ES2476250T3 - Métodos de procedimiento de purificación de fucoidano a partir de extractos de algas marinas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de purificación de fucoidano de una mezcla heterogénea, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una fuente de fucoidano; (b) eliminar iones de metales pesados de dicha fuente tratando con un agente quelante para producir una primera mezcla de fucoidano; (c) precipitar selectivamente el fucoidano presente en dicha primera mezcla de fucoidano para eliminar contaminantes; (d) resuspender el precipitado que contiene fucoidano en disolución acuosa para producir una segunda mezcla de fucoidano; (e) repetir las etapas (c) y (d) una o más veces; y (f) filtrar la disolución acuosa que comprende fucoidano para eliminar contaminantes bacterianos y de endotoxinas para dar fucoidano purificado.

Description

M�todos de procedimiento de purificación de fucoidano a partir de extractos de algas marinas

5 CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere generalmente a la producción de fucoidano (también llamado AV513 en el presente documento). Más particularmente, la invención se refiere a procedimientos de purificación de extracto de fucoidano para eliminar iones de metales pesados, contaminantes bacterianos y de endotoxinas y otras impurezas sin afectar la actividad biológica deseada.

ANTECEDENTES

La coagulación normal de la sangre es un proceso fisiológico y bioquímico complejo que est� regulado en varios niveles.

15 El proceso de la coagulación de la sangre implica la activación de una cascada de factores de coagulación que conduce a la formación de fibrina y a la agregación de plaquetas, junto con vasoconstricci�n local (revisado por Davie y col., Biochemistry 30:10363, 1991). La cascada de coagulación est� compuesta por una ruta “extrínseca” que se cree que es el medio principal del inicio de la coagulación normal y una ruta “intrínseca” que contribuye a una respuesta de la coagulación ampliada. La respuesta normal a una lesión de agresión hemorrágica implica la activación de la ruta extrínseca. La activación de la ruta extrínseca se inicia cuando la sangre se pone en contacto con factor tisular (TF), un cofactor para el factor VII que se expone o expresa en tejidos tras la agresión. El TF forma un complejo con FVII que facilita la producción de FVIIa. A continuación FVIIa se asocia con TF para convertir FX en la serina proteasa FXa, que es un componente crítico del complejo de protrombinasa. La conversión de protrombina en trombina por el complejo de FXa/FVa/calcio/fosfol�pido estimula la formación de fibrina y la activación de plaquetas, siendo todo esencial para la

25 coagulación normal de la sangre. La hemostasia normal se potencia adicionalmente por los factores IXa y VIIIa de la ruta intrínseca, que también convierten FX en FXa. Véase también Weitz, J. I. y col., Chest, 126 (3), septiembre de 2004 (Supl), 265S.

Los polisac�ridos sulfatados son una clase de moléculas caracterizadas por una plétora de actividades biológicas con perfiles de tolerabilidad frecuentemente favorables en animales y seres humanos. Estas moléculas poliani�nicas se derivan frecuentemente de tejidos de plantas y animales y engloban una amplia variedad de subclases que incluyen heparinas, glucosaminoglicanos, fucoidanos, carrageninas, polisulfatos de pentosano y sulfatos de dermatano o dextrano. Los polisac�ridos sulfatados similares a heparina presentan actividad anticoagulante diferencial mediada mediante interacciones de antitrombina III y/o cofactor II de heparina (Toida TC, Linhardt, RJ., Trends in Glycoscience

35 and Glycotechnology 2003; 15:29-46).

Aunque un polisac�rido sulfatado tal, la heparina oral, se ha considerado para el desarrollo como anticoagulante (A Dunn, Idrugs, 3:817-824, 2000), la heparina es inadecuada debido a sus graves complicaciones que incluyen hemorragias intraoperatorias y postoperatorias, osteoporosis, alopecia, resistencia a heparina, rebote de heparina, trombocitopenia inducida por heparina (TIH), síndrome de trombocitopenia-trombosis inducida por heparina (STTIH) y otras desventajas que incluyen múltiples días para atenuar la anticoagulaci�n después de retirar el fármaco (Iqbal O y col., Fareed J, Expert Opin Emerg Drugs 6:111-135, 2001; Roberts, HR, Anesthesiology 100:722-730, 2004). La heparina se administra convencionalmente parenteralmente y posee un nivel de captación oral de solo aproximadamente el 1 % (Fitton, J.H., Glycoscience, The Nutrition Science Site, modificado el 1 de enero de 2005).

45 A diferencia de la heparina, se ha mostrado que otro polisac�rido sulfatado, el fucoidano, un polisac�rido sulfatado aislado de una alga marina, regula (es decir, promueve) la coagulación (publicación de patente de EE.UU. n.� 2005/0282771). Específicamente, los fucoidanos, cuando se administran a bajas concentraciones in vitro, o bajas dosis subcutáneas in vivo, proporcionan coagulación mejorada (acelerada) en casos de hemofilia mediante la activación de la ruta extrínseca (Liu, T. y col. y Johnson, K.W., Thrombosis and Haemostasis, 95:68-76, 2006), demostrando una actividad pro-coagulante. A mayores dosis el fucoidano puede tener un efecto anticoagulante similar a la heparina. En vista de los problemas asociados a los presentes anticoagulantes como la heparina o la warfarina, sigue existiendo claramente una necesidad de agentes, tales como fucoidano, que puedan vencer uno o más de los problemas asociados a la terapia anticoagulante actualmente disponible.

55 As�, sigue existiendo la necesidad de un procedimiento mejorado para producir rentable y eficazmente extracto enriquecido en fucoidano con actividad óptima para uso terapéutico procoagulante o anticoagulante.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el descubrimiento de un procedimiento de purificación de fucoidano a partir de extracto de algas marinas. El procedimiento proporciona altos rendimientos de fucoidano sustancialmente libre de iones de metales pesados, contaminantes bacterianos y de endotoxinas y otras impurezas.

65 Por consiguiente, la invención objeto incluye un procedimiento de enriquecimiento de fucoidano de una mezcla heterogénea, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una fuente de fucoidano;

(b) eliminar iones de metales pesados de dicha fuente tratando con un agente quelante para producir una 5 primera mezcla de fucoidano;

(c)

precipitar selectivamente el fucoidano presente en dicha primera mezcla de fucoidano para eliminar contaminantes;

(d)

resuspender el precipitado que contiene fucoidano en disolución acuosa para producir una segunda mezcla de fucoidano;

(e)

repetir las etapas (c) y (d) una o más veces; y

15 (f) filtrar la disolución acuosa que comprende fucoidano para eliminar contaminantes bacterianos y de endotoxinas para dar extracto de fucoidano purificado.

En una realización, el fucoidano posee del 5 al 25 por ciento en peso de azufre. En otra realización, el fucoidano es de origen algal. En una realización preferida, el fucoidano se deriva del género Fucus o Laminaria. Fucoidanos a modo de ejemplo son aquellos derivados de Fucus vesiculosis o de Laminaria japonica u otras fuentes que incluyen, pero no se limitan a, Undaria pinnitifada y Ascophyllum nodosum.

En ciertas realizaciones, el agente quelante est� seleccionado del grupo que consiste en ácido etilendiaminatetraac�tico (EDTA), acético etilenglicol-bis-(beta-aminoetil�ter)-N,N,N',N'-tetra�cido (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropanol-1

25 sulf�nico (DMPS) y ácido 2,3-dimercaptosucc�nico (DMSA). En una realización preferida, el agente quelante es EDTA. En ciertas realizaciones, el agente quelante se inmoviliza sobre un soporte sólido. En una realización, el agente quelante es una resina quelante de iminodiacetato.

En ciertas realizaciones, el fucoidano se precipita selectivamente una o más veces con etanol, en las que la concentración de etanol en la mezcla de fucoidano es de aproximadamente el 40 % al 50 % (v/v). En ciertas realizaciones, el pH se mantiene entre aproximadamente pH 5,7 y aproximadamente pH 6,0. En una realización preferida, el pH se ajusta a aproximadamente pH 5,95. En ciertas realizaciones se añade NaCl a la mezcla de fucoidano a una concentración de aproximadamente 20-24 g/litro.

35 En otro aspecto, la memoria descriptiva proporciona una composición que comprende fucoidano producido por cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En una realización, el fucoidano posee del 5 al 25 por ciento en peso de azufre. En otra realización, el fucoidano es de origen algal. En una realización preferida, el fucoidano se deriva del género Fucus o Laminaria. Fucoidanos a modo de ejemplo son aquellos derivados de Fucus vesiculosis o de Laminaria japonica o de Chorda filum, Cladosiphon okamuranus, Undaria pinnatifida, Leathesia difformis, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Pelvetia fastigiata, Saundersella simplex, Chordaria flagelliformis, o cualquier otra especie de planta o animal marino que contenga fucoidano. En una realización preferida, el fucoidano es biol�gicamente activo, por ejemplo, teniendo actividad pro-coagulante. En ciertas realizaciones, la composición puede comprender además un excipiente farmac�uticamente aceptable.

45 En otro aspecto, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento para tratar un sujeto en necesidad de coagulación de la sangre potenciada que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende fucoidano, producida por cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, a dicho sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene un trastorno hemorrágico seleccionado del grupo que consiste en un trastorno hemorrágico crónico o agudo, un trastorno de la coagulación congénito producido por una deficiencia de factores de la sangre y un trastorno de la coagulación adquirido. En otras realizaciones, la causa de la necesidad de coagulación de la sangre potenciada es antes de la administración de un anticoagulante, cirugía, u otro procedimiento invasivo. En ciertas realizaciones, el fucoidano se administra a una dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

55 Estas y otras realizaciones de la invención objeto se producirán fácilmente para aquellos expertos en la materia en vista de la divulgación en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra el efecto del procesamiento sobre la actividad del fucoidano (AV513) en un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT).

La Figura 2 muestra el efecto del procesamiento sobre la actividad de fucoidano en un ensayo de tiempo de protrombina diluido (dPT).

65 La Figura 3 muestra un análisis de tromboelast�grafo (TEG) del efecto del procesamiento sobre la actividad de fucoidano.

DESCRIPCI�N DETALLADA DE LA INVENCIÓN

5 La práctica de la presente invención emplear�, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química de proteínas, bioquímica, biología molecular y farmacolog�a, dentro de la experiencia de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Protein Purification Proteins: A Practical Approach (E.L.V. Harris y S. Angal, Eds., 1989); Protein Purification Applications: A Practical Approach (E.L.V. Harris y S. Angal, Eds., 1990); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman y Company, 1993); A.L.

10 Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edición actual); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Morrison y Boyd, Organic Chemistry (Allyn y Bacon, Inc., edición actual); J. March, Advanced Organic Chemistry (McGraw Hill, edición actual); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Ed., 20� ed.; y Goodman & Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics, J. Griffith Hardman, L. L. Limbird, A. Gilman, 10� ed.

15 Las siguientes abreviaturas de amino�cidos se usan en todo el texto: Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) ácido asp�rtico: Asp (D) Ciste�na: Cys (C) Glutamina: Gln (Q)ácido glut�mico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: Thr (T) Tript�fano: Trp (W) Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V)

1. DEFINICIONES

En la descripción de la presente invención se emplearán los siguientes términos y pretenden definirse como se indica a 20 continuación.

Debe observarse que, como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referencias en plural, a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. As�, por ejemplo, referencia a “fucoidano” incluye una mezcla de dos o más de tales fucoidanos y similares.

25 Como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa � aproximadamente el 10 % del valor que modifica.

El término “biol�gicamente activo” se refiere a una proteína que tiene funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas 30 de una molécula que se produce naturalmente.

El término “fucoidano”, como se usa en el presente documento, se refiere a un alfa-L-fucano sulfatado encontrado en muchas plantas y animales marinos. El fucoidano es particularmente abundante en las paredes celulares de algas marrones e incluye fucoidanos derivados del género Fucus (por ejemplo, Fucus vesiculosis, Fucus evanescens, Fucus

35 distichus y Fucus serratus) o Laminaria (por ejemplo, Laminaria japonica, Laminaria religiosa y Laminaria abyssalis). El fucoidano también incluye fucoidanos derivados de Chorda filum, Cladosiphon okamuranus, Undaria pinnatifida, Leathesia difformis, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Pelvetia fastigiata, Saundersella simplex, Chordaria flagelliformis, o cualquier otra especie de planta o animal marino que contenga fucoidano. Además, el término fucoidano incluye fragmentos biol�gicamente activos, derivados o análogos de los mismos. El fucoidano puede incluir fragmentos

40 de fucoidano generados por degradación (por ejemplo, hidrólisis) de moléculas de fucoidano mayores. La degradación puede lograrse por cualquiera de una diversidad de medios conocidos para aquellos expertos en la materia que incluyen tratamiento de fucoidano con ácido, base, calor, o enzimas para dar fucoidano degradado. Los fucoidanos también pueden alterarse químicamente y pueden tener modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, sulfataci�n, polisulfataci�n, acetilaci�n, esterificaci�n y metilaci�n.

45 “Sustancialmente purificado” generalmente se refiere al aislamiento de una sustancia (por ejemplo, fucoidano) de forma que la sustancia comprenda la mayoría del porcentaje de la muestra en la que reside. Normalmente, en una muestra, un componente sustancialmente purificado comprende el 50 %, preferentemente el 80 %-85 %, más preferentemente el 9095 % de la muestra.

50 Una composición que contiene A est� “sustancialmente libre de” B cuando al menos aproximadamente el 80 % en peso de A+B total en la composición es A. Preferentemente, A comprende al menos aproximadamente del 85 % al 95% en peso del total de A+B en la composición.

55 Un “anticoagulante”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente que puede prevenir o ralentizar la formación de coágulos.

Un “procoagulante”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente capaz de acelerar la formación de coágulos.

5 Un “agente quelante”, como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico, p�ptido o proteína que puede unirse a un metal. Ejemplos de agentes quelantes incluyen ácido etilendiaminatetraac�tico (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(beta-aminoetil�ter)-N,N,N',N'-tetraac�tico (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropanol-1-sulf�nico (DMPS) y ácido 2,3-dimercaptosucc�nico (DMSA) y similares. El agente quelante puede inmovilizarse sobre un soporte sólido (por ejemplo, resina quelante de iminodiacetato).

El término “derivado de” se usa en el presente documento para identificar la fuente original de una molécula, pero no pretende limitar el procedimiento por el que se prepara la molécula que puede ser, por ejemplo, por síntesis química o medios recombinantes.

15 Por “derivado” est� prevista cualquier modificación adecuada de la molécula de referencia de interés o de un análogo de la misma, tal como sulfataci�n, acetilaci�n, glucosilaci�n, fosforilaci�n, conjugación de pol�meros (tal como con polietilenglicol), u otra adición de restos extraños, mientras que se conserve la actividad biológica deseada (por ejemplo, actividad de coagulación) de la molécula de referencia. El fucoidano puede alterarse químicamente, por ejemplo, para mejorar la función procoagulante. Tales modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, sulfataci�n, polisulfataci�n, esterificaci�n y metilaci�n. Procedimientos de preparación de análogos y derivados est�n generalmente disponibles en la materia.

Por “fragmento” est� prevista una molécula que consiste en solo una parte de la secuencia y estructura de longitud completa intacta. Un fragmento de un fucoidano puede generarse por degradación (por ejemplo, hidrólisis) de un

25 polisac�rido de fucoidano mayor. Fragmentos activos de fucoidano incluirán generalmente al menos aproximadamente 220 unidades de sac�ridos del polisac�rido de longitud completa, preferentemente al menos aproximadamente 5-10 unidades de sac�rido de la molécula de longitud completa, o cualquier número entero entre 2 unidades de sac�rido y la molécula de longitud completa, a condición de que el fragmento en cuestión retenga la actividad biológica, tal como actividad procoagulante.

“Excipiente o vehículo farmac�uticamente aceptable” se refiere a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en las composiciones de la invención y que no produce efectos toxicológicos adversos significativos al paciente.

“Sal farmac�uticamente aceptable” incluye, pero no se limita a, sales de amino�cidos, sales preparadas con ácidos

35 inorgánicos, tales como sales de cloruro, sulfato, fosfato, difosfato, bromhidrato y nitrato, o sales preparadas con un ácido orgánico, tal como malato, maleato, fumarato, tartrato, succinato, etilsuccinato, citrato, acetato, lactato, metanosulfonato, benzoato, ascorbato, para-toluenosulfonato, pamoato, salicilato y estearato, además de sales de estolato, gluceptato y lactobionato. Similarmente, sales que contienen cationes farmac�uticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sodio, potasio, calcio, aluminio, litio y amonio (incluyendo amonio sustituido).

“Molécula activa” o “agente activo” como se describen en el presente documento incluyen cualquier agente, fármaco, compuesto, composición de materia o mezcla que proporcione algún efecto farmacol�gico, frecuentemente beneficioso, que pueda demostrarse in vivo o in vitro. Esto incluye alimentos, suplementos alimenticios, nutrientes, nutric�uticos, fármacos, vacunas, anticuerpos, vitaminas y otros agentes beneficiosos. Como se usa en el presente documento, los

45 términos incluyen adicionalmente cualquier sustancia fisiológica o farmacol�gicamente activa que produzca un efecto localizado o sist�mico en un paciente.

“Opcional” u “opcionalmente” significa que la circunstancia posteriormente descrita puede o puede no producirse, de manera que la descripción incluye casos en los que la circunstancia se produce y casos en los que no.

Los términos “sujeto”, “individuo” o “paciente” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un vertebrado, preferentemente un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, murinos, roedores, simios, seres humanos, animales de granja, animales para deportes y mascotas.

55 2. MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que la presente invención no se limita a formulaciones o parámetros de procedimiento particulares ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es con el fin de describir realizaciones particulares de la invención solo y no pretende ser limitante.

Aunque varios procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica de la presente invención, los materiales y procedimientos preferidos se describen en el presente documento.

A. Producción de fucoidano

La presente invención se basa en el descubrimiento de un procedimiento de purificación que permite el aislamiento de fucoidano sustancialmente libre de iones de metales pesados, contaminantes bacterianos y de endotoxinas y otras impurezas. El procedimiento comprende una serie de etapas de aislamiento, que incluyen tratamiento con un agente

5 quelante para eliminar metales pesados, una o más precipitaciones selectivas para eliminar impurezas y filtración para eliminar contaminantes bacterianos y de endotoxinas.

Con el fin de entender adicionalmente la invención, a continuación se proporciona una discusión más detallada referente a los procedimientos de purificación de extractos de fucoidano.

Fucoidano

Puede usarse cualquier fuente de extracto de fucoidano en la purificación. Los fucoidanos se encuentran en muchas plantas y animales marinos y son particularmente abundantes en las paredes celulares de algas marrones

15 (Phaeophyceae). Por ejemplo, el fucoidano derivado de algas marrones del género Fucus (por ejemplo, Fucus vesiculosis, Fucus evanescens, Fucus distichus y Fucus serratus) o Laminaria (por ejemplo, Laminaria japonica, Laminaria religiosa y Laminaria abyssalis) puede usarse en la purificación. Alternativamente, el fucoidano de otras fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, Chorda filum, Cladosiphon okamuranus, Undaria pinnatifida, Leathesia difformis, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Pelvetia fastigiata, Saundersella simplex, Chordaria flagelliformis, o cualquier otra especie de planta o animal marino que contenga fucoidano también puede usarse en la práctica de la invención.

Agentes quelantes

25 Cualquier agente quelante que pueda unirse a iones met�licos puede usarse para eliminar contaminantes de iones met�licos de una mezcla heterogénea que contiene fucoidano. Ejemplos de agentes quelantes incluyen, pero no se limitan a, ácido etilendiaminatetraac�tico (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(beta-aminoetil�ter)-N,N,N',N'-tetraac�tico (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropanol-1-sulf�nico (DMPS) y ácido 2,3-dimercaptosucc�nico (DMSA) y similares. Alternativamente, una resina quelante de metales que comprende grupos quelantes inmovilizados puede usarse para eliminar iones met�licos de una muestra que contiene fucoidano. Por ejemplo, pueden usarse resinas quelantes comercialmente disponibles que contienen el ligando quelante iminodiacetato (por ejemplo, CHELEX 100 (Bio-Rad), DOWEX A1 (Dow Chemical Co.) y resina quelante (Hampton Research)). La resina quelante puede añadirse a una muestra de fucoidano en lote y eliminarse por centrifugaci�n. Alternativamente, los iones met�licos pueden eliminarse a partir de muestras de fucoidano por cromatograf�a a través de una columna que contiene resina quelante mediante

35 procedimientos muy conocidos en la técnica.

Precipitaci�n selectiva de fucoidano

El extracto de fucoidano se purifica adicionalmente por precipitación selectiva de fucoidano con etanol. La precipitación selectiva elimina algunos agentes quelantes y otros contaminantes de la mezcla de fucoidano. En ciertas realizaciones, el fucoidano se precipita selectivamente una o más veces con etanol a una concentración de aproximadamente el 40 % al 50 % (v/v) en la mezcla de fucoidano. Antes de la adición de etanol a la mezcla de fucoidano, el pH de la mezcla de fucoidano se ajusta a entre aproximadamente pH 5,7 y aproximadamente pH 6,0 y se añade NaCl a la mezcla de fucoidano a una concentración de aproximadamente 20-24 g/litro. Después de la precipitación del fucoidano, el

45 sobrenadante se elimina del fucoidano precipitado y el fucoidano precipitado se resuspende en disolución acuosa. Ciclos repetidos de tal purificación pueden mejorar la pureza del fucoidano.

Filtraci�n

El fucoidano se filtra a través de un filtro positivamente cargado de 0,2 μm para eliminar contaminantes bacterianos y de endotoxinas. El producto filtrado puede secarse usando liofilización o secado por pulverización. Normalmente, el rendimiento del fucoidano ser� de aproximadamente el 50 % o más, más preferentemente de aproximadamente el 60 % a aproximadamente 80 % o más.

55 Análisis de fucoidano purificado

Las muestras de fucoidano pueden analizarse para pureza y diversas propiedades, tales como peso molecular, contenido de hidratos de carbono, que incluyen fucosa y xilosa, contaminación con metales pesados, sulfato y agua. Pueden usarse varias técnicas analíticas para caracterizar muestras de fucoidano, que incluyen pero no se limitan a, cromatograf�a líquida de alta resolución (HPLC), análisis de composición elemental, dispersi�n de luz láser (DLL), espectrometr�a de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-EM) y CG-EM.

B Composiciones farmacéuticas

65 El fucoidano purificado puede formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden opcionalmente uno o más excipientes farmac�uticamente aceptables. Excipientes a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, hidratos de carbono, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases y combinaciones de los mismos. Excipientes adecuados para composiciones inyectables incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina, aceites vegetales, fosfol�pidos y tensioactivos. Un hidrato de carbono tal como un azúcar, un azúcar derivatizado tal como un alditol, ácido ald�nico, un azúcar esterificado y/o un pol�mero de azúcar puede estar presente como un excipiente.

5 Excipientes de hidrato de carbono específicos incluyen, por ejemplo: monosac�ridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disac�ridos tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares; polisac�ridos tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosilsorbitol, mioinositol y similares. El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o tampón tal como ácido cítrico, cloruro sádico, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato de sodio monob�sico, fosfato de sodio dib�sico y combinaciones de los mismos.

Una composición también puede incluir un agente antimicrobiano para prevenir o impedir el crecimiento microbiano. Ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol benc�lico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol fenilet�lico,

15 nitrato fenilmerc�rico, timerosal y combinaciones de los mismos.

Un antioxidante también puede estar presente en la composición. Los antioxidantes se usan para evitar la oxidación, evitando as� el deterioro del fucoidano u otros componentes de la preparación. Antioxidantes adecuados para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito de sodio, sulfoxilato formaldeh�do sádico, metabisulfito de sodio y combinaciones de los mismos.

Un tensioactivo puede estar presente como excipiente. Tensioactivos a modo de ejemplo incluyen: polisorbatos tales como “Tween 20” y “Tween 80,” y Pluronics tales como F68 y F88 (BASF, Mount Olive, Nueva Jersey); ésteres de

25 sorbitano; lípidos tales como fosfol�pidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferentemente no en forma lipos�mica), ácidos grasos y ésteres grasos; esteroides tales como colesterol; agentes quelantes tales como EDTA; y cinc y tales otros cationes adecuados.

Los ácidos o bases pueden estar presentes como excipiente en la composición. Ejemplos no limitantes de ácidos que pueden usarse incluyen aquellos ácidos seleccionados del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosf�rico, ácido cítrico, ácido m�lico, ácido l�ctico, ácido f�rmico, ácido tricloroac�tico, ácido nítrico, ácido percl�rico, ácido fosf�rico, ácido sulfúrico, ácido fum�rico y combinaciones de los mismos. Ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consiste en hidróxido sádico, acetato sádico, hidróxido de amonio, hidróxido pot�sico, acetato de amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formiato

35 de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumerato de potasio y combinaciones de los mismos.

La cantidad de fucoidano (por ejemplo, cuando est� contenido en un sistema de administración de fármaco) en la composición variar� dependiendo de varios factores, pero ser� óptimamente una dosis terapéuticamente eficaz cuando la composición est� en una forma de dosificación unitaria o recipiente (por ejemplo, un vial). Una dosis terapéuticamente eficaz puede determinarse experimentalmente por administración repetida de cantidades crecientes de la composición con el fin de determinar qué cantidad produce un criterio de valoración cl�nicamente deseado.

La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variar� dependiendo de la naturaleza y función del excipiente y de las necesidades particulares de la composición. Normalmente, la cantidad óptima de cualquier excipiente

45 individual se determina mediante experimentación rutinaria, es decir, preparando composiciones que contienen cantidades variables del excipiente (que oscilan de bajas a altas), examinando la estabilidad y otros parámetros y luego determinando el intervalo al que se obtiene rendimiento óptimo sin efectos adversos significativos. Generalmente, sin embargo, el (los) excipiente(s) estar�(n) presente(s) en la composición en una cantidad de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 99 % en peso, preferentemente de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 98 % en peso, más preferentemente de aproximadamente el 15 a aproximadamente el 95 % en peso del excipiente, siendo las más preferidas concentraciones inferiores al 30 % en peso. Estos excipientes farmacéuticos anteriores, junto con otros excipientes, se describen en “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 19� ed., Williams & Williams (1995), la “Physician's Desk Reference”, 52� ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998) y Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3� edición, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.

55 Las composiciones engloban todos los tipos de formulaciones y en particular aquellas que son aptas para inyección, por ejemplo, polvos o liofilizados que pueden reconstituirse con un disolvente antes de uso, además de disoluciones o suspensiones listas para inyección, composiciones insolubles secas para combinación con un vehículo antes de uso y emulsiones y concentrados líquidos para dilución antes de administración. Ejemplos de diluyentes adecuados para la reconstitución de composiciones sólidas antes de la inyección incluyen agua bacteriost�tica para inyección, dextrosa al 5 % en agua, solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer, solución salina, agua estéril, agua desionizada y combinaciones de las mismas. Con respecto a las composiciones farmacéuticas líquidas, se prevén disoluciones y suspensiones. Composiciones preferidas adicionales incluyen aquellas para administración oral, ocular o localizada.

65 Las preparaciones farmacéuticas en el presente documento también puede estar alojadas en una jeringuilla, un dispositivo de implantación, o similares, dependiendo del modo previsto de administración y uso. Preferentemente, las composiciones de fucoidano en el presente documento se describen en forma de dosificación unitaria, que significa una cantidad de un conjugado o composición apropiado para una dosis única, en una forma previamente medida o previamente envasada.

5 Las composiciones de fucoidano en el presente documento pueden incluir opcionalmente uno o más agentes adicionales, tales como agentes hemost�ticos, factores de la sangre, u otras medicaciones usadas para tratar un sujeto para una afección o enfermedad. Particularmente se prefieren preparaciones combinadas que incluyen uno o más factores de la sangre tales como factor XI, factor XII, precalicre�na, quinin�geno de alto peso molecular (HMWK), factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XIII, factor II, factor VIIa y factor de von Willebrand. Las composiciones de fucoidano también pueden incluir otros procoagulantes, tales como un activador de la ruta de coagulación intrínseca, que incluyen, pero no se limitan a, factor Xa, factor IXa, factor XIa, factor XIIa y VIIIa, precalicre�na y quinin�geno de alto peso molecular; o y activador de la ruta de coagulación intrínseca que incluye, pero no se limita a, factor tisular, factor VIIa, factor Va y factor Xa. Las composiciones de fucoidano pueden incluir factores de coagulación que se producen naturalmente, sintéticos o recombinantes, o fragmentos, variantes o derivados covalentemente modificados de los

15 mismos que retienen la actividad biológica (es decir, promueven la coagulación). Alternativamente, tales agentes pueden estar contenidos en una composición separada del fucoidano y coadministrarse simultáneamente, antes o después de la composición de fucoidano.

C. Administración

Al menos un ciclo de tratamiento terapéuticamente eficaz con fucoidano se administrar� a un sujeto. Por “ciclo de tratamiento terapéuticamente eficaz” est� previsto un ciclo de tratamiento que cuando se administra, provoca una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un individuo para un trastorno hemorrágico. Es de particular interés un ciclo de tratamiento con fucoidano que mejora la hemostasia. Por “respuesta terapéutica positiva” est� previsto

25 que el individuo que recibe tratamiento según la invención presente una mejora en uno o más síntomas de un trastorno hemorrágico, que incluye mejoras tales como tiempos de coagulación de la sangre acortados y hemorragia reducida y/o necesidad reducida de terapia de sustitución de factores.

Otro ciclo de tratamiento terapéuticamente eficaz con fucoidano se administrar� como anticoagulante a sujetos con afecciones pro-tromb�ticas como trombosis venosa profunda, trombosis arterial y otras enfermedades cardiovasculares y de cáncer como terapia preventiva y/o de mantenimiento.

En ciertas realizaciones, se administrarán múltiples dosis terapéuticamente eficaces de composiciones que comprenden fucoidano y/o uno o varios de otros agentes terapéuticos, tales como agentes hemost�ticos, factores de la sangre, u

35 otras medicaciones. Las composiciones se administran normalmente, aunque no necesariamente, por vía oral, mediante inyección (subcut�neamente, intravenosamente o intramuscularmente), por infusión o localmente. La preparación farmacéutica puede estar en forma de una disolución líquida o suspensión inmediatamente antes de la administración, pero también puede tomar otra forma tal como un jarabe, crema, pomada, comprimido, cápsula, polvo, gel, matriz, supositorio, o similares. También se contemplan modos de administración adicionales, tales como pulmonar, rectal, transd�rmica, transmucosa, intratecal, peric�rdica, intra-arterial, intracerebral, intraocular, intraperitoneal, etc. Las composiciones farmacéuticas que comprenden fucoidano y otros agentes pueden administrarse usando las mismas vías de administración o vías de administración diferentes según cualquier procedimiento m�dicamente aceptable conocido en la técnica.

45 En una realización particular, una composición se usa para administración localizada de fucoidano, por ejemplo, para el tratamiento de hemorragia como resultado de una lesión, herida o cirugía. Las preparaciones también son adecuadas para tratamiento local. Por ejemplo, el fucoidano puede administrarse mediante inyección en el sitio de hemorragia o típicamente en forma de un sólido, líquido o pomada, preferentemente mediante un esparadrapo o un vendaje para heridas. También pueden usarse supositorios, cápsulas, en particular cápsulas resistentes a los jugos gástricos, gotas o esprays. La preparación particular y procedimiento apropiado de administración se eligen para ir dirigidos al sitio de hemorragia.

En otra realización, las composiciones farmacéuticas que comprenden fucoidano y/u otros agentes se administran profil�cticamente, por ejemplo, antes de la cirugía planeada. Tales usos profilácticos ser�n de valor particular para

55 sujetos con trastornos de la coagulación de la sangre preexistentes conocidos.

En otra realización, las composiciones farmacéuticas que comprenden fucoidano y/u otros agentes est�n en una formulación de liberación sostenida, o una formulación que se administra usando un dispositivo de liberación sostenida. Tales dispositivos son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, parches transd�rmicos y bombas implantables en miniatura que pueden proporcionar la administración de fármacos con el tiempo en un modo en estado estacionario continuo, a una diversidad de dosis para lograr un efecto de liberación sostenida con una composición farmacéutica de liberación no sostenida.

La memoria descriptiva también proporciona un procedimiento de administración de un conjugado que comprende

65 fucoidano como se proporciona en el presente documento a un paciente que padece una afección que es sensible al tratamiento con fucoidano contenido en el conjugado o composición. El procedimiento comprende administrar, mediante cualquiera de los modos descritos en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz del sistema de administración de conjugado o fármaco, preferentemente proporcionado como parte de una composición farmacéutica. El procedimiento de administración puede usarse para tratar cualquier afección que sea sensible al tratamiento con fucoidano. Más específicamente, las composiciones en el presente documento son eficaces en el tratamiento de

5 trastornos hemorrágicos, que incluyen hemofilia A, hemofilia B, enfermedad de von Willebrand, trombocitopenia idiop�tica, una deficiencia de uno o más factores de contacto tales como factor XI, factor XII, precalicre�na y quinin�geno de alto peso molecular (HMWK), una deficiencia de uno o más factores asociados a hemorragia cl�nicamente significativa, tales como factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XIII, factor II (hipoprotrombinemia) y factor de von Willebrand, una deficiencia de vitamina K, un trastorno de fibrin�geno, que incluye afibrinogenemia, hipofibrinogenemia y disfibrinogenemia, una deficiencia de alfa2-antiplasmina y sangrado excesivo tal como el producido por enfermedad del hígado, enfermedad renal, trombocitopenia, disfunción plaquetaria, hematomas, hemorragia interna, hemartrosis, cirugía, traumatismo, hipotermia, menstruación y embarazo.

Aquellos expertos habituales en la materia apreciarán qué afecciones puede tratar eficazmente un fucoidano específico.

15 La dosis real que va a administrarse variar� dependiendo de la edad, peso y condición general del sujeto, además de la gravedad de la afección que est� tratándose, el criterio del profesional sanitario y el conjugado que se administra. Las cantidades terapéuticamente eficaces pueden determinarse por aquellos expertos en la materia y se ajustarán a los requisitos particulares de cada caso particular.

Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz oscilar� de aproximadamente 0,01 mg/kg a 200 mg/kg de un fucoidano al día, más preferentemente de aproximadamente 0,01 mg/kg a 20 mg/kg al día, incluso más preferentemente de aproximadamente 0,02 mg/kg a 2 mg/kg al día. Preferentemente, tales dosis est�n en el intervalo de 0,01-50 mg/kg cuatro veces al día (QID), 0,01-10 mg/kg QID, 0,01-2 mg/kg QID, 0,01-0,2 mg/kg QID, 0,01-50 mg/kg tres veces al día (TID), 0,01-10 mg/kg TID, 0,01-2 mg/kg TID, 0,01-0,2 mg/kg TID, 0,01-100 mg/kg dos veces al día (BID), 0,01-10 mg/kg

25 BID, 0,01-2 mg/kg BID, o 0,01-0,2 mg/kg BID y 0,1 al 10 % para aplicaciones individuales y múltiples típicas un día. La cantidad del compuesto administrado depender� de la potencia del fucoidano específico y la magnitud o efecto procoagulante deseado y la vía de administración.

Un extracto de fucoidano purificado (de nuevo, se proporciona preferentemente como parte de una preparación farmacéutica) puede administrarse solo o en combinación con otros extractos de fucoidano o agentes terapéuticos, tales como agentes hemost�ticos, factores de la sangre, u otras medicaciones usadas para tratar una afección o enfermedad particular según una variedad de programas de dosificación que dependen del criterio del profesional cl�nico, necesidades del paciente, etc. El programa de dosificación específico ser� conocido por aquellos expertos habituales en la materia o podr� determinarse experimentalmente usando procedimientos rutinarios. Programas de dosificación a

35 modo de ejemplo incluyen, sin limitación, administración cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes y cualquier combinación de los mismos. Composiciones preferidas son aquellas que requieren dosificación no superior a una vez al día.

El fucoidano puede administrarse antes de, simultáneamente a, o posteriormente a otros agentes. Si se proporciona al mismo tiempo que otros agentes, el fucoidano puede proporcionarse en la misma composición o en una composición diferente. As�, el fucoidano y otros agentes pueden presentarse al individuo a modo de terapia simultánea. Por “terapia simultánea” est� prevista la administración a un sujeto de forma que el efecto terapéutico de la combinación de las sustancias sea provocado en el sujeto que recibe la terapia. Por ejemplo, la terapia simultánea puede lograrse

45 administrando una dosis de una composición farmacéutica que comprende un fucoidano y una dosis de una composición farmacéutica que comprende al menos otro agente, tal como un agente hemost�tico o factor de coagulación (por ejemplo, FVIII o FIX), que en combinación comprenden una dosis terapéuticamente eficaz, según una pauta de dosificación particular. Similarmente, el fucoidano y uno o varios de otros agentes terapéuticos pueden administrarse en al menos una dosis terapéutica. La administración de las composiciones farmacéuticas separadas puede realizarse simultáneamente o en momentos diferentes (es decir, secuencialmente, en cualquier orden, el mismo día, o en días diferentes), mientras que el efecto terapéutico de la combinación de estas sustancias sea provocado en el sujeto que recibe la terapia.

F. Aplicaciones

55 Una vez purificado, el extracto de fucoidano puede usarse para una diversidad de fines. A este respecto, el fucoidano puede usarse, por ejemplo, como procoagulante para promover la coagulación de la sangre, reducir hemorragia, contrarrestar los efectos del tratamiento de un sujeto con un anticoagulante, como agente antiinflamatorio, como agente antineopl�sico, como agente antiviral o como agente movilizador de células hematopoy�ticas. La capacidad del extracto de fucoidano purificado para promover la coagulación y reducir la hemorragia se determina fácilmente usando diversos ensayos de coagulación in vitro (por ejemplo, ensayos de dPT y aPTT) y modelos de hemorragia in vivo (por ejemplo, determinación del tiempo de hemorragia de corte en la cola o de la cutícula en ratones o perros hemofílicos). Véanse, por ejemplo, PDR Staff. Physicians’ Desk Reference. 2004, Anderson y col. (1976) Thromb. Res. 9:575-580; Nordfang y col. (1991) Thromb Haemost. 66:464-467; Welsch y col. (1991) Thrombosis Research 64:213-222; Broze y col. (2001)

65 Thromb Haemost 85:747-748; Scallan y col. (2003) Blood. 102:2031-2037; Pijnappels y col. (1986) Thromb. Haemost. 55:70-73; y Giles y col. (1982) Blood 60:727-730.

En un aspecto, el extracto de fucoidano purificado puede usarse para mejorar la hemostasia en el tratamiento de trastornos hemorrágicos, particularmente aquellos asociados a deficiencias de los factores de coagulación o para invertir los efectos de anticoagulantes en un sujeto. El fucoidano puede administrarse a un sujeto para tratar trastornos 5 hemorrágicos, que incluyen trastornos de la coagulación congénitos, trastornos de la coagulación adquiridos y afecciones hemorrágicas inducidas por traumatismo. Ejemplos de trastornos hemorrágicos que pueden tratarse con fucoidano incluyen, pero no se limitan a, hemofilia A, hemofilia B, enfermedad de von Willebrand, trombocitopenia idiop�tica, una deficiencia de uno o más factores de contacto tales como factor XI, factor XII, precalicre�na y quinin�geno de alto peso molecular (HMWK), una deficiencia de uno o más factores asociados a hemorragia cl�nicamente significativa tales como factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XIII, factor II (hipoprotrombinemia) y factor de von Willebrand, una deficiencia de vitamina K, un trastorno de fibrin�geno, que incluye afibrinogenemia, hipofibrinogenemia y disfibrinogenemia, una deficiencia de alfa2-antiplasmina y sangrado excesivo tal como el producido por enfermedad del hígado, enfermedad renal, trombocitopenia, disfunción plaquetaria, hematomas, hemorragia interna, hemartrosis, cirugía, traumatismo, hipotermia, menstruación y embarazo. En ciertas realizaciones, el fucoidano se usa para tratar trastornos

15 de la coagulación congénitos que incluyen hemofilia A, hemofilia B y enfermedad de von Willebrand. En otras realizaciones, el fucoidano se usa para tratar trastornos de la coagulación adquiridos que incluyen deficiencias del factor VIII, factor de von Willebrand, factor IX, factor V, factor XI, factor XII y factor XIII, particularmente trastornos producidos por inhibidores o autoinmunidad contra la coagulación de los factores de la sangre, o trastornos hemost�ticos producidos por una enfermedad o afección que produce síntesis reducida de factores de coagulación.

Las necesidades del paciente dependerán del trastorno hemorrágico particular que est� tratándose. Por ejemplo, un fucoidano puede administrarse para tratar una afección crónica (por ejemplo, un deficiencia congénita o adquirida de factores de la coagulación) en múltiples dosis durante un periodo prolongado. Alternativamente, un fucoidano puede administrarse para tratar una afección aguda (por ejemplo, hemorragia producida por cirugía o traumatismo, o inhibidor 25 de factores/episodios autoinmunitarios en sujetos que reciben terapia de sustitución de la coagulación) en dosis individuales o múltiples durante un periodo relativamente corto, por ejemplo, una a dos semanas. Además, la terapia con fucoidano puede usarse en combinación con otros agentes hemost�ticos, factores de la sangre y medicaciones. Por ejemplo, al sujeto puede administr�rsele una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más factores seleccionados del grupo que consiste en factor XI, factor XII, precalicre�na, quinin�geno de alto peso molecular (HMWK), factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XIII, factor II, factor VIIa y factor de von Willebrand. El tratamiento puede comprender además administrar un procoagulante, tal como un activador de la ruta de coagulación intrínseca, que incluye factor Xa, factor IXa, factor XIa, factor XIIa y VIIIa, precalicre�na y quinin�geno de alto peso molecular; o un activador de la ruta de coagulación extrínseca, que incluye factor tisular, factor VIIa, factor Va y factor Xa. Además, la trasfusión de hemoderivados puede ser necesaria para sustituir la pérdida de sangre en sujetos que experimentan sangrado excesivo

35 y en casos de lesión, la reparación quirúrgica puede ser apropiada para detener la hemorragia.

La memoria descriptiva también proporciona un procedimiento para invertir los efectos de un anticoagulante en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende fucoidano purificado al sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto puede haber sido tratado con un anticoagulante que incluye, pero no se limita a, heparina, un derivado de cumarina, tal como warfarina o dicumarol, TFPI, AT III, anticoagulante de lupus, p�ptido anticoagulante de nematodos (NAPc2), factor VIIa bloqueado en sitios activos (factor VIIai), inhibidores del factor IXa, inhibidores del factor Xa, que incluyen fondaparinux, idraparinux, DX-9065a y razaxaban (DPC906), inhibidores de los factores Va y VIIIa, que incluyen proteína C activada (APC) y trombomodulina soluble, inhibidores de trombina, que incluyen hirudina, bivalirudina, argatroban y ximelagatran. En ciertas realizaciones, el

45 anticoagulante en el sujeto puede ser un anticuerpo que se une a factor de coagulación que incluye, pero no se limita a, un anticuerpo que se une al factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XIII, factor II, factor XI, factor XII, factor de von Willebrand, precalicre�na o quinin�geno de alto peso molecular (HMWK).

En ciertas realizaciones, el extracto de fucoidano purificado puede administrarse solo o coadministrarse con uno o más fucoidanos diferentes y/o en combinación con uno o varios de otros agentes terapéuticos para invertir los efectos de un anticoagulante en el sujeto. Por ejemplo, al sujeto puede administr�rsele una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un fucoidano y uno o más factores seleccionados del grupo que consiste en factor XI, factor XII, precalicre�na, quinin�geno de alto peso molecular (HMWK), factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XIII, factor II, factor VIIa y factor de von Willebrand. El tratamiento puede comprender además administrar un

55 procoagulante, tal como un activador de la ruta de coagulación intrínseca, que incluye factor Xa, factor IXa, factor XIa, factor XIIa y VIIIa, precalicre�na y quinin�geno de alto peso molecular; o un activador de la ruta de coagulación extrínseca, que incluye factor tisular, factor VIIa, factor Va y factor Xa.

En otro aspecto, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento para mejorar la coagulación en un sujeto que recibe un procedimiento quirúrgico o invasivo, comprendiendo el procedimiento administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende fucoidano purificado al sujeto. En ciertas realizaciones, el fucoidano puede administrarse solo o coadministrarse con uno o más fucoidanos diferentes y/o en combinación con uno

o varios de otros agentes terapéuticos al sujeto que experimenta un procedimiento quirúrgico o invasivo. Por ejemplo, al sujeto puede administr�rsele una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más factores seleccionados del grupo que

65 consiste en factor XI, factor XII, precalicre�na, quinin�geno de alto peso molecular (HMWK), factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XIII, factor II, factor VIIa y factor de von Willebrand. El tratamiento puede comprender además administrar un procoagulante, tal como un activador de la ruta de coagulación intrínseca, que incluye factor Xa, factor IXa, factor XIa, factor XIIa y VIIIa, precalicre�na y quinin�geno de alto peso molecular; o un activador de la ruta de coagulación extrínseca que incluye factor tisular, factor VIIa, factor Va y factor Xa.

5 En otro aspecto, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento de inhibición de la actividad de TFPI que comprende combinar una composición que comprende TFPI con una cantidad suficiente de un fucoidano para inhibir la actividad de TFPI. En ciertas realizaciones, la actividad de TFPI se inhibe en un sujeto mediante un procedimiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende extracto de fucoidano purificado al sujeto. En ciertas realizaciones, la memoria descriptiva proporciona un procedimiento para inhibir la actividad de TFPI en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento combinar la muestra biológica (por ejemplo, sangre

o plasma) con una cantidad suficiente de extracto de fucoidano purificado para inhibir la actividad de TFPI.

3. PARTE EXPERIMENTAL

15 A continuación est�n ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para fines ilustrativos solo y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.

Se han hecho esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, debe permitirse algún error experimental y desviación.

Ejemplo 1

Purificaci�n de fucoidano Ensayo 1

25 Día 1

Se disolvió extracto de fucoidano (50 gramos, NPNutra, lote n.� 050316-FU-85) en 1.000 ml de agua de alta pureza (NERL, lote n.� 0808036) y se agit� durante 45 minutos a 40-45 �C en un baño de agua. La disolución estaba a un pH de 5,82 y una temperatura de 41 �C cuando se añadieron 2,5 gramos de EDTA dis�dico con agitaci�n (2,5 % en peso de EDTA/peso del extracto de fucoidano de partida, lote de EDTA n.� 006139 de Fisher). El pH de la disolución disminuyó a 4,70 a medida que se disolvió el EDTA, pero luego se ajust� al alza a 6,02 con NaOH 0,1 M. A continuación la reacción se mezcl� y se mantuvo durante 1 hora a 40-45 �C y pH 6,0 (� 0,2). Después de 1 hora se añadieron 24 gramos de cloruro sádico (2 % en peso/volumen, Fisher, lote n.� 010166) y se retir� la camisa de agua. A continuación, el pH se ajust� de pH 5,7 a 5,95 con NaOH 0,1 M. El fucoidano se precipit� mezclando aproximadamente un volumen de etanol

35 absoluto (1,1 litros, Sigma-Aldrich, lote n.� 06563JE) y dejando que se produjera la precipitación durante la noche a temperatura ambiente.

D�a 2

La disolución de sobrenadante se elimin� por aspiración del precipitado de polisac�rido. A continuación el precipitado se redisolvi� mediante la adición de 1 litro (1.000 ml) de agua de alta pureza a temperatura ambiente, seguido de 30-60 minutos de agitaci�n vigorosa. Una vez el precipitado estaba en disolución, 20 gramos (2 % en peso/volumen) de cloruro sádico se disolvieron por mezcla continua de la disolución. El polisac�rido precipit� de nuevo mezclando 800 ml de etanol absoluto con el precipitado resalinizado resolubilizado del día 1. De nuevo, el polisac�rido se dej� precipitar durante la

45 noche.

D�a 3

La disolución de sobrenadante se elimin� de nuevo del precipitado del día 2 y en el día 3 se repitió el procedimiento entero de resolubilizaci�n (1.000 ml de agua NERL), resalinizaci�n (20 gramos de NaCl) y reprecipitaci�n (800 ml de EtOH absoluto). El fucoidano se dej� de nuevo precipitar durante la noche.

D�a 4

55 En el día 4, el sobrenadante se elimin� por aspiración del precipitado de polisac�rido. A continuación el precipitado se disolvió mezclando con 900 ml de agua de alta pureza durante 1-1,5 horas a 22 �C. El pH, que se midió en 6,85, se ajust� a pH 5,8 mediante la adición de HCl 6 N. A continuación la disolución entera se filtr� a través de una cápsula de filtración KLEENPAK N66 POSIDYNE de 0,2 μm (Pall, lote n.� IJ7287). A continuación, el matraz y el filtro se aclararon con aproximadamente 100 ml de agua de alta pureza, que luego se filtr� a través del filtro POSIDYNE y se a�adi� a la disolución de polisac�rido. A continuación la disolución filtrada entera (∼1,05 litros) se cargó en una única bandeja del liofilizador y se congel� a -40 �C durante 3 horas. A continuación se realizó la liofilización durante las siguientes aproximadamente 48 horas con el siguiente programa: primeras 4 horas, temperatura del estante a 10 �C, siguientes 20 horas, temperatura del estante a 20 �C, 24 horas finales, temperatura del estante a 50 �C. A continuación el producto secado se retir� de la secadora y la bandeja y se colocó en un recipiente de plástico previamente tarado.

65 El rendimiento del producto fue 26,4 gramos (rendimiento del 52,8 % en peso). El producto se marcó como lote/ensayo I y se colocó en bolsas de poli dobles para el almacenamiento.

Ejemplo 2

5 Purificación de fucoidano Ensayo 2

D�a 1

Se disolvió extracto de fucoidano (50 gramos, NPNutra, lote n.� 050316-FU-85) en 1.000 ml de agua de alta pureza (NERL, lote n.� 0808036) por agitaci�n durante 30-45 minutos a 40-45 �C en un baño de agua. La disolución estaba a un pH de 5,83 y una temperatura de 42,5 �C cuando se añadieron 1,25 gramos de EDTA dis�dico con agitaci�n (1,25 % en peso de EDTA/peso del extracto de fucoidano, lote de EDTA n.� 006139 de Fisher). El pH de la disolución disminuyó a 4,90 a medida que se disolvió el EDTA, pero luego se ajust� al alza a 6,04 con NaOH 0,1 M. A continuación la reacción se mezcl� y se mantuvo durante 1 hora a 40-45 �C y pH 6,0 (� 0,2). El pH de la disolución fue 6,15 al final de la

15 incubaci�n de 1 hora, ya que 22 gramos de cloruro sádico se mezclaron en la disolución. El pH disminuyó ligeramente a 55,72 pero a continuación se ajust� a 6,08 con NaOH 1 M. Se precipit� fucoidano mediante la adición de 1 litro (1.000 ml) de EtOH absoluto. El precipitado se dej� sedimentar a temperatura ambiente durante la noche.

D�a 2

La disolución de sobrenadante se elimin� por aspiración del precipitado de polisac�rido. A continuación el precipitado se redisolvi� mediante la adición de 1 litro (1.000 ml) de agua de alta pureza a temperatura ambiente, seguido de 30-60 minutos de agitaci�n vigorosa. Una vez el precipitado estaba en disolución, 20 gramos (2 % en peso/volumen) de cloruro sádico se disolvieron por mezcla continua de la disolución. El polisac�rido precipit� de nuevo mezclando 750 ml de etanol

25 absoluto con el precipitado resalinizado resolubilizado del día 1. De nuevo, el polisac�rido se dej� precipitar durante la noche.

D�a 3

La disolución de sobrenadante se elimin� de nuevo del precipitado del día 2 y en el día 3 se repitió el procedimiento entero de resolubilizaci�n (1.000 ml de agua NERL), resalinizaci�n (20 gramos de NaCl) y reprecipitaci�n (750 ml de EtOH absoluto). El fucoidano se dej� de nuevo precipitar durante la noche.

D�a 4

35 En el día 4, el sobrenadante se elimin� por aspiración del precipitado de polisac�rido. A continuación el precipitado se disolvió mezclando con 900 ml de agua de alta pureza durante 1-2 horas a 22 �C. El pH, que se midió en 6,81, se ajust� A continuación a pH 5,82 mediante la adición de HCl 6 N. A continuación la disolución entera se filtr� a través de una cápsula de filtración KLEENPAK N66 POSIDYNE de 0,2 μm (Pall, lote n.� IJ7287). A continuación el matraz y el filtro se aclararon con aproximadamente 100 ml de agua de alta pureza, que luego se filtr� a través del filtro POSIDYNE y se a�adi� a la disolución de polisac�rido. A continuación la disolución filtrada entera (∼1,1 litros) se cargó en una única bandeja del liofilizador y se congel� a -40 �C durante 3 horas. A continuación se realizó la liofilización durante las siguientes aproximadamente 48 horas con el siguiente programa: primeras 4 horas, temperatura del estante a 10 �C, siguientes 20 horas, temperatura del estante a 20 �C, 24 horas finales, temperatura del estante a 50 �C. A continuación el

45 producto secado se sacó de la secadora y la bandeja y se colocó en un recipiente de plástico previamente tarado.

El rendimiento del producto fue 25,4 gramos (rendimiento del 50,8 % en peso). El producto se marcó como lote/ensayo 2 y se colocó en bolsas de poli dobles para el almacenamiento.

Ejemplo 3

An�lisis de muestras de fucoidano

Muestras de extractos de fucoidano purificados del Ensayo 1 (Ejemplo 1) y Ensayo 2 (Ejemplo 2) se caracterizaron y se

55 compararon con extracto de fucoidano en bruto (NPNutra, lote n.� 050316-FU-85). Los análisis de las muestras se realizaron por Bay Bioanalytical Laboratory, Inc. (BBL, Hercules, CA). La caracterización de extractos de fucoidano incluyó cromatograf�a de exclusión por tamaño con detección de dispersi�n de luz láser (DLL), contenido de fucosa y xilosa, contenido de agua, metales pesados, sulfato y análisis elemental. La cromatograf�a de exclusión por tamaño con DLL se us� para medir el peso molecular promedio. La fucosa y xilosa se determinaron hidrolizando el fucoidano y midiendo el contenido de fucosa y xilosa por HPLC usando una columna diseñada para separar hidratos de carbono pequeños. El contenido de hidratos de carbono total también se estim� usando un ensayo de fenol-ácido sulfúrico con fucosa como el patrón. El contenido de agua se midió usando un ensayo de Karl Fischer (KF). El sulfato se midió por cromatograf�a de intercambio iónico y los cationes (principalmente sodio, potasio y otros metales pesados) se midieron por ICP-EM. Además, se realizó análisis de la composición elemental (CHNS) en muestras. El Centro de Investigación

65 de Hidratos de Carbono Complejos (Universidad de Georgia, Athens, Georgia) realizó los análisis de monosac�ridos mediante CG/EM tras la preparación de metilgluc�sidos per-O-trimetilsililados de la muestra. La endotoxina por LAL se

determin� en Avigen. Los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Resumen de los resultados de la caracterización de extractos de fucoidano

NP Nutra 050316FU-85 (MC514)

Ensayo procesado n.� 1 (AN50) Ensayo procesado n.� 2 (AN51)

Mw

184.800 179.400 183.800

% en peso/peso de azúcares neutros por fenol-H2SO4

52 73 65

Monosac�rido (%)

Fucosa

60,7 60,3 61,1

Xilosa

22,8 27,4 24,9

Glucosa

5,5 1,6 0,8

Galactosa

3,9 0,6 ND

Manosa

3,3 ND 4,0

�cido galactur�nico

2,4 2,2 3,1

�cido glucar�nico

1,4 ND ND

Raminosa

ND 4,3 6,1

% de sulfato

11,6 16,9 15,5

% de agua por KF

8,4 9,2 9,0

An�lisis elemental: % en peso/peso

Carbono

30,4 27,7 25,5

Hidr�geno

4,7 4,0 3,2

Nitr�geno

0,7 0,2 0,3

Azufre

6,6 6,2 6,0

Cationes (los 8 principales): ppm

Sodio

50000 75000 80000

Magnesio

8200 1200 1200

Calcio

6300 5400 6900

Potasio

4900 550 530

Hierro

370 60 102

Estroncio

310 460 480

Fosforoso

160 27 30

Aluminio

43 27 40

Endotoxina (UE/mg)

88,6 38 40

5 Los análisis de muestras se describen en más detalle más adelante.

A. Dispersi�n de luz láser (DLL)

10 Los extractos de fucoidano se analizaron para peso molecular usando HPLC de exclusión de tamaño con detección por dispersi�n de luz láser (DLL) e índice de refracción (IR), como se describe en la publicación de BBL SOP-059, incorporada en el presente documento por referencia. Cada muestra se disolvió en la fase móvil a una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml. El dextrano obtenido de American Polymer Standards se us� como control del sistema. Se usaron la siguiente instrumentaci�n y parámetros:

Instrumentaci�n y parámetros

Fase móvil: Acetato de amonio 0,1 M Columna: Shodex OH pack SB-803 HQ 30 cm x 8 mm (con precolumna) Bomba: ASI Modelo 500 Inyector: Inyector automático Varian 9010 equipado con bucle de 100 μl Detector de DLL: Sistema de dispersi�n de la luz de múltiples detectores Precision Detectors PD2020 (90� clásico) Detector de IR: Shodex RI SE-61 Vol de inyección: 100 μl Velocidad de flujo: 1 ml/min Tiempo de análisis: 20 min Sistema de datos: Precision Discovery 32 v. 0.98.010

La calibración del instrumento se realizó usando NIST BSA lote 927c con un valor del índice de refracción diferencial 20 (dn/dc) de 0,185 ml/g. Los cálculos para el peso molecular del control de dextrano se basaron en un dn/dc de 0,147 ml/g, como se informa por American Polymer Standards. Los cálculos de peso molecular de las muestras usaron un dn/dc de

0,137 ml/g, que se obtuvo del soporte técnico de Sigma. Se hicieron inyecciones individuales para cada muestra. Los resultados de las medidas de peso molecular (MW) de las muestras de fucoidano se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2. Peso molecular promedio en peso (Mw) por DLL

NP Nutra 050316-FU-85 (MC514)

Ensayo procesado n.� 1 (AN50) Ensayo procesado n.� 2 (AN51)

Mw

184.800 179.400 183.800

% <10 kDa

4,7 <1 <1

% 10-50 kDa

22,3 18,7 19,4

% 50-100 kDa

13,0 13,0 11,3

%>100 kDa

60,0 68,3 69,3

Los resultados muestran una diferencia significativa en el peso molecular entre las tres muestras en bruto. En general, los valores de peso molecular pueden variar aproximadamente el 10 % dentro de un laboratorio. 10

B. Hidrólisis de fucoidano y medición de fucosa y xilosa por HPLC

Las muestras se disolvieron en HCl 2 M dando disoluciones de aproximadamente 10 mg/ml. Cinco alícuotas de 1 ml de cada muestra se incubaron a 60 �C en viales de vidrio de 4 ml durante diferentes periodos de tiempo. Un vial de cada 15 muestra se sacó después de 2, 4, 6, 8 y 10 horas y se neutralizó mediante la adición de 1 ml de NaOH 2 M enfriado.

Las muestras se analizaron para contenido de fucosa y xilosa por HPLC con detección del índice de refracción. Se usaron L-fucosa (Sigma-Aldrich, lote n.� 105K058) y D-xilosa (Fluka, lote n.� 1118093) en agua como patrones para la cuantificación. Se usaron la siguiente instrumentaci�n y parámetros:

Instrumentaci�n y parámetros

Fase móvil: ácido sulfúrico 5 mM Columna: Bio-Rad Aminex HPX-78H, 300 mm x 7,8 mm (con precolumna) Bomba: ASI Modelo 500 Inyector: Inyector automático Varian 9010 equipado con bucle de 20 μl Detector de RI: Shodex RI SE-61 Vol. de inyección: 20 μl Velocidad de flujo: 0,8 ml/min Tiempo de análisis: 18 min Temperatura de la columna: ambiente

El contenido de fucosa y xilosa en los tres extractos de fucoidano se determin� por HPLC tras la hidrólisis en HCl 2 N a

25 60 �C durante 22 horas. Los resultados se resumen en la Tabla 3A. Los valores de % en peso/peso en las tablas se han corregido para el aumento de agua durante la hidrólisis: ((164-18)/164) % en peso/peso de fucosa o ((150-18)/150) % en peso/peso de xilosa.

Tabla 3A. Contenido de fucosa y xilosa (60 �C, 22 horas)

NP Nutra 050316-FU-85 (MC514)

Ensayo procesado n.� 1 (AN50) Ensayo procesado n.� 2 (AN51)

% en peso/peso de fucosa

11,1 8,6 8,7

% en peso/peso de xilosa

5,8 4,9 4,9

Estos valores son considerablemente inferiores a los esperados, lo que indica que probablemente no se complet� la hidrólisis. Dos de las muestras se hidrolizaron con la concentración de muestra a 1 mg/ml en HCl 2 N a 100 �C durante 8 horas. Los resultados se resumen en la Tabla 3B.

Tabla 3B. Contenido de fucosa y xilosa (100 �C, 22 horas)

NP Nutra 050316-FU-85 (MC514)

Ensayo procesado n.� 1 (AN50)

% en peso/peso de fucosa

21,7 19,2

% en peso/peso de xilosa

5,3 5,5

Las muestras también se analizaron para azúcares neutros totales por el ensayo de fenol-ácido sulfúrico, un ensayo 40 colorim�trico clásico. La fucosa se us� como patrón.

Estos resultados no se corrigieron para el aumento de agua durante la hidrólisis, por lo que son en algún porcentaje altos, pero próximos a los valores esperados. Los resultados se resumen en la Tabla 3C.

Tabla 3C. Ensayo de fenol-ácido sulfúrico de contenido de fucosa

NP Nutra 050316FU-85 (MC514)

Ensayo procesado n.� 1 (AN50) Ensayo procesado n.� 2 (AN51)

Az�cares neutros en % en peso/peso (patrón de fucosa)

46 65 58

C. Contenido de agua

El contenido de agua de cada extracto de fucoidano se determin� por ensayo de Karl Fischer (KF), según la publicación

10 de BBL SOP-009 v6 “Ensayo del contenido de humedad por Karl Fischer de fármaco a granel usando extracción con metanol anhidro”, incorporado en el presente documento por referencia. Para los ensayos de Karl Fischer, aproximadamente 15 mg de cada muestra se pesaron en un vial de inyector automático de 1,8 ml limpio. Las muestras se prepararon por triplicado. Se extrajo agua de las muestras inyectando aproximadamente 1 ml de metanol en los viales de muestra cerrados. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Contenido de agua

NP Nutra 050316-FU-85 (MC514)

Lote procesado n.� 1 (AN50) Lote procesado n.� 2 (AN51)

Ensayo 1

8,6 9,2 9,1

Ensayo 2

8,1 9,1 9,0

Ensayo 3

- 9,2 8,8

Promedio

8,4 9,2 9,0

Las unidades son % en peso/peso ((peso de agua/peso de muestra total)100).

D. Metales, análisis elemental y análisis de sulfato

20 Se realizó un cribado de metales pesados usando ICP-EM por West Coast Analytical Services, Inc. El azufre se determin� cuantitativamente por ICP-EM. El análisis del contenido de carbono, hidrógeno, nitrógeno y azufre (CHNS) también se realizó por West Coast Analytical Services usando un analizador elemental. También se determin� sulfato por cromatograf�a de iones en West Coast Analytical Services sobre muestras de fucoidano hidrolizadas en HCl 6 N durante

25 6 horas.

Los resultados de la determinación de sulfato por cromatograf�a iónica se muestran en la Tabla 5. Los valores de % en peso/peso en las tablas se han corregido para el aumento de agua durante la hidrólisis: ((96-16)/96) % en peso/peso de sulfato.

Tabla 5. Contenido de sulfato

NP Nutra 050316-FU85 (MC514)

Lote procesado n.� 1 (AN50) Lote procesado n.� 2 (AN51)

% en peso/peso de sulfato

11,6 16,9 15,5

Los resultados del cribado de elementos por ICP-EM se muestran en las Tablas 6A y 6B. Los valores se informan en 35 μg/g (ppm).

Tabla 6A. Elementos más abundantes

Metal

NP Nutra 050316-FU-85 (MC514) Lote procesado n.� 1 (AN50) Lote procesado n.� 2 (AN51)

Sodio

50000 75000 80000

Magnesio

8200 1200 1200

Potasio

4900 550 530

Calcio

6300 5400 6900

Hierro

370 60 102

Estroncio

310 460 480

F�sforo

160 27 30

Aluminio

43 27 40

Manganeso

35 0,19 0,14

Bario

33 52 52

Titanio

15 11 15

Tabla 6B. Contaminantes traza

Metal

NP Nutra 050316-FU-85 (MC514) Lote procesado n.� 1 (AN50) Lote procesado n.� 2 (AN51)

Ars�nico

2,1 ND ND

Bromo

9,5 ND ND

Cerio

0,08 ND ND

Cromo

12 7,2 8,2

Cobalto

0,49 ND ND

Yodo

14 1,6 1,5

Plomo

0,18 ND ND

Litio

0,64 ND ND

Manganeso

35 0,19 0,14

Molibdeno

0,15 ND ND

N�quel

3,8 0,65 0,63

Rubidio

2,2 0,33 0,29

Esta�o

0,27 ND ND

Tungsteno

0,11 ND ND

Uranio

0,55 0,34 0,36

Vanadio

0,89 ND ND

Los resultados del análisis de la composición elemental se muestran en las Tablas 7A y 7B. El análisis de la composición

5 elemental puede compararse con la composición teórica, calculada para un residuo de fucoidano que contiene solo fucosa y un sulfato por fucosa como porcentaje en peso, por ejemplo, C6H12O5 + SO3 -H2O = C6H10O7S (residuo de fucosa + 1 sulfato), véase la Tabla 7B. La composición elemental determinada para todos los lotes est� muy de acuerdo con el valor teórico esperado con la excepción del azufre. As�, es poco probable que cada residuo de fucosa est� sulfatado. Los valores de azufre se correlacionan bien con el análisis de iones sulfato. Los valores de nitrógeno son bajos

10 probablemente debido a otro material de no fucoidano extraído con el fucoidano.

Tabla 7A. Análisis elemental (% en peso/peso)

NP Nutra 050316-FU85 (MC514)

Lote procesado n.� 1 (AN50) Lote procesado n.� 2 (AN51) Teórico

Carbono

30,4 27,7 25,5 31,9

Hidr�geno

4,7 4,0 3,2 4,4

Nitr�geno

0,7 0,2 0,3 0

Azufre

6,6 6,2 6,0 14,2

Tabla 7B. Balance músico de fucoidano

NP Nutra 050316FU-85 (MC514)

Ensayo procesado n.� 1 (AN50) Ensayo procesado n.� 2 (AN51)

Az�cares neutros (por fenol/H2SO4, corregido como residuo)

46 65 58

Agua (por KF)

8,4 9,2 9,0

Sulfato (corregido como residuo)

11,6 16,9 15,5

Cationes (Na+K+Mg+Ca)

5,5 8,2 8,9

Total

71,5 99,3 91,4

E. Composición de monosac�ridos

20 La composición de monosac�ridos se determin� por CG/EM en el Centro de Investigación de Hidratos de Carbono Complejos (Universidad de Georgia, Athens, Georgia). Se prepararon metilgluc�sidos a partir de 10 μg de muestra tratando con HCl 1 M en metanol (25 gotas) a 80 �C durante 15 h seguido de re-N-acetilaci�n con piridina (5 gotas) y anh�drido acético (5 gotas) en metanol (20 gotas) a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación las muestras se per-O-trimetilsililaron por el tratamiento con Tri-Sil (10 gotas, Pierce) a 80 �C (15 minutos). Estos procedimientos se

25 llevaron a cabo como se describe previamente por Merkle y Poppe en Methods Enzymol. 1994, 230, 1-15 y York y col. en Methods Enzymol 1985, 118, 3-40. El análisis de CG/EM de los TMS-metilgluc�sidos se realizó en un CG HP 5890 con interfaz a un 5970 MSD, usando la columna DB-1 (30 m x 0,25 mm de DI). Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8: Análisis de monosac�ridos

Lote original (NP-051316)

Lote de ensayo n.� 1 Lote de ensayo n.� 2

Fucosa

60,7 60,3 61,1

Xilosa

22,8 27,4 24,9

Glucosa

5,5 1,6 0,8

Galactosa

3,9 0,6 ND

Manosa

3,3 ND 4,0

�cido galactur�nico

2,4 2,2 3,1

�cido glucar�nico

1,4 ND ND

Raminosa

ND 4,3 6,1

5 La composición de monosac�ridos no se afect� enormemente por el procesamiento, a pesar del 50 % de pérdida de masa durante el procesamiento y el aumento en azúcares neutros totales y sulfato.

F. Endotoxina

10 La endotoxina bacteriana se determin� por LAL según USP<85>. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 9. El procesamiento produjo una reducción de aproximadamente el 50 % en los niveles de endotoxinas.

Tabla 9: Niveles de endotoxinas de fucoidano sin procesar y procesado

Endotoxina (UE/mg)

Lote original (NP-051316)

88,6

Lote de ensayo n.� 1

38

Lote de ensayo n.� 2

40

Ejemplo 4

Actividad biológica de muestras de fucoidano

20 Muestras de extractos de fucoidano purificadas del ensayo 1 (Ejemplo 1) y ensayo 2 (Ejemplo 2) se evaluaron en ensayos de coagulación in vitro para actividad y se compararon con el extracto de fucoidano en bruto (NPNutra, lote n.� 050316-FU-85). Los extractos de fucoidano purificados y en bruto se evaluaron para actividad biológica en ensayos in vitro, por ejemplo, APTT, dPT y tromboelast�grafo en Avigen Inc.

25 Ensayos de coagulación en plasma: Tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT)

El ensayo de APTT se modificó a partir de los procedimientos convencionales (Anderson 1976; Staff 2004). Brevemente,

30 5 μl de 20X fucoidano en solución salina se incubaron con 95 μl de plasma durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación 100 μl de reactivo de APTT a 37 �C se añadieron a la mezcla y se incubaron a 37 �C durante 3 min, seguido de adición de 100 μl de CaCl2 25 mM a 37 �C e inicio del cronometraje en un fibr�metro convencional.

Tiempo de protrombina diluido (dPT)

35 El ensayo de dPT fue similar al previamente descrito (14). Se diluyó simplastina (bioMeriex, Durham, NC) con solución salina a 1:100 o 1:300, dependiendo del formato del ensayo y se mezcl� con CaCl2 25 mM. La muestra de plasma también se calentó previamente a 37 �C y luego ∼75 μl de cada una se mezclaron juntas y se midió el tiempo hasta la coagulación con un fibr�metro. Para la evaluación de la actividad de fucoidano, 5 μl de 20X fucoidano se preincubaron

40 con plasma a temperatura ambiente durante 30 min antes de iniciarse el ensayo de dPT. Para evaluar la posible inhibición de la actividad de TFPI por fucoidano, rTFPI diluido (American Diagnostica, Stamford, CT) se preincub� con fucoidano durante 5 min a temperatura ambiente, se a�adi� muestra de plasma y la mezcla se incub� durante 25 min adicionales, seguido del inicio de dPT. Todos los estudios de coagulación se realizaron por duplicado y se reprodujeron.

45 Tromboelast�grafo de plasma (TEG)

Preparaci�n de muestras – Muestras de plasma humano deficiente en factor VIII (George King Biomedical, Overland Park, KS) (360 μl) precalentadas a 37 �C se mezclaron con 40 μl de fucoidano sin procesar o tratado con EDTA en solución salina. La concentración de fucoidano final en las muestras de plasma oscil� de 1 μg/ml a 100 μg/ml.

50 Análisis de TEG – Para la activación de las muestras de plasma, 20 μl de CaCl2 0,2 M se añadieron a una copa de plástico montada en un soporte para copas de aluminio. Las mezclas de muestra de plasma y fucoidano (340 μl) se dispensaron a la disolución de CaCl2 y se midieron inmediatamente. El analizador de TEG incub� las muestras continuamente a 37 �C. Las pruebas se detuvieron después de que se calcularan los siguientes parámetros de formación de coágulos por el software TEG�Analytical versión 4: R, periodo de latencia para la coagulación inicial a partir del

5 tiempo en que empezó la medición; ángulo !, que representa la rapidez del fortalecimiento del coágulo; y MA (amplitud máxima), equivalente a la fortaleza máxima del coágulo formado. En muestras de plasma sin formación de coágulos, la medición se termin� después de 2 h. Los valores promedio y desviaciones estándar se calcularon a partir de tres mediciones independientes.

10 El efecto del procesamiento sobre la actividad de fucoidano sobre la ruta de coagulación intrínseca y extrínseca se examin� midiendo el tiempo de coagulación frente a la concentración de fucoidano en los ensayos de APTT (Fig. 1) y dPT (Fig. 2). Como puede apreciarse en la Figura 1, el procesamiento tuvo un modesto cambio en la actividad de APTT. Sin embargo, como se observa en la Figura 2, el fucoidano potencia la inhibición de TFPI disminuyendo el tiempo de coagulación y desplaza la respuesta a dosis (CI90 para el extracto de fucoidano en bruto es aprox. 30 μg/ml frente a los

15 lotes de extracto de fucoidano purificado n.� 1 y n.� 2 que son aprox. 4 μg/ml).

El impacto del procesamiento sobre las actividades pro-y anticoagulaci�n en plasma de Hem A humana como se mide por análisis de TEG se examin� en muestras de plasma de cuatro pacientes con hemofilia A separados. El valor de R se representa frente a la concentración cuando los valores de R representan el tiempo necesario para formar un coágulo de

20 20 mm de tamaño. Como se representa en la Figura 3, aunque el extracto de fucoidano en bruto y los extractos de fucoidano purificados demostraron perfil pro-coagulante similar en los cuatro plasmas de Hem A, vari� el efecto sobre la anticoagulaci�n. Los lotes procesados n.� 1 y n.� 2 que contienen fucoidano mostraron actividad anticoagulante alterada en algunas muestras.

25 E. Conclusión

El extracto de fucoidano purificado como se describe en los Ejemplos 1 y 2 tuvo elevado contenido de azúcares neutros y sulfato y reducida contaminación de metales pesados y niveles de endotoxinas, mientras que mantiene el perfil de monosac�ridos. Los extractos de fucoidano purificados tuvieron niveles no detectables (ND) de arsénico, bromo, cerio,

30 cobalto, plomo, litio, molibdeno, estaño, tungsteno y vanadio. Además, la purificación redujo los niveles de yodo, hierro, magnesio, manganeso, níquel, fósforo, potasio y rubidio al menos dos veces. Los niveles de endotoxinas se redujeron aproximadamente el 50 %. Los extractos de fucoidano purificados que contienen fucoidano enriquecido tuvieron actividad de coagulación acelerada (e inhibición de TFPI potenciada) y cambio mínimo en la actividad anticoagulante cuando se compararon con el extracto de fucoidano en bruto.

35 Aunque las realizaciones preferidas de la invención se han ilustrado y descrito, se apreciar� que pueden hacerse diversos cambios en las mismas sin apartarse del alcance de la invención.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de purificación de fucoidano de una mezcla heterogénea, comprendiendo el procedimiento: 5 (a) proporcionar una fuente de fucoidano;

   (b) eliminar iones de metales pesados de dicha fuente tratando con un agente quelante para producir una primera mezcla de fucoidano;

   10 (c) precipitar selectivamente el fucoidano presente en dicha primera mezcla de fucoidano para eliminar contaminantes;

   (d) resuspender el precipitado que contiene fucoidano en disolución acuosa para producir una segunda mezcla de fucoidano;

   15 (e) repetir las etapas (c) y (d) una o más veces; y

   (f) filtrar la disolución acuosa que comprende fucoidano para eliminar contaminantes bacterianos y de endotoxinas para dar fucoidano purificado.

   20 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el fucoidano posee del 5 al 25 por ciento en peso de azufre.
2. 3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el fucoidano es de origen algal.
3. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el fucoidano es del género Fucus o Laminaria. 25

4. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el fucoidano es de Fucus vesiculosis o Laminaria japonica.

5. 6.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el agente quelante est� seleccionado del

   grupo que consiste en ácido etilendiaminatetraac�tico (EDTA), ácido etilenglicol-bis-(beta-aminoetil�ter)-N,N,N',N'30 tetraac�tico (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropanol-1-sulf�nico (DMPS) y ácido 2,3-dimercaptosucc�nico (DMSA).
6. 7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el agente quelante es EDTA.

7. 8.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el agente quelante se inmoviliza sobre un 35 soporte sólido.

8. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el agente quelante es una resina quelante de iminodiacetato.

9. 10.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el fucoidano en dicha primera mezcla de 40 fucoidano se precipita selectivamente con etanol.

10. 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la concentración de etanol es aproximadamente del 40 % al 50 % (v/v).

    45 12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el pH se mantiene entre aproximadamente pH 5,7 y aproximadamente pH 6,0.
11. 13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el pH se ajusta a aproximadamente pH 5,95.

    50 14. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que se añade NaCl a la mezcla de fucoidano a una concentración de aproximadamente 20-24 g/litro.
12. 15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende repetir las etapas (c) y (d) tres

    veces. 55
13. 16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende además liofilización del fucoidano purificado.

    (μg/ml)

    (μg/ml)

    (μg/ml)