RU2717672C1

RU2717672C1 - Способ стимуляции клеток иммунной системы человека

Info

Publication number: RU2717672C1
Application number: RU2019110167A
Authority: RU
Inventors: Александр Андреевич Абрамов; Алиса Антоновна Петкевич; Вадим Игоревич Поспелов
Original assignee: Гордейчук Владимир Евгеньевич; Вадим Игоревич Поспелов; Рубцов Сергей Владимирович; Барсуков Александр Павлович
Priority date: 2019-04-05
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2020-03-25

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано для стимуляции клеток иммунной системы человека. Для стимуляции клеток иммунной системы человека получают препарат путем экстрагирования гомогената водорослей Laminaria Japonica и Laminaria Angustata в водно-изобутаноловом растворе в соотношении 1 г:2,5 мл:2,5 мл с получением на выходе однородной смеси, которую затем выдерживают в течение 1 часа при 60°C и далее инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 часов, затем отбирают супернатант, который центрифугируют при 3000 об/мин 30 мин при +4°C. Далее образовавшийся в процессе центрифугирования супернатант помещают в вакуумный испаритель и продувают аргоном, а затем проводят его вакуумную сушку при комнатной температуре в течение 1 часа и далее при 60°C до полного выпаривания жидкой фракции, после чего полученный осадок разбавляют водой до получения 5% раствора и подвергают ультрацентрифугированию при 100000 об/мин в течение часа. Затем отбирают образовавшийся супернатант и центрифугируют его с использованием пробирок с фильтрами 10 кДа в течение 1 часа при 5000 об/мин, после чего отбирают нижнюю фракцию, прошедшую фильтры, и проводят ее центрифугирование с использованием пробирок с фильтрами 5 кДа в течение 1 часа при 5000 об/мин, после чего отбирают верхнюю фракцию, не прошедшую фильтр, которую растворяют в 500 мл NaCl до конечной концентрации 10 мг/мл. Полученный препарат вводят per os пациенту по 1 мл перед едой 1 раз в день в течение двух недель. Использование данного способа позволяет проводить стимуляцию клеток иммунной системы человека, что приводит к нормализации показателей иммунного статуса. 2 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано для стимуляции клеток иммунной системы человека при лечении различных заболеваний связанных с нарушениями иммунной системы.

Известен способ иммуностимуляции с помощью препарата Панаген (№ ЛСР-004429/08), который принимается в форме таблеток или раствора для внутримышечных инъекций и стимулирует эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов (патент: RU 2498821 С1, опубл. 04.10.2012). Препарат представляет собой двуцепочечную геномную фрагментированную ДНК человека с размером фрагментов 200-6000 пар оснований. Данный способ не позволяет достигнуть высокой эффективности иммунной стимуляции, в связи с невысокой биодоступностью препарата и потерями при приеме per os при прохождении через отделы желудочно-кишечного тракта. Одновременно как и всякая чужеродная ДНК он может подвергаться активному разрушению, кроме того, являясь специфической нуклеотидной последовательностью, может вызывать негативные реакции, нарушая структуру ДНК в клетках человека.

Препарат «Панаген» используют в таблетированной форме в количестве 3 таблетки, содержащих 5 мг активной субстанции, ежедневно на протяжении 1-14 дней от начала приема или до момента достижения лечебного эффекта. Использование таблетированной формы препарата на основе чужеродной ДНК может приводить к значительной потере активного вещества и снижению его эффективности.

Задачей заявленного способа является создание препарата для стимуляции клеток иммунной системы человека лишенного недостатков известного препарата за счет его более высокой биодоступности и способности проникать внутрь клеток за счет небольшого размера (5-10 кДа)

активных веществ и меньших потерь при прохождении через отделы желудочно-кишечного тракта вследствие химической структуры активных веществ, которые представлены в основном полисахаридами.

Указанная задача решается тем, что для стимуляции клеток иммунной системы человека получают препарат путем экстрагирования гомогената водорослей Laminaria Japonica и Laminaria Angustata в водно-изобутаноловом растворе в соотношении 1 г:2,5 мл:2,5 мл с получением на выходе однородной смеси, которую затем выдерживают в течение 1 часа при 60°C, и далее инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 часов, затем отбирают супернатант, который центрифугируют при 3000 об/мин 30 мин при +4°C, далее образовавшийся в процессе центрифугирования супернатант помещают в вакуумный испаритель и продувают аргоном, а затем проводят его вакуумную сушку при комнатной температуре в течение 1 часа и далее при 60°C до полного выпаривания жидкой фракции, после чего полученный осадок разбавляют водой до получения 5% раствора и подвергают ультрацентрифугированию при 100000 об/мин в течение часа, затем отбирают образовавшийся супернатант и центрифугируют его с использованием пробирок с фильтрами 10 кДа, в течение 1 часа при 5000 об/мин, после чего отбирают нижнюю фракцию, прошедшую фильтры, и проводят ее центрифугирование с использованием пробирок с фильтрами 5 кДа в течение 1 часа при 5000 об/мин, после чего отбирают верхнюю фракцию, не прошедшую фильтр, которую растворяют в 500 мл NaCl до конечной концентрации 10 мг/мл, затем полученный препарат вводят per os пациенту по 1 мл перед едой 1 раз в день в течение 2х недель.

Проницаемость энтероцитов и бокаловидных клеток, которые, помимо отделов ЖКТ, представлены в экстраторакальной части трахеи, протоках поджелудочной и околоушных желез, в три раза выше для молекул массой 5-10 кДа в сравнении с остальными типами клеток ЖКТ, в т.ч. стволовыми клетками и клетками Панета. Таким образом, пулы клеток, ответственные отчасти за проявления местного иммунитета и защитные функции ЖКТ, а

также поступление веществ из ЖКТ в кровеносное русло оказываются наиболее проницаемыми для экстракта водорослей в сравнении с остальными пулами клеток. Как следствие, попадание активного экстракта водорослей в кровеносное русло может осуществляться парацеллюлярным и трансцеллюлярным путями (через энтероциты). Помимо повышенной проницаемости для определенных типов клеток ЖКТ, повышенной биодоступности экстракта водорослей споспособствуют небольшой размер частиц (5-10 кДа) и отсутствие сложной трехмерной структуры. В процессе изучения эффективности препарата схема применения per os по 1 мл перед едой 1 раз в день в течение 2х недель показала себя как самая эффективная и самая безопасная.

Указанный способ получения отдельных фракций Laminaria Japonica и/или Laminaria Angustata, представленных молекулами в интервале от 5 до 10 кДа является более оптимальным, и позволяет достигнуть обогащения данной фракции, по сравнению с исходным содержанием, более чем в 10000 раз.

Алгоритм заявленного способа:

Для получения данных фракций из высушенного измельченного гомогената водорослей (Laminaria Japonica и Laminaria Angustata) методом экстрации бутанольно-водной смесью происходит экстрагирование порошка ламинарии в водно-изобутаноловом растворе (1 г:2,5 мл:2,5 мл), для чего в бутыль объемом 12 л наливают 500 мл изобутанола; затем добавляют 200 гр порошка ламинарии и перемешивают до гомогенизации раствора и приобретения им темно-зеленого цвета. Далее через 10 минут в бутыль доливают 500 мл дистиллированной воды и снова перемешивают до однородной смеси. Полученную смесь нагревают в течение 1 часа на водяной бане или в термостате при 60°C, затем инкубируем при комнатной температуре в течение 10-15 часов, далее отбирают супернатант, проводят центрифугирование раствора ламинарии при 3000 об/мин 30 мин на аппарате Eppendorf Centrifuge 5804 R при +4°C. Необходимо отобрать

образовавшийся супернатант, поместить его в вакуумный испаритель и продуть аргоном. Затем проводится вакуумная сушка полученного супернатанта по следующей схеме: при комнатной температуре в течение 1 часа для предотвращения вскипания раствора при понижении давления и далее при 60°C до полного выпаривания. Далее проводят приготовление 5% водного раствора и ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение часа. Образовавшийся супернатант нужно отобрать и вновь провести центрифугирование уже с использованием пробирок с фильтрами 10 кДа в течение 1 часа при 5000 об/мин на аппарате Eppendorf Centrifuge 5804 R. После этого отбирают нижнюю фракцию, прошедшую фильтры, и проводят центрифугирование с использованием пробирок с фильтрами 5 кДа в течение 1 часа при 5000 об/мин на аппарате Eppendorf Centrifuge 5804 R7. Далее забирают верхнюю фракцию, не прошедшую фильтр, и добавляют 500 мл NaCl. Полученный препарат применяется следующим образом: 1 мл препарата разводится в 20 мл воды и выпивается перед едой 1 раз в день в течение 2х недель. Препарат представлен молекулами между 5 и 10 кДа.

Примеры реализации заявленного способа.

Пример 1.

Пациентка 40 лет была направлена терапевтом к иммунологу в связи с частыми эпизодами ОРЗ (4-5 раз в год) последние 3 года, жалобами на утомляемость, сонливость и постоянную слабость. Анамнез не отягощен, беременности - 2, роды - 2 (23 года и 27 лет), данных физикальных методов обследования - без особенностей. Общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови без особенностей. Иммунолог назначил исследование иммунного статуса, в результате которого выявилось снижение пула натуральных киллеров и В-лимфоцитов при сохранении абсолютных нормальных значений. Пациентке был назначен препарат в режиме 1 мл препарата в 20 мл воды и per os перед едой 1 раз в день в течение 2х недель. После месяца от начала приема препарата пациентка стала отмечать субъективное улучшение состояния: уменьшились слабость и усталость, со

слова, пациентка стала легче вставать по утрам (при неизмененном режиме дня). По объективным данным: по результатам повторного исследования иммунного статуса у пациентки отмечается повышение пула натуральных киллеров и В-лимфоцитов в 3 и 2 раза соответственно.

Пример 2

Пациент 60 лет, мужчина, анамнез без особенностей, самостоятельно обратился к иммунологу в связи с периодическими болями в суставах, повышенной раздражительностью, утомляемостью, проблемы со сном (тяжело засыпать и просыпаться). При обследовании в терапевтическим отделении частной клиники никаких особенностей не выявлено. По результатам исследования иммунного статуса выявлено снижение

натуральных киллеров (относительное) и значения показателей гуморальных факторов иммунитета (IgA и IgM). Пациенту был назначен препарат в режиме 1 мл препарата в 20 мл воды и per os перед едой 1 раз в день в течение 2х недель. После месяца от начала приема препарата пациент отметил улучшение качества сна (быстро засыпает и не просыпается по время сна ночью), улучшение настроения, объективно: после месяца от начала приема препарата отмечается увеличение показателей факторов гуморального иммунитета и нормализация соотношения популяций лимфоцитов.

На основании вышеприведенных примеров очевидно, что назначение препарата, активным веществом которого являются молекулы 5-10 кДа Laminaria Japonica и Laminaria Angustata, приводит к нормализации показателей иммунного статуса пациентов и субъективному улучшению их самочувствия

Claims

Способ стимуляции клеток иммунной системы человека, характеризующийся тем, что получают препарат путем экстрагирования гомогената водорослей Laminaria Japonica и Laminaria Angustata в водно-изобутаноловом растворе в соотношении 1 г:2,5 мл:2,5 мл с получением на выходе однородной смеси, которую затем выдерживают в течение 1 часа при 60°C и далее инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 часов, затем отбирают супернатант, который центрифугируют при 3000 об/мин 30 мин при +4°C, далее образовавшийся в процессе центрифугирования супернатант помещают в вакуумный испаритель и продувают аргоном, а затем проводят его вакуумную сушку при комнатной температуре в течение 1 часа и далее при 60°C до полного выпаривания жидкой фракции, после чего полученный осадок разбавляют водой до получения 5% раствора и подвергают ультрацентрифугированию при 100000 об/мин в течение часа, затем отбирают образовавшийся супернатант и центрифугируют его с использованием пробирок с фильтрами 10 кДа в течение 1 часа при 5000 об/мин, после чего отбирают нижнюю фракцию, прошедшую фильтры, и проводят ее центрифугирование с использованием пробирок с фильтрами 5 кДа в течение 1 часа при 5000 об/мин, после чего отбирают верхнюю фракцию, не прошедшую фильтр, которую растворяют в 500 мл NaCl до конечной концентрации 10 мг/мл, затем полученный препарат вводят per os пациенту по 1 мл перед едой 1 раз в день в течение двух недель.