プロトロンビナーゼ活性が調節されることを標示し；ＴＦ開始性の凝固の間のＦＶＩＩＩの活性化によって、トロンビンフィードバック反応と独立して、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ活性が生じ、ＴＦＰＩによる制御を逃れるという概念を補強する。
本発明者らは、次いで、原理証明の阻害剤を特定するために、ＦＶＩＩａに対するＭｏＡｂのライブラリーをスクリーニングした。このような阻害剤によって、ＦＶＩＩａ変異体Ｔ９９Ｙを用いて見られた機能的な特性のシフト－ＦＶＩＩＩの活性化の喪失ではなく、効率的なＦＸａおよびＦＩＸａ生成の喪失－をまとめることができた。完全な阻害性ＭｏＡｂである３Ｇ１２とは対照的に、抗体１２Ｃ７は、ＦＶＩＩＩの活性化に効果を及ぼさなかった（図１５Ａ）。さらに、それは、ＦＩＸａが存在した際に、内在性テナーゼ活性の生成に有意な効果を及ぼさなかったが、ＦＩＸが代わりに供給された際には、顕著に阻害した（図１５Ｂ）。ＭｏＡｂ １２Ｃ７は、ＰＲＰ中でＴＧを減弱させるが、ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙを用いて見られたように、ＴＧをＦＸＩａ依存的なものとした（図１５Ｃ）。このように、変異体ＦＶＩＩａ分子および阻害性抗体を用いた結果により、一致して、ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体が、別個の反応で内在性凝固経路および外因性凝固経路を開始できることが示された。
ＴＦによる内在性経路の活性化は、血流中のフィブリン形成に繋がる。 ｅｘ ｖｉｖｏでの血流中、直接的な初発のトロンビン生成が制限された際に、ＴＦ－ＦＶＩＩａが血栓形成を開始できるか否かを評価するために、壁せん断速度ｏｆ３００ｓ－１でのＦＶＩＩＩ依存的なフィブリン形成に充分な低さの濃度で、ＴＦを表面に固相化した。ＷＴ ＦＶＩＩａを用いて確立されたこれらの条件下で、不活性のＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａよりも多くの血小板の接着を支持したにも関わらず、ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙは、血栓形成活性を減じていた（図１６Ａ、図１６Ｂ）。ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙを含有する血液に１０ｐＭ ＦＩＸａを添加することによって、ＦＶＩＩＩ依存的なフィブリン形成が復活したが、不活性のＦＶＩＩａ Ｓ１９５Ａを含有する血液では復活しなかった（図１６Ａ、図１６Ｂ）。これに対して、直接的なＴＧにおいてＴ９９Ｙのように欠陥のある変異体ＦＶＩＩａＥ１５４Ａ（図１４Ｅを参照）は、ＦＩＸａ不在下で再構成されたＦＶＩＩ欠損血液に添加された際に、ＦＶＩＩａ ＷＴと同様にＦＶＩＩＩａ依存的な血栓形成をサポートした（図１６Ａ、図１６Ｃ）。このことによって、フィードバックループを活性化する直接的なＴＦ依存的なトロンビン生成が限定された低いＴＦ環境で、止血を亢進する可能性を有した内在性テナーゼ複合体中で機能するＦＶＩＩＩａを、ＴＦ－ＦＶＩＩａの新生ＦＸａ産物が直接的に生成することができることが確定された。
実施例３５
考察
ここに提示される知見は、外因性ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体の新規の機能を描き出すものであり、言い換えれば、トロンビンフィードバックループとは独立した、ＦＶＩＩＩ抗血友病補因子の選択的なフィードフォワード活性化を示すものである（図１Ｂ）。この新生ＦＸａの特異的な反応は、ＰＲＰ中の生理的な凝固阻害物質または精製系中のＴＦＰＩαによる制御を逃れる。これまで認識されていたＴＦ－ＦＶＩＩａのＦＩＸａ抗血友病プロテアーゼ生成能と併せて、直接的なＦＶＩＩＩの活性化は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ開始性凝固の中に完全に組み込まれかつ共通の凝固経路の古典的な直接的な活性化に先立つ、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ活性への経路を完成するものである。
新生のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａは、内在性テナーゼの形成を容易にするＦＶＩＩＩａを生成するが、プロトロンビナーゼ活性のためのＦＶａをもたらさない。後者の生成は、ＴＦ－ＦＶＩＩａからドッキング解除されたＦＸａを必要とし、それゆえ遊離のＦＸａは阻害性の制御に曝露される。したがって、新たに特定されたＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの機能は、血栓形成促進性のＦＶａを増加させることなく、活性の止血促進性の抗血友病ＦＶＩＩＩａ補因子の蓄積を可能にする。このことは、互角の抗血栓効力を有し、ビタミンＫアンタゴニストよりも少ない影響を止血に及ぼす標的化ＦＸａ抗凝血剤にとって適切であることがある。注目すべきことに、そのような機構は、トロンビンフィードバック反応およびＦＸＩ活性とは独立しており、それゆえトロンビン阻害剤または最近妥当性が確認されたＦＸＩを標的としたストラテジーを用いた治療の間、止血をサポートすることがある。
補因子の活性化の選択性は、ＴＦ－ＦＶＩＩａとの複合体であるかまたはＴＦ－ＦＶＩＩａから放出されるＦＸａの別個の機能的な特性を標示する。凝固補因子－酵素複合体は、典型的には、迅速なトロンビン生成のための効率の良い基質ターンオ－バーの方にギアを入れられるのに対し、ＴＦ開始複合体は、進化を通じて、その安定性に有利となるような機構を保持しているようである。ＦＸは、酵素原から酵素への転移による影響を最小限に受ける延伸した境界面を通じて、ＴＦ－ＦＶＩＩａと相互作用する。この境界面では、様々な種を通じて保存されているＦＶＩＩａの残基Ｅ１５４が、基質により占有されているプロテアーゼの活性部位から立体配座の変化を伝え、それによって次の産物の放出を調節することがある。この立体配座のスイッチの排除は、ＴＦ－ＦＶＩＩａによる巨大分子基質の活性化と産物ＦＸａのターンオ－バーとを分離するには充分である。そのため、変異体ＦＶＩＩａのＥ１５４Ａは、流れの下の血小板に富む血漿および全血中における、ＴＦ－ＦＶＩＩａに会合している新生ＦＸａによる直接的なＦＶＩＩＩの活性化、ならびにこの新規の経路のもたらすトロンビン生成および血栓形成への寄与に関し、情報を提供する助けとなった。
ＴＦ凝固開始複合体の安定性は、凝固の活性化と先天免疫とを連係するというＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの持つ重要なシグナル伝達の役割を保持することの、進化上の利点を表す可能性がある。効率良くＦＶＩＩＩを活性化することに一致して、ＦＶＩＩａ Ｔ９９Ｙは、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）２の活性化を媒介する際に、完全に機能性である。さらに、ＦＶＩＩＩａ生成に見られるように、ＴＦＰＩαによる機能阻害に対する抵抗性もまた、内皮細胞中でＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによって誘導されるＰＡＲシグナル伝達の重要な特長である。このシグナル伝達複合体は、マウスおよびヒトでは、ＦＸａ結合パートナーである内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）の動員によって、さらに安定化される。ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ－ＥＰＣＲ複合体について鍵となる先天免疫のシグナル伝達の役割が、最近、樹状細胞で明らかになり、樹状細胞では、ｔｏｌｌ様受容体４によるインターフェロン調節遺伝子の誘導に不可欠である。代替的なＥＰＣＲリガンドである活性化プロテインＣによるこの経路の負の制御は、ＦＶおよびプロテインＳの持つ古典的な抗凝血補因子機能を利用する。このように、これらのおよび他の従来になかった凝固系の機能は、多様な役割を免疫、止血、傷害修復に同時に提供する、同じ機構論の特長を利用する可能性がある。
本明細書の開示は、止血をサポートするかまたは血栓症に寄与する際のＴＦの別個の役割を定義するための、生化学的なベースを提供する。直接的に血栓形成を惹起する際のＴＦの部分的な機能を定義するか、または止血に適合する内在性経路の活性化をもたらすための、ＦＶＩＩａの変異体または記載される抗体試薬の適用を想定することができる。突き詰めれば、このことは、最近のおよび将来の新しい抗凝血剤が止血および血栓症におけるＴＦの二重の役割に及ぼす効果を、選択的に査定する可能性に繋がるはずである。ここに提示された凝固に関する新規の概念はまた、止血剤の開発および評価のための潜在的な意義を有する可能性があり、このような止血剤は、血管性の基礎疾患を有する患者において、有害な血栓性の合併症を回避するとともに、重度の出血合併症からの保護を同時にもたらすことが可能である。
実施例３６
凝固活性
材料 様々なｒＴＦ濃度、１００ｐＭ ＦＶＩＩａ、および１３５ｎＭ ＦＸを含むＦＸａ生成アッセイを用いて、イノビンｒＴＦ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、参照ロット（＃５３６９１；１３．９ｎＭ ｒＴＦ）に対し較正した。参照ロットは、８０％ホスファチジルコリン（ＰＣ）／２０％ホスファチジルセリン（ＰＳ）ｍｏｌ／ｍｏｌリン脂質ベシクル（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、アラバスター、アラバマ州）を用いて較正されたプロトロンビナーゼ活性により測定された１０１．４μＭ凝血原リン脂質を含み、１０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で超音波処理された。トロンビン生成性のＦＶＩＩＩａは、１９０ｎＭ ＦＶＩＩＩ、１９ｎＭ ＦＩＩａ、および５ｍＭ ＣａＣｌ２中、３７℃で３０秒間インキュベーションした後、トロンビンを中和するために３６ｎＭレピルジン（組換え［Ｌｅｕ１－Ｔｈｒ２］－６３－ジスルホヒルジン；レフルダン，Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）を加えて調製した。正常なＰＰＰは、地元にて、１０．９ｍＭクエン酸三ナトリウムを含有する静脈血を２５℃、１，５００ｇで１０分間遠心分離することによって調製した。ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、またはＦＩＸの重度の先天性欠乏症（＜１％）の患者由来のＰＰＰは、ＧｅｏｒｇｅＫｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ（オーバーランドパーク、カンザス州）から；正常な血漿の免疫親和性枯渇によって調製されたＦＩＸ欠損ＰＰＰは、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。
血液灌流実験 ０．２ｍｇ／ｍＬポリ－Ｌ－リジンを用いて３７℃で６時間処理したガラスカバースリップを、ｒＴＦを用いて３７℃で１８～２０時間被覆し、緩衝生理食塩水でリンスし、１２５μｍ高のシリコンガスケットの付いた矩形のフローチャンバーに取り付けた。共焦点顕微鏡の解析用ステージ上に配置した。プラスチックシリンジを用いて、静脈血を終濃度１０．９ｍＭのクエン酸三ナトリウム中に採集した。ＣａＣｌ２を添加して１．２９ｍＭ Ｃａ２＋を得た後に、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、ホリストン、マサチューセッツ州）を用いて初発の壁せん断速度３００ｓ－１で灌流を維持した。ＷＴおよび変異体のＦＶＩＩａを用いた実験については、５０μｇ／ｍＬ ＣＴＩおよびアピラーゼ（１０Ｕ／ｍL ＡＤＰａｓｅ活性）を補充した０型のクエン酸添加血液中の細胞を、１５００ｇで７分間の遠心分離のサイクルの連続により、洗浄して血漿不含とした。１回目のサイクルで、血漿は、５Ｕ／ｍＬアピラーゼを含有する等体積のカルシウム不含のタイロード緩衝液、ｐＨ６．５に置換し；次いで、緩衝液および１．２５Ｕ／ｍｌアピラーゼに置換し；最後に、ヒトＦＶＩＩ欠損血漿に本来の血液の体積になるまで置換した。再構成された血液または天然の血液中の血球容量および血小板の計数は、±１０％以内であった。血小板／白血球は、灌流前に、キナクリン－ＨＣｌ（メパクリン；Ｓｉｇｍａ）を濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、室温で１５分間インキュベーションすることによって可視化した。フィブリンは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識したマウスモノクローナルＩｇＧ（ＨＢ－８５４５；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州）を５０μｇ／ｍＬ濃度で血液中に使用した際の結合を可視化した。上記抗体は、ヒト／マウスフィブリンβと相互作用するが、フィブリノーゲンＢβ鎖には作用しない。
ヒトの天然のまたは再構成されたＰＲＰのＴＧ分析 ＰＲＰは、終濃度１２．９ｍＭ クエン酸三ナトリウムとなるように採集した血液から、２５℃、２５０ｇで１０分間遠心分離して調製した。１，５００ｇで１０分間遠心分離したＰＲＰから得た相同なＰＰＰを用いて希釈することによって、血小板数を１８０・１０３／μＬに調整した。再構成されたＰＲＰを、洗浄済みの血小板を用いて調製した。この血小板は、１／５体積の酸性クエン酸デキストロース（７１ｍＭクエン酸、８５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１１１ｍＭデキストロース、ｐＨ４．５）および５Ｕ／ｍｌアピラーゼと混合した正常なＰＲＰから調製した。１，５００ｇで１０分間遠心分離した後、血小板ペレットを、正常であるかまたは特定の凝固因子を欠失しているかのどちらかでありかつ予め３０～５０μｇ／ｍＬ ＣＴＩを添加されたＰＰＰに再懸濁し、最終的な血小板数を１８０・１０３／μＬとした。トロンビンによる基質Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣの切断によって生じる、反応中の蛍光強度を、分光蛍光光度計にて３７℃で４０分までの間、継続的に測定した。トロンビンのバーストの傾き（ｎＭ／分）は、トロンビン濃度のピーク高を、誘導から発生までの時間マイナス遅延時間、すなわち誘導から３ｎＭ生成トロンビンとなるまでの時間として定義されるもので割ることによって算出した。内在性トロンビン生成能（ＥＴＰ、すなわち総生成トロンビン活性）は、ＴＧ曲線下の面積から決定した。不連続２段階ＴＧアッセイは、０．１５ｐＭ ｒＴＦおよび１８ｍＭ ＣａＣｌ２を、３０μｇ／ｍＬ ＣＴＩおよび４００ｐＭ ＷＴ ＦＶＩＩａまたはｉＦＶＩＩａを含みかつ２０ｐＭ ＦＩＸａ不在／存在のＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中に添加することによって開始した。他の実験では、ＴＧを、ＴＦ－ｉＦＶＩＩａ－ＦＸａ－ＴＦＰＩまたはＴＦ－ｉＦＶＩＩａ－ＦＸａ－ＮＡＰｃ２によって誘導した。５ｎＭ ＦＸａ、１０ｎＭ ＴＦ、１０ｎＭ ｉＦＶＩＩａ、および４０ｎＭ ＴＦＰＩまたはＮＡＰｃ２を、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、３７℃で１２０秒間インキュベーションすることによって、安定な複合体を予め形成した。複合体を、ＦＶＩＩ欠損ＰＲＰ中に添加した後、３７℃で８分間インキュベーションした。
精製構成成分を含む反応中での凝固活性化 ＴＦ－ＦＶＩＩａを含む安定なＦＸａ複合体によるＦＶＩＩＩの活性化は、ＴＦＰＩα，の存在または不在下、ＦＶＩＩＩ、ＦＶ、およびレピルジンを含有し、３７℃での３０～１２０秒間のインキュベーションを伴う反応中にて試験した。唯一の活性プロテアーゼとしてＦＸａを含む安定な複合体は、１）２００ｐＭ ＦＸａ、４００ｐＭ ｒＴＦ、５００ｐＭ ｉＦＶＩＩａ、４０ｎＭ ＮＡＰｃ２、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２；２）１００ｐＭ ＦＸａ、５０ｐＭ ｒＴＦ、１００ｐＭ ｉＦＶＩＩａ、５ｎＭ ＮＡＰｃ２、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む反応中で、３７℃で１２０秒間インキュベーションして調製した。添加されたＦＶａが遊離のＦＸａによるＦＶＩＩＩａの生成に及ぼす効果は、１０ｐＭ ＦＸａを含む反応中で、５０ｐＭ ｒＴＦおよび基質とともに３７℃で１８０秒間インキュベーションして試験した。ヒルゲンがＦＩＩａによるＦＶＩＩＩａの生成に及ぼす阻害効果は、０．５ｎＭ ＦＩＩａを含む反応中で、５０ｐＭ ｒＴＦおよびＦＶＩＩＩとともに３７℃で１８０秒間インキュベーションして試験した。
ＴＦ－ＦＶＩＩａによる基質のターンオ－バーは、リン脂質を含まず、１０ｎＭ ＦＶＩＩａ、１μＭ ＦＸ、および２μＭ 可溶性ｒＴＦ１－２１８を含有する反応における、ＦＸａの生成から評価した。ＦＶａは、プロトロンビン活性化アッセイにて力価測定し、このアッセイでは、１０ｐＭ ＦＸａを１μＭ プロトロンビン、５０ｐＭ ｒＴＦ、および７００ｐＭ ＦＶＩＩＩとともに１８０秒間インキュベーションした。
ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＩＸの活性化は、１５０ｎＭ ＦＩＸを５０ｐＭ ｒＴＦ、２００ｐＭ ＦＶＩＩａ、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２とともに含有する反応にて、３７℃で３０分間インキュベーションして試験した。．１０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて反応を終了させた後、エチレングリコール（３７％、体積／体積）の存在下、発色基質ＣＨ３ＳＯ２－（Ｄ）－ＣＨＧ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－パラ－ニトロアニリド・ＡｃＯＨ（Ｐｅｆａｃｈｒｏｍｅ ＦＩＸａ、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ、バーゼル、スイス；１ｍＭ）を用いてアミド分解活性を動態学的に測定することによって、ＦＩＸａ活性を決定した。ＦＩＸａの較正曲線は、既知濃度のＦＩＸａを用いて作製した。
ＦＶＩＩＩａの凝固活性の測定 ＦＶＩＩＩａが生成した反応物のアリコートを、ＦＶＩＩＩ欠損血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ）中に添加し、次いで、１０ｎＭ ＦＩＸａ、２０μＭ ＰＬ および８ｍＭ ＣａＣｌ２と混合した。ＦＶＩＩＩａの凝固活性は、トロンビンにより活性化された既知濃度のＦＶＩＩＩａを用いて作製した較正曲線を使用して定量した。
マウスにおける塩化鉄により誘導された血栓症 傷害後の最初の閉塞までの時間とは、非傷害の動脈で測定された値の＜１０％にまで血流が減少するのに必要な時間である。流動指数とは、３０分内に傷害のある動脈を通って流れる血液体積（ｍＬ／分で測定された流量および毎秒サンプリングされた流量の積分）と、非傷害の動脈における流量の期待値（傷害前の１分間に測定される流量に３０を乗じて算出される）との比である。
実施例３７
高感度かつ迅速なトロンビン生成アッセイ
本明細書に開示されるのは、抗血友病内在性経路によって血漿中に生産される初発の少量のトロンビンを選択的に決定するための、高感度かつ迅速なトロンビン 生成 アッセイの組成物および方法であり、これらによって、先天性および後天性の 出血 障害および血栓性の 合併症をさらに正確に査定することが可能になる。
血液凝固酵素であるトロンビン（ＦＩＩａ）は、安定なフィブリン凝塊を形成することにより、大出血の防止および自然発生の出血の停止（すなわち「止血」）を担うが、その一方で、ＦＩＩａの過剰形成は、心臓発作および脳卒中を含めた致死性の血管の疾患「血栓症」を引き起こすことがある。現在広まっているＦＩＩａ生成（ＴＧ）のスキームでは、組織因子（ＴＦ）と活性の因子（Ｆ）ＶＩＩａとの外因性経路複合体が、タンパク質分解反応のカスケードを開始し、このカスケードは、活性の補因子ＦＶａとともにプロトロンビナーゼ複合体を形成する第１相で、ＦＸａを産生し、初発の少量のＦＩＩａを生成する。初発で生産されたＦＩＩａは、プロトロンビナーゼ複合体の活性を増強することによってＦＩＩａ生成（ＴＧ）を増幅し、第２相の生成ＦＩＩａのバーストに導く。本発明者らは、初発のＦＩＩａがプロトロンビナーゼ複合体の活性を増強することに資する分子機構が、以下の通りであることを発見している。すなわち、１）初発のＦＩＩａが、プロトロンビナーゼ活性に不可欠な活性のリン脂質表面を提供する、血小板の活性化を惹起する；２）ＦＩＩａが、ＦＶをＦＶａへと直接的に活性化することによって、プロトロンビナーゼ複合体の形成を増加させる；３）ＦＩＩａが、内在性のＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ経路の活性化によって、ＦＸａの生成を促進する、である。ＦＩＩａは、必須の補因子であるＦＶＩＩＩを、プロテアーゼＦＩＸａのための活性のＦＶＩＩＩａへと、直接的に活性化する。さらに、ＦＩＩａは、ＦＩＸをＦＩＸａへと間接的に活性化するが、この活性化は、酵素原ＦＸＩの酵素ＦＸＩａへの活性化によって媒介され、ＦＸＩａは、次いで、ＦＩＸをＦＩＸａへと活性化する。最後に、大量の生成ＦＩＩａは、フィブリノーゲンを、止血および血栓症に不可欠なフィブリンに変換する。このように、最初に生成されるＦＩＩａは、血液凝固の程度の決定要因として機能し、このことは、初発のＴＧを決定することによって、出血障害および血栓性の合併症をさらに正確に査定するための診断のアプローチがもたらされることを示唆する。
本願で開示されるＴＦ依存的なＦＶＩＩＩ活性化経路は、ＦＶＩＩＩのフィードバック活性化の前にＦＶＩＩＩ活性化機構がＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ開始複合体中の新生ＦＸａによって媒介されるものであり、血漿中の初発のＴＧにおいて鍵となる役割を持つ。新規の機構論の概念に基づき、本発明者らは、血漿中のＦＶＩＩＩａ依存的な初発のＴＧを決定するための新規の組成物および方法を開示している。本アッセイでは、極端に低い濃度（例えば１５０ｆＭ）の再脂質化組換えＴＦ（ｒＴＦ）およびＦＩＸａ（例えば２００ｐＭ）を組み合わせて添加することによって、ＴＧを開始し、その後、ＦＩＩａ基質を３７℃で４０分間用いて、生成ＦＩＩａを継続的にモニタリングする（いわゆる「連続ＴＧアッセイ」）。この連続ＴＧアッセイでは、ＦＶＩＩＩａは、ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａ開始複合体によって生産され、生成されたＦＶＩＩＩａは、ＦＩＸａにより生成されるＦＸａを増加させることによって、ＴＧを促進する。そのため、このＴＧアッセイは、先天性の／後天性のＦＶＩＩＩａ－欠損症の血友病Ａ患者および抗血栓療法で治療されている対象における、機能的なＦＶＩＩＩａのレベルと出血のエピソードとの関係を定義するための、有用なアプローチを提供する。
さらに、本発明者らは、ＴＧの量の迅速な決定を可能にする別のアッセイを開示している。一実施形態では、この新しいアッセイは、患者でのＴＧを決定するための標準化および自動化された方法を提供することがある。本発明者らは、抗血友病内在性経路によって生産される初発の少量のＦＩＩａを選択的に決定するための、迅速かつ高感度なＴＧアッセイの新規の構成成分および方法を開示している。この新規のアッセイによって、先天性および後天性の出血障害さらに正確な自動化された査定が可能になる。本アッセイは、従来の凝固アッセイを置き換える、臨床診断用の臨床検査として利用される可能性がある。
高感度のＴＧアッセイ方法を確立するために、本発明者らは、動態学的パラメーターを決定することにより、高い親和性とターンオ－バー速度とを持つＦＩＩａ基質のスクリーニングを作出し、次いで、既知濃度のＦＩＩａキャリブレーターを用いて、較正曲線を作製した。研究にて、我々は、２種の発光発生基質Ｈ－Ｄ－シクロヘキシル－アラニル－アラニル－アルギニル－アミドメチルクマリン（ＡＭＣ）（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ）およびブチルオキシカルボニル－バリル－プロリニル－アルギニル－ＡＭＣ（Ｖ－Ｐ－Ｒ－ＡＭＣ）が、検出限界約５ｐＭの極めて低濃度のＦＩＩａ活性の定量に適していることを見出した（図１７）。初発のＴＧは、高感度の基質を使用した「不連続２段階アッセイ」を用いて測定した。簡単に述べれば、ｒＴＦとＦＩＸａとを組み合わせて１８ｍＭ ＣａＣｌ２とともに血漿中に添加することによって、ＴＧを開始した後、３７℃で５分までの間インキュベーションした。インキュベーション後、２０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて反応を終了させ、高感度のＦＩＩａ基質Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨまたはＶ－Ｐ－Ｒ－ＡＭＣを用いて生成ＦＩＩａを測定した。アッセイでは、１５０ｆＭ ｒＴＦおよび２００ｐＭ ＦＩＸａを組み合わせて添加することによって、健康なドナーから調製された正常な血小板を欠乏した血漿（ＰＰＰ）中で、ＦＩＩａが時間依存的に生産された（図１８Ａ）。ｒＴＦ（９．４～６００ｆＭ）およびＦＩＸａ（６．３～４００ｐＭ）を用いた力価測定実験では、初発のＴＧに２種の開始物質の用量依存性が示された（図１８Ｂ、図１８Ｃ）。さらに別の実験では、８０％ホスファチジルコリン／２０％ホスファチジルセリン（ｍｏｌ／ｍｏｌ）からなるリン脂質（ＰＬ）ベシクル（０．０８～２０μＭ）の添加によって、ＰＰＰ中の初発のＴＧが劇的に増強されることが標示された（図１８Ｄ）。さらに本アッセイ方法の妥当性を確認するために、手動のアッセイプロトコールを用いてアッセイ内および－アッセイ間の変動係数（ＣＶ）を決定することによって、本ＴＧアッセイ方法の再現性を検討した。アッセイ内とアッセイ間のどちらのＣＶ値も、＜１５％と算出され（図１９）、このことは、これが、信頼性の高いＴＧアッセイ方法であることを標示する。
正常なＰＰＰ中に添加された抗ＦＶＩＩＩ阻害性のモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）が、ＰＬとともに１５０ｆＭ ｒＴＦ／２００ｐＭ ＦＩＸａによって誘導された初発のＴＧに及ぼす効果を試験することによって、ＦＶＩＩＩａ依存的なＴＧを立証した（図２０）。初発のＴＧを、血友病Ａ患者から調製されたＦＶＩＩＩ欠損ＰＰＰ中で検討した。ＴＦ／ＦＩＸａおよびＰＬを添加することによって誘導された正常なＰＰＰ中の初発のＴＧに比べて、はるかに少ないＴＧが、抗ＦＶＩＩＩ阻害剤抗体（９６、１３３、および１７６ベセスダ単位／ｍＬ）の不在および存在下の患者由来のＰＰＰ中に観察された（図２１Ａ）。１ベセスダ単位は、正常な血漿中で１単位のＦＶＩＩＩ活性の５０％を中和する阻害剤の量として定義される。さらに重要なことに、阻害剤を含まないＦＶＩＩＩ欠損ＰＰＰに血漿由来のＦＶＩＩＩ（０．１～１．６ＩＵ／ｄＬ）を補充した際には、初発のＴＧは、用量依存的な様式で増強された（図５Ｂ）。結果は、初発のＴＧの不連続２段階アッセイが、ＦＶＩＩＩａ依存的なＴＧが特異的に決定すること、およびそれが、血漿中のＦＶＩＩＩａ活性の検出では、以前に開示されている連続ＴＧアッセイと同様の感度を有することを、明確に標示している（図５Ｂ）。このように、このアッセイを使用して、重度の血友病Ａ患者でさらに正確にかつ迅速に出血リスクを予測することができ、それによってＦＶＩＩＩ産物を用いた補充療法が改善される。．
ビタミンＫアンタゴニストであるクマジン（ワルファリン）は、血栓性の疾患を防止するために広く使用されている。クマジン治療は、命に関わる重篤な大出血を引き起こすことがあることから、患者は、通常、国際標準比（ＩＮＲ）試験によってモニタリングされる。ＩＮＲ値は、ｒＴＦを用いた従来の凝固アッセイ（いわゆるプロトロンビン時間アッセイ）によって決定される。ＩＮＲ値が初発のＦＶＩＩＩａ依存的なＴＧと相関するか否かを明らかにするために、クマジン治療患者由来の各種ＩＮＲ値を用い、ｒＴＦおよびＦＩＸａを添加することによって、ＰＰＰ中の初発のＴＧを試験した。初発のＦＶＩＩＩａ依存的なＴＧは、それぞれ１．５および２．９のＩＮＲを有する患者血漿では、正常な血漿の約１５％および約５％に低減したが、尤も、それよりはるかに高いＩＮＲ値を有する血漿ではＴＧは完全に消失した（図２２）。これに対して、血漿中にＦＩＸａを含まず１．２ｐＭ ｒＴＦのみを添加することによって決定されたＦＶＩＩＩａ非依存的なＴＧは、さらに低いＩＮＲでさえ消失した。それらの結果は、直接的なＴＦ経路によるＦＶＩＩＩａ非依存的なＴＧとは対照的に、抗血友病内在性経路によるＦＶＩＩＩａ依存的なＴＧが、クマジン治療患者中で持続されることがあり、それによりおそらくは止血に寄与することを示唆している。このように、ここに発明された本アッセイ方法は、患者における出血リスクの個別化予測の助けとなることがある。また、ＦＶＩＩＩａ非依存的なＴＧと依存的なＴＧのアッセイの組合せは、薬剤の投薬量のさらに洗練された決定を可能にすることがあり、ＦＶＩＩＩａ非依存的なＴＧを決定することにより血栓症を阻害するための、一方で、ＦＶＩＩＩａ依存的なＴＧを決定することにより充分な止血性の機能を保持するための、薬剤の投薬量とする。要約すると、この開示は、血漿および血液中にＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体を介して特異的に抗血友病内在性経路によって生産された初発の少量のＦＩＩａを決定するための高感度のアッセイの診断検査キットおよび方法を提供する。本キットは、ｒＴＦ、ＦＩＸａや、ＰＬなどの凝固因子および高感度のＦＩＩａ基質から構成される。本新規のアッセイは、出血の表現型の特徴をさらに正確に明らかにすること、および先天性および後天性の血友病Ａ患者および抗血栓治療下の個体における出血リスクを予測することを、可能にするものと思われる。
プロトロンビン時間（ＰＴ）や活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）などの従来の凝固アッセイは、自動化された臨床検査として広く使用されているが、それらは、凝固反応の些少な変化の特徴を明らかにする際に、ならびに患者での大出血および血栓形成のリスク予測する際に、感度が非常に低いという決定的なデメリットを有する。一方、元々はＨｅｍｋｅｒの研究室により開発された連続ＦＩＩａ生成（ＴＧ）試験は、そのような患者で、過剰凝固状態および出血性素因の診断の助けとするには充分な感度がある。しかし、凝固アッセイとは異なり、このアッセイは、自動化に馴染みかつ充分に標準化されているという点で強力なメリットはなく、それはなぜなら、このアッセイ方法が、非常に時間のかかるものであり（例えば４０～６０分）、アッセイ内およびアッセイ間に高い変動性を有するためである。このアッセイはまた、親和性が低いために大量のＦＩＩａ基質を必要とし、それゆえに診断キットの生産のコストがより大きく、販売製品の値段がより高いものとなる。そのため、臨床的な意思決定への連続ＴＧアッセイの適用は、上記の課題により依然として阻まれている。
本明細書に開示される新規の「不連続２段階ＴＧアッセイ方法」は、この課題を克服し、抗血友病内在性経路により生産された初発の少量のＦＩＩａを選択的に決定することによって、出欠に関連する凝固因子の変化および反応の検証に際し高感度を持つ迅速（１０分以内）かつ簡便なＴＧアッセイを提供する。例として、本明細書に開示されるアッセイおよび方法は、重度の血友病Ａ患者におけるＦＶＩＩＩのレベルを決定するために使用することができ（図２１Ｂを参照）、ＦＶＩＩＩ濃縮物を用いた治療をモニタリングするために、および濃縮物の効力を査定するために、有用となることがある。本アッセイはまた、機能性が向上しおよび／または安定性が増加したＦＶＩＩＩバリアントを特定するために、ならびに血友病Ａ治療のための効能および安全性が向上した新規の止血剤をスクリーニングするために、利用することができる。さらに、本明細書に開示される不連続ＴＧアッセイは、患者でより高い初発のＴＧを検出することによって、血栓性の障害を正確に予測することを可能にする。総合すると、本発明のＴＧアッセイは、従来の凝固アッセイを置き換えることが可能な臨床診断の臨床検査として利用されるべきである。
ここに開示されるアッセイは、血漿中のＴＦ開始複合体により駆動されるＦＶＩＩＩ活性化経路の発見に基づき、この経路は、止血に不可欠な凝固反応の開始および第１相で、ＦＩＩａ生成の増幅をサポートする。そのため、古典的なおよび従来のＦＶＩＩＩ活性アッセイとは対照的に、本願のアッセイは、生理的なＦＶＩＩＩ活性化の過程のこれまで認識されていなかった経路を査定することに関する追加の利点を有する。それゆえにこの高感度の方法は、ＦＶＩＩＩの活性化を阻害または促進する因子および基質を特定するために、および重度の血友病Ａ患者をさらに正確に分類するために、有用であることがあり、ＦＶＩＩＩ活性と出血エピソードの頻度および重症度とのさらに直接的な相関を確立し、出血リスクのさらに正確な予測に導く。
臨床スクリーニング検査は、自動化および標準化された方法を必要とする。以前の連続ＴＧアッセイとは対照的に、本明細書に開示される新規のＴＧアッセイは、生成ＦＩＩａをある特定の時点（例えば３分）で測定することによって、充分に自動化されさらに容易に標準化されたものとすることができ、患者での過小または過剰凝固状態の迅速かつ単純な臨床検査を提供する。さらに、それは、はるかに少ないコストの診断キットを提供することができ、なぜなら本キットが非常に少量の構成成分ｒＴＦ、ＦＩＸａ、ＰＬ、および高感度のＦＩＩａ基質を含むためである。このことは、本キットが商業化に大きなメリットを有することを標示する。
本発明者らの目標は、従来の凝固アッセイを置き換える新規の臨床検査を確立することであった。この目標のために、彼らは、補填的な方法のいくらかの改変を伴う新規のＴＧアッセイ方法を開発してきた。ここでの方法およびアッセイのＦＶＩＩＩ活性の診断用臨床検査への適用は、感度、特異性、および再現性を分析により決定することによって、および重度のＦＶＩＩＩ欠乏症の患者由来のＦＶＩＩＩスパイクされた血漿を用いて回収試験を実施することによって、妥当性を確認されている。クマジン－血漿を用いたさらに別の研究もまた、本アッセイが、患者についての血栓および出血のリスクの個別化予測に非常に有用である場合があることを支持する。アッセイ妥当性確認研究の結果に基づき、本発明者らは、試作品キットが凝固因子であるｒＴＦとＦＩＸａとＰＬ、および高感度のＦＩＩａ基質からなるものと決定している。
一実施形態では、本発明者らは、ｒＴＦ、ＦＩＸａ、ＰＬ、およびＦＩＩａ基質を含む凍結乾燥の試作品の診断キットを開示し、次いで、国際医療施設との共同研究で得られた臨床血漿試料を使用することによって、新規のアッセイの妥当性を確認している。これらの研究の目標は、新規のアッセイが、さらに詳細な血友病患者の分類と、抗血栓治療下の患者についての血栓および出血のリスクの予測とを可能にすることを証明することになろう。別の実施形態では、本明細書に開示されるアッセイおよびキットをさらに開発して、自動のデバイスおよび試薬キットを作り出す。
実施例３８
新規の凝固機構は、出血/血栓症リスクの個別化評価および抗血栓療法をサポートする。
安全で有効な抗血栓療法は、血栓症を妨げるとともに正常な止血を最小限に減じることを目標とする機構をより良く理解することが必要である。本開示は、生理的な因子（Ｆ）Ｘａ阻害物質に抵抗性がある外因性組織因子（ＴＦ）凝固開始複合体のこれまで認識されていなかった機能を示す。内在性ＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）は、プロトロンビナーゼ補因子ＦＶの活性化と直接的なＴＦ誘導性の血栓形成とを制御するが；ＴＦ－ＦＶＩＩａに会合している新生ＦＸａによる抗血友病補因子ＦＶＩＩＩの選択的な活性化を制御しない。ＴＦ経路による内在性ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体の直接的な活性化は、内在性阻害剤による制御だけではなく、治療用量のＦＸａ指向性の経口抗凝血剤による制御をも逃れる。これらのＦＸａ阻害剤は、ＴＦによる直接的な凝固活性化を制限するにも関わらず、ＴＦ開始複合体によるフィードフォワードのＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの活性化を保持し、それゆえ、抗血栓治療中の止血にさらに小さく干渉する。これらの知見は、広く処方されている特異的なＦＸａおよびトロンビン（ＦＩＩａ）の阻害剤であるビタミンＫアンタゴニストに関連する、個々の出血リスクｖｓ抗血栓効能を予測するための新規のアッセイフォーマットの使用、ならびに現在開発中のＦＸＩを標的とするストラテジーを支持するものである。
現在公知の凝固のパラダイム（図１Ａ）は、共通の凝固経路の鍵となるプロテアーゼであるＦＸａおよびトロンビンを標的とする薬剤が、複数の凝固因子に影響を及ぼすビタミンＫアンタゴニスト（ＶＫＡ）に匹敵する抗血栓効能のために用量投与した際に、重度の出血および頭蓋内出血のリスクを低減するという、充分に文書で立証された観察を容易に説明することができない。この結論に対する報告された例外、例えば胃腸内出血などは、全身的な止血の阻害というよりも、活性の経口薬剤の器官特異的な濃度が治療的な血漿中レベルを超えたことの結果である可能性がある。外因性ＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体の新規の機能はここに開示されており、言い換えれば、トロンビンフィードバックループとは独立した、ＦＶＩＩＩ抗血友病補因子の選択的なフィードフォワード活性化が示されている。この新生ＦＸａの特異的な反応は、ＴＦＰＩαを含めた生理的な凝固阻害物質による制御を逃れる。これまで認識されていたＴＦ－ＦＶＩＩａのＦＩＸａ抗血友病プロテアーゼ生成能と併せて、直接的なＦＶＩＩＩの活性化は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ開始性凝固の中に完全に組み込まれかつ共通の凝固経路の古典的な直接的な活性化に先立つ、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ活性への経路を完成するものである（図１Ｂ）。
一実施形態では、本発明者らは、限られた濃度の再脂質化された組換え組織因子（ｒＴＦ）を用いて被覆された表面の上を流れる血液中で凝固が開始された際に、内在性テナーゼプロテアーゼであるＦＩＸａの活性化が別個の個体のパターンを辿ることを示している。さらに、ＴＦ－ＦＶＩＩａを含む複合体中の新生ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化は、内在性ＦＸａ阻害物質と同じ量の薬理的な阻害物質に抵抗性を有し、このことは、標的選択的な抗凝血療法の間に止血が保持されることを説明することができる。とはいえ、予期しないことに、別個の凝固経路がトロンビン生成に及ぼす寄与を選択的に評価する条件下で試験した際に、ＦＸａおよびトロンビンを標的とする経口の抗凝血剤の効果は、個体間で多様である。このことは、各種凝固開始経路および増殖経路の相対的な機能を評価するためにフォーマット化された検査アッセイに基づいて、出血および血栓のリスクを査定するための新しい展望をもたらす。重要なことに、この新しいアッセイフォーマットは、現在考えられていることとは対照的に、標的化された経口の抗凝血剤が、全ての個体において一定の投薬量では同等に有効ではない場合があることを明らかにする。
本発明者らは、ＦＩＸからＦＩＸａへの活性化の際にＦＸＩａおよびＴＦ－ＦＶＩＩａを生成するトロンビンフィードバックループの相対的な役割を比較するための、カルシウム再加されたクエン酸添加全血を用いた流れベースのアッセイを本明細書に開示している。この帰結のために、ＦＶＩＩＩａおよびＦＩＸａの活性に依存した凝固の活性化およびフィブリンの沈着をサポートすることが以前に示されている限定濃度のｒＴＦで被覆された表面の上に、１０人の正常な個体から得た血液を灌流した（図１６を参照）。そこでは、灌流中の壁せん断速度を３００ｓ－１で維持した。対照として、トロンビン生成とは独立して血小板の接着および凝集をサポートする線維コラーゲンＩ型の表面に、同じ血液試料を灌流した。トロンビンフィードバックループによるＦＸＩａかまたはＴＦ－ＦＶＩＩａをそれぞれ通じたＦＩＸａ生成を選択的に阻害するための特異的なモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を用いて、ＦＸＩａおよびＴＦの活性を遮断した。予想通り、コラーゲン表面で、血小板凝集体の体積は、凝固経路を阻害することによる影響を受けなかったのに対して、フィブリンの沈着は、抗ＦＸＩａ ＭｏＡｂによって顕著に減少し、抗ＴＦ ＭｏＡｂによって本質的に影響を受けなかった（図２３Ａ～Ｂ）。これらの結果は、コラーゲン表面での凝固の活性化が、ＦＸＩＩａ依存的な接触経路を通じたＦＸＩａ生成によって開始されるという見解に一致する。
ｒＴＦ表面では、驚くべきことに、得られた結果は、２つの別個のパターンの凝固開始を描き出した。供試された１０人の正常な個体のうち６人では、フィブリン形成が、ＦＸＩａ活性の阻害に対する感受性を持たなかったが（図２３Ａ）、残りの４人では、抗ＦＸＩａ ＭｏＡｂが、ＴＦ開始性の凝固およびフィブリン形成が有意に低減した（図２３Ｂ）。全ての試料で、抗ＴＦ ＭｏＡｂは、フィブリン沈着を本質的に消失させ（図２３Ａ～Ｂ）、このことは、選ばれた実験条件下でのトロンビン生成に必要なＦＶＩＩＩａの活性化においてＴＦ－ＦＶＩＩａ－新生ＦＸａの持つ、最近実証された鍵となる役割に一致する。フィブリンの体積とは異なり、ＦＸＩａ活性を阻害することによって、ＴＦ表面で血小板凝集体の体積が有意に減少した試料はなく、その一方で、それは、ＴＦ活性の遮断によって様々に減少したが、ＦＸＩａ活性がトロンビン生成およびフィブリン形成に寄与していた上記の４試料でのみ大幅に減少した（図２３Ａ～Ｂ）。
ＦＶＩＩＩａ依存的な凝固が、ＦＩＸａの利用可能性によって制限されることから、これらの知見は、約６０％の正常な個体で、トロンビンフィードバックによるＦＸＩの活性化が、ＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ複合体の形成のためのＦＩＸａをＴＦ－ＦＶＩＩａから得る内在性テナーゼ依存的な凝固にとっては制限とはならないことを標示する。約４０％の正常な個体では、その代わりに、ＦＸＩａによるＦＩＸａ生成がフィブリン形成に必要であり、それゆえ、ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＩＸａ生成は、正常な凝固に寄与することができない。外因性経路により生産されるＦＩＸａと、Ｘを活性化する内在性Ｘａｓｅ複合体内で機能するためのその能力は、血管の損傷に続く凝血原応答の開始相と持続相の両方に必要なＸａの生産に重要な役割を果たすことがあることが、早期に示唆されていた。現時点で、本発明者らは、新たに開発された凝固アッセイフォーマットを流れの下で用いることで、ＦＩＸａ生成に導く機構が、標的特異的な抗凝血薬剤の効果に関して潜在的な意義を有する可能性がある個々の変量であることを見出している。最も明らかな例は、ＦＸＩの血漿中濃度を減少させる新しいカテゴリーの化合物であり、これらの化合物は、ＦＸＩａ－トロンビンフィードバックループ由来のＦＩＸａが凝固の増幅の鍵であるという現在広まっている仮説の上で開発されている。このデータは、それらの効果が、ＴＦ－ＦＶＩＩａから生じるＦＩＸａの影響が限定的であることを示すおそらくは６０％もの患者では、様々に変動するはずであることを示唆している。
ＦＸａを標的とする抗凝血剤であるリバーロキサバンおよびアピキサバンの効能を、異なる治療下の個体で評価した。リバーロキサバンおよびアピキサバンは、ＦＸａプロトロンビナーゼ活性をそれぞれＩＣ５００．４３±０．０６および１．０８±０．１１ｎＭで互角に阻害する（図２４Ａ）。治療濃度の５０～４５０ｎＭでは、予め活性化されたＦＸａを含有する精製構成成分を含む反応中で、両方ともＦＶＩＩＩａ生成を約９０％阻害した。ここでは、ＦＸａは、遊離であるか、またはＴＦと活性部位の変異したＦＶＩＩａ（ｉＦＶＩＩａ）とを含み線虫抗凝血タンパク質（ＮＡＰ）ｃ２により安定化された複合体であるかのどちらかであった。これに対し、最初にＦＸを含有していた反応では、新生のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるＦＶＩＩＩａ生成は、僅かに影響を受けたに過ぎなかった（図２４Ｂ）。２種のＦＸａ阻害剤に対する抵抗性は、ＴＦ－ＦＶＩＩａにより新たに生成されたＦＸａの特異的な特性であったが、それはなぜなら、ラッセルマムシ毒（ＲＶＶ）ＦＸアクティベーターによりｉｎ ｓｉｔｕで生産された等濃度のＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化を、リバーロキサバンが阻害したためである（図２４Ｃ）。観察された阻害の喪失が、ＦＸａと相互作用する阻害剤についての酵素原からプロテアーゼへの立体配座の遷移における動態学的なデメリットを反映するか否かを評価するために、本発明者らは、活性のプロテアーゼの立体配座を採る能力を制限する、Ｖ１７Ｍ置換を持つＦＸａを試験した。ＴＦ－ｉＦＶＩＩａ－ＮＡＰｃ２との安定な複合体では、ＦＸａＶ１７Ｍは、ＦＸａ ＷＴよりも効率は劣るものの、ＦＶＩＩＩａを生成することができた。しかし、この活性は、５ｎＭまでのリバーロキサバンには感受性がなかったのに対し、１ｎＭでは、ＦＸａ ＷＴによるＦＶＩＩＩ活性化がほぼ完全に阻害された（図２４Ｄ～Ｅ）。このように、酵素原からプロテアーゼへの遷移の動力学は、新生ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの機能への直接的ＦＸａ阻害剤の干渉の制限に寄与する。
この結果は、ＦＸａ－選択的なリバーロキサバンおよびＶＫＡワルファリン－後者はＦＸａおよびＦＩＩａに加えてＦＶＩＩａおよびＦＩＸａの機能に影響を及ぼす－の抗血栓効果が、治療患者の個々での基盤に応じて変わる可能性があったことを示唆した。この仮説を試験するために、本発明者らは、２種の抗凝血薬剤を受けていた患者由来の血液の流れに曝露された固相化ｒＴＦ上への、血小板の凝集およびフィブリンの沈着を、非処理対照と比べて測定した（図２５）。アッセイ条件は、図２に示されたような実験に使用された通りであったが、凝固の開始が、非処理対照由来の血液中のＦＶＩＩＩａ活性によってもはや完全には制限されないものとなるように、表面のＴＦ濃度を増加させた。表面の被覆に用いるＴＦのモル濃度は、ＴＦ－ＦＶＩＩａによる直接的なＦＸａ生成として測定した個々のｒＴＦロットの持つ異なる特異的な凝血原活性を考慮して調整した。２つの異なるＴＦ濃度を試験すると、ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔ，低い方のＴＦでは、沈着フィブリンの体積は、ワルファリンまたはリバーロキサバンのどちらかを用いて治療された患者で、対照よりも顕著に小さかったが、高い方のＴＦでは、それはリバーロキサバン治療患者で、ワルファリンよりも有意に大きかったことが見出された（図２５Ａ）。さらに、高い方のＴＦ表面では、治療患者血漿中で測定されたピーク濃度範囲でリバーロキサバンを正常な血液に添加することによって、フィブリンの体積が部分的に低減したが、それ自体で中程度の阻害を生じる抗ＦＶＩＩＩ ＭｏＡｂの存在下では、ほぼ完全に低減した（図２５Ｂ－Ｃ）。これらの知見は、ピーク濃度であっても、選択的なＦＸａ標的化阻害剤は、生理的な阻害物質による制御下の血流中で内在性凝固を直接的に可能にする新たに明らかになったＴＦ開始性経路を、別個に保持することができることを実証する。
これらの研究は、ワルファリン、リバーロキサバン、または直接的なトロンビン阻害剤であるダビガトランを用いて治療されていたさらに大きな患者のコホートから得られた血液中の血小板の凝集およびフィブリンの沈着を測定することによって、拡大された。全ての抗凝血レジメンが長期間であり、患者は、現在承認されているプロトコールに従って投薬を受けていた。ワルファリン治療患者は、定期的に、ＩＮＲ凝固指標を測定することによってモニタリングされた。リバーロキサバンまたはダビガトランを用いて治療されていた患者は、凝固の変化を測定されることなく、現行の処方通りに固定用量の薬剤を受けた。全ての試験は、治験審査委員会によって認可および監督され、ヒト対象での実験行為に関する標準プロトコールに従って実施された。同じ実験的なアプローチを、図２に示されるような試験に使用し、線維コラーゲン１型または異なるｒＴＦ濃度を用いて被覆した表面の上に、カルシウム再加されたクエン酸添加全血を、壁せん断速度３００ｓ－１で５分間灌流した。コラーゲン表面上で、対照の非処理試料中または３種の抗凝血レジメンのいずれかを用いて治療された患者由来の試料中に形成された血小板凝集体の平均体積は、有意な差はなかったが、尤も、何人かの患者では、特にトロンビン阻害剤であるダビガトランを用いて治療された患者では、対象群で測定された最低値を下回っていた（図２６）。この結果は、トロンビンが、血小板の活性化および凝集を補強することができるものの、血小板は、コラーゲンに接着し、トロンビンの生成とそれによる刺激とは独立して活性化されて凝集体を形成するという見解に一致する。これに対し、沈着フィブリンの体積は、ワルファリンおよびダビガトランを受けていた患者では顕著に低減した－トロンビン生成の低減とトロンビン活性の阻害とをそれぞれ標示する－が、リバーロキサバンを受けていた患者では低減しなかった。実際に、後者では、沈着フィブリンの平均体積は、正常とは有意な差はなく、ワルファリン群およびダビガトラン群よりも有意に大きかった（図２６）。
ｒＴＦ表面では、興味深いことに結果は異なっていた。２通りの被覆濃度（２０および４０ｐＭ）を、図２５に示される実験にあるように試験し、図２６に示されるコラーゲンに関する実験にあるように、血小板凝集体および沈着フィブリンの体積を測定した。どちらのｒＴＦ表面でも、血小板凝集体の体積は、リバーロキサバンを受けていた患者では対照とは有意な差はなく；ワルファリンを受けていた患者では、代わりに、両方のｒＴＦ表面で有意に低減しており、ダビガトランを受けていた患者では、低い方のｒＴＦ濃度を用いた表面でのみ有意に低減していた（図２７Ａ）。これらの結果は、固相化ＴＦ上の血小板の接着および凝集が、ＴＦ誘導性の凝固の結果として生成されるトロンビンによりもたらされる活性化を必要とするという概念に一致する。この結果はまた、血小板凝集体の体積が、生成トロンビンおよびトロンビン活性のレベルの結果であって、それは、ワルファリンおよびダビガトランを受けていた患者では、使用された投薬量でリバーロキサバンよりも低いことを示す。フィブリンに関しては、全ての抗凝血治療患者は、低い方のｒＴＦ密度の表面に血液を灌流した際に、薬剤および使用された投薬量に関わらず、非処理対照に比べて顕著にかつ有意に沈着を低減した（図２７Ｂ）。しかし、表面ＴＦが高い方の濃度であった際には、ワルファリンおよびダビガトランを受けていた患者由来の血液のみが、依然として顕著に低減されたフィブリン形成を示したのに対し、多くのリバーロキサバン治療の試料は、正常範囲のフィブリン形成を示した（図２７Ｂ）。後者の結果は、ＦＸａ阻害剤であるリバーロキサバンが、新生のＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａによるＦＶＩＩＩの活性化を遮断せず、ＴＦ経路の生理的な阻害物質をもバイパスするＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａ内在性テナーゼ複合体の機能を保持することに一致する。
上に記載される様々な方法および手法は、本発明を実施するための複数の手段を提供する。もちろん、必ずしも全ての記載される目的または利点が、本明細書に記載される具体的な実施形態に従って達成されるわけではないことが理解されよう。それゆえ、例えば、本明細書に教示または示唆されることがあるような他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書に教示されるような１つの利点または利点のグループを達成または最適化する方式で、本方法を実施することができることを、当業者は認識することになる。種々の 有利なおよび不利な代替物が、本明細書に言及される。１つの、別の、またはいくつかの有利な 特長を具体的に含む好適な実施形態があれば、１つの、別の、またはいくつかの有利な 特長を具体的に除外するものもあり、さらに１つの、別の、またはいくつかの有利な 特長を含むことによって当面の不利な 特長を具体的に軽減するものもあることを理解されたい。
さらに、当業者は、異なる実施形態から様々な特長の適用性を認識することになろう。同様に、上記に議論された様々な要素、特長、およびステップ、ならびにそのような要素、特長、またはステップのそれぞれについての他の公知の等価物を、この技術分野の当業者は混合および適合して、本明細書に記載される原理に従う方法を実施することができる。様々な要素、特長、およびステップのうち、多様な実施形態に具体的に含まれることになるものもあれば、具体的に除外されるものもある。
本発明が、ある特定の実施形態および実施例のコンテクストで開示されているとはいえ、本発明の実施形態は、具体的に開示される実施形態を越えて、他の代替の実施形態および／または使用およびそれらの改変および等価物に延びることを、当業者は理解されよう。
数多くの変形および代替の要素が、本発明の実施形態に開示されている。さらに別の変形および代替の要素が、当業者に明らかになろう。これらの変形の中には、限定なく、本発明の組成物、ならびにそれを用いて診断、予知、または治療されることがある疾患および他の臨床的状態について、構成要素のモジュールの選択がある。本発明の様々な実施形態は、これらの変形または要素のいずれも具体的に含むか除外することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を記載および特許請求するために使用される、成分の量、濃度などの特性、反応条件を表す数字は、場合によっては用語「約」によって修飾されるものと理解されよう。したがって、いくつかの実施形態では、書面記載および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメーターは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメーターは、報告された有効数字の数と、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を示す数値範囲およびパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は、実施可能な限り正確に報告される。本発明のいくつかの実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含むことがある。
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明する文脈で使用される用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の言及は（特に以下の特許請求の範囲のある特定の文脈において）、単数形と複数形の両方をカバーするものと解釈することができる。本明細書での値の範囲の記述は、その範囲内にある別々の値のそれぞれに個々に言及する簡略な方法として役立つことを意図されているに過ぎない。本明細書に特段に標示のない限り、それぞれの個々の値は、本明細書中に個別に記述されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書中で特段に標示のない限り、または文脈により特段に明確に矛盾のない限り、任意の適した順序で実施することができる。本明細書のある特定の実施形態に関して提供される任意のおよび全ての例、または例示的な語（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く明示することを意図されているに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている以外の本発明の範囲に限定を置くものではない。本明細書中のいかなる語も、本発明の実践に不可欠な任意の特許請求の範囲に記載されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
本明細書に開示される本発明の代替の要素または実施形態のグループ分けは、限定であるものと解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、または本明細書に見出されるグループまたは他の要素の他のメンバーとの任意の組み合わせで、参照するおよび特許請求の範囲に記載することができる。利便性および／または特許性の理由から、1つまたは複数のグループのメンバーをグループに含めるか、またはグループから削除することができる。いかなるそのような包含または欠失が起こる際にも、本明細書は、そのグループを改変として含み、それゆえ添付の特許請求の範囲で使用される全てのＭａｒｋｕｓｈグループの書面記載を満たすものとみなされる。
本発明を実施するための本発明者らの知る最良の形態を含めて、この発明の好適な実施形態が本明細書に記載されている。これらの好適な実施形態の変形は、前述の記載を読んだ際に当業者に明らかとなるろう。当業者は、そのような変形を適切に採用することができ、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外に実践できるものと想定される。したがって、この発明の多くの実施形態は、適用法によって許容されるように、ここに添付されている特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変および等価物を含む。さらに、本明細書中に特段に指示のない限り、または文脈によって特段に明確に否定されない限り、その全ての可能な変形のうちの上記の要素の任意の組合せは、本発明に包含される。
さらに、この明細書を通して、特許および印刷刊行物に数多くの参照がなされている。上に引用した参考文献および印刷刊行物のそれぞれは、参照によりその全体が個々に本明細書に組み込まれる。
最後に、本明細書に開示される本発明の実施形態は、本発明の原理を説明するものであることを理解されたい。採用できる他の改変もまた本発明の範囲内とすることができる。ゆえに、限定ではなく例として、本発明の代替の構成を、本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明の実施形態は、図示および記載されるまさにそのようなものに限定されない。

Claims (10)

  1. 組織因子（ＴＦ）媒介性のＦＸａによるＦＶＩＩＩからＦＶＩＩＩａへの活性化に依存して又は依存せずに、血漿もしくは全血試料中で生成された、トロンビンの産物としてのフィブリンを測定するためのアッセイであって、
    （ａ）前記血漿もしくは全血試料をＴＦ、ＦＩＸａ、およびＣａＣｌ２と共にインキュベーションして、ＴＦによるＦＶＩＩＩの活性化を専ら介してフィブリンを生成し、及び前記血漿もしくは全血試料中のフィブリンを定量すること、ここで該ステップにおけるＴＦの濃度が１フェムトモル濃度（ｆＭ）と１ピコモル濃度（ｐＭ）との間である；及び
    （ｂ）前記血漿もしくは全血試料をＴＦおよびＣａＣｌ２と共に、但しＦＩＸａは用いずに、ＦＶＩＩＩの活性が阻害される抗体の存在下でインキュベーションしてＦＶＩＩＩの活性化に依存することなくフィブリンを生成し、及び前記血漿もしくは全血試料中のフィブリンを定量すること、ここで該ステップにおけるＴＦの濃度が１．２ｐＭと４００ｐＭとの間である、
    を含み、前記ステップ（ａ）及び（ｂ）は、任意の順で連続して、又は並行して行われる、アッセイ。
  2. 前記ステップ（ａ）において、前記血漿もしくは全血試料に添加されるＦＩＸａの量は、１μＭと１ｐＭとの間である、請求項１に記載のアッセイ。
  3. 前記ステップ（ａ）において、血漿もしくは全血試料をＴＦ、ＦＩＸａ、ＣａＣｌ２に加えてリン脂質と共にインキュベーションする、請求項１に記載のアッセイ。
  4. 前記血漿もしくは全血試料に添加されるＣａＣｌ２の量は、１ｍＭと９９９ｍＭとの間である、請求項１に記載のアッセイ。
  5. 前記血漿もしくは全血試料は、重度の血友病患者由来である、請求項１に記載のアッセイ。
  6. 前記ＴＦは、組換え組織因子（ｒＴＦ）である、請求項１に記載のアッセイ。
  7. １０分以内に完了させることができる、請求項１に記載のアッセイ。
  8. 新規の止血剤をスクリーニングするのに有用である、請求項１に記載のアッセイ。
  9. 新規の抗血栓剤をスクリーニングするのに有用である、請求項１に記載のアッセイ。
  10. （ｃ）血漿もしくは全血試料をＣａＣｌ２、ＴＦ、及びＴＦによるＦＶＩＩＩの活性を維持しつつＦＩＸの活性を阻止する抗－ＦＶＩＩａモノクローナル抗体、と共にインキュベーションし、及びＦＸＩ－介在性のＦＩＸａ生成に依存したフィブリンの生成を測定すること、をさらに含み、前記ステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は任意の順で連続して、又は並行して行われる、請求項１記載のアッセイ。
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