CN1120015C - 高效纯天然降血糖剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及保健品医药领域中对较为难控制的常见的糖尿病提供了一种高效纯天然的降血糖保健品或药品，动物与临床实验证明本品具有显著的食疗与治疗效果。本发明系从野生的石莲花、采用高科技的生物技术经破细胞壁后提取的含有降血糖有效成分的原粉。本发明同时适用于生产降血糖保健品或中药厂家。
Description
本发明涉及保健品和医药领域从野生资源石莲花(Echevaria glauca)中提取的高效纯天然降血糖剂。
本发明的石莲花系景天科石莲花属(中国植物志第34卷第一分册中P.63)的石莲花又称荷花掌(河北植物志，第一卷中，575～576；Hort.ex Baker.in Saund.Refug.Bot.1：sub T.61.1863-(Cotyledon glauca Baker)石莲花为半灌木或草本状，高达60厘米。根状茎粗壮，半直立，密被近螺旋状着生的宽扁叶痕，生有多数细长丝状气根，叶痕腋部常生出新的小莲座全，莲座丛长大时，其下也生出新的根状茎，成为老茎的分枝。叶蓝灰色，嵌镶排列成一莲座丛。幼时无茎，长大时其下面根状茎，增长半直立，把莲座丛支起生于其顶端；叶片稍肉质，倒卵匙形，长5-8厘米，最宽处2.5-4厘米，先端阔而圆或近平截，中央有一小突尖，长约一毫米，红色，基部窄缩成匙状，长约占叶长的1/3-1/2，全缘；无叶柄。花茎腋生，高20-30厘米，花10-20，成单歧聚伞花序；花萼绿色线形；花冠外面粉红色，里面黄色，长约1.5厘米，先端稍外展。花期6-8月。
据文献记载石莲花原产于墨西哥，按发明者实地勘察表明：在我国广西巴马山区的悬崖峭壁上的石缝中大量生长着石莲花，每年6-8月份开花季节，远远眺望，峭壁悬崖被装点成一片粉红色的世界，胜似好看。
国内外发明了许多治疗非胰岛素依赖型糖尿病的中西药，但不是用药量较大，就是长期使用有抗药性或副作用，即使降糖效果好但往往容易出现低血糖现象，人们企盼着一种纯天然高效无毒副作用，安全、双向调节的营养型降血糖药物或保健品问世，本发明就为此目的应运而生的。
现将本发明的高效纯天然降血糖剂(以下简称DAS)的提取方法，动物实验、临床典型病例详述于后。
一、提取DAS的方法：参考申请号为95117499.1专利的破壁方法。
1.DAS提取液的提取法：
实施例1.按图1-①用50～70％药用酒精破细胞壁的生产工艺流程进行操作：将10kg鲜石莲花洗净，置于破碎机中捣碎再加入4升98％的药用酒精，用水或以石莲花的水分将水溶液比重调至70％后，室温浸泡过夜，过滤，收集滤液；滤渣加4升蒸馏水按上述操作重复4次，合并5次滤液60～70℃水浴减压浓缩，得到浓度为50g/ml的200ml浓缩液。
实施例2.按图1-②用速冻速解冻破细胞壁的生产工艺流程进行操作：将10kg石莲花洗净，置于破碎机中破碎，迅速降温至-20℃，待温度平衡4小时后，迅速加热至40～50℃解冻，加入4升蒸溜水浸泡过夜，过滤，收集滤液；滤渣按上述操作重复4次，合并5次滤液，60～70％水浴减压浓缩，得到浓度为50g/ml的200ml浓缩液。
实施例3.按图1-③用超声波细胞捣碎仪破细胞壁的生产工艺流程进行操作：将1000g石莲花洗净，置于破碎机中破碎后，用W220型SONIGATOR超声波细胞捣碎仪，在800-900赫兹(HZ)条件下搅拌5分钟，再加入400ml蒸溜水浸泡过夜，过滤，收集滤液；滤渣按上述操作重复4次，合并5次滤液；60-70℃水浴减压浓缩，得到浓度为5g/ml的200ml浓缩液。
2.DAS原粉的提取法：
实施例4.将实施例1.的200ml浓度为50g/ml的浓缩液进行操作导到DAS原粉243g、收率为2.43％。
实施例5.将实施例2.的200ml浓度为50g/ml的浓缩液，按图2.DAS原粉生产工艺流程进行操作，得到239gDAS原粉，收率为2.39％。
实施例6.将实施例3.的200ml浓度为5g/ml的浓缩液，按图2.DAS原粉生产工艺流程进行操作，得到23.6gDAS原粉，收率为2.36％。
3.DAS精粉的提取法：
实施例7.取实施例1.中浓缩液50ml装上硅胶柱(100～150目，30×360)，按图3.DAS精粉生产工艺流程进行操作：分别依次用乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙酸乙酯丙酮＝1∶1、甲醇、丙酮∶甲醇＝5∶1、丙酮∶甲醇＝1∶1进行非线性洗脱、按紫外监测仪的峰值收集的丙酮∶甲醇＝5∶1的组分进行硅胶薄板(GF254 10～40μ)分离，以乙酯∶甲醇∶水＝4∶0.6∶0.3作为展开剂，收集薄板上的Rf∶0.37～0.52的组分，溶于丙酮∶甲醇＝5∶1的混含液中，过滤，减压蒸干，得到17.01g DAS精粉，收率为28％。
实施例8.将实施例3.中浓缩液50ml浓度为5g/ml，按图4生产工艺流程进行操作：Saphadex LH3-20柱(50×1200)，用甲醇进行梯度洗脱，根据紫外监测仪的峰值收集洗脱的有效组分，减压浓缩，蒸干，得到0.974g，收率为16.5％。
实施例9.取实施例2.中200ml的浓缩液，用4×200ml乙酸乙酯萃取，合并4次酯溶液待回收，将水溶液减压浓缩，用甲醇反复洗涤沉淀物，然后回收甲醇，再用无水乙醇反复沉淀，在减压回收乙醇后，得到89.6gDAS3精粉，收率为37.5％(以其原粉产量为基准)。
4.DAS成分表：
表1、DAS成分表(％)
组别 含量％
蛋白质 30～52
总糖 3.6～5.1
多糖 3.5
皂甙 1.8
水分 0.4～1.1
纤维素 1.7
微量元素 3～7.3
咖啡因 ＜10-3
(Natl+Kcl) 0.58～1.25
总含量二、DAS原粉或精粉的动物实验：
1.DAS的急性毒性实验：如表2所示。
表2、最大耐受量(Maximum tolerated dose缩写为MTD)的测定
2、DAS原粉与精粉降血糖值实验：
| 送检样品 | 送检单位 | 动物种类 | 实验方法 |
| DAS提取液批号：961688生药量：3.6/ml | 发明者 | 昆明种小鼠 | 体重20±2.5g的小鼠20只雌雄各半，空腹灌胃剂量78g/kg，一次灌完，连续观察7日，动物安静，无异常，此剂量相当于人用剂量的360倍。 |
(1)实验方法：将昆明种小鼠随机分成对照组、DSP、DAS、DAS1、DAS2、DAS3、达美康、优降糖组，每组11只雌性小鼠，用四氧嘧啶制成糖尿病模型，以已知DSP、达美康、优降糖作为降血糖值的标准样品进行比较，每组灌胃剂量：原粉均为0.5mg/ml，每天0.2ml/只，对照组只用0.2ml/日的生理盐水灌胃，灌胃6天后，取血测定血糖值。
(2)实验结果：对测定数据进行生物统计，结果如表3所示
表3
组别 动物数 性别 血糖含量mg％ 血糖下降率
给药前 给药后 -X±SD (-Δx％) P值
DSA 11 ♀ 204.21 157.55 46.66±36.85 46.66 ＜0.01
DAS1 11 ♀ 198.41 102.95 51.89±40.99 51.89 ＜0.01
DAS2 11 ♀ 258.67 158.79 61.39±36.82 61.39 ＜0.001
DAS3 11 ♀ 238.82 100.41 57.96±39.25 57.96 ＜0.01
DSP 11 ♀ 295.36 159.15 46.12±34.18 46.12 ＜0.01
优降糖 11 ♀ 296.58 162.28 45.28±37.05 45.28 ＜0.01
达美康 11 ♀ 292.35 110.5 42.55±38.61 42.55 ＜0.01
对照组 11 ♀ 180.67 176.98 2.04±5.94 2.04 --注：①血糖下降率的顺序为：DAS2＞DAS3＞DAS1＞DSP＞优降糖＞达美康，DAS2降血糖效果最佳；
②DAS2具有极显著性差异，而其它各组均具有非常显著性差异；
③对照组无统计意义。
3、DAS致畸胎实验：
(1)实验动物：采用三月龄Wistar大鼠，由中国医学科学院动物部提供(一级合络动物)，在动物室饲养四天后进行试验，动物室室温控制在25±1℃，湿度60～80％。
(2)剂量分组：按临床用药量(每人每天固体DASlmg/kg体重)的200倍为最高剂量组，即200mg/kg，以1/4递减下设二个剂量组即50mg/kg，12.5mg/kg，另设阳性对照组(乙酰水杨酸200mg/kg)及阴性对照组，共分五组，每组已交配鼠数为14-15只。
(3)给药途径及给药时间：DAS液及8.3％乙酰水杨酸均灌胃给药，DAS给药时间为受孕第6天至第14天共给药9天，乙酰水杨酸给药时间为受孕第8天至第14天，共给药7天，
(4)实验方法：每日下午6：00，雌、雄鼠以2∶1比例同笼，次日晨8：30检查阴栓及精子，以发现精子者为已交配，当日算为受孕0天，于受孕0天称体重，随机分入各实验组，于受孕第五天，十天，十五天及二十天称体重，于第20天颈椎脱臼法处死，取出胎鼠进行常规外观检查，茜素红染色作骨骼畸形检查及波氏液固定作内脏畸形检查。
(5)实验结果：如表4所示
表4。组别 母鼠体重增量 孕鼠活胎率％ 胎鼠畸形(P)
(P) (P) 外观 骨骼 内脏实验组 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05阴性对照组 —— —— —— —— ——(6)结论：以上结果表明，实验组DAS在超过人临床应用量12.5、50、200倍的情况下，与阴性对照组比较P＞0.05均无显著性差异，因此可以认为DAS对大鼠无致畸作用。
4、DAS致突性实验：
(1)实验方法：
①Ames试验：
采用沙门氏菌营养缺陷型TA97.TA98.TA100和TA102，四个菌株，采用平皿掺入法进行直接致突变试验及经鼠肝粒体酶诱导的间接致突变试验。菌株由美国加州大学Ames实验室惠赠，经鉴定生物学特性符合要求。实验设5、50、500、1000mg/皿四个剂量组，另设阳性对照组、阴性对照组(自然回变)。每次实验各组织三个平行样品，共做二次实验，结果以平均值表示。菌落回变数超过自然回变数2倍者，判断为致突变阳性。
②小鼠骨髓微核试验：
采用昆明种小鼠，由本院动物室提供(一级合格动物)，体重24～30g。实验设10、600、1200mg/kg体重三个DAS剂量组，另设阳性对照组(环磷酰胺30mg/kg腹腔注射，二次)各阴性对照组共五组，每组动物10只，雌雄各半。给药途径为灌胃，连续2天于末次灌胃后6小时处死，取胸骨骨髓按常规制片，染红色。每鼠计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染细胞数，计算微核细胞率。
③小鼠精子畸变试验：
采用昆明种小鼠由中国医学科学院动物中心提供(一级合格动物)，体重27～36g。设10、600、1200mg/kg三个DAS剂量组，另设阳性对照组(环磷酰胺30mg/kg腹腔注射5天)及阴性对照组。给药途径为灌胃连续5天，于第一次给药后第35天处死，取两侧附睾，按常规制片，染色，每只动物观察1000个精子，计算精子畸变率。
(2)实验结果：
①Ames试验：结果如表5、可见四个菌株的自然回变数不论是否添加S9均在要求范围内，各阳性物的回变菌落数均超过相应自然回变数的三倍以上，而四个剂量组不论是否添加S9的情况下，回变菌落数均未超过自然回变数的2倍，说明DAS在试验剂量范围内，对鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型的四个菌株均未直接和间接致突变作用。
表5、Ames试验结果(回变菌落数/皿 M±SD)剂量 TA97 TA98 TA100 TA102(ug/皿) S9- + - + - + - +0 177±63 190±29 37±12 43±8 192±29 213±29 315±80 330±785 170±7 2 173±32 36±5 46±9 213±11 200±42 356±33 302±7750 175±27 197±44 38±7 45±6 175±20 193±25 311±45 315±57500 185±43 177±46 36±4 36±7 183±26 175±18 336±26 325±1071000 168±3 2 183±33 34±4 34±8 198±21 208±15 339±45 314±424NQNO(0.5) 691±156 214±51 1820±199 930±1562AA(12) 738±169 1041±150 1206±109 715±30
②小鼠骨髓微核试验：结果如表6所示。
表6微核试验结果。
组别 动物数 分析细胞数 细胞微核率(％。)
阴性对照组 10 10000 2.1
阳性对照组 9 9000 45.3
DAS10MG/KG 10 10000 3.0
600” 9 9000 2.8
1200” 10 10000 3.2经X统计分析阳性对照组与阴性对照组相比，有极显著性差异(P＜0.01)，三个实验组与阴性对照组相比，均未发现有显著性差异(P＞0.05)，说明DAS在上述实验剂量范围内未发现有诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率增高的作用。
③小鼠精子畸变试验： 结果如表7所示。
表7精子畸变分析结果
组别 动物数 观察精子数 畸形精子数 畸形率(％)。
阴性对照组 10 10000 137 13.7
阳性对照组 10 10000 619 61.9
DAS10mg/kg 10 10000 133 13.3
600mg/kg 10 10000 130 13.0
1200mg/kg 10 10000 147 14.7经统计处理，阳性对照组与阴性对照组相比，有极显著性差异(P＜0.01)，三个剂量的实验组与阴性对照组相比均未发现有显著性差异(P＞0.05)，说明DAS在上述实验剂量范围内未发现有诱发小鼠精子畸变的作用。
综合上述三个实验的结果，在实验剂量范围内均未发现有致突变作用，可以认为DAS对小鼠不会引起体细胞和生殖细胞的突变。
5.DAS亚慢性实验：
(1)实验动物：Wistar断乳大鼠体重210～220g由中国医学科学院提供，一级合格动物。
(2)动物分组与剂量：
按随机分组分成4组，每组动物24只，雌雄各半，6个实验组一个对照组每日实验组中分低、中，高剂量组，低剂量相当于拟人每日用量(1mg/kg)的10倍、中剂量组，相当于50倍、高剂量组相当于100倍。即低剂量10mg/kg、中剂量50mg/kg、
高剂量100/kg。
(3)观察项目：如表8.所示
Hb：血清蛋白；(WBC+DC)：白细胞总数与分类；S-GPT：转氨酶；
TG：甘油三脂；CHO：总胆固醇；BUN：尿素氮；
GLU：血糖；TP：总蛋白；ALb：白蛋白；GLb：球蛋白；
①45天时随机取半数动物，雌雄各半，尾端取血测定表8.45天血清生化指标测定结果(X±SD)的P值
| 性别 | 组别 | 动物数 | s-GPT GLU BUN CHO TG GLB ALB TP MB WBC 总数 细胞％A/Gmg/ml mg/dl g/dl 万/mm3 淋巴 中性 嗜酸 单核 |
| ♀ | 低剂量中剂量高剂量对照组 | 5555 | ＞0.05…………………………………………………………………………………………………………＞0.05…………………………………………………………………………………………………………＞0.05………………………………………………………………………………………………………… |
| ♀ | 低剂量中剂量高剂量对照组 | 5555 | ＞0.05…………………………………………………………………………………………………………＞0.05…………………………………………………………………………………………………………＞0.05………………………………………………………………………………………………………… |
注：①P值均＞0.05，与对照组比较无显著性差异。
②对照组无统计意义
③“＞0.05……………………”代表P值均大于0.05
②DAS对大鼠90天给药的体重，进食量、血液、生化常规指标、主要脏器含量系数的影响，如表9所示。
表9
(4)讨论：
| 性别 | 组 别 | 动物数 | 体重(P值) | 进食量(P值) | 血液学常规指标(P值) | 血液生化学(P值) | 主要脏器系数(P值)重量 肉眼观察 病理镜检 |
| 低剂量 12 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05♀ 中剂量 12 ＞0.05 0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05高剂量 11 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05对照组 11 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 | |||||||
| 低剂量 12 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05中剂量 11 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05♀ 高剂量 12 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05对照组 12 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 | |||||||
①对45天血液常规各血清生化检查，以及90天血液常规检查和血清生化检查以及病理学检查结果认为：对受试物DAS在此实验浓度条件下，对Wistar大鼠未发现任何不良作用；
②从45天、90天所测定的血糖值来看，对未患糖尿病的大鼠长期、大剂量用药未出现一例低血糖与高血糖而对照组则有出现高血糖现象，说明DAS具有双向调节血糖值的作用。三、临床典型病例举例：
病例1、孔××：女，58岁，1993年6月15日诊断为非胰岛素赖型糖尿病，曾先后服用过消渴丸、愈消散，优降糖、达美康等中西药，并注意饮食控制，但空腹血糖值一直在138～260之间波动，1995年10月1日改用单一的含石莲花原粉的DAS片，每片含原粉20mg，3片/日，饭前眼用，一周后空腹血糖值下降到180mg，尿糖(±)四周后测定空腹血糖值为121mg尿糖(-)。
病例2张××：男，48岁，1994年5月9日确诊为胰岛素依赖型糖尿病，空腹血糖值为310mg尿糖为(++)每日注射胰岛素20万单位，血糖值维持在110～150mg之间，偶而出现低血糖或高血糖，1995年10月2日起加服DAS片，3片/日每日减量注射15万单位胰岛素，一周后，空腹血糖值稳定在130mg，尿糖(±)。四周后测定空腹血糖值为115mg，尿糖(-)。从加服DAS片后未出现低血糖高血糖的病灶。
病例3.李××：男，76岁，1987年4月5日确诊为非依赖型糖尿病。空腹血糖值在260～300mg。后服用消渴丸，加上饮食控制治疗。空腹血糖维持在135～180mg之间，1995年10月3日改服用DAS片，2片/日，一周后测定空腹血糖值为140mg，尿糖为(±)。四周后测定空腹血糖值为120mg，尿糖(-)。
病例4.欧阳××：女，51岁，1988年2月3日确诊为II型糖尿病，空腹血糖值为280mg，尿糖(++)。曾先后服用优降糖，达美康等西药。空腹血糖值稳定在150～190mg之间，尿糖(±)但在服用优降糖后常出现头晕现象，即低血糖病灶。1995年10月2日改服用DAS片，3片/日(20mg/片)一周后空腹血糖值为145mg，尿糖(±)。四周后测定空腹血糖值为107mg，尿糖(-)，并在一个月的疗程中从未出现过低血糖现象。
病例5，司马××：女47岁，1991年8月2日确诊为II型糖尿病，空腹血糖值为265mg。尿糖(++)。先后服用过优降糖，降糖舒，达美康等中、西药，大体上空腹血糖值能稳定在120～160之间，尿糖(±)1995年10月2日改服用DAS片，一周后空腹血糖值为135mg，尿糖(±)。四周后测定空腹血糖值为105mg。尿糖(-)。
Claims (3)
1.要求保护石莲花提取物在制备临床治疗糖尿病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述用途，在制备提取物前采用超声波、酒精、速冻速解破坏细胞壁的方法，使提取物中的有效组分在临床治疗糖尿病的药物中起到应有的用途；
3.根据权利的要求1所述用途，其中石莲花提取物是按照以下方法获得的：水提取酒精沉淀再经SaphadexLH20柱或硅胶柱和化学萃取沉淀法。
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