KR20070107783A

KR20070107783A - Ｐｄｅ11 조절자의 식별 방법

Info

Publication number: KR20070107783A
Application number: KR1020077021879A
Authority: KR
Inventors: 요아킴 슐츠; 마르코 그로스-랑엔호프
Original assignee: 니코메드 게엠베하
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2005-05-18
Publication date: 2007-11-07
Also published as: JP2008531025A; AU2005328605A1; CA2598593A1; WO2006092175A1; EP1856254A1; US20090298108A1; NO20074805L; IL185085A0

Abstract

본 발명은 신규한 GAF_A 도메인 함유 폴리펩타이드, 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 GAF_A 도메인, 및 아데닐레이트 사이클라제 촉매 도메인에 관한 것이다. PDE11 조절자의 식별 방법에서의 상기 폴리펩타이드의 용도도 또한 개시되어 있다.

Description

ＰＤＥ11 조절자의 식별 방법{METHOD FOR IDENTIFYING PDE11 MODULATORS}

본 발명은 인간 포스포디에스터라제 11(human phosphodiesterase 11, PDE11)의 GAF_A 도메인 및 GAF_B도메인, 및 아데닐레이트 사이클라제(adenylate cyclase)의 촉매 도메인을 포함하는 신규한 폴리펩타이드, 및 PDE11 조절자의 식별 방법에서의 상기 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.

포스포디에스터라제(PDE)는 진핵생물 단백질로서 환형 뉴클레오타이드인 cAMP 및 cGMP의 조절자로서 공지되어 있다. PDE는 3개의 유형(I형, II형 및 III형)으로 분류되며, 이들 중 11종의 PDE 부류(PDE1 내지 PDE 11로 지칭됨)를 갖는 I형만이 포유류에 존재한다.

GAF 도메인은 모든 생명체에 편재되어 있으며 단백질 구조 및 서열 비교에 기초하여 아브라빈트(Abravind) 및 폰팅(Ponting)에 의해 정의되었다(문헌[Abravind L. 및 Poting C.P.,: The GAF domain: An evolutionary link between diverse phototransducing proteins, 1997, TIBS, 22, 458-459]). PDE2, PDE5 및 PDE6은 소위 cGMP 결합 GAF 도메인을 포함하며, 이러한 결합 도메인은 PDE의 다른자리입체성(allosteric) 활성화의 역할을 한다.

인간 PDE11의 다양한 이소폼이 클로닝되고 이들의 특성이 분석되어 있다(문헌[Hetman 등, PNAS 2000, 97, 12891-12895] 및 문헌[Soderling 등, Current Opinion in Cell Biology 2000, 12, 174-179]).

아데닐레이트 사이클라제(AC)는 모든 생명체에서 ATP의 cAMP로의 전환을 촉진한다(문헌[Cooper D.M.: Regulation and organization of adenylyl cyclases and cAMP, 2003, Biochem J., 375(Pt. 3), 517-29] 및 문헌[Tang W.J. 및 Gilman A.G.: Construction of a soluble adenylyl cyclase activated by Gaα and forskolin, 1995, Science, 268, 1769-1772]). 서열 비교 및 구조적 고려사항에 기초하여, 상기 아데닐레이트 사이클라제는 5개의 유형(I형 내지 V형)으로 분류된다. 시아노박테리아(Cyanobacteria), 특히 CyaB1이 또한 속한, 노스토크 종(Nostoc sp.) PCC7120으로부터의 박테리아성 III형 AC는 분자 생물학적으로 중요하다. 상기 시아노박테리아 AC의 CyaB1 및 CyaB2는 또한 상기 PDE와 구조적으로 유사한 N-말단 GAF 도메인을 포함하지만 활성화 리간드로서 cAMP를 갖는다. 인간에 존재하는 III형 AC의 9개의 공지된 부류는 모두 막 결합성 단백질이고, G-단백질을 통해서 조절된다(문헌[Tang W.J. 및 Gilman A.G.: Construction of a soluble adenylyl cyclase activated by Gaα and forskolin, 1995, Science, 268, 1769-1772]). GAF 도메인과의 조합은 당해 기술분야에 공지되어 있지 않다.

래트 PDE2의 GAF 도메인과 아데닐레이트 사이클라제 CyaB2의 촉매 중심으로부터의 키메라(chimera)의 구축은 이미 공지되어 있다(문헌[Kanacher T., Schultz A., Linder J.U., 및 Schultz J.E.: A GAF domain-regulated adnylyl cyclase from Anabaena is a self-activated cAMP switch. 2002, EMBO J., 21, 3672-3680]).

인간 PDE11과 박테리아성 아데닐레이트 사이클라제의 키메라는 당해 기술분야에 공지되어 있지 않다. 또한, PDE11 조절자의 식별 방법에서의 이 같은 키메라의 용도도 또한 선행 기술분야에서 공지되어 있지 않다.

도 1은 PDE11/CyaB1 키메라의 아미노산 서열이다.

도 2는 PDE11/CyaB1 키메라의 cDNA 서열이다.

도 3은 정제 이후의 PDE11/CyaB1 키메라의 단백질 서열이다. 상기 단백질 서열에서 이탤릭체는 상기 발현 벡터(큐아젠(Quiagen)사의 pQE30)로 정제한 일자를 나타내고, 볼드체는 PDE11-GAF 도메인을 갖는 N-말단을 나타내고, 밑줄친 볼드체는 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인을 나타내고, V386은 클로닝 경계면의 삽입으로 인해 L386으로부터 변이된 것이고, 밑줄친 부분은 촉매 도메인을 갖는 CyaB1의 C-말단을 나타낸다.

도 4는 키메라 PDE11/CyaB1 폴리펩타이드의 계략적인 도면이다.

도 5는 환형 뉴클레오타이드를 통한 PDE11/CyaB1 키메라의 활성화를 보여주는 것이다. 시험 물질로서 cGMP 또는 cAMP를 이용하여 상기 분석법을 실시할 때 이는 도 5에 도시된 투여량 효과 곡선을 산출한다. 상기 PDE11/CyaB1 키메라는 1mM의 cGMP에 의해 약 4배 정도 활성화된다. 이는 400% 기본 값에 상응하며, cGMP가 PDE11A4-GAF 작용제임을 보여준다. cAMP는 1mM의 양에서 상기 PDE11/CyaB1 키메라 를 활성화시키지 못하며, 약 150% 기본 값을 갖는데, 이는 GAF 작용제도 GAF 길항제도 아님을 의미한다.

본 발명의 목적은 PDE11 조절자의 식별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 도메인이 기능적으로 서로 연결된 폴리펩타이드에 있어서, (a) 인간 포스포디에스터라제 11의 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인, 또는 이들의 기능적 등가 변이체들; 및 (b) 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인 또는 이의 기능적 등가 변이체들을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 및 상기 PDE11 조절자의 식별 방법에서의 이의 사용방법을 제공한다.

놀랍게도, 본 발명자는, N-말단의 인간 PDE11-GAF 도메인 및 아데닐레이트 사이클라제의 C-말단 촉매 중심으로 구성된 키메라 단백질이 효과기(effector) 분자로서 적합하다는 것을 발견하였다. 상기 키메라 단백질에서 상기 GAF 도메인은, 리간드를 형성하는 동안에 이들의 형태를 변형시켜, 판독(read-out) 도메인으로서 작용하는 상기 아데닐레이트 사이클라제 도메인의 촉매 활성을 조절하는 활성화 도메인이다.

또한 놀랍게도, 본 발명자는, cGMP가 작용제로서 상기 PDE11의 GAF 도메인을 선택적으로 활성화시킨다는 것을 발견하였다.

예를 들어, 상기 PDE11A4의 GAF 도메인이 CyaB1의 GAF 도메인과 단지 26%의 동일성을 나타내며 상기 PDE11A4의 GAF 도메인의 작용성 활성화 리간드가 현재까지 공지되어 있지 않기 때문에 이러한 결과는 특히 놀랄만한 것이다(문헌[Yuasa K., Kanoh Y., Okumura K., Omori K. Geneomic organization of the human phosphodiesterase PDE 11A gene. Evolutionary relatedness with other PDEs containing GAF domains, Eur J Biochem, 2001, 268, 168-78]).

본 발명은, 상기 PDE11의 촉매 중심의 결합 및 차단에 의해 작용하는 것이 아니라 상기 PDE11의 N-말단, 즉 GAF 도메인 상에서 다른자리입체성 조절을 통해 작용하는 PDE11 조절자, 즉 PDE11 길항제 또는 PDE11 작용제를 식별하는 것을 가능케 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 하기 도메인이 기능적으로 서로 연결된 폴리펩타이드에 있어서, (a) 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인, 또는 이들의 기능적 등가 변이체들; 및 (b) 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인 또는 이의 기능적 등가 변이체들을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

"인간 포스포디에스터라제 또는 PDE"란 용어는 cAMP 또는 cGMP를 상응하는 불활성화 5'-모노포스페이트로 전환시킬 수 있는 인간 기원의 효소를 의미한다. 상기 PDE는 이들의 구조 및 특성에 기초하여 다양한 부류로 분류된다. 특히, PDE11로도 지칭되는 인간 포스포디에스터라제 11은 cGMP를 불활성 5'-모노포스페이트로 전환시킬 수 있는 인간 기원의 효소 부류를 의미한다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 PDE11은 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인을 갖는 모든 PDE11을 포함한다. 상기 PDE11의 GAF 도메인은 연쇄(tandem) N-말단으로서 상기 단백질에 위치한다. 상기 N-말단에 가장 근접한 GAF 도메인은 GAF_A로서 지칭되고, 바로 다음에 위치한 도메인은 GAF_B로서 지칭된다. 상기 GAF 도메인의 시작과 끝은 단백질 서열 비교를 통해서 결정될 수 있다. 예들 들어, SMART 서열 비교(문헌[Schultz J., Milpetz F., Bork P., 및 Poting C.P.: SMART a simple modular architecture research tool: identification of signalling domains. 1998, PNAS, 95, 5857-5864])를 통해서 이소폼 PDE11A4: GAF_A에 대해 L240-L403(서열 번호 6) 및 GAF_B에 대해 V425-K591(서열 번호 8)이 수득된다.

"아데닐레이트 사이클라제"란 용어는 ATP를 cAMP로 전환시킬 수 있는 효소를 지칭한다. 따라서, 아데닐레이트 사이클라제 활성은 특정 시간 동안에 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 의해 전환된 ATP의 양, 또는 형성된 cAMP의 양을 나타낸다.

아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인은 상기 아데닐레이트 사이클라제가 ATP를 cAMP로 전환시키는 특성을 나타내는데 필요한 아데닐레이트 사이클라제 아미노산 서열의 일부를 지칭하며, 여기서 상기 아미노산 서열의 일부는 여전히 본질적으로 작용성이고, 따라서 아데닐레이트 사이클라제 활성을 나타내고 있다.

상기 아미노산 서열의 반복적인 단축 및 후속적인 아데닐레이트 사이클라제 활성의 측정을 통해 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인을 용이하게 결정할 수 있다.

예를 들어, 아데닐레이트 사이클라제 활성의 측정은 방사선 [α-³²P]-ATP의 [α-³²P]-cAMP로의 전환을 측정함으로써 수행될 수 있다.

일반적으로, 아데닐레이트 사이클라제 활성은 얻어진 cAMP 또는 항체 형성을 측정함으로써 용이하게 측정될 수 있다. 이를 위해, Amersham^®의 cAMP[³H] 또는 [¹²⁵I] BioTrak^® cAMP SPA-Assay, 또는 PerkinElmer^®의 AlphaScreen^® 또는 Lance^® cAMP Assay와 같은 다양한 분석 키트가 시판되고 있지만, 이들 모든 키트는 AC 반응 도중에 라벨링되지 않은 cAMP가 ATP로부터 생성된다는 원칙에 기초하고 있다. 이러한 라벨링되지 않은 cAMP는 cAMP-특이 항체에 결합하기 위해 외생적으로 첨가된 ³H-, ¹²⁵I-, 또는 비오틴-라벨링된 cAMP와 경쟁한다. 상기 비-방사성 Lance^® 분석법에서 Alexa^®-Flour은 665nm의 파장에서 탐침과 함께 TR-FRET 신호를 생성하는 상기 항체에 결합한다. 상기 라벨링되지 않은 cAMP가 더욱 더 많이 결합할수록 상기 라벨링된 cAMP에 의해 생성된 신호는 더욱 약해진다. 상응하는 cAMP의 농도의 신호 강도를 분류하기 위해서 표준 곡선이 사용될 수 있다.

IMAP 기술에 기초한 분자 기기를 이용한 고효율 형광분극(high-efficiency fluorescence polarization, HEFP^TM)-PDE 분석법과 유사하게, 방사성-라벨링된 기질이 아닌 형광-라벨링된 기질을 사용할 수 있다. 상기 HEFP-PDE 분석법에서는 PDE에 의해 플루오레신-라벨링된 5'AMP(Fl-AMP)로 전환되는 플루오레신-라벨링된 cAMP(Fl-cAMP)가 사용된다. 상기 Fl-AMP는 특정한 비드에 선택적으로 결합하여 상기 형광성을 강하게 분극화시킨다. 상기 Fl-cAMP는 상기 비드에 결합하지 못하므로, 분극화의 증가는 Fl-AMP의 생성량에 비례한다. 상응하는 AC 테스트에 있어서, 형광-라벨링된 ATP는 Fl-cAMP 대신에 사용될 수 있고, Fl-cAMP에 선택적으로 결합하는 비드(예를 들어, cAMP 항체가 충진된 비드)도 Fl-cAMP 대신에 사용될 수 있다.

폴리펩타이드 또는 도메인, 즉 특정한 기능을 갖는 폴리펩타이드의 서열 단편의 "기능적 등가 변이체"란 용어는 후술하는 바와 같이 구조적으로는 다르지만 여전히 동일한 기능을 수행하는 폴리펩타이드 및/또는 도메인을 지칭한다. 도메인의 기능적 등가 변이체는 이하에 더욱 상세하게 기술한 바와 같이 상기 상응하는 도메인의 변이 또는 작용성 시험, 기타 공지된 단백질의 상응하는 도메인과의 서열 비교, 또는 기타 유기체로부터의 적합한 서열을 갖는 이들 도메인을 암호화하는 상응하는 핵산 서열의 혼성화를 통해서 당해 기술분야의 숙련자에 의해 용이하게 얻을 수 있다.

"기능적 연결"이란 용어는 도메인이 그들의 기능을 수행하도록 상기 도메인을 배열시키는 상기 도메인의 연결, 바람직하게는 공유결합을 지칭한다. 예를 들어, 상기 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인과 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 작용성 결합은, 상기 GAF 도메인이 예를 들어 cGMP 또는 PDE11 조절자에 의한 리간드 결합으로 인해 그들의 형태를 변경시키고, 그 결과 상기 아데닐레이트 사이클라제 도메인의 촉매 활성을 조정할 수 있도록 상기 도메인을 배열시키는 상기 도메인의 결합을 지칭한다. 또한, 예를 들어 상기 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인의 작용성 결합은, 상기 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인이, 예를 들어 cGMP 또는 PDE11 조절자에 의해 리간드 결합 시에 GAF 도메인으로서 함께 그들의 형태를 변경시키는 방식으로 상기 도메인을 정렬시키는 상기 도메인의 결합을 지칭한다.

바람직하게는, 상기 GAF 도메인(GAF_A 및 GAF_B)으로 사용될 수 있는 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)은 이소폼인 PDE11A(수탁번호:NP_058649/BAB16371), PDE11A1(수탁번호: BAB62714/CAB82573), PDE11A2(수탁번호: BAB16372), PDE11A3(수탁번호: BAB62713) 및 PDE11A4(수탁번호: BAB62712), 또는 이들 각각의 기능성 등가 변이체들로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 이소폼 PDE11A4의 GAF 도메인 또는 이의 기능성 등가 변이체들의 본 발명에 따른 용도가 특히 바람직하다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드의 GAF_A 도메인은 서열 번호 6을 갖는 아미노산 서열; 또는 상기 서열 번호 6을 갖는 서열과 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 더욱 바람직하게는 92% 이상, 더욱 바람직하게는 93% 이상, 더욱 바람직하게는 94% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 GAF_A 도메인의 특성을 나타내는, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 번호 6 대신에 서열 번호 15가 전체를 설명하기 위해 유사하게 사용될 수 있다. 서열 번호 15에서, 상기 GAF_A 도메인의 N-말단은 서열 번호 6에 대해 하나의 아미노산(L240)이 단축된다.

이러한 경우, 이는 상기 GAF_A 도메인의 천연형의 기능적 등가 변이체일 수 있으며, 이때 상기 변이체는 상술한 바와 같이 기타 단백질 또는 인공적인 GAF_A 도메인과 상기 서열의 상동성 비교를 통해서 얻을 수 있으며, 여기서 상기 인공적인 GAF_A 도메인은 이전에 서열 번호 6을 갖는 서열에 기초하여 아미노산의 인공적인 변이, 예를 들어 치환, 삽입 또는 결실을 통해 전환되었다.

본원에서 "치환"이란 용어는 하나 또는 수 개의 아미노산에 의한 하나 또는 수 개의 아미노산의 치환을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 치환된 아미노산이 초기 아미노산과 유사한 특성을 갖는 경우에 소위 보존성 변경, 예를 들어 Asp에 의한 Glu의 치환, Gln에 의한 Asn의 치환, Ile에 의한 Val의 치환, Ile에 의한 Leu의 치환, 또는 Thr에 의한 Ser의 치환이 수행되어야 한다.

결실은 직접적인 결합을 통한 아미노산의 치환이다. 결실을 위한 바람직한 위치는 폴리펩타이드의 말단, 및 각 단백질 도메인 사이의 연결부위이다.

삽입은, 직접적인 결합이 하나 이상의 아미노산에 의해 형식적으로 치환된 폴리펩타이드 쇄에 아미노산이 포함되는 것이다.

2종의 단백질 사이의 상동성은 각 단백질의 전체 연결부위에 걸친 아미노산의 상동성, 구체적으로는 클러스탈법(Clustal method, 문헌[Higgins D.G. Sharp P.M.: Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1])을 이용한 레이저진 소프트웨어(Lasergene Software, 미국 위스콘신주 메디슨 소재의 DNASTAR사의 제품)를 이용하여 서로 비교함으로써 산정된 상동성을 지칭하며, 상기 클러스탈법의 범주는 하기에 나열되어 있다:

다중 배열 범주:

갭 감점(gap penalty) 10

갭길이 감점(gap length penalty) 10

쌍 배열 범주:

K-kuple 1

갭 감점(gap penalty) 3

윈도우 5

보존 대각선 5

따라서, 서열 번호 6과 90% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 단백질 또는 도메인은, 특히 상기 범주 세트를 갖는 상기 프로그램 대수(program logarithm)에 따라 이들 서열과 상기 서열 번호 6의 서열을 비교했을 때 90% 이상의 상동성을 나타내는 단백질 및/또는 도메인을 지칭할 것이다.

상기 GAF_A 도메인의 특성은, 특히 상기 GAF_B 도메인과 함께 cGMP에 결합하는 기능을 구체적으로 지칭한다.

더욱 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드의 GAF_A 도메인은 서열 번호 6을 갖는 상기 아미노산 서열을 나타낸다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드의 GAF_B 도메인은 서열 번호 8; 또는 상기 서열 번호 8과 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 더욱 바람직하게는 92% 이상, 더욱 바람직하게는 93% 이상, 더욱 바람직하게는 94% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 GAF_B 도메인의 특성을 나타내는 것으로 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다.

이러한 경우, 이는 상기 GAF_B 도메인의 천연형의 기능적 등가 변이체일 수 있으며, 이때 상기 변이체는 상술한 바와 같이 기타 단백질 또는 인공적인 GAF_B 도메인과 상기 서열의 상동성 비교를 통해서 얻을 수 있으며, 여기서 상기 인공적인 GAF_B 도메인은 이전에 서열 번호 6을 갖는 서열에 기초하여 아미노산의 인공적인 변이, 예를 들어 치환, 삽입 또는 결실을 통해 전환되었다.

구체적으로는, 상기 GAF_B 도메인의 특성은, 이량체(dimer) 형성에 관여하는 이의 기능, 및 구체적으로는 상기 GAF_A 도메인과 함께 활성화를 위한 상기 PDE11의 dGMP의 결합을 통한 기능, 또는 PDE11 활성의 조정을 위한, 즉 상기 PDE11 활성의 증감을 위한 PDE11 조절자의 결합을 통한 기능을 나타낸다.

추가의 실시태양에서, 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드의 GAF_B 도메인은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드의 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 기능적으로 서로 연결된 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인, 즉 완전한 GAF 도메인은 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11) 또는 이의 기능적 등가 변이체를 나타내며, 여기서 상기 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11) 또는 이의 기능적 등가 변이체는 서열 번호 10; 또는 상기 서열 번호 10과 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 93% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지며 상기 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 GAF 도메인의 조절 특성을 나타내는 것으로 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 수득된 서열 번호 6의 GAF_A 도메인 및 서열 번호 8의 GAF_B 도메인의 아미노산 서열은 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실을 통해 최대 10%, 바람직하게는 최대 9%, 더욱 바람직하게는 최대 8%, 더욱 바람직하게는 최대 7%, 더욱 바람직하게는 최대 6%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 더욱 바람직하게는 최대 4%, 더욱 바람직하게는 최대 3%, 더욱 바람직하게는 최대 2%, 더욱 바람직하게는 최대 1%, 및 더욱 바람직하게는 최대 0.5% 정도 변경된다.

특히, 서열 번호 10의 특히 바람직한 GAF 도메인의 N-말단 잔기는 이의 N-말단으로부터 상기 서열 번호 6의 GAF_A 도메인까지 자유롭게 변경될 수 있으며, 특히 단축될 수 있다. 바람직하게는, 상기 서열 번호 10의 특히 바람직한 GAF 도메인의 N-말단 잔기는 100개의 아미노산, 바람직하게는 90개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 80개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 70개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 60개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 40개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 30개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 20개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10개의 아미노산, 및 더욱 바람직하게는 5개의 아미노산 정도를 N-말단에서 단축시킬 수 있어야 한다.

상기 서열 번호 6의 GAF_A 도메인 및 서열 번호 8의 GAF_B 도메인의 부분 아미노산 서열은 상술한 각 기능의 손상 없이 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 최대 10%, 바람직하게는 최대 9%, 더욱 바람직하게는 최대 8%, 더욱 바람직하게는 최대 7%, 더욱 바람직하게는 최대 6%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 더욱 바람직하게는 최대 4%, 더욱 바람직하게는 최대 3%, 더욱 바람직하게는 최대 2%, 더욱 바람직하게는 최대 1%, 및 더욱 바람직하게는 최대 0.5% 정도 변경될 수 있다.

바람직하게는, 상기 기능적으로 서로 연결된 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인, 즉 완전한 GAF 도메인은:

(a) M24 아미노산에서부터 K591 아미노산까지의 인간 PDE11A4의 N-말단; 및

(b)서열 번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11) 또는 이의 기능적 등가 변이체를 나타낸다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인 일부에 있어서, 천연형으로 FAF 도메인을 나타내는 아데닐레이트 사이클라제가 바람직하게 사용된다. 특히 바람직한 아데닐레이트 사이클라제는 박테리아 기원, 특히 시아노박테리아(Cyanobacteria)의 아데닐레이트 사이클라제로서, 천연형의 GAF 도메인 또는 이의 기능성 등가 변이체를 나타낸다.

특히 바람직한 아데닐레이트 사이클라제는,

(a) 아나베나 종(Anabaena sp.) PCC 7120으로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(b) 아나베나 바리아빌라이(Anabaena variabili) ATTC 29413으로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(c) 노스토크 펀크티포르메(Nostoc punctiforme) PCC 73102로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(d) 트리코데스뮴 에리트레움(Trichodesmium erythraeum) IMS 101로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(e) 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus) HD 100으로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들; 및

(f) 마그네토코커스 종(Magnetococcus sp.) MC-1로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들로부터 이루어진 군으로부터 선택된다.

특히 바람직한 아데닐레이트 사이클라제는 상기 이소폼 CyaB1 또는 CyaB2, 특히 CyaB1(수탁번호: NP_486306, D89623)의 아나베나 종 PCC 7120으로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들이다.

바람직한 실시태양에서, 아데닐레이트 사이클라제 또는 이의 기능적 등가 변이체들의 촉매 도메인은 서열 번호 12; 또는 상기 서열 번호 12와 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 더욱 바람직하게는 92% 이상, 더욱 바람직하게는 93% 이상, 더욱 바람직하게는 94% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 특성을 나타내는 것으로 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다.

이러한 경우, 이는 상기 아데닐레이트 사이클라제 촉매 도메인의 천연형의 기능적 등가 변이체일 수 있으며, 이때 상기 변이체는 상술한 바와 같이 기타 아데닐레이트 사이클라제 또는 인공적인 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인과 상기 서열의 상동성 비교를 통해서 얻을 수 있으며, 여기서 상기 인공적인 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인은 전술한 바와 같이 서열 번호 12의 서열에 기초하여 아미노산의 인공적인 변이, 예를 들어 치환, 삽입 또는 결실을 통해 전환되었다.

상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 특성은 상기에서 기술한 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 특성, 특히 ATP를 cAMP로 전환시키는 능력을 의미한다.

바람직하게는, 상기 아데닐레이트 사이클라제 또는 이의 기능적 등가 변이체의 촉매 도메인은,

(a) CyaB1의 아미노산 L386이 V386으로 치환된, 아미노산 L386에서부터 K859까지의 CyaB1의 C-말단; 및

(b) 서열 번호 12로부터 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타낸다.

특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는, 서열 번호 1 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열; 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 4 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 93% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지며 상기 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 GAF 도메인의 조절 특성 및 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 특성을 나타내는 것으로 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 수득된 서열 번호 6의 GAF_A 도메인, 서열 번호 8의 GAF_B 도메인 및 서열 번호 12의 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 아미노산 서열은 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실을 통해 최대 10% 정도 변경된다.

서열 번호 4 대신에 서열 번호 13이 전체를 설명하기 위해 유사하게 사용될 수 있다. 서열 번호 13에서는 서열 번호 4와 비교 시에 A1020 아미노산이 결실되어 있다.

특히, 서열 번호 1 및 4의 본 발명에 따른 특히 바람직한 폴리펩타이드의 N-말단 잔기는 자유롭게 변경될 수 있으며, 특히 이의 N-말단으로부터 상기 서열 번호 6의 TAF_A 도메인까지 단축될 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 1 및 4의 본 발명에 따른 특히 바람직한 폴리펩타이드의 N-말단 잔기는 100개의 아미노산, 바람직하게는 90개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 80개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 70개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 60개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 50개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 40개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 30개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 20개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 10개의 아미노산, 및 더욱 바람직하게는 5개의 아미노산 정도를 N-말단에서 단축시킬 수 있어야 한다.

상기 서열 번호 6의 GAF_A 도메인, 서열 번호 8의 GAF_B 도메인 및 서열 번호 12의 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 부분 아미노산 서열은 상술한 각 기능의 손상 없이 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 최대 10%, 바람직하게는 최대 9%, 더욱 바람직하게는 최대 8%, 더욱 바람직하게는 최대 7%, 더욱 바람직하게는 최대 6%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 더욱 바람직하게는 최대 4%, 더욱 바람직하게는 최대 3%, 더욱 바람직하게는 최대 2%, 더욱 바람직하게는 최대 1%, 및 더욱 바람직하게는 최대 0.5% 정도 변경될 수 있다.

특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 M24에서부터 K591까지의 키메라 폴리펩타이드의 N-말단은 인간 PDE11A4(수탁번호: BAB62712)의 N-말단을 포함한다. 여기에 CyaB1(수탁번호: NP_486306)의 클로닝 경계면의 삽입으로 L386에서부터 C-말단의 K859까지 돌연변이된 V386의 C-말단이 부착된다.

서열 번호 1 또는 서열 번호 4를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 더욱 더 바람직한 폴리펩타이드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 4를 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 상술한 폴리펩타이드중 하나를 암호화하는 핵산으로서 하기에 나타나 있는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

본 명세서에서 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은, 예를 들어 RNA, DNA 또는 cDNA 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 특히 바람직한 폴리뉴클레오타이드는,

(a) 서열 번호 5 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 5를 갖는 핵산 서열과 혼성화된 핵산 서열;

(b) 서열 번호 7 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 7을 갖는 핵산 서열과 혼성화된 핵산 서열; 및

(c) 서열 번호 11 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 11을 갖는 핵산 서열과 혼성화된 핵산 서열을 부분 서열로서 포함한다.

서열 번호 5는 서열 번호 6의 특히 바람직한 GAF_A 도메인을 암호화하는 특히 바람직한 부분 핵산 서열을 구성한다.

서열 번호 7은 서열 번호 8의 특히 바람직한 GAF_B 도메인을 암호화하는 특히 바람직한 부분 핵산 서열을 구성한다.

서열 번호 11은 서열 번호 12를 갖는 아데닐레이트 사이클라제의 특히 바람직한 촉매 도메인을 암호화하는 특히 바람직한 부분 핵산 서열을 구성한다.

상술한 도메인을 암호화하는 핵산 및/또는 부분 핵산의 추가의 천연형의 예들이 또한 상술한 부분 핵산 서열, 특히 서열 번호 5, 7 또는 11을 갖는 서열에 기초하여 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 혼성화 기법에 의해 염기서열이 공지되어 있지 않은 다양한 유기체로부터 용이하게 얻을 수 있다.

보통(낮은 엄격함)의 조건하에서, 또는 바람직하게는 엄격한(고도의 엄격함) 조건하에서 혼성화가 일어날 수 있다.

이 같은 혼성화 조건의 예는 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning(A laboratory Manual), 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp.9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 개시되어 있다.

예를 들어, 상기 조건은, 엄격함이 낮은 조건(50℃에서의 2X SSC 조건), 및 엄격함이 높은 조건(50℃, 바람직하게는 65℃에서의 2X SSC 조건)(20X SSC: 0.3M 구연산나트륨, 3M 염화나트륨, pH 7.0)으로 한정된 상기 조건 범위로부터 세척단계 도중에 선택될 수 있다.

또한, 상기 세척 단계 도중의 온도는 보통의 조건의 실온(22℃)에서 엄격한 조건의 65℃로 증가될 수 있다.

염 농도와 온도의 2개의 범주는 동시에 변경될 수 있거나, 2개의 범주 중 하나는 일정하게 유지되고 다른 하나만이 변경될 수 있다. 혼성화 도중에 포름아미드 또는 SDS와 같은 변성화제가 또한 사용될 수 있다. 50%의 포름아미드의 존재하에서는 42℃에서 혼성화를 수행하는 것이 바람직하다.

상기 세척 단계에서 혼성화 조건의 몇몇 예는 하기에 나열되어 있다:

(1) 예를 들어 하기와 같은 혼성화 조건:

(i) 65℃에서의 4X SSC;

(ii) 45℃에서의 6X SSC;

(iii) 68℃에서의 6X SSC, 100mg/ml의 변성된 물고기 정자 DNA;

(iv) 68℃에서의 6X SSC, 0.5% SDS, 100mg/ml의 변성 및 단편화된 연어 정자 DNA;

(v) 42℃에서의 6X SSC, 0.5% SDS, 100mg/ml의 변성 및 단편화된 연어 정자 DNA, 50% 포름아미드;

(vi) 42℃에서의 50% 포름아미드, 4X SSC;

(vii) 42℃에서의 50% 포름아미드(부피/부피), 0.1% 우혈청 알부민, 0.1% 피콜(Ficol), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 50mM 인산나트륨 완충액, pH 6.5, 750mM NaCl, 75mM 구연산나트륨;

(viii) 50℃에서의 2X 또는 4X SSC(보통의 조건); 또는

(ix) 42℃에서의 30 내지 40% 포름아미드, 2X 또는 4X SSC(보통의 조건).

(2) 예를 들어 하기와 같은 각 10분 동안의 세척 단계:

(i) 50℃에서의 0.015M NaCl/0.0015M 구연산나트륨/0.1% SDS;

(ii) 65℃에서의 0.1X SSC;

(iii) 68℃에서의 0.1X SSC, 0.5% SDS;

(iv) 42℃에서의 0.1X SSC, 0.5% SDS, 50% 포름아미드;

(v) 42℃에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS; 또는

(vi) 65℃에서의 2X SSC(보통의 조건).

본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명에 따른 특히 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명에 따른 더욱 더 바람직한 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 2의 핵산 서열을 나타낸다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드를 적합한 발현 벡터에 클로닝하고, 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고, 상기 숙주 세포를 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 발현 조건하에서 발현시키고, 이어 본 발명에 따른 단백질을 단리한다는 점에서 바람직하게 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명은 재조합 숙주 세포의 배양, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 발현 및 단리를 통한 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 형질전환 방법은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 이들은 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning(A laboratory Manual), 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp.9.31-9.57]에 개시되어 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 플라스미드 백터, 특히 발현 벡터에 관한 것이다.

상기 유형의 발현 벡터는 중요하지 않다. 상응하는 숙주 세포에서 상기 목적하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 발현 시스템은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

바람직한 발현 벡터로는 pQE30(큐아젠), pQE60(큐아젠), pMAL(NEB), pIRES, PIVEX2.4a(로슈(Roche)), PIVEX2.4b(로슈), PIVEX2.4c(로슈), pUMVC1(알데브론(Aldevron)), pUMVC2(알데브론), pUMVC3(알데브론), pUMVC4a(알데브론), pUMVC4b(알데브론), pUMVC7(알데브론), pUMVC6a(알데브론), pSP64T, pSP64TS, pT7TS, pCro7(다카라(Takara)), pKJE7(다카라), pKM260, pYes260, 및 pGEM-Teasy가 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 플라스미드 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 형질전환된 숙주 세포는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 것이 바람직하다.

상기 유형의 숙주 세포는 중요하지 않다. 원핵세포성 숙주 세포 및 진핵세포성 숙주 세포 둘 모두가 적합하다. 상응하는 발현 벡터로 상기 목적하는 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. 발현 벡터와 숙주 세포로 이루어진 적합한 발현 시스템은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있다.

바람직한 숙주 세포의 예로는 E. coli, 코리네박테리아(Corynebacteria), 효모, 스트렙토마이세테스(Streptomycetes) 등과 같은 원핵세포; CHO, HEK293과 같은 진핵세포; 또는 SF9, SF21, 제노푸스 우오자이테스(Xenopus Oozytes) 등과 같은 곤충 세포주를 들 수 있다.

배양배지의 조성 및 발효조건과 같은 상기 형질전환된 숙주 세포의 배양 조건은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 이는 선별된 숙주 세포에 의존한다.

상기 폴리펩타이드의 단리 및 정제는 표준 방법, 예를 들어 문헌["The Quia Expressionist", 5th Edition, June 2003]에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드를 발현하는 상술한 상기 형질전환된 숙주 세포는 세포분석법에서 PED11 조절자의 식별을 위해 후술한 방법을 수행하기에 특히 적합하다. 또한, 상기 상응하는 숙주 세포를 고체 담체에 고정시키고/고정시키거나 고효율 규모로 상응하는 스크리닝 방법을 수행하는 것이 유리할 수 있다(고효율 스크리닝).

상술한 모든 핵산 서열은 당해 기술분야의 숙련자에 공지된 효소법(enzymatic method)과 같은 방법들을 이용하여 공지된 핵산 서열을 절단하고 다른 공지된 핵산 서열과 재조합함으로써 제조될 수 있다. 또한, 상술한 모든 핵산 서열은 뉴클레오타이드 빌딩블록(building block)으로부터 화학 합성, 예를 들어 상기 이중나선의 개개의 중첩된 상보성 핵산 빌딩블록의 단편 응축(fragment condensation)에 의해 당해 기술분야의 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 화학 합성은 공지된 포스포라미다이트(phosphoramidite)법에 따라 수행할 수 있다(문헌[Voet, Voet, 2nd Edition, Wiley Press, New York, pp. 896-897]). 일반적인 클로닝 공정뿐만 아니라, 합성 올리고뉴클레오타이드의 축적, DNA 중합효소의 클레노(Klenow) 단편을 이용한 갭의 연결 및 라이게이션 반응(ligation reaction)등이 문헌[Sambrook 등, (1989), Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 개시되어 있다.

또한 본 발명은 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 조절자를 식별하는 방법에 있어서,

(a) 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 가능성 있는 조절자를 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 가능성 있는 조절자의 부재 시와 비교하여 상기 가능성 있는 조절자가 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 아데닐레이트 사이클라제 활성을 변경시키는 지를 측정하는 단계를 포함하는 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11) 조절자의 식별 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 상기 단계 (a)에서 상기 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 가능성 있는 조절자 이외에 cGMP가 본 발명에 따른 폴리펩타이드와 접촉한다.

본 발명에 따른 방법에서, 상기 가능한 PDE11 조절자는 본 발명에 따른 상기 바람직하게 정지된 폴리펩타이드와 함께 생체내에서 배양하고, 특히 바람직하게는 cGMP와 함께 배양하며, 상기 PDE11 조절자가 없는 시험 혼합물과 비교하여 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 아데닐레이트 사이클라제 활성의 변화를 측정한다.

대안적으로, 상기 가능성 있는 PDE11 조절자를 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 가능하게는 cGMP를 포함하는 시험 혼합물에 첨가한 이후에 상기 아데닐레이트 사이클라제 활성의 변화를 측정할 수 있다. 더욱 더 상세하게 후술한 바와 같이, 상기 PDE11/CyaB1 키메라의 아데닐레이트 사이클라제 활성은 규정량의 ATP를 cAMP로 전환시킴으로써 측정한다.

하기에서 또한 PDE11-조절자로서 지칭되는 상기 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 조절자는 이러한 경우에는 아데닐레이트 사이클라제 활성에 대하여 측정된 바와 같이 상기 PDE11의 GAF 도메인에 결합함으로써 PDE11 활성을 조정할 수 있는, 즉 이러한 활성을 변경할 수 있는 물질을 지칭한다. 따라서, PDE 11 조절자는 PDE11의 다른자리입체성 중심을 통해 작용하지만, 상기 PDE11의 촉매 중심을 통해서만은 작용하지 않는다. 상기 조절자는 상기 PDE11의 효소 활성을 증가시킨다는 점에서 작용제이거나(PDE11 작용제), 상기 PDE11의 효소 활성을 저하시킨다는 점에서 길항제일 수 있다(PDE11 길항제).

예를 들어, 놀랍게도 후술한 바와 같은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 cGMP가 PDE11 작용제를 구성한다는 것을 알 수 있다.

또한, 바람직한 PDE11 조절자는, 예를 들어 펩타이드, 펩타이드유사체(peptidomimetics), 단백질(특히 항체, 특히 GAF 도메인에 대한 단일클론성 항체), 아미노산, 아미노산 유사체, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 폴리뉴클레오타이드(특히, 올리고뉴클레오타이드) 및 특히 바람직한 소위 "작은 분자" 또는 SMOL들이다. 바람직한 SMOL은 유기 또는 무기 화합물로서, 1,000g/mol 이하의 분자량, 특히 200 내지 800g/mol의 분자량, 특히 바람직하게는 300 내지 600g/mol의 분자량을 갖는 헤테로유기 화합물 또는 오가노메탈성 화합물을 포함한다.

본 발명에 따르면, PDE11 조절자는 본 발명에 따른 폴리펩타이드(PDE11/CyaB1 키메라) 내 GAF 도메인에 우선적으로 결합하고, 직접적으로는 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드(PDE11/CyaB1 키메라)의 아데닐레이트 사이클라제 활성을 변화시키거나, PDE11/CyaB1 키메라에 의한 cGMP의 억제에 의해 상기 PDE11/CyaB1 키메라의 아데닐레이트 사이클라제 활성을 변화시킨다.

시험 물질로서 cGMP 또는 cAMP가 존재하고 PDE11 조절가는 없이 본 발명에 따른 상기 방법을 수행하는 경우, 도 5에 도시된 투여량 효과 곡선(dose-effect curve)을 수득한다. 상기 PDE11A4/CyaB1 키메라는 1mM의 cGMP에 의해 약 4배 정도 활성화된다. 이는 400%의 기본 값에 상응하며 cGMP가 PDE11A4-GAF 작용제임을 증명하는 것이다. cAMP는 1mM의 양에서 상기 PDE11/CyaB1 키메라를 활성화시키지 못하며, 약 150% 기본 값을 갖는데, 즉 cAMP는 GAF 작용제도 GAF 길항제도 아니다.

상기 조정, 즉 cGMP가 없는 시험 혼합물에서 상기 PDE11 조절자를 통한 아데닐레이트 사이클라제 활성의 증감인 변화는 하기 수학식 1에 따라 기본 값(%)으로서 산정된다:

수학식 1

100μM의 상기 가능성 있는 PDE11 조절자의 사용시에 기본 값이 50% 미만인 경우에 이는 상기 PDE11/CyaB1 키메라에서 상기 GAF 도메인에 결합하는 PDE11 길항제임을 보여주는 반면, 200% 초과의 기본 값은 PDE11 작용제임을 보여준다.

따라서, 본 발명은, 상기 조절자의 존재하에서 상기 조절자의 부재와 비교하여 아데닐레이트 사이클라제 활성의 감소를 측정하며 상기 조절자는 PDE11 길항제를 구성하고 있는 본 발명에 따른 특히 바람직한 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 상기 방법은 상기 조절자가 존재할 때 상기 조절자의 부재와 비교하여 아데닐레이트 사이클라제 활성의 감소를 측정하며 상기 조절자는 PDE11 작용제를 구성하고 있는 본 발명에 따른 특히 바람직한 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 실시태양에서, 아데닐레이트 사이클라제 활성의 측정은 방사선- 또는 형광-라벨링된 ATP의 전환을 측정함으로써 수행된다.

본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드인 PDE11/CyaB1 키메라의 아데닐레이트 사이클라제 활성의 측정은 방사선 [α-³²P]-ATP의 [α-³²P]-cAMP로의 전환을 측정함으로써 수행될 수 있다.

일반적으로, 아데닐레이트 사이클라제 활성은 항체 형성 하에서 얻어진 cAMP를 측정함으로써 용이하게 측정될 수 있다. 이를 위해, 아머샴(Amersham)사의 cAMP[³H] 또는 [¹²⁵I] BioTrak cAMP SPA-Assay, 또는 퍼킨엘머(PerkinElmer)사의 AlphaScreen 또는 Lance cAMP Assay와 같은 다양한 분석 키트가 시판되고 있지만, 이들 모든 키트는 AC 반응 도중에 라벨링되지 않은 cAMP가 ATP로부터 생성된다는 원칙에 기초하고 있다. 이러한 라벨링되지 않은 cAMP는 cAMP-특이 항체에 결합하기 위해 외생적으로 첨가된 ³H-, ¹²⁵I-, 또는 비오틴-라벨링된 cAMP와 경쟁한다. 상기 비-방사성 Lance 분석법에서 665nm의 파장에서 탐침과 함께 TR-FRET신호를 생성하는 Alexa-Flour 및 상기 항체가 결합한다. 상기 라벨링되지 않은 cAMP가 더욱 더 많이 결합할수록 상기 라벨링된 cAMP에 의해 시작된 신호는 더욱 약해진다. 표준 곡선을 이용하여 상기 상응하는 cAMP의 농도의 신호 강도를 분류할 수 있다.

IMAP 기술에 기초한 분자 기기를 이용한 고효율 형광분극(high-efficiency fluorescence polarization, HEFP^TM)-PDE 분석법과 유사하게, 방사성-라벨링된 기질이 아닌 형광-라벨링된 기질을 사용할 수 있다. 상기 HEFP-PDE 분석법에서는 PDE에 의해 플루오레신-라벨링된 5'AMP(Fl-AMP)로 전환되는 플루오레신-라벨링된 cAMP(Fl-cAMP)가 사용된다. 상기 Fl-AMP는 특정한 비드에 결합하여 상기 형광성을 강하게 분극화시킨다. 상기 Fl-cAMP는 상기 비드에 결합하지 못하므로, 분극화의 증가는 생성된 Fl-AMP의 양에 비례한다. 상응하는 AC 테스트에 있어서, 형광-라벨링된 ATP는 Fl-cAMP 대신에 사용될 수 있고, Fl-cAMP에 선택적으로 결합하는 비드(예를 들어, cAMP 항체가 충진된 비드)도 Fl-cAMP 대신에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 방법이 추가로 바람직한 실시태양에서, 변경된 기본 값(%)이 GAF에 의해 조정된 물질의 효과에 의해 야기되었는지, 아니면 상기 AC 촉매 중심의 직접적인 조정에 의해 야기되었는지를 구별하기 위해, 부가적인 카운터 스크린(counter screen)법을 실시한다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 바람직한 방법에 관한 것으로, 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인에서 직접적인 조절자를 배제시키기 위해 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인은 갖고 있지만 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 작용성 GAF 도메인이 없는 폴리펩타이드를 이용하여 본 발명에 따른 방법을 실시한다.

바람직하게는 상기 PDE11/CyaB1 키메라가 아닌 단백질을 이용하여 상술한 방법과 유사하게 상기 기본 값(%)을 또한 측정하는데, 이때 상기 단백질은 바람직하게는,

(a) 상기 AC 촉매 중심을 포함하거나,

(b) GAF 기능에 필수적인 상기 아미노산 상의 돌연변이를 포함하거나,

(c) GAF 도메인에 의해 N-말단을 단축시킨다.

상기 (a)의 예는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이며, 단 N-말단이 A2 내지 L775 아미노산이 결실되어 있다.

상기 (b)의 예는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이며, 단 상기 폴리펩타이드는 D355A 돌연변이를 포함한다.

상기 (c)의 예는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이며, 단 L240 내지 K568 아미노산의 부분 서열이 결실되어 있다.

상기 (a), (b) 및 (c)에 따라 변형된 단백질을 갖는 100μM의 물질이 50% 미만의 기본 값을 갖는 경우, 상기 AC 촉매 중심이 억제되고, 따라서 순수한 GAF 길항작용은 배제할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 추가적인 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 상술한 숙주 세포의 존재하에 세포 분석법으로서 수행된다.

또한, 생성된 cAMP는 아데닐레이트 사이클라제 활성의 척도로서 문헌[Johnston, P. Cellular assays in HTS, Methods Mol Biol. 190, 107-16 (2002)] 및 문헌[Johnston, P.A.: Cellular platforms for HTS, three case studies, Drug Discov Today, 7, 353-63 (2002)]에 기술된 바와 같은 세포 분석법으로 또한 측정될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드인 상기 PDE11/CyaB1 키메라의 cDNA는 적합한 경계면을 통해 형질감염 벡터에 도입되고, CHO 또는 HEK293 세포와 같은 적합한 세포의 얻어진 벡터 컨스트럭트(vector construct)로 형질감염된다. 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드를 안정하게 발현시키는 세포 클론들이 선택된다.

형질감염된 세포 클론의 세포내 cAMP의 수준은 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드의 아데닐레이트 사이클라제 활성에 의해 크게 영향을 받는다. GAF 길항제는 상기 아데닐레이트 사이클라제 활성을 억제함으로써 세포내 cAMP를 감소시키고, GAF 작용제는 상기 세포내 cAMP를 증가시킨다.

상기 cAMP의 양은 상술한 방법(Bio Trak, AlphaScreen 또는 HEFP)에 의해 세포의 용균(lysis) 이후에 측정되거나, 상기 세포에서 직접 측정될 수 있다. 이를 위해, 상기 세포주 내의 리포터 유전자(reporter gene)가 CRE(cAMP response element)에 결합하는 것이 바람직하다(문헌[Johnston, P. Cellular assays in HTS, Methods Mol Biol. 190, 107-16 (2002)]). cAMP 수준의 증가는 상기 CRE 조절자에 대한 CREB(cAMP response element binding protein)의 결합을 증가시키고, 따라서 상기 리포터 유전자의 전사를 증가시킨다. 예를 들어, 리포터 유전자로서 녹색 형광성 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP), β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제를 이용할 수 있으며, 이들의 발현량은 문헌[Greer, L.F. 및 Szalay, A.A. Imaging of light emission form the expression of luciferase in living cells and organisms, a review. Luminescence 17, 43-72 (2002)] 또는 문헌[Hill, S. 등, Reporter-gene systems for the study of G-protein coupled receptors, Curr. Opin. Pharmacol. 1, 526-532 (2001)]에서와 같이 형광분석법(fluorometric method), 광분석법(photometric method) 또는 발광분석법(luminometric method)에 의해 측정될 수 있다.

특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 상술한 방법은, 특히 세포분석법으로서 고효율 규모로 사용된다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하고 있지만, 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

PED11/CyaB1 키메라를 암호화하는 재조합 DNA의 제조

표준 방법에 따라 클로닝을 실시하였다. 인간 PDE11A4(Genbank 수탁 번호: BAB62712)에 대한 유전자를 함유한 초기 클론을 벡터에 제공하였다. PCR을 통해서 상기 PDE2-GAF 키메라의 클로닝을 문헌[Kanacher 등, EMBO J. 2002]에 개시된 방법과 유사하게 수행하였다. 특정 프라이머를 이용하여 상기 GAF-A 도메인과 함께 상기 PDE11A4의 N-말단을 암호화하고 BglII의 N-말단 경계면과 Xbal의 C-말단 경계면을 포함하는 hPDE11A4_1-391의 유전자 단편을 증폭하였다. 유사한 방식으로, 상기 GAF-B 도메인을 암호화하고 Xbal의 N-말단 경계면과 SalI의 C-말단 경계면을 포함하는 hPDE11A4_392-569의 유전자 단편을 증폭하였다. 상기 2개의 단편은 상기 클로닝 벡터인 pBluescriptII SK(-)에서 서브클로닝 단계를 거쳐 Xbal 경계면을 통해 서로 연결하여 hPDE11A4_1-569를 수득하였다. 상기 hPDE11A4_1-569 유전자 단편의 경우, PCR에 의해 생성된 유전자 단편 CyaBI_386-859를 SalI C-말단 경계면을 통해 아데닐레이트 사 이클라제 CyaB1(Genbank 수탁 번호: D89623)의 촉매 도메인에 부착되었다. 이러한 경우, 상기 hPDE11A4_1-569의 SalI N-말단 경계면은 CyaB1_386-859의 XhoI C-말단 경계면 상에 클로닝되고, CyaBI의 L386은 발린(V)으로 돌연변이된다. 모든 클로닝 단계는 E. coli ZI1blueMRP에서 수행된다.

상기 PDE11-GAF 키메라의 유전자는 pQE30 발현 벡터(큐아젠)에 재클로닝되었다.

실시예 2

폴리펩타이드의 발현 및 정제

상기 PDE11-GAF 키메라의 유전자를 갖는 상기 pQE30 벡터를 E. coli Bl21 세포에 재형질전환시켰다. 상기 단백질의 발현 및 정제는 문헌["The Quia Expressionist^®", 5th Edition, June 2003]에 개시된 바와 같이 수행하였다. 이러한 경우, E. coli를 25μM IPTG로 유도하고 16℃에서 16시간 동안 배양한 후 프렌치 프레스(French press) 처리를 실시하기 위한 조건하에서 최적의 단백질 수득량을 달성하였다.

실시예 3

분석의 실시

상기 PED11A4/CyaB1 키메라의 아데닐레이트 사이클라제 활성은 상기 시험 물질의 유무에 따라 측정하였다. 이러한 경우, 상기 아데닐레이트 사이클라제 활성 또는 규정량의 ATP의 cAMP로의 전환, 및 2회의 컬럼 단계를 거친 크로마토그래피에 의한 분리는 살로몬 (Salomon) 등의 방법에 따라 측정할 수 있다. 상기 전환을 검출하기 위해 [α-³²P]-ATP를 방사선 탐침으로 사용하였으며, [α-³²P]-cAMP의 생성량을 측정하였다. ³H-cAMP는 회복율에 대한 내부 기준으로서 사용하였다. 배양 시간은 1 내지 120분이고, 반응 온도는 20 내지 45℃이고, 상기 Mg²⁺ 보조인자의 농도는 1 내지 20mM(상응하는 양의 Mn²⁺도 또한 보조인자로서 사용할 수 있음)이며, 상기 ATP의 농도는 0.5μM 내지 5mM이어야 한다. 상기 물질의 부재시와 비교하여 상기 물질의 존재시의 상기 전환율의 증가는 GAF-작용제 효과를 나타낸다. 상기 물질을 첨가함에 따라 전환율이 억제되면, 이는 상기 물질의 GAF 길항 효과를 나타낸다. 원형 GAF 리간드인 cGAP에 의해 상기 PDE11A4/CyaB1 키메라의 활성화를 차단함으로써 GAF 길항작용도 또한 측정하였다. 또한, cGAP 농도의 증가에 따른 전환율을 상기 물질의 존재 유무에 따라 측정하였다. 상기 물질의 존재시의 전환율이 상기 물질의 부재시의 전환율보다 낮은 경우에 이는 상기 물질의 GAF 길항작용을 나타낸다.

반응시험은 하기 조건들을 포함한다:

- 50㎕의 AC-테스트-칵테일(글리세롤 43.5%(부피/부피), 0.1M 트리스/HCl, pH 7.5, 20mM MgCl₂)

- 40-x ㎕ 효소 희석액(활성에 의존함, 0.1%(중량/부피)의 BAS 수용액 중의 0.1-0.3㎍의 PDE10/CyaB1-키메라를 함유함)

- x ㎕의 물질

- 10㎕의 750μM ATP-출발용액(16-30 kBq[α-³²P]-ATP를 함유함).

상기 단백질 샘플 및 칵테일은 얼음 상의 1.5ml 반응 용기에서 측정하고, ATP와의 반응을 시작하였으며, 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 150㎕의 AC 반응 중단 완충액을 이용하여 상기 반응을 중단하고 반응 용기를 얼음 위에 놓고, 100 Bq[2,8-³H]-cAMP를 함유한 10㎕의 20mM cAMP 및 750㎕의의 물을 첨가하였다.

시험 혼합물에 대한 시험은 각각 2회 수행하였다. 효소 대신에 물을 사용한 시험 혼합물을 대조시험으로서 사용하였다. 상기 시험 혼합물에 상기 물질 및 cGMP가 존재하지 않은 경우에 기초 효소 활성을 측정하였다. ATP 활성과 cAMP 활성을 분리하기 위해, 1.2g의 도웩스(Dowex)-50WX4-400을 함유한 유리관을 통해 각 샘플을 흘러보내고, 각 샘플이 침전한 이후에 3-4ml의 물로 세척하였다. 세척 이후에 5ml의 물을 이용하여 산화알루미늄 컬럼(0.5g의 Al₂O₃을 함유한 9x1cm 유리 컬럼, 활성도: 90%, 중성 pH)을 용출하고, 4ml의 제조된 신틸레이터(scintillator) Ultima XR Gold를 함유한 신틸레이션(scintillation) 용기에서 4ml의 0.1M 트리스/HCl(pH 7.5)로 상기 컬럼을 용출하였다. 충분히 혼합한 후에 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 계수하였다. 방사선-라벨링된 cAMP 및 ATP의 사용량은 5ml의 용출 완충액 및 4ml의 신틸레이터에서 직접 ³H 및 ³²P의 총수로 측정하였다.

이어, 상기 전환율은 하기 수학식에 따라 효소 활성으로서 산정한다.

수학식 2

상기 물질에 의한 상기 효소의 억제 또는 활성화는 하기 수학식 1에 따라 기본 값(%)으로서 산정한다.

수학식 1

100μM의 상기 물질에 대한 기본 값이 50% 미만인 경우에 이는 상기 AC-촉매 중심의 억제가 제외되므로 GAF 길항제임을 나타내고, 반면 200% 초과의 기본 값은 GAF 작용제임을 보여준다.

100μM의 시험 물질을 사용할 때의 기본 값이 90% 미만인 경우에 100μM의 cGMP가 존재하는 시험 혼합물에 GAF 길항제가 존재한다.

상기 컬럼은 사용 이후에 하기와 같이 재생되었다.

도웩스 컬럼(Dowex column): 5ml의 2N HCl, 2x 5ml의 물

산화알루미늄 컬럼: 2x 5ml의 0.1M 트리스/HCl, pH 7.5

SEQUENCE LISTING <110> ALTANA Pharma AG <120> Methode zur Identifizierung von PDE11-Antagonisten <130> 1389WOORD01 <160> 15 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1042 <212> PRT <213> Kuenstliche Sequenz <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1042) <223> PDE11GAF/CyaB1-Chimaere <400> 1 Met Ala Ala Ser Arg Leu Asp Phe Gly Glu Val Glu Thr Phe Leu Asp 1 5 10 15 Arg His Pro Glu Leu Phe Glu Asp Tyr Leu Met Arg Lys Gly Lys Gln 20 25 30 Glu Met Val Glu Lys Trp Leu Gln Arg His Ser Gln Gly Gln Gly Ala 35 40 45 Leu Gly Pro Arg Pro Ser Leu Ala Gly Thr Ser Ser Leu Ala His Ser 50 55 60 Thr Cys Arg Gly Gly Ser Ser Val Gly Gly Gly Thr Gly Pro Asn Gly 65 70 75 80 Ser Ala His Ser Gln Pro Leu Pro Gly Gly Gly Asp Cys Gly Gly Val 85 90 95 Pro Leu Ser Pro Ser Trp Ala Gly Gly Ser Arg Gly Asp Gly Asn Leu 100 105 110 Gln Arg Arg Ala Ser Gln Lys Glu Leu Arg Lys Ser Phe Ala Arg Ser 115 120 125 Lys Ala Ile His Val Asn Arg Thr Tyr Asp Glu Gln Val Thr Ser Arg 130 135 140 Ala Gln Glu Pro Leu Ser Ser Val Arg Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys 145 150 155 160 Ala Ser Ser Leu Pro Pro Thr Thr Ala His Ile Leu Ser Ala Leu Leu 165 170 175 Glu Ser Arg Val Asn Leu Pro Gln Tyr Pro Pro Thr Ala Ile Asp Tyr 180 185 190 Lys Cys His Leu Lys Lys His Asn Glu Arg Gln Phe Phe Leu Glu Leu 195 200 205 Val Lys Asp Ile Ser Asn Asp Leu Asp Leu Thr Ser Leu Ser Tyr Lys 210 215 220 Ile Leu Ile Phe Val Cys Leu Met Val Asp Ala Asp Arg Cys Ser Leu 225 230 235 240 Phe Leu Val Glu Gly Ala Ala Ala Gly Lys Lys Thr Leu Val Ser Lys 245 250 255 Phe Phe Asp Val His Ala Gly Thr Pro Leu Leu Pro Cys Ser Ser Thr 260 265 270 Glu Asn Ser Asn Glu Val Gln Val Pro Trp Gly Lys Gly Ile Ile Gly 275 280 285 Tyr Val Gly Glu His Gly Glu Thr Val Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Gln 290 295 300 Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp Lys Leu Thr Gly Tyr Lys Thr 305 310 315 320 Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg Ser Ser Asp Gly Glu Ile Ile 325 330 335 Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile Pro Glu Gly Ala Pro Phe Thr 340 345 350 Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met Tyr Leu Pro Phe Cys Gly Ile 355 360 365 Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala Ala Ser Arg Lys Glu Tyr Glu 370 375 380 Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val Asn Asp Leu Phe Glu Glu Gln 385 390 395 400 Thr Asp Leu Glu Lys Ile Val Lys Lys Ile Met His Arg Ala Gln Thr 405 410 415 Leu Leu Lys Cys Glu Arg Cys Ser Val Leu Leu Leu Glu Asp Ile Glu 420 425 430 Ser Pro Val Val Lys Phe Thr Lys Ser Phe Glu Leu Met Ser Pro Lys 435 440 445 Cys Ser Ala Asp Ala Glu Asn Ser Phe Lys Glu Ser Met Glu Lys Ser 450 455 460 Ser Tyr Ser Asp Trp Leu Ile Asn Asn Ser Ile Ala Glu Leu Val Ala 465 470 475 480 Ser Thr Gly Leu Pro Val Asn Ile Ser Asp Ala Tyr Gln Asp Pro Arg 485 490 495 Phe Asp Ala Glu Ala Asp Gln Ile Ser Gly Phe His Ile Arg Ser Val 500 505 510 Leu Cys Val Pro Ile Trp Asn Ser Asn His Gln Ile Ile Gly Val Ala 515 520 525 Gln Val Leu Asn Arg Leu Asp Gly Lys Pro Phe Asp Asp Ala Asp Gln 530 535 540 Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile Phe Cys Gly Leu Gly Ile Asn Asn 545 550 555 560 Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys Val Glu Lys Gln Tyr Gln Lys Asp 565 570 575 Ile Leu Gln Ser Leu Ser Asp Ala Val Ile Ser Thr Asp Met Ala Gly 580 585 590 Arg Ile Val Thr Ile Asn Asp Ala Ala Leu Glu Leu Leu Gly Cys Pro 595 600 605 Leu Gly Asp Ala Asn His Lys Ser Asn Lys Leu Leu Trp Glu Gln Asn 610 615 620 Leu Ile Gly Arg Val Val Trp Glu Ile Val Pro Ile Glu Asn Leu Gln 625 630 635 640 Met Arg Leu Glu Asp Ser Leu Lys Ser Gly Ala Lys His Tyr Val Pro 645 650 655 Glu Gln Ser Leu Ile Val Gly Ile Tyr Gln Leu Gln Met Ser Glu Ser 660 665 670 Arg Val Leu His Glu Thr Gln Asp Tyr Ser Ile Leu Thr Val Arg Asp 675 680 685 Arg Ile Asn Pro Asp Ile Phe Leu Pro Trp Asn Leu Pro Gln Thr Pro 690 695 700 Gln Ser Gln Phe Ile Thr Pro Glu Glu Val Gln Ile Leu Glu Arg Ser 705 710 715 720 Ile Asn Leu Thr Val Asn Pro Leu Thr Asn Pro Glu Gly Gly Val Arg 725 730 735 Gly Gly Leu Val Val Leu Glu Asp Ile Ser Gln Glu Lys Arg Leu Lys 740 745 750 Thr Thr Met Tyr Arg Tyr Leu Thr Pro His Val Ala Glu Gln Val Met 755 760 765 Ala Leu Gly Glu Asp Ala Leu Met Val Gly Glu Arg Lys 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Leu Val Arg 980 985 990 Asp Phe Thr Gln Ala Ile Ala Cys Phe Asn Ser Ala Lys His Ile Arg 995 1000 1005 Pro Thr Asp Gln Ala Val Asn Ile His Leu Glu Arg Ala Tyr Asn 1010 1015 1020 Tyr Gln Gln Thr Pro Pro Pro Pro Gln Trp Asp Gly Val Trp Thr 1025 1030 1035 Ile Phe Thr Lys 1040 <210> 2 <211> 3198 <212> DNA <213> Kuenstliche Sequenz <220> <221> CDS <222> (1)..(3198) <223> PDE11GAF/CyaB1-Chimaere <400> 2 atg ggc cat cat cat cat cat cat cat cat cat cac agc agc ggc cat 48 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 atc gaa ggt cgt cat aga tcc atg gca gcc tcc cgc ctg gac ttc ggg 96 Ile Glu Gly Arg His Arg Ser Met Ala Ala Ser Arg Leu Asp Phe Gly 20 25 30 gag gtg gaa act ttc ctg gac agg cac cca gag ttg ttt gaa gat tac 144 Glu Val Glu Thr Phe Leu Asp Arg His Pro Glu Leu Phe Glu Asp Tyr 35 40 45 ttg atg cgg aag ggg aag cag gag atg gtt gaa aag tgg ctg cag agg 192 Leu Met Arg Lys Gly Lys Gln Glu Met Val Glu Lys Trp Leu Gln Arg 50 55 60 cac agt cag ggt cag ggg gct tta ggt 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400 gcc tca agg aaa gaa tat gaa aga agc aga gct ttg cta gag gtg gtt 1248 Ala Ser Arg Lys Glu Tyr Glu Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val 405 410 415 aat gac ctc ttt gaa gaa cag act gac ctg gag aaa att gtc aag aaa 1296 Asn Asp Leu Phe Glu Glu Gln Thr Asp Leu Glu Lys Ile Val Lys Lys 420 425 430 ata atg cat cgg gcc caa act ctg ctg aaa tgt gaa cgc tgt tcc gtt 1344 Ile Met His Arg Ala Gln Thr Leu Leu Lys Cys Glu Arg Cys Ser Val 435 440 445 tta ctc cta gag gac atc gaa tca cca gtg gtg aaa ttt acc aaa tcc 1392 Leu Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Pro Val Val Lys Phe Thr Lys Ser 450 455 460 ttt gaa ttg atg tcc cca aag tgc agt gct gat gct gag aac agt ttc 1440 Phe Glu Leu Met Ser Pro Lys Cys Ser Ala Asp Ala Glu Asn Ser Phe 465 470 475 480 aaa gaa agc atg gag aaa tca tca tac tcc gac tgg cta ata aat aac 1488 Lys Glu Ser Met Glu Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Trp Leu Ile Asn Asn 485 490 495 agc att gct gag ctg gtt gct tca aca ggc ctt cca gtg aac atc agt 1536 Ser Ile Ala Glu Leu Val Ala Ser Thr Gly Leu Pro Val Asn Ile Ser 500 505 510 gat gcc tac cag gat ccg cgc ttt gat gca gag gca gac cag ata tct 1584 Asp Ala Tyr Gln Asp Pro Arg Phe Asp Ala Glu Ala Asp Gln Ile Ser 515 520 525 ggt ttt cac ata aga tct gtt ctt tgt gtc cct att tgg aat agc aac 1632 Gly Phe His Ile Arg Ser Val Leu Cys Val Pro Ile Trp Asn Ser Asn 530 535 540 cac caa ata att gga gtg gct caa gtg tta aac aga ctt gat ggg aaa 1680 His Gln Ile Ile Gly Val Ala Gln Val Leu Asn Arg Leu Asp Gly Lys 545 550 555 560 cct ttt gat gat gca gat caa cga ctt ttt gag gct ttt gtc atc ttt 1728 Pro Phe Asp Asp Ala Asp Gln Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile Phe 565 570 575 tgt gga ctt ggc atc aac aac aca att atg tat gat caa gtg aag gtc 1776 Cys Gly Leu Gly Ile Asn Asn Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys Val 580 585 590 gag aaa caa tat caa aaa gac att tta caa agc ttg tca gat gct gta 1824 Glu Lys Gln Tyr Gln Lys Asp Ile Leu Gln Ser Leu Ser Asp Ala Val 595 600 605 att tct aca gat atg gcc ggg aga att gtc aca att aat gat gca gcc 1872 Ile Ser Thr Asp Met Ala Gly Arg Ile Val Thr Ile Asn Asp Ala Ala 610 615 620 ttg gaa tta ctc ggt tgt cct tta ggt gat gct aat cat aaa agt aat 1920 Leu Glu Leu Leu Gly Cys Pro Leu Gly Asp Ala Asn His Lys Ser Asn 625 630 635 640 aag ctg ctg tgg gaa caa aat tta att ggt cgc gta gtt tgg gaa att 1968 Lys Leu Leu Trp Glu Gln Asn Leu Ile Gly Arg Val Val Trp Glu Ile 645 650 655 gta cca att gaa aat ttg cag atg cgc tta gaa gat agt tta aaa agt 2016 Val Pro Ile Glu Asn Leu Gln Met Arg Leu Glu Asp Ser Leu Lys Ser 660 665 670 ggt gct aaa cat tat gtg cca gaa caa agt ttg ata gtg gga att tat 2064 Gly Ala Lys His Tyr Val Pro Glu Gln Ser Leu Ile Val Gly Ile Tyr 675 680 685 caa tta caa atg tct gaa agt cgg gtt ttg cat gaa act caa gac tac 2112 Gln Leu Gln Met Ser Glu Ser Arg Val Leu His Glu Thr Gln Asp Tyr 690 695 700 tct att ttg aca gta cgc gat cgc atc aac cca gat att ttt ctc ccc 2160 Ser Ile Leu Thr Val Arg Asp Arg Ile Asn Pro Asp Ile Phe Leu Pro 705 710 715 720 tgg aat tta ccc caa acc ccc cag tcg caa ttt atc acc ccg gaa gaa 2208 Trp Asn Leu Pro Gln Thr Pro Gln Ser Gln Phe Ile Thr Pro Glu Glu 725 730 735 gta caa atc tta gaa cgc agt att aat ctt acc gtt aat cct ttg acg 2256 Val Gln Ile Leu Glu Arg Ser Ile Asn Leu Thr Val Asn Pro Leu Thr 740 745 750 aac cca gaa ggc ggt gtc cgt ggt ggt ttg gta gtt ttg gaa gat att 2304 Asn Pro Glu Gly Gly Val Arg Gly Gly Leu Val Val Leu Glu Asp Ile 755 760 765 agt caa gag aag cgc ctc aaa act act atg tat cgc tac ctt aca ccc 2352 Ser Gln Glu Lys Arg Leu Lys Thr Thr Met Tyr Arg Tyr Leu Thr Pro 770 775 780 cat gta gct gaa cag gta atg gct tta ggg gaa gat gcc tta atg gtt 2400 His Val Ala Glu Gln Val Met Ala Leu Gly Glu Asp Ala Leu Met Val 785 790 795 800 ggt gaa cgc aag gag gtg act gtt tta ttt tca gat atc cga ggc tac 2448 Gly Glu Arg Lys Glu Val Thr Val Leu Phe Ser Asp Ile Arg Gly Tyr 805 810 815 acc aca ctt acg gaa aat cta ggt gcg gct gaa gtg gta tca ctc ctg 2496 Thr Thr Leu Thr Glu Asn Leu Gly Ala Ala Glu Val Val Ser Leu Leu 820 825 830 aac caa tat ttt gaa aca atg gtt gaa gca gtt ttc aac tat 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gag ttt act tac caa tta tgc 2880 Glu Tyr Gly Cys Asp Ile Ile Leu Ser Glu Phe Thr Tyr Gln Leu Cys 945 950 955 960 agc gat cgc att tgg gta cgt cag tta gat aaa atc cga gtc aaa ggg 2928 Ser Asp Arg Ile Trp Val Arg Gln Leu Asp Lys Ile Arg Val Lys Gly 965 970 975 aaa cac caa gct gtc aat atc tat gag ttg att agc gat cgc agt act 2976 Lys His Gln Ala Val Asn Ile Tyr Glu Leu Ile Ser Asp Arg Ser Thr 980 985 990 ccc tta gat gac aac acc caa gag ttc ctc ttt cac tat cat aat ggt 3024 Pro Leu Asp Asp Asn Thr Gln Glu Phe Leu Phe His Tyr His Asn Gly 995 1000 1005 cgg act gcc tac tta gtc cgc gat ttt acc cag gcg atc gct tgt 3069 Arg Thr Ala Tyr Leu Val Arg Asp Phe Thr Gln Ala Ile Ala Cys 1010 1015 1020 ttt aac tca gct aaa cat att cga ccc aca gac caa gct gtc aat 3114 Phe Asn Ser Ala Lys His Ile Arg Pro Thr Asp Gln Ala Val Asn 1025 1030 1035 att cac cta gaa cgc gcc tac aat tat caa caa act cca cca cct 3159 Ile His Leu Glu Arg Ala Tyr Asn Tyr Gln Gln Thr Pro Pro Pro 1040 1045 1050 cct caa tgg gac ggc gta tgg aca att ttc aca aag tag 3198 Pro Gln Trp Asp Gly Val Trp Thr Ile Phe Thr Lys 1055 1060 1065 <210> 3 <211> 1065 <212> PRT <213> Kuenstliche Sequenz <400> 3 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg His Arg Ser Met Ala Ala Ser Arg Leu Asp Phe Gly 20 25 30 Glu Val Glu Thr Phe Leu Asp Arg His Pro Glu Leu Phe Glu Asp Tyr 35 40 45 Leu Met Arg Lys Gly Lys Gln Glu Met Val Glu Lys Trp Leu Gln Arg 50 55 60 His Ser Gln Gly Gln Gly Ala Leu Gly Pro Arg Pro Ser Leu Ala Gly 65 70 75 80 Thr Ser Ser Leu Ala His Ser Thr Cys Arg Gly Gly Ser Ser Val Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Gly Pro Asn Gly Ser Ala His Ser Gln Pro Leu Pro Gly 100 105 110 Gly Gly Asp Cys Gly Gly Val Pro Leu Ser Pro Ser Trp Ala Gly Gly 115 120 125 Ser Arg Gly Asp Gly Asn Leu Gln Arg Arg Ala Ser Gln Lys Glu Leu 130 135 140 Arg Lys Ser Phe Ala Arg Ser Lys Ala Ile His Val Asn Arg Thr Tyr 145 150 155 160 Asp Glu Gln Val Thr Ser Arg Ala Gln Glu Pro Leu Ser Ser Val Arg 165 170 175 Arg Arg Ala Leu Leu 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Ile Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala 385 390 395 400 Ala Ser Arg Lys Glu Tyr Glu Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val 405 410 415 Asn Asp Leu Phe Glu Glu Gln Thr Asp Leu Glu Lys Ile Val Lys Lys 420 425 430 Ile Met His Arg Ala Gln Thr Leu Leu Lys Cys Glu Arg Cys Ser Val 435 440 445 Leu Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Pro Val Val Lys Phe Thr Lys Ser 450 455 460 Phe Glu Leu Met Ser Pro Lys Cys Ser Ala Asp Ala Glu Asn Ser Phe 465 470 475 480 Lys Glu Ser Met Glu Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Trp Leu Ile Asn Asn 485 490 495 Ser Ile Ala Glu Leu Val Ala Ser Thr Gly Leu Pro Val Asn Ile Ser 500 505 510 Asp Ala Tyr Gln Asp Pro Arg Phe Asp Ala Glu Ala Asp Gln Ile Ser 515 520 525 Gly Phe His Ile Arg Ser Val Leu Cys Val Pro Ile Trp Asn Ser Asn 530 535 540 His Gln Ile Ile Gly Val Ala Gln Val Leu Asn Arg Leu Asp Gly Lys 545 550 555 560 Pro Phe Asp Asp Ala Asp Gln Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile Phe 565 570 575 Cys Gly Leu Gly Ile Asn Asn Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys Val 580 585 590 Glu Lys Gln Tyr Gln Lys 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Gly Lys Gly Ile Ile 35 40 45 ggc tat gtc ggg gag cat gga gaa acg gtc aac att cct gat gcc tac 192 Gly Tyr Val Gly Glu His Gly Glu Thr Val Asn Ile Pro Asp Ala Tyr 50 55 60 cag gat cga cga ttc aat gat gaa atc gac aag cta act gga tac aag 240 Gln Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp Lys Leu Thr Gly Tyr Lys 65 70 75 80 aca aaa tca tta ttg tgc atg cct atc cga agc agt gat ggt gag att 288 Thr Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg Ser Ser Asp Gly Glu Ile 85 90 95 att ggt gtg gcc caa gcg ata aat aag att cct gaa gga gct cca ttt 336 Ile Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile Pro Glu Gly Ala Pro Phe 100 105 110 act gaa gat gat gaa aaa gtt atg cag atg tat ctt cca ttt tgt gga 384 Thr Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met Tyr Leu Pro Phe Cys Gly 115 120 125 atc gcc ata tct aac gct cag ctc ttt gct gcc tca agg aaa gaa tat 432 Ile Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala Ala Ser Arg Lys Glu Tyr 130 135 140 gaa aga agc aga gct ttg cta gag gtg gtt aat gac ctc ttt gaa gaa 480 Glu Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val Asn Asp Leu Phe Glu Glu 145 150 155 160 cag act gac ctg 492 Gln Thr Asp Leu <210> 6 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Phe Leu Val Glu Gly Ala Ala Ala Gly Lys Lys Thr Leu Val Ser 1 5 10 15 Lys Phe Phe Asp Val His Ala Gly Thr Pro Leu Leu Pro Cys Ser Ser 20 25 30 Thr Glu Asn Ser Asn Glu Val Gln Val Pro Trp Gly Lys Gly Ile Ile 35 40 45 Gly Tyr Val Gly Glu His Gly Glu Thr Val Asn Ile Pro Asp Ala Tyr 50 55 60 Gln Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp Lys Leu Thr Gly Tyr Lys 65 70 75 80 Thr Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg Ser Ser Asp Gly Glu Ile 85 90 95 Ile Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile Pro Glu Gly Ala Pro Phe 100 105 110 Thr Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met Tyr Leu Pro Phe Cys Gly 115 120 125 Ile Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala Ala Ser Arg Lys Glu Tyr 130 135 140 Glu Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val Asn Asp Leu Phe Glu Glu 145 150 155 160 Gln Thr Asp Leu <210> 7 <211> 432 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(432) <223> GAF-B PDE11 <400> 7 gtt tta ctc cta gag gac atc gaa tca cca gtg gtg aaa ttt acc aaa 48 Val Leu Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Pro Val Val Lys Phe Thr Lys 1 5 10 15 tcc ttt gaa ttg atg tcc cca aag tgc agt gct gat gct gag aac agt 96 Ser Phe Glu Leu Met Ser Pro Lys Cys Ser Ala Asp Ala Glu Asn Ser 20 25 30 ttc aaa gaa agc atg gag aaa tca tca tac tcc gac tgg cta ata aat 144 Phe Lys Glu Ser Met Glu Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Trp Leu Ile Asn 35 40 45 aac agc att gct gag ctg gtt gct tca aca ggc ctt cca gtg aac atc 192 Asn Ser Ile Ala Glu Leu Val Ala Ser Thr Gly Leu Pro Val Asn Ile 50 55 60 agt gat gcc tac cag gat ccg cgc ttt gat gca gag gca gac cag ata 240 Ser Asp Ala Tyr Gln Asp Pro Arg Phe Asp Ala Glu Ala Asp Gln Ile 65 70 75 80 tct ggt ttt cac ata aga tct gtt ctt tgt gtc cct att tgg aat agc 288 Ser Gly Phe His Ile Arg Ser Val Leu Cys Val Pro Ile Trp Asn Ser 85 90 95 aac cac caa ata att gga gtg gct caa gtg tta aac aga ctt gat ggg 336 Asn His Gln Ile Ile Gly Val Ala Gln Val Leu Asn Arg Leu Asp Gly 100 105 110 aaa cct ttt gat gat gca gat caa cga ctt ttt gag gct ttt gtc atc 384 Lys Pro Phe Asp Asp Ala Asp Gln Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile 115 120 125 ttt tgt gga ctt ggc atc aac aac aca att atg tat gat caa gtg aag 432 Phe Cys Gly Leu Gly Ile Asn Asn Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys 130 135 140 <210> 8 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Val Leu Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Pro Val Val Lys Phe Thr Lys 1 5 10 15 Ser Phe Glu Leu Met Ser Pro Lys Cys Ser Ala Asp Ala Glu Asn Ser 20 25 30 Phe Lys Glu Ser Met Glu Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Trp Leu Ile Asn 35 40 45 Asn Ser Ile Ala Glu Leu Val Ala Ser Thr Gly Leu Pro Val Asn Ile 50 55 60 Ser Asp Ala Tyr Gln Asp Pro Arg Phe Asp Ala Glu Ala Asp Gln Ile 65 70 75 80 Ser Gly Phe His Ile Arg Ser Val Leu Cys Val Pro Ile Trp Asn Ser 85 90 95 Asn His Gln Ile Ile Gly Val Ala Gln Val Leu Asn Arg Leu Asp Gly 100 105 110 Lys Pro Phe Asp Asp Ala Asp Gln Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile 115 120 125 Phe Cys Gly Leu Gly Ile Asn Asn Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys 130 135 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agg ggc gat ggg aac ctg 336 Pro Leu Ser Pro Ser Trp Ala Gly Gly Ser Arg Gly Asp Gly Asn Leu 100 105 110 cag cgg aga gct tct cag aaa gag cta agg aag agt ttt gcc cgc tcc 384 Gln Arg Arg Ala Ser Gln Lys Glu Leu Arg Lys Ser Phe Ala Arg Ser 115 120 125 aag gcc atc cac gtg aac agg acc tac gat gaa cag gtg acc tcc cgg 432 Lys Ala Ile His Val Asn Arg Thr Tyr Asp Glu Gln Val Thr Ser Arg 130 135 140 gct cag gaa ccc ctg agt agt gtg cga cgg agg gca ctt ctc cgg aag 480 Ala Gln Glu Pro Leu Ser Ser Val Arg Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys 145 150 155 160 gca agc tcc ctg ccc ccc acc aca gcc cat att ctc agt gcg ctg ctg 528 Ala Ser Ser Leu Pro Pro Thr Thr Ala His Ile Leu Ser Ala Leu Leu 165 170 175 gaa tcg aga gtg aat ctg cct cag tat ccc cct aca gcc atc gac tac 576 Glu Ser Arg Val Asn Leu Pro Gln Tyr Pro Pro Thr Ala Ile Asp Tyr 180 185 190 aag tgc cat ctg aaa aag cat aat gag cgt cag ttc ttt ctg gaa ttg 624 Lys Cys His Leu Lys Lys His Asn Glu Arg Gln Phe Phe Leu Glu Leu 195 200 205 gtc aaa gat atc tcc aat gac ctt gac ctc acc agc ctg agc tac aag 672 Val Lys Asp Ile Ser Asn Asp Leu Asp Leu Thr Ser Leu Ser Tyr Lys 210 215 220 att ctc atc ttt gtc tgc ctt atg gtg gat gct gac cgc tgc tct ctt 720 Ile Leu Ile Phe Val Cys Leu Met Val Asp Ala Asp Arg Cys Ser Leu 225 230 235 240 ttc ctg gtg gaa ggg gca gct gct ggc aag aag acc ttg gtc tcc aaa 768 Phe Leu Val Glu Gly Ala Ala Ala Gly Lys Lys Thr Leu Val Ser Lys 245 250 255 ttc ttt gat gtg cat gca gga acc cct ctg ctg cct tgc agc agc aca 816 Phe Phe Asp Val His Ala Gly Thr Pro Leu Leu Pro Cys Ser Ser Thr 260 265 270 gag aac tca aat gag gtg cag gtc ccc tgg ggc aaa ggt atc att ggc 864 Glu Asn Ser Asn Glu Val Gln Val Pro Trp Gly Lys Gly Ile Ile Gly 275 280 285 tat gtc ggg gag cat gga gaa acg gtc aac att cct gat gcc tac cag 912 Tyr Val Gly Glu His Gly Glu Thr Val Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Gln 290 295 300 gat cga cga ttc aat gat gaa atc gac aag cta act gga tac aag aca 960 Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp Lys Leu Thr Gly Tyr Lys Thr 305 310 315 320 aaa tca tta ttg tgc atg cct atc cga agc agt gat ggt gag att att 1008 Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg Ser Ser Asp Gly Glu Ile Ile 325 330 335 ggt gtg gcc caa gcg ata aat aag att cct gaa gga gct cca ttt act 1056 Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile Pro Glu Gly Ala Pro Phe Thr 340 345 350 gaa gat gat gaa aaa gtt atg cag atg tat ctt cca ttt tgt gga atc 1104 Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met Tyr Leu Pro Phe Cys Gly Ile 355 360 365 gcc ata tct aac gct cag ctc ttt gct gcc tca agg aaa gaa tat gaa 1152 Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala Ala Ser Arg Lys Glu Tyr Glu 370 375 380 aga agc aga gct ttg cta gag gtg gtt aat gac ctc ttt gaa gaa cag 1200 Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val Asn Asp Leu Phe Glu Glu Gln 385 390 395 400 act gac ctg gag aaa att gtc aag aaa ata atg cat cgg gcc caa act 1248 Thr Asp Leu Glu Lys Ile Val Lys Lys Ile Met His Arg Ala Gln Thr 405 410 415 ctg ctg aaa tgt gaa cgc tgt tcc gtt tta ctc cta gag gac atc gaa 1296 Leu Leu Lys Cys Glu Arg Cys Ser Val Leu Leu Leu Glu Asp Ile Glu 420 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Asp Ala Asp Gln 530 535 540 cga ctt ttt gag gct ttt gtc atc ttt tgt gga ctt ggc atc aac aac 1680 Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile Phe Cys Gly Leu Gly Ile Asn Asn 545 550 555 560 aca att atg tat gat caa gtg aag 1704 Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys 565 <210> 10 <211> 568 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Ala Ser Arg Leu Asp Phe Gly Glu Val Glu Thr Phe Leu Asp 1 5 10 15 Arg His Pro Glu Leu Phe Glu Asp Tyr Leu Met Arg Lys Gly Lys Gln 20 25 30 Glu Met Val Glu Lys Trp Leu Gln Arg His Ser Gln Gly Gln Gly Ala 35 40 45 Leu Gly Pro Arg Pro Ser Leu Ala Gly Thr Ser Ser Leu Ala His Ser 50 55 60 Thr Cys Arg Gly Gly Ser Ser Val Gly Gly Gly Thr Gly Pro Asn Gly 65 70 75 80 Ser Ala His Ser Gln Pro Leu Pro Gly Gly Gly Asp Cys Gly Gly Val 85 90 95 Pro Leu Ser Pro Ser Trp Ala Gly Gly Ser Arg Gly Asp Gly Asn Leu 100 105 110 Gln Arg Arg Ala Ser Gln Lys Glu Leu Arg Lys Ser Phe Ala Arg Ser 115 120 125 Lys Ala Ile His Val Asn Arg Thr Tyr Asp Glu Gln Val Thr Ser Arg 130 135 140 Ala Gln Glu Pro Leu Ser Ser Val Arg Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys 145 150 155 160 Ala Ser Ser Leu Pro Pro Thr Thr Ala His Ile Leu Ser Ala Leu Leu 165 170 175 Glu Ser Arg Val Asn Leu Pro Gln Tyr Pro Pro Thr Ala Ile Asp Tyr 180 185 190 Lys Cys His Leu Lys Lys His Asn Glu Arg Gln Phe Phe Leu Glu Leu 195 200 205 Val Lys Asp Ile Ser Asn Asp Leu Asp Leu Thr Ser Leu Ser Tyr Lys 210 215 220 Ile Leu Ile Phe Val Cys Leu Met Val Asp Ala Asp Arg Cys Ser Leu 225 230 235 240 Phe Leu Val Glu Gly Ala Ala Ala Gly Lys Lys Thr Leu Val Ser Lys 245 250 255 Phe Phe Asp Val His Ala Gly Thr Pro Leu Leu Pro Cys Ser Ser Thr 260 265 270 Glu Asn Ser Asn Glu Val Gln Val Pro Trp Gly Lys Gly Ile Ile Gly 275 280 285 Tyr Val Gly Glu His Gly Glu Thr Val Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Gln 290 295 300 Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp Lys Leu Thr Gly Tyr Lys Thr 305 310 315 320 Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg Ser Ser Asp Gly Glu Ile Ile 325 330 335 Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile Pro Glu Gly Ala Pro Phe Thr 340 345 350 Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met Tyr Leu Pro Phe Cys Gly Ile 355 360 365 Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala Ala Ser Arg Lys Glu Tyr Glu 370 375 380 Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val Asn Asp Leu Phe Glu Glu Gln 385 390 395 400 Thr Asp Leu Glu Lys Ile Val Lys Lys Ile Met His Arg Ala Gln Thr 405 410 415 Leu Leu Lys Cys Glu Arg Cys Ser Val Leu Leu Leu Glu Asp Ile Glu 420 425 430 Ser Pro Val Val Lys Phe Thr Lys Ser Phe Glu Leu Met Ser Pro Lys 435 440 445 Cys Ser Ala Asp Ala Glu Asn Ser Phe Lys Glu Ser Met Glu Lys Ser 450 455 460 Ser Tyr Ser Asp Trp Leu Ile Asn Asn Ser Ile Ala Glu Leu Val Ala 465 470 475 480 Ser Thr Gly Leu Pro Val Asn Ile Ser Asp Ala Tyr Gln Asp Pro Arg 485 490 495 Phe Asp Ala Glu Ala Asp Gln Ile Ser Gly Phe His Ile Arg Ser Val 500 505 510 Leu Cys Val Pro Ile Trp Asn Ser Asn His Gln Ile Ile Gly Val Ala 515 520 525 Gln Val Leu Asn Arg Leu Asp Gly Lys Pro Phe Asp Asp Ala Asp Gln 530 535 540 Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile Phe Cys Gly Leu Gly Ile Asn Asn 545 550 555 560 Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys 565 <210> 11 <211> 1425 <212> DNA <213> Anabaena PCC7120 <220> <221> CDS <222> (1)..(1425) <223> Katalytische Dom?e CyaB1 (V386) <400> 11 gtc gag aaa caa tat caa aaa gac att tta caa agc ttg tca gat gct 48 Val Glu Lys Gln Tyr Gln Lys Asp Ile Leu Gln Ser Leu Ser Asp Ala 1 5 10 15 gta att tct aca gat atg gcc ggg aga att gtc aca att aat gat gca 96 Val Ile Ser Thr Asp Met Ala Gly Arg Ile Val Thr Ile Asn Asp Ala 20 25 30 gcc ttg gaa tta ctc ggt tgt cct tta ggt gat gct aat cat aaa agt 144 Ala Leu Glu Leu Leu Gly Cys Pro Leu Gly Asp Ala Asn His Lys Ser 35 40 45 aat aag ctg ctg tgg gaa caa aat tta att ggt cgc gta gtt tgg gaa 192 Asn Lys Leu Leu Trp Glu Gln Asn Leu Ile Gly Arg Val Val Trp Glu 50 55 60 att gta cca att gaa aat ttg cag atg cgc tta gaa gat agt tta aaa 240 Ile Val Pro Ile Glu Asn Leu Gln Met Arg Leu Glu Asp Ser Leu Lys 65 70 75 80 agt ggt gct aaa cat tat gtg cca gaa caa agt ttg ata gtg gga att 288 Ser Gly Ala Lys His Tyr Val Pro Glu Gln Ser Leu Ile Val Gly Ile 85 90 95 tat caa tta caa atg tct gaa agt cgg gtt ttg cat gaa act caa gac 336 Tyr Gln Leu Gln Met Ser Glu Ser Arg Val Leu His Glu Thr Gln Asp 100 105 110 tac tct att ttg aca gta cgc gat cgc atc aac cca gat att ttt ctc 384 Tyr Ser Ile Leu Thr Val Arg Asp Arg Ile Asn Pro Asp Ile Phe Leu 115 120 125 ccc tgg aat tta ccc caa acc ccc cag tcg caa ttt atc acc ccg gaa 432 Pro Trp Asn Leu Pro Gln Thr Pro Gln Ser Gln Phe Ile Thr Pro Glu 130 135 140 gaa gta caa atc tta gaa cgc agt att aat ctt acc gtt aat cct ttg 480 Glu Val Gln Ile Leu Glu Arg Ser Ile Asn Leu Thr Val Asn Pro Leu 145 150 155 160 acg aac cca gaa ggc ggt gtc cgt ggt ggt ttg gta gtt ttg gaa gat 528 Thr Asn Pro Glu Gly Gly Val Arg Gly Gly Leu Val Val Leu Glu Asp 165 170 175 att agt caa gag aag cgc ctc aaa act act atg tat cgc tac ctt aca 576 Ile Ser Gln Glu Lys Arg Leu Lys Thr Thr Met Tyr Arg Tyr Leu Thr 180 185 190 ccc cat gta gct gaa cag gta atg gct tta ggg gaa gat gcc tta atg 624 Pro His Val Ala Glu Gln Val Met Ala Leu Gly Glu Asp Ala Leu Met 195 200 205 gtt ggt gaa cgc aag gag gtg act gtt tta ttt tca gat atc cga ggc 672 Val Gly Glu Arg Lys Glu Val Thr Val Leu Phe Ser Asp Ile Arg Gly 210 215 220 tac acc aca ctt acg gaa aat cta ggt gcg gct gaa gtg gta tca ctc 720 Tyr Thr Thr Leu Thr Glu Asn Leu Gly Ala Ala Glu Val Val Ser Leu 225 230 235 240 ctg aac caa tat ttt gaa aca atg gtt gaa gca gtt ttc aac tat gaa 768 Leu Asn Gln Tyr Phe Glu Thr Met Val Glu Ala Val Phe Asn Tyr Glu 245 250 255 ggc aca ctg gat aaa ttt atc ggt gat gct tta atg gct gtt ttt ggt 816 Gly Thr Leu Asp Lys Phe Ile Gly Asp Ala Leu Met Ala Val Phe Gly 260 265 270 gcg cca cta cca ctc aca gaa aat cat gct tgg caa gca gta cag tca 864 Ala Pro Leu Pro Leu Thr Glu Asn His Ala Trp Gln Ala Val Gln Ser 275 280 285 gca tta gat atg cgc caa cgc ctg aag gaa ttt aac caa cga cgc atc 912 Ala Leu Asp Met Arg Gln Arg Leu Lys Glu Phe Asn Gln Arg Arg Ile 290 295 300 att cag gca caa cca caa atc aaa atc ggt att ggt att agt tct gga 960 Ile Gln Ala Gln Pro Gln Ile Lys Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ser Gly 305 310 315 320 gaa gta gtt tct ggt aac atc ggt tct cac aag cgt atg gat tac aca 1008 Glu Val Val Ser Gly Asn Ile Gly Ser His Lys Arg Met Asp Tyr Thr 325 330 335 gtc att ggt gat ggt gtg aat tta agt tcc cgc ttg gaa act gtc acc 1056 Val Ile Gly Asp Gly Val Asn Leu Ser Ser Arg Leu Glu Thr Val Thr 340 345 350 aaa gaa tat ggc tgt gat att atc ctc agt gag ttt act tac caa tta 1104 Lys Glu Tyr Gly Cys Asp Ile Ile Leu Ser Glu Phe Thr Tyr Gln Leu 355 360 365 tgc agc gat cgc att tgg gta cgt cag tta gat aaa atc cga gtc aaa 1152 Cys Ser Asp Arg Ile Trp Val Arg Gln Leu Asp Lys Ile Arg Val Lys 370 375 380 ggg aaa cac caa gct gtc aat atc tat gag ttg att agc gat cgc agt 1200 Gly Lys His Gln Ala Val Asn Ile Tyr Glu Leu Ile Ser Asp Arg Ser 385 390 395 400 act ccc tta gat gac aac acc caa gag ttc ctc ttt cac tat cat aat 1248 Thr Pro Leu Asp Asp Asn Thr Gln Glu Phe Leu Phe His Tyr His Asn 405 410 415 ggt cgg act gcc tac tta gtc cgc gat ttt acc cag gcg atc gct tgt 1296 Gly Arg Thr Ala Tyr Leu Val Arg 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310 315 320 Glu Val Val Ser Gly Asn Ile Gly Ser His Lys Arg Met Asp Tyr Thr 325 330 335 Val Ile Gly Asp Gly Val Asn Leu Ser Ser Arg Leu Glu Thr Val Thr 340 345 350 Lys Glu Tyr Gly Cys Asp Ile Ile Leu Ser Glu Phe Thr Tyr Gln Leu 355 360 365 Cys Ser Asp Arg Ile Trp Val Arg Gln Leu Asp Lys Ile Arg Val Lys 370 375 380 Gly Lys His Gln Ala Val Asn Ile Tyr Glu Leu Ile Ser Asp Arg Ser 385 390 395 400 Thr Pro Leu Asp Asp Asn Thr Gln Glu Phe Leu Phe His Tyr His Asn 405 410 415 Gly Arg Thr Ala Tyr Leu Val Arg Asp Phe Thr Gln Ala Ile Ala Cys 420 425 430 Phe Asn Ser Ala Lys His Ile Arg Pro Thr Asp Gln Ala Val Asn Ile 435 440 445 His Leu Glu Arg Ala Tyr Asn Tyr Gln Gln Thr Pro Pro Pro Pro Gln 450 455 460 Trp Asp Gly Val Trp Thr Ile Phe Thr Lys 465 470 <210> 13 <211> 1064 <212> PRT <213> Kuenstliche Sequenz <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1064) <223> PDE11GAF/CyaB1-Chimaere <400> 13 Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg His Arg Ser Met Ala Ala Ser Arg Leu Asp Phe Gly 20 25 30 Glu Val Glu Thr Phe Leu Asp Arg His Pro Glu Leu Phe Glu Asp Tyr 35 40 45 Leu Met Arg Lys Gly Lys Gln Glu Met Val Glu Lys Trp Leu Gln Arg 50 55 60 His Ser Gln Gly Gln Gly Ala Leu Gly Pro Arg Pro Ser Leu Ala Gly 65 70 75 80 Thr Ser Ser Leu Ala His Ser Thr Cys Arg Gly Gly Ser Ser Val Gly 85 90 95 Gly Gly Thr Gly Pro Asn Gly Ser Ala His Ser Gln Pro Leu Pro Gly 100 105 110 Gly Gly Asp Cys Gly Gly Val Pro Leu Ser Pro Ser Trp Ala Gly Gly 115 120 125 Ser Arg Gly Asp Gly Asn Leu Gln Arg Arg Ala Ser Gln Lys Glu Leu 130 135 140 Arg Lys Ser Phe Ala Arg Ser Lys Ala Ile His Val Asn Arg Thr Tyr 145 150 155 160 Asp Glu Gln Val Thr Ser Arg Ala Gln Glu Pro Leu Ser Ser Val Arg 165 170 175 Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys Ala Ser Ser Leu Pro Pro Thr Thr Ala 180 185 190 His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Glu Ser Arg Val Asn Leu Pro Gln Tyr 195 200 205 Pro Pro Thr Ala Ile Asp Tyr Lys Cys His Leu Lys Lys His Asn Glu 210 215 220 Arg Gln Phe Phe Leu Glu Leu Val Lys Asp Ile Ser Asn Asp Leu Asp 225 230 235 240 Leu Thr Ser Leu Ser Tyr Lys Ile Leu Ile Phe Val Cys Leu Met Val 245 250 255 Asp Ala Asp Arg Cys Ser Leu Phe Leu Val Glu Gly Ala Ala Ala Gly 260 265 270 Lys Lys Thr Leu Val Ser Lys Phe Phe Asp Val His Ala Gly Thr Pro 275 280 285 Leu Leu Pro Cys Ser Ser Thr Glu Asn Ser Asn Glu Val Gln Val Pro 290 295 300 Trp Gly Lys Gly Ile Ile Gly Tyr Val Gly Glu His Gly Glu Thr Val 305 310 315 320 Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Gln Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp 325 330 335 Lys Leu Thr Gly Tyr Lys Thr Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg 340 345 350 Ser Ser Asp Gly Glu Ile Ile Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile 355 360 365 Pro Glu Gly Ala Pro Phe Thr Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met 370 375 380 Tyr Leu Pro Phe Cys Gly Ile Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala 385 390 395 400 Ala Ser Arg Lys Glu Tyr Glu Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val 405 410 415 Asn Asp Leu Phe Glu Glu Gln Thr Asp Leu Glu Lys Ile Val Lys Lys 420 425 430 Ile Met His Arg Ala Gln Thr Leu Leu Lys Cys Glu Arg Cys Ser Val 435 440 445 Leu Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Pro Val Val Lys Phe Thr Lys Ser 450 455 460 Phe Glu Leu Met Ser Pro Lys Cys Ser Ala Asp Ala Glu Asn Ser Phe 465 470 475 480 Lys Glu Ser Met Glu Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Trp Leu Ile Asn Asn 485 490 495 Ser Ile Ala Glu Leu Val Ala Ser Thr Gly Leu Pro Val Asn Ile Ser 500 505 510 Asp Ala Tyr Gln Asp Pro Arg Phe Asp Ala Glu Ala Asp Gln Ile Ser 515 520 525 Gly Phe His Ile Arg Ser Val Leu Cys Val Pro Ile Trp Asn Ser Asn 530 535 540 His Gln Ile Ile Gly Val Ala Gln Val Leu Asn Arg Leu Asp Gly Lys 545 550 555 560 Pro Phe Asp Asp Ala Asp Gln Arg Leu Phe Glu Ala Phe Val Ile Phe 565 570 575 Cys Gly Leu Gly Ile Asn Asn Thr Ile Met Tyr Asp Gln Val Lys Val 580 585 590 Glu Lys Gln Tyr Gln Lys Asp Ile Leu Gln Ser Leu Ser Asp Ala Val 595 600 605 Ile Ser Thr Asp Met Ala Gly Arg Ile Val Thr Ile Asn Asp Ala Ala 610 615 620 Leu Glu Leu Leu Gly Cys Pro Leu Gly Asp Ala Asn His Lys Ser Asn 625 630 635 640 Lys Leu Leu Trp Glu Gln Asn Leu Ile Gly Arg Val Val Trp Glu Ile 645 650 655 Val Pro Ile Glu Asn Leu Gln Met Arg Leu Glu Asp Ser Leu Lys Ser 660 665 670 Gly Ala Lys His Tyr Val Pro Glu Gln Ser Leu Ile Val Gly Ile Tyr 675 680 685 Gln Leu Gln Met Ser Glu Ser Arg Val Leu His Glu Thr Gln Asp Tyr 690 695 700 Ser Ile Leu Thr Val Arg Asp Arg Ile Asn Pro Asp Ile Phe Leu Pro 705 710 715 720 Trp Asn Leu Pro Gln Thr Pro Gln Ser Gln Phe Ile Thr Pro Glu Glu 725 730 735 Val Gln Ile Leu Glu Arg Ser Ile Asn Leu Thr Val Asn Pro Leu Thr 740 745 750 Asn Pro Glu Gly Gly Val Arg Gly Gly Leu Val Val Leu Glu Asp Ile 755 760 765 Ser Gln Glu Lys Arg Leu Lys Thr Thr Met Tyr Arg Tyr Leu Thr Pro 770 775 780 His Val Ala Glu Gln Val Met Ala Leu Gly Glu Asp Ala Leu Met Val 785 790 795 800 Gly Glu Arg Lys Glu Val Thr Val Leu Phe Ser Asp Ile Arg Gly Tyr 805 810 815 Thr Thr Leu Thr Glu Asn Leu Gly Ala Ala Glu Val Val Ser Leu Leu 820 825 830 Asn Gln Tyr Phe Glu Thr Met Val Glu Ala Val Phe Asn Tyr Glu Gly 835 840 845 Thr Leu Asp Lys Phe Ile Gly Asp Ala Leu Met Ala Val Phe Gly Ala 850 855 860 Pro Leu Pro Leu Thr Glu Asn His Ala Trp Gln Ala Val Gln Ser Ala 865 870 875 880 Leu Asp Met Arg Gln Arg Leu Lys Glu Phe Asn Gln Arg Arg Ile Ile 885 890 895 Gln Ala Gln Pro Gln Ile Lys Ile Gly Ile Gly Ile Ser Ser Gly Glu 900 905 910 Val Val Ser Gly Asn Ile Gly Ser His Lys Arg Met Asp Tyr Thr Val 915 920 925 Ile Gly Asp Gly Val Asn Leu Ser Ser Arg Leu Glu Thr Val Thr Lys 930 935 940 Glu Tyr Gly Cys Asp Ile Ile Leu Ser Glu Phe Thr Tyr Gln Leu Cys 945 950 955 960 Ser Asp Arg Ile Trp Val Arg Gln Leu Asp Lys Ile Arg Val Lys Gly 965 970 975 Lys His Gln Ala Val Asn Ile Tyr Glu Leu Ile Ser Asp Arg Ser Thr 980 985 990 Pro Leu Asp Asp Asn Thr Gln Glu Phe Leu Phe His Tyr His Asn Gly 995 1000 1005 Arg Thr Ala Tyr Leu Val Arg Asp Phe Thr Gln Ile Ala Cys Phe 1010 1015 1020 Asn Ser Ala Lys His Ile Arg Pro Thr Asp Gln Ala Val Asn Ile 1025 1030 1035 His Leu Glu Arg Ala Tyr Asn Tyr Gln Gln Thr Pro Pro Pro Pro 1040 1045 1050 Gln Trp Asp Gly Val Trp Thr Ile Phe Thr Lys 1055 1060 <210> 14 <211> 489 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(489) <223> GAF-A PDE11 <400> 14 ttc ctg gtg gaa ggg gca gct gct ggc aag aag acc ttg gtc tcc aaa 48 Phe Leu Val Glu Gly Ala Ala Ala Gly Lys Lys Thr Leu Val Ser Lys 1 5 10 15 ttc ttt gat gtg cat gca gga acc cct ctg ctg cct tgc agc agc aca 96 Phe Phe Asp Val His Ala Gly Thr Pro Leu Leu Pro Cys Ser Ser Thr 20 25 30 gag aac tca aat gag gtg cag gtc ccc tgg ggc aaa ggt atc att ggc 144 Glu Asn Ser Asn Glu Val Gln Val Pro Trp Gly Lys Gly Ile Ile Gly 35 40 45 tat gtc ggg gag cat gga gaa acg gtc aac att cct gat gcc tac cag 192 Tyr Val Gly Glu His Gly Glu Thr Val Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Gln 50 55 60 gat cga cga ttc aat gat gaa atc gac aag cta act gga tac aag aca 240 Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp Lys Leu Thr Gly Tyr Lys Thr 65 70 75 80 aaa tca tta ttg tgc atg cct atc cga agc agt gat ggt gag att att 288 Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg Ser Ser Asp Gly Glu Ile Ile 85 90 95 ggt gtg gcc caa gcg ata aat aag att cct gaa gga gct cca ttt act 336 Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile Pro Glu Gly Ala Pro Phe Thr 100 105 110 gaa gat gat gaa aaa gtt atg cag atg tat ctt cca ttt tgt gga atc 384 Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met Tyr Leu Pro Phe Cys Gly Ile 115 120 125 gcc ata tct aac gct cag ctc ttt gct gcc tca agg aaa gaa tat gaa 432 Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala Ala Ser Arg Lys Glu Tyr Glu 130 135 140 aga agc aga gct ttg cta gag gtg gtt aat gac ctc ttt gaa gaa cag 480 Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val Asn Asp Leu Phe Glu Glu Gln 145 150 155 160 act gac ctg 489 Thr Asp Leu <210> 15 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Phe Leu Val Glu Gly Ala Ala Ala Gly Lys Lys Thr Leu Val Ser Lys 1 5 10 15 Phe Phe Asp Val His Ala Gly Thr Pro Leu Leu Pro Cys Ser Ser Thr 20 25 30 Glu Asn Ser Asn Glu Val Gln Val Pro Trp Gly Lys Gly Ile Ile Gly 35 40 45 Tyr Val Gly Glu His Gly Glu Thr Val Asn Ile Pro Asp Ala Tyr Gln 50 55 60 Asp Arg Arg Phe Asn Asp Glu Ile Asp Lys Leu Thr Gly Tyr Lys Thr 65 70 75 80 Lys Ser Leu Leu Cys Met Pro Ile Arg Ser Ser Asp Gly Glu Ile Ile 85 90 95 Gly Val Ala Gln Ala Ile Asn Lys Ile Pro Glu Gly Ala Pro Phe Thr 100 105 110 Glu Asp Asp Glu Lys Val Met Gln Met Tyr Leu Pro Phe Cys Gly Ile 115 120 125 Ala Ile Ser Asn Ala Gln Leu Phe Ala Ala Ser Arg Lys Glu Tyr Glu 130 135 140 Arg Ser Arg Ala Leu Leu Glu Val Val Asn Asp Leu Phe Glu Glu Gln 145 150 155 160 Thr Asp Leu

Claims

하기 도메인이 기능적으로 서로 연결된 폴리펩타이드에 있어서,

(a) 인간 포스포디에스터라제 11(human phosphodiesterase 11, PDE11)의 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인, 또는 이들의 기능적 등가 변이체들; 및

(b) 아데닐레이트 사이클라제(adenylate cyclase)의 촉매 도메인 또는 이의 기능적 등가 변이체들

을 포함하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 포스포디에스터라제 11(PDE11)은 PDE11A1, PDE11A2, PDE11A3, PDE11A4, 또는 이들 각각의 기능적 등가 변이체들의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포스포디에스터라제 11(PDE11)은 이소폼 PDE11A4를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAF_A 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열; 또는 서열 번호 6의 서열과 아미노산 수준에서 90% 이상의 동일성을 가지고 GAF_A 도메인의 특성을 나타내는, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제4항에 있어서, 상기 GAF_A 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GAF_B 도메인은 서열 번호 8의 아미노산 서열; 또는 서열 번호 8의 서열과 아미노산 수준에서 90% 이상의 동일성을 가지고 GAF_B 도메인의 특성을 가지는, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 GAF_B 도메인은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적으로 서로 연결된 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인, 또는 이들의 기능적 등가 변이체들은 서열 번호 10의 아미노산 서열; 또는 서열 번호 10의 서열과 아미노산을 기준으로 70% 이상의 서열 동일성을 가지며 상기 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 GAF 도메인의 조절 특성을 나타내는, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 상기 서열 번호 6의 GAF_A 도메인 및 상기 서열 번호 8의 GAF_B 도메인의 수득된 아미노산 서열이 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 최대 10% 변경된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기능적으로 서로 연결된 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 GAF_A 도메인 및 GAF_B 도메인, 또는 이들의 기능적 등가 변이체들은

(a) M24 아미노산에서부터 K591 아미노산까지의 인간 PDE11A4의 N-말단; 또는

(b) 서열 번호 10

의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데닐레이트 사이클라제는 GAF 도메인 또는 이들 각각의 기능적 등가 변이체들을 포함하는 박테리아 기원의 아데닐레이트 사이클라제로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데닐레이트 사이클라제는,

(a) 아나베나 종(Anabaena sp.) PCC 7120으로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(b) 아나베나 바리아빌라이(Anabaena variabili) ATTC 29413으로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(c) 노스토크 펀크티포르메(Nostoc punctiforme) PCC 73102로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(d) 트리코데스뮴 에리트레움(Trichodesmium erythraeum) IMS 101로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(e) 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus) HD 100으로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들;

(f) 마그네토코커스 종(Magnetococcus sp.) MC-1로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들

의 군으로부터 선택된 아데닐레이트 사이클라제로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데닐레이트 사이클라제는 상기 이소폼 CyaB1 또는 CyaB2의 아나베나 종 PCC 7120으로부터의 아데닐레이트 사이클라제, 또는 이의 기능적 등가 변이체들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인 또는 이의 기능적 등가 변이체들은 서열 번호 12의 아미노산 서열; 또는 서열 번호 12의 서열과 아미노산을 기준으로 90% 이상의 동일성을 가지고 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 특성을 나타내는, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인 또는 이의 기능적 등가 변이체들은,

(a) CyaB1의 아미노산 L386이 V386으로 치환된, 아미노산 L386에서부터 K859까지의 CyaB1의 C-말단; 또는

(b) 서열 번호 12

의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열; 또는 서열 번호 1 또는 서열 번호 4의 서열과 아미노산 기준으 로 70% 이상의 동일성을 가지고 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 GAF 도메인의 조절 특성 및 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 특성을 가지는, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유래한 서열을 포함하며, 상기에서 얻어진 서열 번호 6의 GAF_A 도메인, 서열 번호 8의 GAF_B 도메인 및 서열변호 12의 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인의 아미노산 서열이 치환, 삽입 또는 결실에 의해 최대 10% 변경되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
서열 번호 1 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제18항에 있어서,

(a) 서열 번호 5 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 5의 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 서열; 및

(b) 서열 번호 7 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 7의 핵산 서열과 혼성화 하는 핵산 서열; 및

(c) 서열 번호 11 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호 11의 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 서열

을 부분 서열로서 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
서열 번호 2의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
서열 번호 2의 핵산 서열의 폴리뉴클레오타이드.
제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 플라스미드 벡터.
제22항에 따른 플라스미드 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
제23항에 따른 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계;

제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 발현시키고 단리하는 단계

를 포함하는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 제조 방법.
(a) 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 가능성 있는 조절자를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 가능성 있는 조절자의 부재 시와 비교하여 상기 가능성 있는 조절자가 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 아데닐레이트 사이클라제 활성을 변경시키는 지를 측정하는 단계

를 포함하는 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11) 조절자의 식별 방법.
제25항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 상기 가능성 있는 조절자 이외에, cGMP를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드와 접촉시키는 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 아데닐레이트 사이클라제 활성의 측정은 방사선- 또는 형광-표지된 ATP의 전환률을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절자의 부재 시와 비교하여 상기 조절자의 존재 하에 아데닐레이트 사이클라제 활성의 감소가 측정되고, 따라서 상기 조절자는 PDE11 길항제를 구성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절자의 부재 시와 비교 하여 상기 조절자의 존재 하에 아데닐레이트 사이클라제 활성의 증가가 측정되고, 따라서 상기 조절자는 PDE11 작용제를 구성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인에 대한 직접적인 조절자를 배제시키기 위해 상기 아데닐레이트 사이클라제의 촉매 도메인을 나타내지만 인간 포스포디에스터라제 11(PDE11)의 작용성 GAF 도메인을 나타내지 않는 폴리펩타이드를 이용하여 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 제23항에 따른 숙수 세포의 존재하에 세포분석법(cellular assay)으로서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 방법은 고처리량 규모로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.