KR20090127142A

KR20090127142A - 해조류 추출물로부터 푸코이단을 정제하는 방법

Info

Publication number: KR20090127142A
Application number: KR1020097019831A
Authority: KR
Inventors: 패트릭 엔. 샤크리; 제니퍼 바르-데이비드슨; 스리니바사 프라사드; 커크 존슨
Original assignee: 박스터 인터내쇼날 인코포레이티드; 박스터 헬쓰케어 에스.에이.
Priority date: 2007-02-23
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2009-12-09
Also published as: US20100144667A1; CN102911281B; ES2476250T3; HK1135120A1; ES2683948T3; EP3409694A1; CN101663326A; US9234051B2; CN102911281A; EP2532686B1; EP2121767A1; KR101486931B1; EP2532686A1; JP2010519383A; US20140328827A1; US8748595B2; WO2008103234A1; JP5679663B2; EP2121767B1; CN101663326B

Abstract

본 발명은 갈조류로부터의 추출물 중에서 푸코이단을 정제하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히,추출물 중에서 중금속, 박테리아 및 내독소 오염 물질 및 기타의 불순물을 제거하기 위하여 푸코이단을 정제하는 방법을 설명한다. 이 방법은 킬레이트제, 선택적 침전 및 여과법을 사용한다.

해조류, 푸코이단, 정제

Description

해조류 추출물로부터 푸코이단을 정제하는 방법 {PROCESS METHODS FOR FUCOIDAN PURIFICATION FROM SEAWEED EXTRACTS}

본 발명은 일반적으로 푸코이단 (본 명세서에서 AV513으로도 명명)의 생성에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 소망하는 생물학적 활성에 영향을 미치는 일이 없이 중금속 이온, 박테리아 및 내독소 오염 물질 및 기타의 불순물을 제거하기 위하여 푸코이단 추출물을 정제하는 방법에 관한 것이다.

정상적인 혈액 응고는 여러 가지 수준에서 조절되는 복합적인 생리학적 및 생화학적 과정이다. 혈액 응고 과정은 국소적인 혈관 수축과 함께 피브린 형성과 혈소판 응집을 유도하는 응혈 인자 캐스케이드의 활성화를 동반한다 (참조: Davie et al., Biochemistry 30:10363, 1991). 응혈 캐스케이드는 정상적인 응혈 개시의 제1 수단으로 여겨지는 "외인성" 경로와, 확장된 응혈 반응에 기여하는 "내인성" 경로로 이루어진다. 혈관 손상에 대한 정상적인 반응에는 외인성 경로의 활성화가 포함된다. 외인성 경로의 활성화는 조직 인자 (TF), 손상후 조직 상에 노출되었거나 발현된 제VII 인자에 대한 보조 인자와 혈액이 접촉되었을 때 개시된다. TF는 FVII와 복합체를 형성하여 FVIIa의 생산을 촉진한다. 이어서, FVIIa는 TF와 회합하여, FX를 세린 프로테아제 FXa로 전환하는데, 이는 프로트롬비나아제 복합체의 중 요한 성분이다. FXa/FVa/칼슘/인지질 복합체로 인하여 프로트롬빈에서 트롬빈으로 전환되면, 피브린의 형성과 혈소판의 활성화를 자극하는데, 이 모든 것은 정상의 혈액 응고에 있어 필수적이다. 정상적인 지혈은 내인성 경로 제IXa 인자 및 제VIIIa 인자에 의하여 더욱 향상되는데, 이는 FX를 FXa로 전환시킨다. 참조: Weitz, J. I., et al., Chest, 126 (3), September 2004 (Suppl), 265S.

황산화 다당류는 동물 및 인간에서 종종 양호한 내성 (tolerability) 특성을 지니는 생물학적 활성의 과다가 특징인 분자의 일 부류이다. 이들 다가 음이온 분자는 종종 식물 및 동물 조직으로부터 유래되며, 헤파린, 글리코사미노글리칸, 푸코이단, 카라기난, 펜토산 폴리술페이트 및 더마탄 또는 덱스트란 술페이트를 비롯한 폭넓은 범위의 하위 부류도 포함한다. 헤파린형 황산화 다당류는 항트롬빈 III 및/또는 헤파린 보조 인자 II 상호 작용을 통하여 매개되는 상이한 항응혈 작용을 보인다 (Toida TC, Linhardt, RJ., Trends in Glycoscience and Glycotechnology 2003;15:29-46).

이러한 황산화 다당류 중 하나인 구강 헤파린은 항응혈제로서 개발하기 위해 고려되어 온 반면에 (A Dunn, Idrugs, 3:817-824, 2000), 헤파린은 수술시 및 수술후 출혈, 골다공증, 탈모증, 헤파린 내성, 헤파린 재결합, 헤파린 유도성 혈소판 감소증 (HIT), 헤파린 유도성 혈소판 감소증 혈전증 증후군 (HITTS) 및 약물 중단 후 항응혈이 감소되기 까지 수일이 걸린다는 기타의 단점을 비롯한 심각한 부작용 때문에 부적절하다 (Iqbal O, et al., Fareed J, Expert Opin Emerg Drugs 6:111-135, 2001; Roberts, HR, Anesthesiology 100:722-730, 2004). 헤파린은 보통 비경 구로 투여되고, 약 1%만이 경구로 흡수된다 (Fitton, J.H., Glycoscience, The Nutrition Science Site, modified January 01, 2005).

헤파린과 대조적으로, 다른 황산화 다당류인 푸코이단, 즉 해조류로부터 분리된 황산화 다당류는 응혈을 조절 (즉, 촉진)하는 것으로 증명된 바 있다 (미국 특허 공개 제2005/0282771호). 특히, 시험관내에서 저농도로 투여되었을 때, 또는 생체내에서 저용량 피하로 투여되었을 때 푸코이단은, 외인성 경로 활성화를 통하여 혈우병에 있어서의 개선된 (가속화된) 응혈을 제공하는데 (Liu, T., et al., and Johnson, K.W., Thrombosis and Haemostasis, 95:68-76, 2006), 이는 응혈 촉진 활성을 증명하는 것이다. 고용량의 푸코이단은 헤파린과 유사한 항응혈 작용을 할 수 있다. 헤파린 또는 와파린 형의 기존의 항응혈제와 관련된 문제점에 비추어 보면, 기존에 사용가능하였던 항응혈 치료와 관련된 1가지 이상의 문제점을 극복할 수 있는 푸코이단 등의 다른 제제가 절실히 필요하다.

그러므로, 응혈 촉진제 또는 항응혈 치료용 용도를 위한 최적의 활성을 갖는 푸코이단 농축 추출물을 비용 효율적이고 효과적으로 생산해 내는 개선된 방법도 역시 요구된다.

발명의 요약

본 발명은 해조류 추출물로부터 푸코이단을 정제하기 위한 방법을 발견하였다는 것에 근거한다. 이 방법은 중금속, 박테리아 오염 물질 및 내독소 오염 물질과, 기타 불순물이 실질적으로 존재하지 않는 푸코이단을 고수율로 생산한다.

따라서, 본 발명은 이질 혼합물로부터 푸코이단을 농축하는 방법을 포함하는 데, 이 방법은

(a) 푸코이단 급원을 제공하는 단계와,

(b) 킬레이트제로 처리하여 상기 급원으로부터 중금속을 제거함으로써 제1 푸코이단 혼합물을 제조하는 단계와,

(c) 제1 푸코이단 혼합물에 존재하는 푸코이단을 선택적으로 침전시켜 오염물질을 제거하는 단계와,

(d) 수용액 중에 푸코이단 함유 침전물을 재현탁시켜 제2 푸코이단 혼합물을 제조하는 단계와,

(e) 상기 (c) 및 (d) 단계를 1회 이상 반복하는 단계와,

(f) 박테리아 및 내독소 오염 물질을 제거하기 위하여 푸코이단을 포함하는 수용액을 여과함으로써 정제된 푸코이단 추출물을 생성시키는 단계

를 포함한다.

한 가지 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 황을 5 내지 25 중량% 포함한다. 다른 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 해조류로부터 유래한다. 양호한 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 푸커스 (Fucus) 속이나, 라미나리아 (Laminaria) 속에서 유래된 것이다. 예시적인 푸코이단으로는 푸커스 베시쿨로시스 (Fucus vesiculosis)에서 유래된 것 또는 라미나리아 자포니카 (Laminaria japonica)에서 유래된 것, 또는 운다리아 피니티파다 (Undaria pinnitifada) 및 아스코필룸 노도숨 (Ascophyllum nodosum)을 포함하나 이에 한정되지는 않는 다른 급원에서 유래된 것들이 있다.

특정한 실시 상태에 있어서, 킬레이트제는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌글리콜-비스-(베타-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA) 및 2,3-디머캅토프로판엘-1-술폰산 (DMPS) 및 2,3-디머캅토숙신산 (DMSA)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 킬레이트제는 EDTA이다. 특정 실시 상태에 있어서, 킬레이트제는 고상 지지체에 고정되어 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 킬레이트제는 이미노디아세테이트 킬레이트 수지이다.

특정 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 에탄올을 사용하여 1회 이상 선택적으로 침전시키는데, 여기서 푸코이단 혼합물 중 에탄올의 농도는 약 40 내지 50% (v/v)이다. 특정 실시 상태에 있어서, pH는 약 pH 5.7 내지 약 6.0 사이로 유지된다. 양호한 실시 상태에 있어서, pH는 약 pH 5.95로 조정된다. 양호한 실시 상태에 있어서, NaCl은 약 20~24 g/리터의 농도로 푸코이단 혼합물에 첨가된다.

다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 의하여 생산된 푸코이단을 포함하는 조성물을 제공한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 황을 5 내지 25 중량% 포함한다. 다른 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 해조류에서 유래한다. 양호한 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 푸커스 속 또는 라미나리아 속에서 유래된 것이다. 예시적인 푸코이단으로는 푸커스 베시쿨로시스 (Fucus vesiculosis)에서 유래된 것 또는 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica)에서 유래된 것, 또는 코르다 필룸 (Chorda filum), 클라도시폰 오카무라누스 (Cladosiphon okamuranus), 운다리아 피나티피다 (Undaria pinnatifida), 레아테시 아 디포르미스 (Leathesia difformis), 아스코필룸 노도숨 (Ascophyllum nodosum), 에클로니아 쿠로메 (Ecklonia kurome), 필베티아 파스티지아타 (Pelvetia fastigiata), 사운데르셀라 심플렉스 (Saundersella simplex), 코르다리아 플라젤리포르미스 (Chordaria flagelliformis)에서 유래된 것, 또는 푸코이단을 함유하는 해양 식물 또는 동물의 다른 종에서 유래된 것이 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 생물학적으로 활성인데, 예컨대 응혈 촉진 활성이 있다. 특정한 실시 상태에 있어서, 이 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함할 수 있다.

다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 의하여 생산된 푸코이단을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 응혈 능력 향상이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 개체는 만성 또는 급성 출혈 질환, 응혈 인자 결손으로 인한 선천적인 응혈 질환, 및 후천성 응혈 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된 출혈성 질환을 앓고 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 응혈 능력 향상이 필요하게 되는 원인은 항응혈제의 이전 투여, 수술 또는 기타의 침입적 시술이다. 특정 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 투여량으로 투여된다.

본 발명의 이러한 실시 상태 및 기타의 실시 상태는 본 명세서에 관련하여 이 기술 분야의 숙련자들이 용이하게 발생시킬 수 있을 것이다.

도 1은 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 분석에서 푸코이단 (AV513) 활성에 대하여 가공이 미치는 효과를 보인다.

도 2는 희석액 프로트롬빈 타임 (dPT) 분석에서 푸코이단의 활성에 대하여 가공이 미치는 효과를 보인다.

도 3은 푸코이단의 활성에 대한 가공 효과의 트롬보엘라스토그래프 (TEG) 분석을 보인다.

본 발명의 실시에 있어서는, 별도로 지적하지 않는 한 통상의 단백질 화학, 생화학, 분자 생물학 및 약리학적 방법을 이 기술 분야 범위 내에서 사용할 것이다. 이러한 기술은 아래의 문헌에 자세히 설명되어 있다. 참조: 예컨대, Protein Purification Methods: A Practical Approach, (E.L.V. Harris and S. Angal, Eds., 1989); Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E.L.V. Harris and S. Angal, Eds., 1990); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Morrison and Boyd, Organic Chemistry (Allyn and Bacon, Inc., current addition); J. March, Advanced Organic Chemistry (McGraw Hill, current addition); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Ed., 20^th Ed.; and Goodman & Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics, J. Griffith Hardman, L. L. Limbird, A. Gilman, 10^th Ed.

전술하였거나, 아래에 서술되는 본 명세서에 기재된 모든 공고, 특허 및 특허 출원서는 본 명세서에 그 전체가 참조로서 통합된다.

다음의 아미노산 약자가 명세서 전체에 사용된다.

알라닌: Ala (A)	아르기닌: Arg (R)
아스파라긴: Asn (N)	아스파르트산: Asp (D)
시스테인: Cys (C)	글루타민: Gln (Q)
글루탐산: Glu (E)	글리신: Gly (G)
히스티딘: His (H)	이소루신: Ile (I)
루신: Leu (L)	리신: Lys (K)
메티오닌: Met (M)	페닐알라닌: Phe (F)
프롤린: Pro (P)	세린: Ser (S)
트레오닌: Thr (T)	트립토판: Trp (W)
티로신: Tyr (Y)	발린: Val (V)

1. 정의

본 발명을 설명하는 데 있어서, 다음의 용어를 사용하는데, 이들은 모두 아래에 서술하는 바와 같이 정의하기로 한다.

발명의 상세한 설명 및 청구의 범위에서 사용되는 단수의 표현은 별도로 명백하게 설명하지 않는 한, 복수를 의미도 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "푸코이단"이라는 용어는 2종 이상의 이러한 푸코이단의 혼합물을 포함하는 것이다.

본 명세서에 사용된 "약"이라는 용어는 해당 값의 약 ±10% 정도가 변화한다는 의미이다.

"생물학적으로 활성인"이라는 용어는 천연 발생 분자의 구조적 기능, 조절 기능 또는 생화학적 기능을 가지는 단백질을 말하는 것이다.

"푸코이단"이라는 용어는 다수의 해양 식물 및 동물에서 발견되는 황산화 알파-L-푸칸을 말하는 것이다. 푸코이단은 특히 갈조류의 세포벽에 풍부하며, 푸커스 속 [예를 들어, Fucus vesiculosis (푸커스 베시쿨로시스), Fucus evanescens (푸커스 에바네센스), Fucus distichus (푸커스 디스티쿠스), 및 Fucus serratus (푸커스 세라투스)] 또는 라미나리아 속 (Laminaria) [예를 들어, 라미나리아 자포니카 (Laminaria japonica), 라미나리아 렐리지오사 (Laminaria religiosa), 및 라미나리아 아비살리스 (Laminaria abyssalis)]에서 유래된 것들이 있다. 푸코이단으로는 코르다 필룸 (Chorda filum), 클라도시폰 오카무라누스 (Cladosiphon okamuranus), 운다리아 피나티피다 (Undaria pinnatifida), 레아테시아 디포르미스 (Leathesia difformis), 아스코필룸 노도숨 (Ascophyllum nodosum), 에클로니아 쿠로메 (Ecklonia kurome), 필베티아 파스티지아타 (Pelvetia fastigiata), 사운데르셀라 심플렉스 (Saundersella simplex), 코르다리아 플라젤리포르미스 (Chordaria flagelliformis)에서 유래된 것, 또는 푸코이단을 함유하는 해양 식물 또는 동물의 다른 종에서 유래된 것이 있다. 더욱이, 푸코이단이라는 용어는 이의 생물학적으로 활성인 단편, 유도체, 또는 유사체도 포함한다. 푸코이단에는 대형 푸코이단 분자의 분해 (예를 들면, 가수 분해)에 의하여 생성되는 푸코이단의 단편도 포함될 수 있다. 분해는 산, 염기, 열 또는 효소로 푸코이단을 처리하여 분해된 푸코이단을 생성하는 것을 비롯하여, 이 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 각종 수단에 의하여 달성될 수 있다. 푸코이단은 화학적으로 변경될 수 있고 변형될 수도 있는데, 이러한 기술로는 예컨대 황산화, 다중 황산화, 아세틸화, 에스테르화, 및 메틸화가 있고, 이러한 것에 한정되는 것은 아니다.

"실질적으로 정제된"이라는 용어는 해당 물질(예컨대, 푸코이단)이 이들이 존재하는 시료 중의 대부분의 %를 차지하도록 하는 해당 물질의 분리를 말하는 것이다. 보통은 시료 중에 실질적으로 정제된 성분이 50%, 좋기로는 80 내지 85%, 더욱 좋기로는 90 내지 95%로 포함된다.

A를 함유하는 조성물에서, 조성물 중의 총 A+B의 중량에 비하여 A가 적어도 약 80% 존재하는 경우에, B가 "실질적으로 존재하지 않는다". 좋기로는, A는 조성물의 A+B의 총중량에 비하여 약 85% 내지 95%를 차지한다.

본 명세서에서 "항응혈제"라는 용어는 응괴 형성을 예방하거나 늦출 수 있는 임의의 제제를 말한다.

"응혈 촉진제"라는 용어는 응괴 형성을 가속화시킬 수 있는 임의의 제제를 말한다.

본 명세서에서 사용된 "킬레이트제"라는 용어는 금속과 결합할 수 있는 화합물, 펩티드 또는 단백질을 말한다. 킬레이트제의 예로는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌글리콜-비스(베타-아미노에틸 에스테르) N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 2,3-디머캅토프로판엘-1-술폰산 (DMPS) 및 2,3-디머캅토숙신산 (DMSA) 등이 있다. 킬레이트제는 고상 지지체 상에 고정될 수 있다 (예컨대, 이미노디아세테이트 킬레이트 수지).

본 명세서에서 "~에서 유래된"이라는 용어는 어떠한 분자의 본래 급원을 밝히고자 한 것이지만, 분자가 만들어질 수 있는 방법을 예컨대, 화학 합성법이나 재조합 수단으로 한정하고자 하는 것은 아니다.

"유도체"라는 용어는 해당 분자, 또는 이의 유사체의 적당한 변형을 포함시키고자 하는 것이며, 해당 분자의 바람직한 생물학적 활성 (예컨대, 응혈 활성)이 유지되는 것이라면, 황산화, 아세틸화, 글리코실화, 인산화, 중합체 컨쥬게이션 (폴리에틸렌 글리콜 등을 사용), 또는 기타 외래 분자체의 첨가 등을 말하고자 하는 것이다. 푸코이단은 예컨대, 응혈 촉진 기능을 개선시키도록 화학적으로 변경될 수 있다. 이러한 변형에는 예컨대, 황산화, 다중 황산화, 에스테르화, 및 메틸화가 있으나, 이러한 것들로 한정되는 것은 아니다. 유사체 및 유도체를 제조하는 방법은 이 기술 분야에서 일반적으로 통용되고 있다.

"단편"이라는 용어는 전장 서열 및 구조체 전체의 일부만으로 이루어진 분자를 말하려는 것이다. 푸코이단의 단편은 대형 푸코이단 폴리사카라이드의 분해 (예컨대, 가수 분해)에 의하여 발생될 수 있다. 푸코이단의 활성 단편은 해당 단편이 응혈 촉진 활성 등과 같은 이의 생물학적 활성을 유지하는 한, 전장 다당류의 적어도 약 2 내지 20개 당 단위체, 좋기로는 전장 분자의 약 5 내지 10개 당 단위체, 또는 2개 당 단위체 내지 전장 분자 사이의 임의의 정수개 단위체를 포함하게 된다.

"약학적으로 허용가능한 부형제 또는 캐리어"라는 용어는 본 발명의 조성물중에 임의로 포함될 수 있고, 환자에게 심각한 독성 부작용 효과를 일으키지 않는 부형제를 말한다.

"약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 아미노산염과, 예컨대 염화염, 황산염, 인산염, 이인산염, 브롬화수소염 및 질산염 염 등의 무기산염으로 제조된 염, 또는, 예컨대 말레이트, 말리에이트, 퓨마레이트, 타르트레이트, 숙시네이트, 에틸숙시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄술포네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, 파라-톨루엔술포네이트, 팔모에이트, 살리실레이트 및 스테아레이트 등의 유기산으로 제조된 염을 비롯하여, 에스톨레이트, 글루셉테이트 및 락토비오네이트 염이 있다. 마찬가지로, 약학적으로 허용가능한 양이온을 함유하는 염에는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄 (치환 암모늄 포함)이 있으나, 이러한 것들로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 설명된 "활성 분자" 또는 "활성 제제"라는 용어에는 생체내에서 또는 시험관내에서 증명될 수 있는 약리학적 효과를 제공하며 종종 유리한 효과를 제공하는 임의의 제제, 약물, 화합물, 조성물이 포함된다. 이러한 것에는 식품, 식용 보충제, 영양제, 기능성 식품, 약물, 백신, 항체, 비타민, 그 외 유리한 제제 등이 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어는 환자에서 국소적이거나 전신적인 효과를 제공하는 약리학적으로 또는 약동학적으로 활성인 물질도 더 포함된다.

"임의적" 또는 "임의적으로"라는 용어는 어떤 상황이 발생하는 경우와, 발생하지 않는 경우를 포함하여 설명할 수 있도록, 그 용어 다음에 오는 상황이 일어나거나, 일어나지 않을 수도 있다는 의미이다.

"개체", 또는 "환자"라는 용어는 본 명세서에서 호환되며, 척추 동물, 좋기로는 포유류를 말하는 것이다. 포유류에는 쥣과, 설치류, 원숭이, 인간, 가축, 스포츠용 동물 및 애완 동물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

2. 본 발명의 수행 방식

본 발명을 자세히 설명하기 전에, 본 발명은 특정 포뮬레이션 또는 공정 매개 변수에 제한되지 않으며, 그에 따라 다양할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 본 발명의 특정한 실시 상태를 설명하기 위한 목적이지, 한정하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다.

본 명세서에 설명된 것과 유사한 또는 동등한 다수의 방법 및 물질을 본 발명의 실시에 사용할 수 있지만, 양호한 물질 및 방법을 아래에 설명한다.

A. 푸코이단의 생성

본 발명은 중금속 이온, 박테리아 및 내독소 오염 물질 및 기타 불순물이 실질적으로 존재하지 않는 푸코이단을 분리하도록 하는 정제 방법을 발견한 것에 기초한다. 이 방법은 중금속을 제거하기 위하여 킬레이트제로 처리하는 단계와, 불순물을 제거하기 위하여 1회 이상 선택적으로 침전시키는 단계와, 박테리아 및 내독소 오염 물질을 제거하기 위하여 여과시키는 단계를 비롯하여 일련의 분리 단계를 포함한다.

본 발명이 더 잘 이해될 수 있도록, 푸코이단 추출물을 분리하기 위한 방법에 관하여 아래에 더욱 자세히 설명한다.

푸코이단

푸코이단 추출물의 급원을 정제 단계에 사용할 수 있다. 푸코이단은 다수의 해양 식물 및 동물에서 발견되며, 특히 갈조류 (phaeophyceae)의 세포벽에 풍부하다. 예컨대, 푸커스 속 [예를 들어, Fucus vesiculosis (푸커스 베시쿨로시스), Fucus evanescens (푸커스 에바네센스), Fucus distichus (푸커스 디스티쿠스), 및 Fucus serratus (푸커스 세라투스)] 또는 라미나리아 속 (Laminaria) [예를 들어, 라미나리아 자포니카 (Laminaria japonica), 라미나리아 렐리지오사 (Laminaria religiosa) 및 라미나리아 아비살리스 (Laminaria abyssalis)]의 갈조류에서 유래된 푸코이단이 정제에 사용될 수 있다. 또는, 코르다 필룸 (Chorda filum), 클라도시폰 오카무라누스 (Cladosiphon okamuranus), 운다리아 피나티피다 (Undaria pinnatifida), 레아테시아 디포르미스 (Leathesia difformis), 아스코필룸 노도숨 (Ascophyllum nodosum), 에클로니아 쿠로메 (Ecklonia kurome), 필베티아 파스티지아타 (Pelvetia fastigiata), 사운데르셀라 심플렉스 (Saundersella simplex), 코르다리아 플라젤리포르미스 (Chordaria flagelliformis)에서 유래된 것, 또는 푸코이단을 함유하는 해양 식물 또는 동물의 다른 종에서 유래된 것을 포함하나 이에 한정되지는 않는 급원에서 유래된 푸코이단이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.

킬레이트제

금속 이온과 결합할 수 있는 킬레이트제는 푸코이단을 함유하는 이질 혼합물로부터 금속 이온 오염 물질을 제거하기 위하여 사용될 수 있다. 킬레이트제의 예에는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌글리콜-비스-(베타-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA) 및 2,3-디머캅토프로판엘-1-술폰산 (DMPS) 및 2,3-디머캅토숙신산 (DMSA) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또는, 고정된 킬레이트기를 포함하는 금속 킬레이트 수지는 푸코이단을 함유하는 시료로부터 금속 이온을 제거하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 킬레이트 리간드 이미노디아세테이트를 함유하는 시판되는 킬레이트 수지 (예컨대, CHELEX 100 (Bio-Rad), DOWEX A1 (Dow Chemical Co.)와 킬레이트 수지 (Hampton Research))를 사용할 수 있다. 킬레이트 수지는 뱃치 중의 푸코이단 시료 중에 첨가할 수 있고, 원심분리에 의하여 제거할 수 있다. 또는, 금속 이온은 이 기술 분야의 기지의 방법에 의하여 킬레이트 수지를 함유하는 컬럼에 크로마토그래피함으로써 푸코이단 시료로부터 제거할 수 있다.

푸코이단의 선택적 침전

푸코이단 추출물은 에탄올로 푸코이단을 선택적으로 침전시킴으로써 더 정제한다. 선택적 침전은 푸코이단 혼합물로부터 일부 킬레이트제와 기타의 불순물을 제거한다. 특정 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 푸코이단 혼합물 중의 약 40 내지 50% (v/v)의 농도로 에탄을 사용하여 1회 이상 선택적으로 침전시킨다. 에탄올을 푸코이단 혼합물에 첨가하기 전에, 푸코이단 혼합물의 pH는 약 5.7 내지 약 6.0 사이로 조정되며, NaCl을 푸코이단 혼합물에 약 20~24 g/리터의 농도로 첨가한다. 푸코이단을 침전시킨 후, 상징액을 침전된 푸코이단으로부터 제거하고, 침전된 푸코이단을 수용액 중에 재현탁시킨다. 이러한 정제를 수회 반복하여 푸코이단의 순도를 높일 수 있다.

여과

푸코이단을 양으로 하전된 0.2 ㎛ 필터로 여과하여, 박테리아 및 내독소 오염 물질을 제거할 수 있다. 여과물은 동결 건조법 또는 분무 건조법을 사용하여 건조시킬 수 있다. 보통 푸코이단의 수율은 50% 이상이고, 더욱 좋기로는 약 60 내지 약 80% 이상이다.

정제된 푸코이단의 분석

푸코이단 시료는 분자량, 푸코스 및 자일로스를 비롯한 탄수화물 함량, 중금속 오염 물질, 황산염 및 물 등의, 순도 및 각종 성질에 대하여 분석할 수 있다. 다수의 분석 기술을 사용하여 푸코이단 시료를 분석할 수 있는데, 이러한 것들로는 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 성분 조성 분석, 레이저 광산란 (LLS), 유도 커플 플라스마 질량 분석기 (ICP-MS), 및 GC-MS가 있다.

B. 약학 조성물

정제된 푸코이단을 임의로는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물로 제형할 수 있다. 예시적인 부형제에는 탄수화물, 무기 염, 항미생물제, 항산화제, 표면 활성제, 완충제, 산, 염기 및 이들의 배합물이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 주사용 조성물에 적합한 부형제로는 물, 알콜, 폴리올, 글리세린, 식물유, 포스포리피드 및 계면활성제가 있다. 당과, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당 등의 당 유도체, 및/또는 당 중합체 등의 탄수화물이 부형제로서 존재할 수 있다. 구체적인 탄수화물 부형제로는, 예컨대 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등의 단당류와, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀룰로비오스 등의 이당류와, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 녹말 등의 다당류와, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨 (글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등의 알디톨이 있다. 부형제로는 구연산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 제1 인산나트륨, 제2 인산나트륨 및 이러한 것들의 혼합물이 있으나, 이러한 것들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 미생물의 성장을 예방하거나 방해하기 위한 항미생물제를 포함할 수도 있다. 본 발명에 적합한 항미생물제의 비제한적인 예로는 염화벤잘코늄, 염화벤즈토늄, 벤질 알콜, 염화세틸피리듐, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 질산페닐수은, 티메로졸 및 이들의 혼합물이 있다.

항산화제도 조성물 등에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 방지함으로써, 조제물 중의 푸코이단이나 기타 성분의 훼손을 방지하는 데 사용된다. 본 발명에 사용하기에 적당한 항산화제로는 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 산성아황산나트륨, 소듐 포름알데하이드 술폭실레이트, 소듐 메타비술피트 및 이의 혼합물이 있다.

계면활성제도 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제로는 "Tween 20" 및 "Tween 80" 등의 폴리소르베이트와, F68 및 F88 (BASF, Mount Olive, New Jersey) 등의 플루로닉과, 소르비탄 에스테르와, 레시틴 등의 인지질, 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (좋기로는 리포좀 형태가 아닌 것), 지방산 및 지방산 에스테르 등의 지질과, 콜레스테롤 등의 스테로이드와, EDTA 등의 킬레이트제 및 아연과 기타 적당한 양이온이 있다.

산 또는 염기도 조성물 중에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비제한적인 예로는, 염산, 아세트산, 인산, 구연산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 포스포르산, 황산, 푸마르산, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 산이 있다. 적당한 염기의 예로는, 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 구연산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸메르산칼륨, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 염기가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

조성물 중의 푸코이단 (예컨대, 약물 전달 시스템 중에 함유된 경우)의 양은 여러 가지 인자에 따라 다양해지는데, 조성물이 단위 투여량 형태이거나 용기 중에 있는 경우 (예컨대, 바이얼)에는, 치료적 유효량으로 있는 것이 좋다. 치료적 유효량은 의료적으로 바람직한 종점 (endpoint)을 발생시키는 양을 결정하기 위하여 조성물의 양을 증가시키면서 반복 투여함으로써 실험적으로 결정할 수 있다.

조성물 중의 각 부형제의 양은 부형제의 성질과 기능, 그리고 조성물의 구체적인 필요 사항에 따라서 다양해질 것이다. 보통 어떠한 각 부형제의 최적량은 통상적인 실험으로 결정되는데, 즉, 부형제의 양을 달리하여 (저용량에서 고용량까지) 함유하는 조성물을 조제하고, 안정성 및 기타의 매개 변수를 검사한 다음에, 부작용 없이 최적의 성능이 얻어지는 범위를 결정하는 것에 의하여 이루어진다. 그러나, 일반적으로 부형제는 조성물 중에 부형제 약 1 내지 약 99 중량%, 좋기로는 약 5 내지 약 98 중량%, 더욱 좋기로는 약 15 내지 약 95 중량%로 이루어지며, 30 중량% 이하의 농도가 가장 좋다. 다른 부형제와 함께 전술한 부형제들은 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), and Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.]에도 상세히 설명되어 있다.

조성물에는 모든 종류의 포뮬레이션 및 특히 주사에 적합한 것들, 예컨대 사용 직전에 용매로 재구성시킬 수 있는 분말이나 동결 건조물을 비롯하여 주사액 또는 주사용 현탁액 준비물, 사용 직전에 비히클과 혼합하기 위한 건조형 비용해성 조성물, 및 투여전에 희석하기 위한 에멀젼 및 액체 농축물이 포함된다. 주사 전에 고체 조성물을 재구성하기 위한 적당한 희석제의 예로는 주사용 정균수, 물 중의 5% 덱스트로스, 인산 완충 식염수, 링거액, 염수, 멸균수, 탈이온수 및 이들의 혼합물이 있다. 액체 약학 조성물에 관하여, 용액 및 현탁액이 좋다. 다른 양호한 조성물에는 구강, 눈, 또는 국소적 전달을 위한 것들이 있다.

본 명세서에서의 약학 조제물은 전달 및 사용 방식에 따라서 시린지, 임플란트 장치 등에 담길 수 있다. 좋기로는, 본 명세서에 기재된 푸코이단 조성물은 단위 투여량 형태인데, 이는 곧 단일 투여를 위해 적합한 본 발명의 컨쥬게이트 또는 조성물이 미리 측정되어 있는 형태 또는 미리 포장되어 있는 형태 중에 들어있는 것을 말한다.

본 발명에서의 푸코이단 조성물은 임의로는 예컨대 지혈제, 혈액 인자 또는 개체의 어떠한 증상 또는 질병을 치료하기 위하여 사용되는 의약 등의 1종 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 특히 양호한 것은, 제XI 인자, 제XII 인자, 프리칼리크레인 (prekallikrein), 고분자량 키니노겐 (high molecular weight kininogen; HMWK), 제V 인자, 제VII 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자, 제XIII 인자, 제II 인자, 제VIIa 인자, 본 빌러브란트 인자 (von Willebrands factor) 등의 1종 이상의 혈액 인자를 포함하는 혼합된 조제물이다. 푸코이단 조성물은, 제Xa 인자, 제IXa 인자, 제XIa 인자, 제XIIa 인자, 및 VIIIa, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 내인성 응혈 경로의 활성자, 또는 조직 인자, 제VIIa 인자, 제Va 인자, 및 제Xa 인자를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 외인성 응혈 경로의 활성자 등의 기타 응혈 촉진제를 포함할 수도 있다. 푸코이단 조성물은 생물학적 활성 (즉, 응혈을 촉진하는 활성)을 보유하는 천연 발생, 합성 또는 재조합 응혈 인자 또는 이의 단편, 변이체 또는 공유적으로 변형된 유도체를 포함할 수 있다. 또는, 이러한 제제는 푸코이단으로부터 별개의 조성물 중에 함유될 수 있고, 본 발명의 푸코이단 조성물을 투여하는 것과 동시에, 전에, 또는 그 후에 투여할 수 있다.

C. 투여

푸코이단으로 치료하는 것의 치료적으로 유효한 사이클 1회 이상을 개체에게 투여하게 된다. "치료의 치료적으로 유효한 사이클"이라는 용어는, 투여되었을 때 출혈 질환에 대한 개체의 치료에 관하여 양성 치료 반응을 불러일으킬 수 있는 치료의 사이클을 말하려고 하는 것이다. 특히 흥미로운 것은, 지혈 작용을 개선시키는 푸코이단을 사용하는 치료의 사이클이다. "양성 치료 반응"이란, 본 발명에 따라 치료를 받은 개체가, 단축된 혈액 응고 시간 및 출혈 감소 및/또는 응혈 인자 대체 치료를 위한 요구 감소를 비롯하여, 출혈 질환의 징후 1가지 이상이 개선된 것을 보임을 의미하고자 하는 것이다.

푸코이단을 사용하는 치료의 치료적으로 유효한 사이클의 다른 예는, 혈전 형성 촉진 증상, 예컨대 심(深)정맥 혈전증, 동맥 혈전 및 기타의 심혈관계 및 암 질환을 가진 개체에게 항응혈제로서 예방적 치료 및/또는 유지 치료 형태로 투여하는 것이다.

특정 실시 상태에 있어서, 푸코이단 및/또는 지혈제, 혈액 인자 또는 기타의 의약 등의 1종 이상의 기타 치료제를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 투여량 수회분을 투여하게 된다. 본 발명의 조성물은 반드시 그러한 것은 아니지만 보통은 경구로, 주사 (피하, 정맥, 또는 근육)로, 주입으로, 또는 국소적 방법을 통하여 투여된다. 약학 조제물은 투여 직전에는 액상 용액 형태이거나 현탁액 형태일 수 있으나, 시럽, 크림, 연고, 태블릿, 캡슐, 파우더, 겔, 매트릭스, 좌약 등의 다른 형태일 수도 있다. 폐, 직장, 경피, 근육, 경막, 심근내, 동맥내, 뇌실내, 안내, 복강내 등의 다른 투여 방식도 가능하다. 푸코이단 및 기타 제제를 포함하는 약학 조성물은 이 기술 분야에 공지되어 있는 의료적으로 허용가능한 방법에 따른 것과 동일한 또는 상이한 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다.

특정 실시 상태에 있어서, 본 발명의 조성물은 푸코이단의 국소 전달을 위해 사용되는데, 예컨대, 병변, 상처 또는 수술의 결과로서 출혈이 일어나는 것을 치료하기 위하여 사용된다. 본 발명에 따른 조제물은 또한 국소적 치료를 위해서도 적합하다. 예컨대, 푸코이단은 고체, 액체 또는 연고 형태로 출혈부에 주사함으로써 또는 국소적으로, 좋기로는 접착제 테입 또는 상처 덮개를 통하여 투여할 수 있다. 좌약, 캡슐, 특히 위산에 내성인 캡슐, 드롭제 또는 스프레이제를 사용하는 것도 가능하다. 구체적인 조제물 및 적당한 투여 방법은 출혈부에 맞추어 선택된다.

또 한가지의 실시 상태에 있어서, 푸코이단 및/또는 기타 제제를 포함하는 약학 조성물은 예방학적으로, 예컨대 수술 전에 투여된다. 이러한 예방적 용도는 이미 혈액 응고 질환을 앓고 있는 환자의 구체적인 상태에 따른 것이다.

본 발명의 또 한가지의 실시 상태에 있어서, 푸코이단 및/또는 기타 제제를 포함하는 약학 조성물은 지연 방출형 제형물 또는 지연 방출형 장치를 사용하여 투여되는 제형물 형태이다. 이러한 장치는 이 기술 분야에 알려져 있으며, 예컨대, 경피용 패치, 다양한 투여량을 연속적인 시간에 걸쳐 일정한 방식으로 약물을 전달하여 비-지연 방출형 약학 조성물로 지연 방출형 효과를 달성하게 하는 미니어쳐 이식형 펌프가 있다.

본 발명은 본 명세서에 설명된 푸코이단을 포함하는 컨쥬게이트 또는 조성물에 함유되어 있는 푸코이단으로 치료하는 것에 대하여 반응을 보이는, 증상을 앓고 있는 환자에게 본 명세서에 설명된 푸코이단을 포함하는 컨쥬게이트를 투여하는 방법을 제공한다. 이 방법은 본 명세서에 설명된 방식으로, 좋기로는 약학 조성물의 일부로서 제공된 컨쥬게이트 또는 약물 전달 시스템의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 투여 방법은 푸코이단으로 치료하는 것에 대하여 반응성인 임의의 증상을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 명세서에 기재된 조성물은 혈우병 A, 혈우병 B, 빌러브란트씨병 (von Willebrand disease), 원인 불명의 혈소판 감소증과, 제XI 인자, 제XII 인자, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐 (HMWK) 등의 1종 이상의 접촉 인자의 결핍과, 제V 인자, 제VII 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자, 제XIII 인자, 제II 인자 (저트롬빈빈혈증), 빌러브란트 인자 등의 임상학적으로 유의한 출혈과 관련된 1종 이상의 인자의 결핍과, 비타민 K 결핍과, 무섬유소혈증, 저섬유소혈증, 이상섬유소원혈증을 비롯한 피브리노겐 관련 질환과, 알파₂-안티플라스민 결핍과, 간 질환, 신장 질환, 혈소판 감소증, 혈소판 이상, 혈종, 내출혈, 관절내출혈 (hemarthroses), 수술, 외상, 저온증, 월경, 및 임신 등에 의하여 유발된 과다 출혈을 비롯한 출혈성 질환의 치료에 있어 효과적이다.

이 기술 분야의 숙련자는 특정 푸코이단이 효과적으로 치료할 수 있는 증상을 잘 알 것이다. 투여되는 실제 투여량은 개체의 연령, 체중 및 일반적인 건강 상태를 비롯하여, 치료되어야 할 증상의 심각도, 건강 주치의의 소견 및 투여되는 컨쥬게이트 등에 따라 달라지게 된다. 치료적으로 유효한 양은 이 기술 분야의 숙련자가 결정할 수 있으며, 각 특정한 경우에 따라서 필요한 양으로 조정하게 된다.

일반적으로 치료적으로 유효한 양은 1일에 푸코이단 약 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 더욱 좋기로는 1일에 약 0.01 mg/kg 내지 20 mg/kg, 더욱 더 좋기로는 1일에 0.02 mg/kg 내지 2 mg/kg이다. 좋기로는, 이러한 투여량은 1일에 4회분으로 (QID) 0.01-50 mg/kg, 0.01-10 mg/kg QID, 0.01-2 mg/kg QID, 0.01-0.2 mg/kg QID이고, 1일에 3회분으로 (TID) 0.01-50 mg/kg, 0.01-10 mg/kg TID, 0.01-2 mg/kg TID, 0.01-0.2 mg/kg TID, 1일에 2회분으로 (BID) 0.01-100 mg/kg (BID), 0.01-10 mg/kg BID, 0.01-2 mg/kg BID, 또는 0.01-0.2 mg/kg BID이며, 국소적으로 1일에 1회 또는 수회 도포하기 위해서는 0.1 내지 10%이다. 투여되는 화합물의 양은 구체적인 푸코이단의 효능에 따라 달라지며, 소망하는 강도 및 응혈 촉진 효과, 그리고 투여 방식에 따라 달라지게 된다.

정제된 푸코이단 추출물 (이는, 다시 한번 말하지만, 좋기로는 약학 조성물의 일부로서 제공된다)은 단독으로 투여될 수 있거나, 지혈제, 혈액 인자 또는 임상의 소견, 환자의 요구 등에 따라 달라지는 각종 투여 스케쥴에 따라서, 구체적인 증상 또는 질병을 치료하기 위하여 사용되는 기타의 의약 등의 치료제 또는 다른 푸코이단 추출물과 함께 배합되어 투여된다. 구체적인 투약 스케쥴은 이 기술 분야의 숙련자가 잘 알고 있고, 또는 통상의 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 예시적인 투여 스케쥴에는 1일에 5회 투여, 1일에 4회 투여, 1일에 3회 투여, 1일에 2회 투여, 1일에 1회 투여, 1주에 3회 투여, 1주에 2회 투여, 1주에 1회 투여, 1개월에 2회 투여, 1개월에 1회 투여, 및 이들의 혼합 형태가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 양호한 조성물은 1일에 1회 이하로 투여될 것이 요구된다.

푸코이단은 기타 제제를 투여하기 전에, 기타 제제와 동시에, 또는 기타 제제를 투여한 후에 투여될 수 있다. 다른 제제와 동시에 제공되는 경우에, 푸코이단은 동일한 또는 별개의 조성물 중에 제공된다. 그러므로, 푸코이단 및 기타의 제제가 동시 치료 방식으로 개체에게 투여되는 것도 가능하다. "동시 투여"란 물질의 혼합물의 치료 효과가 치료 받은 개체에서 유발되도록 하는 방식으로 개체에게 투여하는 것을 말한다. 예컨대, 동시 치료는 푸코이단을 포함하는 약학 조성물의 투여량 및 구체적인 투여 계획에 따라 치료적 유효량도 함께 포함하는 지혈제 또는 응혈제 (예컨대, FVIII 또는 FIX) 등의 1종 이상의 다른 치료제를 포함하는 약학 조성물의 투여량을 투여함으로써 달성할 수 있다. 마찬가지로, 푸코이단 및 1종 이상의 치료제는 1회 이상의 치료량으로 투여할 수 있다. 별개의 약학 조성물의 투여는, 이들 성분의 혼합물의 치료 효과가 치료를 받는 개체에서 유발되는 한, 동시에 또는 시간을 달리하여 (즉, 순차적으로 동일한 날에 순서대로, 또는 다른 날에 순차적으로 순서대로) 수행할 수 있다.

F. 용례

일단 정제되면, 푸코이단 추출물은 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 관점에서, 푸코이단은 예컨대, 혈액 응고를 촉진하고, 출혈을 감소시키며, 항염증제, 항암제, 항바이러스제 또는 조혈세포 이동제 (mobilizing agent)로서 항응혈제로 치료를 받는 개체의 치료 효과의 반대 작용을 촉진하기 위한 응혈 촉진제로서 사용될 수도 있다. 혈액 응고를 촉진하고 출혈을 감소시키는 것을 촉진하기 위한 정제된 푸코이단 추출물의 능력은 시험관내 응혈 분석법 (예컨대, dPT 및 aPTT 분석법)과, 또한 생체내 출혈 모델 (예컨대, 혈우병 마우스 또는 개에서 꼬리를 절단 또는 피하 출혈 시간 측정)을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 참조: 예컨대, PDR Staff. Physicians' Desk Reference. 2004, Anderson et al. (1976) Thromb. Res. 9:575-580; Nordfang et al. (1991) Thromb Haemost. 66:464-467; Welsch et al. (1991) Thrombosis Research 64:213-222; Broze et al. (2001) Thromb Haemost 85:747-748; Scallan et al. (2003) Blood. 102:2031-2037; Pijnappels et al. (1986) Thromb. Haemost. 55:70-73; and Giles et al.(1982) Blood 60:727-730 (상기 참고 문헌은 본 명세서에 참조로써 통합된다).

한 가지 관점에 있어서, 정제된 푸코이단 추출물은 출혈성 질환을 치료하는 데 있어서, 특히 응혈 인자의 결핍과 관련된 질환을 치료하는 데 있어서 지혈을 촉진하기 위하여, 또는 개체에서 항응혈제의 효과를 되돌리기 위하여 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 푸코이단은 선천성 응혈 질환, 후천성 응혈 질환 및 외상에 의하여 유발된 출혈을 비롯한 출혈성 질환을 치료하기 위하여 개체에게 투여될 수 있다. 푸코이단으로 치료될 수 있는 출혈성 질환의 예에는 혈우병 A, 혈우병 B, 빌러브란트씨병 (von Willebrand disease), 원인 불명의 혈소판 감소증과, 제XI 인자, 제XII 인자, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐 (HMWK) 등의 1종 이상의 접촉 인자의 결핍과, 제V 인자, 제VII 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자, 제XIII 인자, 제II 인자 (저트롬빈빈혈증), 빌러브란트 인자 등의 임상학적으로 유의한 출혈과 관련된 1종 이상의 인자의 결핍과, 비타민 K 결핍과, 무섬유소혈증, 저섬유소혈증, 이상섬유소원혈증을 비롯한 피브리노겐 관련 질환과, 알파₂-안티플라스민 결핍과, 간 질환, 신장 질환, 혈소판 감소증, 혈소판 이상, 혈종, 내출혈, 관절내출혈 (hemarthroses), 수술, 외상, 저온증, 월경, 및 임신 등에 의하여 유발된 과다 출혈을 비롯한 출혈성 질환이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정한 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 혈우병 A, 혈우병 B, 빌러브란트씨병을 비롯한 선천성 응혈 질환을 치료하는 데 사용된다. 다른 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 제VIII 인자, 빌러브란트 인자, 제IX 인자, 제V 인자, 제XI 인자, 제XII 인자 및 제XIII 인자 결핍, 특히 응혈 인자의 억제제 또는 응혈 인자에 대한 자가 면역에 의하여 유발된 질환, 또는 응혈 인자 합성의 감소를 유발시키는 질병 또는 증상에 의하여 유발된 지혈성 질환을 비롯한 후천성 응혈 질환을 치료하는 데 사용된다.

환자의 필요 조건은 치료되는 구체적인 출혈 질환에 따라 좌우된다. 예컨대, 푸코이단은 연장된 기간 동안 수회 투여량으로 만성 증상 (예컨대, 선천성 또는 후천성 응혈 인자 결핍)을 치료하기 위하여 투여될 수 있다. 또는, 푸코이단은 비교적 단기간, 예컨대 1 내지 2주 사이에 1회 또는 수회 투여량으로 급성 증상 (예컨대, 수술 또는 외상으로 인한 출혈, 또는 응고 대체 치료 (coagulation replacement therapy)를 받은 개체에서 인자 억제제/자가 면역의 경우 등)을 치료하기 위하여 투여될 수 있다. 더욱이, 푸코이단 치료는 다른 지혈제, 혈액 인자 및 의약과 함께 사용될 수도 있다. 예컨대, 개체에는 제XI 인자, 제XII 인자, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐 (HMWK), 제V 인자, 제VII 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자, 제XIII 인자, 제II 인자, 제VIIa 인자, 빌러브란트 인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자의 치료적으로 유효한 양을 투여할 수 있다. 치료는 제Xa 인자, 제IXa 인자, 제XIa 인자, 제XIIa 인자, 제VIIIa 인자, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐을 비롯한 내인성 응혈 경로의 활성자, 또는 조직 인자, 제VIIa 인자, 제Va 인자, 제Xa 인자를 비롯한 외인성 응혈 경로의 활성자 등의 응혈 촉진제를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 더욱이, 혈액 제품의 수혈은 과다 출혈을 보이는 개체에서 혈액 손실을 보상하게 위하여 필요할 수 있고 상처의 경우에는 수술로 회복하는 것이 출혈을 중단시키기에 적합할 수 있다.

본 발명은 개체에서 항응혈제의 효과를 되돌리기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 정제된 푸코이단을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 개체는 헤파린과, 와파린 또는 디쿠마롤 등의 쿠마린 유도체와, TFPI, AT III, 루퍼스 항응혈제, 네마토드 항응혈제 펩티드 (NAPc2), 활성 부위가 차단된 제VIIa 인자 (제VIIai 인자), 제IXa 인자 억제제와, 폰다파리눅스 (fondaparinux), 이드라파리눅스 (idraparinux), DX-9065a, 및 라자사반(razaxaban) (DPC906)를 비롯한 제Xa 인자 억제제, 활성화된 단백질 C (APC) 및 가용성 트롬보모둘린을 비롯한 제Va 인자 및 제VIIIa 인자의 억제제와, 히루딘, 비발리루딘, 아르가트로반 및 지멜라가트란을 비롯한 트롬빈 억제제 등의 항응혈제로 치료받을 수 있다. 특정한 실시 상태에 있어서, 개체에서의 항응혈제는 제V 인자, 제VII 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자, 제XIII 인자, 제II 인자, 제XI 인자, 제XII 인자, 빌러브란트 인자, 프리칼리크레인, 또는 고분자량 키니노겐 (HMWK)에 결합하는 항체를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 응혈 인자에 결합하는 항체일 수 있다.

특정한 실시 상태에 있어서, 정제된 푸코이단 추출물은 단독으로 투여되거나 또는 개체에서 항응혈제의 효과를 되돌리기 위한 1종 이상의 기타 치료제와 배합되고 그리고/또는 1종 이상의 상이한 푸코이단과 함께 동시 투여된다. 예를 들어, 이 개체는 푸코이단과 제XI 인자, 제XII 인자, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐 (HMWK), 제V 인자, 제VII 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자, 제XIII 인자, 제II 인자, 제VIIa 인자, 빌러브란트 인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여받을 수 있다. 이 치료는 제Xa 인자, 제IXa 인자, 제XIa 인자, 제XIIa 인자, 및 VIIIa, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐을 비롯한 내인성 응혈 경로의 활성자, 또는 조직 인자, 제VIIa 인자, 제Va 인자, 제Xa 인자를 비롯한 외인성 응혈 경로의 활성자 등의 응혈 촉진제를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.

또 한 가지의 관점에 있어서, 본 발명은 외과적 시술 또는 침입적 시술을 받은 개체에서의 응혈을 개선하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 정제된 푸코이단을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 푸코이단은 외과적 시술 또는 침입적 시술을 받은 개체에게 단독으로 투여되거나 또는 1종 이상의 상이한 푸코이단 및/또는 1종 이상의 기타 치료제와 함께 배합하여 동시 투여할 수 있다. 예컨대, 이 개체는 제XI 인자, 제XII 인자, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐 (HMWK), 제V 인자, 제VII 인자, 제VIII 인자, 제IX 인자, 제X 인자, 제XIII 인자, 제II 인자, 제VIIa 인자, 빌러브란트 인자로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 인자의 치료적 유효량을 투여받을 수 있다. 치료는 Xa 인자, 제IXa 인자, 제XIa 인자, 제XIIa 인자, 및 VIIIa, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐을 비롯한 내인성 응혈 경로의 활성자, 또는 조직 인자, 제VIIa 인자, 제Va 인자, 제Xa 인자를 비롯한 외인성 응혈 경로의 활성자 등의 응혈 촉진제를 더 포함할 수 있다.

또 한 가지의 관점에 있어서, 본 발명은 TFPI 활성을 억제하기 위한 푸코이단의 충분량과 TFPI를 포함하는 조성물을 혼합하는 것을 포함하는, TFPI 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시 상태에 있어서, TFPI 활성은 정제된 푸코이단 추출물을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법에 의하여 개체에서 억제된다. 특정 실시 상태에 있어서, 본 발명은 생물학적 시료 중에서 TFPI 활성을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 TFPI 활성을 억제하기 위하여 정제된 푸코이단 추출물의 충분량과 생물학적 시료 (예컨대, 혈액 또는 혈장)를 혼합하는 것을 포함한다.

아래에 본 발명을 수행하기 위한 특정 실시 상태의 예를 제공한다. 이 실시예는 설명할 목적으로만 제공하는 것이지, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하려는 것이 아니다.

사용된 숫자 (에컨대, 양, 온도 등)의 정확성을 보장하기 위하여 노력하였지만, 일부 실험적 오류와 변화 등은 당연히 있을 수 있다.

실시예 1

푸코이단 정제 시험 1

1일째

푸코이단 추출물 (50 g, NPNutra lot #050316-FU-85)을 고순도 물 (NERL, lot #0808036) 1000 ml에 용해시키고, 수조 중에서 40~45℃에서 45분간 교반하였다. 디소듐 EDTA 2.5 g을 교반하며 첨가하였을 때 (2.5% wEDTA/출발 푸코이단 추출 물 w, EDTA lot#006139, Fisher로부터 입수), 이 용액의 pH는 5.82였고, 온도는 41℃였다. EDTA가 용해됨에 따라서 용액의 pH는 4.70으로 감소되었지만, 그 다음에 0.1 M NaOH를 첨가하여 6.02까지 상향 조정하였다. 이어서 이 반응물을 혼합하고, pH 6.0 (±0.2), 40~45℃에서 1시간 동안 유지하였다. 1시간 후에, 염화나트륨 24 g (2% w/v, Fisher Lot #010166)을 가하고, 워터 쟈켓을 제거하였다. 이어서, 0.1 M NaOH를 사용하여 pH를 5.7에서 5.95로 조정하였다. 약 1 부피의 무수 에탄올 (1.1 리터, Sigma-Aldrich Lot#06563JE)을 혼합하고, 주위 온도에서 푸코이단이 침전되도록 철야 방치하였다.

2일째

다당류 침전물로부터 흡입하여 상징액을 제거하였다. 침전물을 실온의 고순도 물 1리터 (1000 ml)를 첨가하고, 격렬하게 30~60분간 교반함으로써 재용해시켰다. 일단 용액 중에 침전된 경우라면, 염화나트륨 20 g (2% w/v)을 용액의 연속적 혼합에 의하여 용해시켰다. 1일째로부터의 재용해되고, 다시 한번 염수를 가한 침전물과 무수 에탄올 800 ml를 혼합함으로써 다당류를 다시 침전시켰다. 다시 한번, 다당류가 침전되도록 철야 방치하였다.

3일째

2일째 침전물로부터 상징액을 다시 제거하고, 재용해 공정 (1,000 mL NERL 물), 다시 염수를 가하는 공정 (NaCl 20 g), 및 다시 침전시키는 공정 (무수 ETOH 800 ml) 전체를 3일째에 반복하였다. 다시 한번, 푸코이단이 침전되도록 철야 방치하였다.

4일째

4일 째에, 상징액을 다당류 침전물로부터 흡입함으로써 제거하였다. 이어서 침전물을 22℃에서 1~1.5시간 고순도 물 900 ml과 함께 혼합함으로써 용해시켰다. pH는 6.85로 측정되었는데, 이 pH를 6N HCl을 첨가함으로써 pH 5.8로 조정하였다. 이 용액 전체를 필터 캡슐 [0.2 ㎛ Kleenpak N66 Posidyne filter capsule (Pall, Lot # IJ7287)]로 여과시켰다. 이어서, 플라스크 및 필터를 고순도 물 약 100 ml로 세정하고, 필터 [Posidyne filter]로 여과한 뒤, 다당류 용액에 첨가하였다. 여과된 용액 전체 (~1.05 리터)를 싱글 냉동 건조기 트레이에 넣고, -40℃로 3시간 냉동시켰다. 이어서, 48시간 동안 아래 프로그램에 따라 냉동 건조를 수행하였다: 처음 4시간 저장 온도 10℃, 다음 20시간 저장 온도 20℃, 마지막 24시간 저장 온도 50℃. 이어서 건조된 생성물을 건조기 및 트레이에서 꺼내어 미리 용기의 중량을 재어 둔 플라스틱 용기에 넣었다.

생성물의 수득량은 26.4 g (52.8 중량% 수율)이었다. 생성물을 Lot/trial 1로 표시하고, 이를 보관을 위하여 이중 비닐 백에 넣었다.

실시예 2

푸코이단 정제 시험 2

1일째

푸코이단 추출물 (50 g, NPNutra lot #050316-FU-85)을 고순도 물 (NERL, lot #0808036) 1000 ml에 용해시키고, 수조 중에서 40~45℃에서 30~45분간 교반하였다. 디소듐 EDTA 1.25 g을 교반하며 첨가하였을 때 (1.25% wEDTA/출발 푸코이단 추출물 w, EDTA lot#006139 from Fisher), 이 용액의 pH는 5.83이었고, 온도는 42.5℃였다. EDTA가 용해됨에 따라서 용액의 pH는 4.90으로 감소되었지만, 그 다음에 0.1 M NaOH를 첨가하여 6.04까지 상향 조정하였다. 이어서 이 반응물을 혼합하고, pH 6.0 (±0.2), 40~45℃에서 1시간 동안 유지하였다. 1시간 인큐베이션한 후에, 용액의 pH는 6.15였고, 염화나트륨 22 g을 용액에 가하였다. pH는 55.72로 약간 감소되었지만, 1M NaOH를 사용하여 6.08로 조정하였다. 무수 에탄올 1 리터 (1000 ml)를 첨가하여 푸코이단을 침전시켰다. 침전물이 생기도록 실온에서 철야 방치하였다.

2일째

다당류 침전물로부터 흡입하여 상징액을 제거하였다. 침전물을 실온의 고순도 물 1리터 (1000 ml)를 첨가하고, 격렬하게 30~60분간 교반함으로써 재용해시켰다. 일단 용액 중에 침전된 경우라면, 염화나트륨 20 g (2% w/v)을 용액의 연속적 혼합에 의하여 용해시켰다. 1일째로부터의 재용해되고, 다시 한번 염수를 가한 침전물과 무수 에탄올 750 ml를 혼합함으로써 다당류를 다시 침전시켰다. 다시 한번, 침전되도록 다당류를 철야 방지하였다.

3일째

2일째 침전물로부터 상징액을 다시 제거하고, 재용해 공정 (1,000 mL NERL 물), 다시 염수를 가하는 공정 (NaCl 20 g), 및 다시 침전시키는 공정 (무수 ETOH 750 ml) 전체를 3일째에 반복하였다. 다시 한번, 푸코이단이 침전되도록 철야 방치하였다.

4일째

4일 째에, 상징액을 다당류 침전물로부터 흡입함으로써 제거하였다. 이어서 침전물을 22℃에서 1~2시간 고순도 물 900 ml과 함께 혼합함으로써 용해시켰다. pH는 6.81로 측정되었는데, 이 pH를 6N HCl을 첨가함으로써 pH 5.82로 조정하였다. 이 용액 전체를 필터 캡슐 [0.2 ㎛ Kleenpak N66 Posidyne filter capsule (Pall, Lot # IJ7287)]로 여과시켰다. 이어서, 플라스크 및 필터를 고순도 물 약 100 ml로 세정하고, 필터 [Posidyne filter]로 여과한 뒤, 다당류 용액에 첨가하였다. 여과된 용액 전체 (~1.1 리터)를 싱글 냉동 건조기 트레이에 넣고, -40℃로 3시간 냉동시켰다. 이어서, 48시간 동안 다음 프로그램에 따라 냉동 건조를 수행하였다: 처음 4시간 저장 온도 10℃, 다음 20시간 저장 온도 20℃, 마지막 24시간 저장 온도 50℃. 이어서 건조된 생성물을 건조기 및 트레이에서 꺼내어 미리 용기의 중량을 재어 둔 플라스틱 용기에 넣었다.

생성물의 수득량은 25.4 g (50.8 중량% 수율)이었다. 생성물을 Lot/trial 2로 표시하고, 이를 보관을 위하여 이중 비닐 백에 넣었다.

실시예 3

푸코이단 시료의 분석

시험 (Trial) 1 (실시예 1) 및 시험 (Trial) 2 (실시예 2)로부터의 정제된 푸코이단 추출물의 시료를 특징 분석하여, 정제하지 않은 푸코이단 추출물 (NPNutra lot #050316-FU-85)과 비교하였다. 시료 분석은 베이 바이오어낼리티칼 래보래토리, 인코포레이티드 [Bay Bioanalytical Laboratory, Inc. (BBL, Hercules, CA)]가 수행하였다. 푸코이단 추출물의 특징 분석에는 레이저 광산란 (LLS) 검출기를 구비한 크기 배제 크로마토 그래피, 푸코스 및 자일로스 함량, 수분 함량, 중금속, 황산염 및 성분 분석이 포함되었다. LLS가 구비된 크기 배제 크로마토 그래피는 평균 분자량을 측정하기 위하여 사용하였다. 푸코스 및 자일로스는 푸코이단을 가수 분해하고, 소형 탄수화물을 분리하도록 고안된 컬럼을 사용하는 HPLC에 의하여 푸코스 및 자일로스 함량을 측정함으로써 측정하였다. 총 탄수화물 함량은 표준으로서 푸코스를 사용하여 페놀-황산 분석법으로 계산하였다. 수분 함량은 칼 피셔법 [Karl Fischer (KF) assay]으로 측정하였다. 황산염은 이온 교환 크로마토그래피로 측정하였고, 양이온 (원칙적으로는 나트륨, 칼륨 및 기타의 중금속)을 ICP-MS로 측정하였다. 더욱이, 성분 조성 분석 (CHNS)를 시료에 대하여 수행하였다. 컴플렉스 카보하이드레이트 리써치 센터 [The Complex Carbohydrate Research Center (University of Georgia, Athens, Georgia)]가 시료로부터 per-O-트리메틸실릴화 메틸 글리코사이드를 제조한 후 GC/MS를 통하여 단당류 분석을 수행하였다. LAL에 의한 내독소 양은 아비젠 [Avigen]에서 측정하였다. 이 결과를 표 1에 요약하였다.

시료 분석 결과는 아래에 더욱 자세히 설명하기로 한다.

A. 레이저 광 산란 (LLS)

본 명세서에 참조로써 통합되는 문헌인 [BBL publication SOP-059]에서 설명한 바와 같이, 푸코이단 추출물을 레이저 광 산란 (LLS) 및 굴절률 (RI)에 의하여 검출하는 것과 함께, 크기 배제 HPLC로 분자량을 분석하였다. 각 시료를 최종 농도 약 10 mg/ml로 이동상 중에 용해시켰다. 어메리칸 폴리머 스탠다드 (American Polymer Standards)로부터 입수한 덱스트란을 대조군으로서 사용하였다. 다음 장치 및 매개 변수를 사용하였다.

장치 및 설비

이동상: 0.1 M 아세트산암모늄

컬럼: Shodex OH pack SB-803 HQ 30 cm x 8 mm (가드 컬럼 있음)

펌프: ASI Model 500

인젝터: 100 ㎕ 루프(loop)가 장착된 Varian 9010 오토샘플러

LLS 검출기: 프리시젼 검출기 PD2020 멀티-검출기 광산란 시스템 (90°클래시컬)

RI 검출기: Shodex RI SE-61

인젝션 부피: 100 ㎕

유속: 1 mL/분

분석 시간: 20분

데이터 시스템: 프리시젼 디스커버리 32 v. 0.98.010

0.185 ml/g의 상이한 굴절율 (dn/dc)값을 가지는 NIST BSA lot 927c를 사용하여 장치 캘리브레이션을 수행하였다. 덱스트란 대조군 분자량에 대한 캘리브레이션은 어메리칸 폴리머 스탠다드가 보고한 바와 같이, 0.147 ml/g의 dn/dc을 기준으로 하였다. 시료의 분자량에 대한 캘리브레이션은 0.137 ml/g의 dn/dc를 사용하였고, 이 수치는 시그마 테크니컬 서포트 (Sigma technical support)로부터 입수한 것이었다. 각 샘플에 대하여 1회 인젝션을 하였다.

푸코이단 시료의 분자량 (MW) 측정 결과를 표 2에 요약하였다.

상기 결과는 3가지 정제되지 않은 시료 중에서 분자량의 유의한 차이를 보여주고 있다. 일반적으로 분자량은 실험실 내에서 약 10% 범위로 다양할 수 있다.

B. 푸코이단의 가수 분해 및 HPLC에 의한 푸코스 및 자일로스의 측정

시료를 2M HCl에 용해시켜서 약 10 mg/ml 용액을 만들었다. 각 시료의 1 ml 분취액 5개를 상이한 기간 동안 4 ml 들이 유리 바이얼 중에서 60℃로 인큐베이션하였다. 각 시료가 든 1개의 바이얼을 2, 4, 6, 8, 10시간 후 제거하고, 냉각시킨 2M NaOH 1 ml를 첨가하여 중화시켰다.

각 시료를 굴절률 검출기가 장착된 HPLC에 의하여 푸코스 및 자일로스 함량에 대하여 분석하였다. 수중의 L-푸코스 (Sigma-Aldrich, lot# 105K1058) 및 D-자일로스 (Fluka lot# 1118093)를 정량 분석을 위한 표준으로 사용하였다. 다음의 장치 및 매개 변수를 사용하였다.

장치 및 설비

이동상: 5 mM 황산

컬럼: Bio-Rad Aminex HPX-78H, 300mm x 7.8mm (가이드 컬럼 있음)

펌프: ASI Model 500

인젝터:20 ㎕ 루프가 장착된 Varian 9010 오토 샘플러

RI 검출기: Shodex RI SE-61

인젝션 부피: 20 ㎕

유속: 0.8 mL/min

분석 시간: 18분

컬럼 온도: 주위 온도

3가지 푸코이단 추출물 중의 푸코스 및 자일로스 함량을 HPLC에 이어 22시간 60℃에서 2N HCl 중에서 가수분해 시켜서 측정하였다. 그 결과를 표 3a에 요약하였다. 표 중의 % w/w 값을 가수 분해 중의 물의 수득량에 대하여 보정하였다. ((164-18)/164)푸코스 %w/w 또는 ((150-18)/150) 자일로스 %w/w.

이들 값은 예상했던 것보다는 상당히 낮은데, 가수 분해가 완전히 일어나지 않은 것으로부터 기인한 것으로 보인다. 샘플 중 2가지는 8시간 동안 100℃에서 2N HCl 중의 1 mg/ml 시료 농도로 가수 분해되었다. 결과는 표 3b에 요약한다.

상기 시료를 페놀-황산 분석, 전통적인 비색 분석에 의하여 총 중성 당에 대하여 분석하였다. 푸코스를 표준으로 사용하였다.

이들 결과를 가수 분해 중에 일어난 수분의 수득량에 대하여 보정하지 않았기 때문에, 약 몇 %정도 더 높을 수 있지만, 거의 예상된 값에 가까웠다. 이 결과를 표 3c에 요약하였다.

C. 수분 함량

각 푸코이단 추출물의 수분 함량을 본 명세서에 참조로서 통합되는 문헌 [BBL publication SOP-009 v6 "Karl Fischer Moisture Content Assay of Bulk Drug Using Anhydrous Methanol Extraction"]에 따라, 칼피셔 분석법 [Karl Fischer (KF) assay]으로 측정하였다. 칼피셔 분석법에 대하여는, 각 시료 약 15 mg을 칭량하여 깨끗한 1.8 ml 들이 오토샘플러 바이얼에 담았다. 시료를 3회 준비하였다. 메탄올 약 1 ml를 밀폐된 시료 바이얼에 주사함으로써 시료로부터 물을 추출하였다. 그 결과를 표 4에 요약하였다.

D. 금속, 성분 분석 및 황산염 분석

웨스트 코스트 애널리티칼 서비스즈, 인코포레이티드 [West Coast Analytical Services, Inc]가 ICP-MS를 사용하여 중금속 스크린을 실시하였다. 황의 양은 ICP-MS로 측정하였다. 탄소, 수소, 질소 및 황 (CHNS) 함량에 대한 분석도 역시 성분 분석기를 사용하여 웨스트 코스트 애널리티칼 서비스즈가 실시하였다. 황산염도 웨스트 코스트 애널리티칼 서비스즈, 인코포레이티드에서 6시간 동안 6N HCl 중에 가수분해시킨 푸코이단 시료에 대하여 이온 크로마토그래피함으로써 측정하였다.

이온 크로마토그래피에 의하여 황산염을 측정한 결과를 표 5에 제시한다. 표 중의 %w/w 값은 가수 분해 중에 늘어난 물의 양에 대하여 보정하였다: ((96-16)/96)황산염 %w/w.

ICP-MS에 의한 원소 스크린 결과를 아래 표 6a 및 6b에 나타내었다. 값들은 ㎍/g (ppm) 단위로 나타내었다.

원소 조성 분석의 결과를 표 7a 및 7b에 나타낸다. 원소 조성 분석을 푸코스만 함유하는 푸코이단 잔사 및 푸코스당 1개의 황산염을 함유하는 푸코이단에 대하여 계산된 이론적 조성과 비교하였다. 예컨대, C₆H₁₂O₅ + SO₃ - H₂O = C₆H₁₀O₇S (푸코스 잔사 + 1 황산염), 표 7b 참조. 모든 로트 (lot)에 대하여 측정된 원소 조성은 황을 제외하고는 예상하였던 이론값과 잘 들어맞았다. 그러므로, 각 푸코스 잔기는 황산화되지 않은 것으로 보인다. 황의 값은 술페이트 이온 분석과 일치하였다. 질소 값은 푸코이단으로부터 추출한 기타의 푸코이단이 아닌 물질 때문에 아마도 낮은 것으로 판단된다.

E. 당단류 조성

당단류 조성은 컴플렉스 카보하이드레이트 리써치 센터 [Complex Carbohydrate Research Center (University of Georgia, Athens, Georgia)]에서 GC/MS로 측정하였다. 메틸 글리코사이드를 80℃에서 15시간 메탄올 중의 1M HCl로 처리 (25 점적)한 후, 피리딘 (5 점적) 및 메탄올 (20 점적) 중의 아세트산 무수물 (5 점적)으로 실온에서 1시간 동안 다시 N-아세틸화처리함으로써 시료 10 ug으로부터 제조하였다. 이 시료를 80℃ (15분)에서 Tri-Sil (10 점적, Pierce)로 처리함으로써 per-O-트리메틸실릴화하였다. 이들 절차들은 문헌 [Merkle and Poppe in Methods Enzymol. 1994, 230, 1-15 and York et al. in Methods Enzymol 1985, 118, 3-40]에 기재되어 있는 바와 같이 수행하였다. TMS 메틸 글리코사이드의 GC/MS 분석을 DB-1 컬럼 (30m x 0.25 mm ID)을 사용하는 5970 MSD에 인터페이스된 HP 5890 GC 상에서 수행하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.

가공 동안에 50% 질량 손실이 있었고, 총 중성 당 및 황산염의 양이 증가하였음에도 불구하고, 단당류 조성은 가공 (processing)에 의하여 크게 영향받지는 않았다.

F. 내독소

박테리아 내독소는 USP<85>에 따라 LAL에 의하여 측정하였다. 그 결과는 아래의 표 9에 나타낸다. 가공으로 인하여 약 50%의 내독소가 감소되었다.

실시예 4

푸코이단 시료의 생물학적 분석

시험 (Trial) 1 (실시예 1) 및 시험 (Trial) 2 (실시예 2)로부터의 정제된 푸코이단 추출물의 시료를 활성에 대해서 시험관내 응혈 분석으로 평가하고, 정제되지 않은 푸코이단 추출물 (NPNutra lot #050316-FU-85)과 비교하였다. 정제된 푸코이단 및 정제되지 않은 푸코이단 추출물을 아비젠 인코포레이티드 (Avigen Inc.)에서 예컨대, APTT, dPT 등의 시험관내 분석법으로 생물학적 활성에 대하여 평가하였고, 트롬보엘라스토그래프로 평가하였다.

혈장 응고 분석:

활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 (APTT)

표준 절차 (Anderson 1976; Staff 2004)에서 APTT 분석법을 변형시켰다. 약술하자면, 염수 중의 20X 푸코이단 5 ㎕를 30분간 실온에서 혈장 95 ㎕와 혼합하였다. 이어서, 37 ℃ APTT 시약 100 ㎕를 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 3분간 인큐베이트한 다음에, 37℃ 25 mM CaCl₂ 100 ㎕를 첨가하고, 표준 피브로미터 중에서 시간을 재기 시작하였다.

희석액 프로트롬빈 시간 (dPT)

dPT 분석은 예전에 기술된 것 (14)과 유사하였다. 심플라스틴 (Simplastin) (bioMeriex, Durham, NC)을 분석 형태에 따라서 1:100 또는 1:300으로 염수 중에 희석시켰으며, 25 mM CaCl₂과 혼합하였다. 혈장 시료를 37℃로 예열한 다음에, 각 혈장 시료 ~75 ㎕를 서로 혼합하고, 응고에 걸리는 시간을 피브로미터로 측정하였다. 푸코이단 활성을 평가하기 위하여, 20 x 푸코이단 5 ㎕를 실온에서 혈장과 함께 30분간 예비 배양한 다음에, dPT 분석을 개시하였다. 푸코이단에 의한 TFPI 활성의 잠재적인 억제를 평가하기 위하여, 희석된 rTFPI (American Diagnostica, Stamford, CT)를 실온에서 5분간 푸코이단과 함께 예비 배양하였고, 혈장 시료를 첨가한 다음에, 혼합물을 25분간 더 인큐베이션한 다음에 dPT를 개시하였다. 모든 응고 연구를 2회 수행하고 재현하였다.

혈장 트롬보엘라스토그래프 (TEG)

시료 준비- 제VIII 인자 결핍 인간 혈장 (George King Biomedical, Overland Park, KS) 시료 (360 ㎕)를 37℃까지 예열한 다음에, 염수 중의 EDTA로 처리한 푸코이단 또는 가공되지 않은 푸코이단 40 ㎕와 함께 혼합하였다. 혈장 시료 중의 최종 푸코이단 농도는 1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml 범위였다.

TEG 분석- 혈장 시료의 활성화를 위해서, 0.2 M CaCl₂ 20 ㎕를 알루미늄 컵 홀더가 달린 플라스틱 컵에 첨가하였다. 혈장 시료 및 푸코이단의 혼합물 (340 ㎕)을 CaCl₂ 용액에 현탁시키고, 즉시 측정하였다. TEG 분석기는 시료를 37℃에서 연속적으로 인큐베이션하였다. 응괴가 형성된 후 시험을 중단하였고, 소프트웨어 [TEG^® analytical Software Version 4: R]에 의하여 매개 변수를 계산하였는데, 초기 응고가 시작된 시간이 늦어진 기간, 응고 강도의 신속성을 나타내는 각도 α 및 형성된 응괴의 최대 강도에 상당하는 MA (최대 강도)를 측정하였다. 응고가 형성되지 않은 혈장 시료에서, 측정은 2시간 후에 종료하였다. 평균값 및 표준 편차를 3회의 독립적인 측정치로부터 계산하였다.

내인성 및 외인성 응혈 경로에 미치는 푸코이단 활성 가공의 효과를, 응고 시간 대 APTT에서의 푸코이단 농도를 측정함으로써 검사하였고 (도 1), dPT (도 2) 분석을 함으로써 검사하였다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 가공 결과 APTT 활성이 중간 정도로 변화하였다. 그러나, 도 2에서 나타난 바와 같이, 푸코이단은 응고 시간을 단축시킴으로서 TFPI 억제를 향상시켰으며, 정제하지 않은 푸코이단 추출물에 대한 용량 반응 (IC90)의 이동은 30 ㎍/ml이고, 정제된 푸코이단 추출물 lots #1 및 #2에 대해서는 약 4 ㎍/ml이었다.

TEG 분석에 의하여 측정된 인간 HemA 혈장에서의 응고 촉진 활성 및 항응고 활성에 대한 가공의 효과를 4명의 별도의 혈우병 A 환자로부터의 혈장 시료에서 시험하였다. R값을 농도에 대하여 플롯팅하였는데, 여기서 R값은 20 mm 크기의 응괴를 형성하는 데 걸리는 시간을 말한다. 도 3에서 나타나 있는 바와 같이, 정제되지 않은 푸코이단 추출물 및 정제된 푸코이단 추출물은 모든 4개의 Hem A 혈장에서 응고 촉진 특성이 증명되었고, 다채로운 항응고에 대한 효과가 증명되었다. 푸코이단을 함유하는 가공된 lot #1 및 #2는 일부 시료에서 변경된 항응고 작용을 보였다.

E. 결론

실시예 1 및 2에 설명되어 있는 정제된 푸코이단 추출물은 증가된 중성 당 및 황산염 함량을 가졌고, 감소된 중금속 오염 물질 및 내독소 수준을 가졌지만, 단당류 특성은 유지하였다. 정제된 푸코이단 추출물은 검출 불가능한 (ND) 수준의 비소, 브롬, 세륨, 코발트, 납, 리튬, 몰리브덴, 주석, 텅스텐, 및 바나듐을 함유하였다. 더욱이, 요오드, 철, 마그네슘, 망간, 니켈, 인, 칼륨 및 루비듐의 수준이 최소한 2배 감소되었다. 내독소 수준은 약 50%로 감소되었다. 농축된 푸코이단을 함유하는 정제된 푸코이단 추출물은 응고 활성을 가속화시키고 (또한 향상된 TFPI 억제를 보였으며), 정제되지 않은 푸코이단 추출물에 비교하였을 때 항응고 작용에서 최소한의 변화를 보였다.

이상, 본 발명의 양호한 실시 상태를 자세히 설명하였지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나는 일이 없이 본 발명에서 여러 가지 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다.

Claims

(a) 푸코이단 급원을 제공하는 단계와,

(b) 상기 급원을 킬레이트제로 처리하여 상기 급원으로부터 중금속을 제거함으로써 제1 푸코이단 혼합물을 제조하는 단계와,

(c) 제1 푸코이단 혼합물에 존재하는 푸코이단을 선택적으로 침전시켜 오염물질을 제거하는 단계와,

(d) 수용액 중에 푸코이단 함유 침전물을 재현탁시켜 제2 푸코이단 혼합물을 제조하는 단계와,

(e) 상기 (c) 및 (d) 단계를 1회 이상 반복하는 단계와,

(f) 박테리아 및 내독소 오염 물질을 제거하기 위하여 푸코이단을 포함하는 수용액을 여과함으로써 정제된 푸코이단을 생성시키는 단계

를 포함하는 이질 혼합물로부터 푸코이단을 정제하기 위한 방법.
제1항에 있어서, 상기 푸코이단은 황을 5 내지 25 중량% 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 푸코이단은 해조류로부터 유래하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 푸코이단은 푸커스 (Fucus) 속이나, 라미나리아 (Laminaria) 속에서 유래된 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 푸코이단은 푸커스 베시쿨로시스 (Fucus vesiculosis)또는 라미나리아 자포니카 (Laminaria japonica)에서 유래된 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 킬레이트제는 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌글리콜-비스-(베타-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA) 및 2,3-디머캅토프로판엘-1-술폰산 (DMPS) 및 2,3-디머캅토숙신산 (DMSA)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA인 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 킬레이트제는 고상 지지체에 고정되어 있는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 킬레이트제는 이미노디아세테이트 킬레이트 수지인 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 푸코이단 혼합물 중의 푸코이단은 에탄올을 사용하여 선택적으로 침전되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 에탄올 농도는 약 40 내지 50% (v/v)인 것인 방법.
제10항에 있어서, pH는 약 pH 5.7 내지 약 6.0 사이로 유지되는 것인 방법.
제12항에 있어서, pH는 약 pH 5.95로 조정되는 것인 방법.
제10항에 있어서, NaCl은 약 20-24 g/리터의 농도로 푸코이단 혼합물에 첨가되는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 (c) 및 (d) 단계를 3회 반복하는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 정제된 푸코이단의 동결 건조 단계를 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 생성된 정제된 푸코이단을 포함하는 조성물.
제17항에 있어서, 상기 푸코이단은 생물학적으로 활성인 것인 조성물.
제18항에 있어서, 상기 푸코이단은 응혈 촉진 활성을 가지는 것인 조성물.
제17항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는 것인 조성물.
제17항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물의 치료적 유효량을 응혈 능력 향상이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는 상기 개체를 치료하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 푸코이단은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg의 투여량으로 투여되는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 개체는 만성 또는 급성 출혈 질환, 응혈 인자 결핍에 의하여 유발된 선천성 응혈 질환, 및 후천성 응혈 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 출혈성 질환을 앓고 있는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 개체는 급성 상처 또는 상처 처치시 향상된 지혈을 필요로 하는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 응혈 능력 향상이 필요하게 된 원인은 항응혈제의 이전 투여, 수술, 또는 기타의 침입성 시술인 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 응혈 능력 향상이 필요하게 된 원인은 항염증제, 항암제, 항바이러스제, 또는 조혈 선구 세포 이동제인 방법.
응혈 능력 향상이 필요한 개체를 치료하기 위한 방법에 있어서 제17항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 기재된 조성물의 용도.
응혈 능력 향상이 필요한 개체를 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 생성된 푸코이단의 용도.