CN1344565A

CN1344565A - 岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂及其制备方法

Info

Publication number: CN1344565A
Application number: CN 01136467
Authority: CN
Inventors: 汤洁; 王为璋
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2002-04-17

Abstract

本发明公开了一种岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂及其制备方法。该制剂为系列产品,以岩藻多糖酯为有效成分,可制成鱼虾宠物抗病毒饲料添加剂、畜禽疫苗免疫调节剂、畜禽及宠物抗病毒针剂。其制备方法是从海带或其他褐藻中提取岩藻多糖酯,主要包括:控温搅拌浸提,高速离心分离,反渗透浓缩,乙醇分级沉降,活性炭脱色,超滤装置脱盐,醇沉醇洗精制,得岩藻多糖酯原料,再经超微粉碎,真空干燥和针剂制备等工艺步骤得精制岩藻多糖酯及抗病毒及免疫调节剂。提取方法具有工艺简单、得率较高、纯度高和易于工厂化生产的特点;制剂制备利于活性物质的稳定、效能的发挥。

Description

岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种海藻生物新药及其制备方法-岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂的制备方法，属于海藻生物化学的技术领域。

技术背景

本发明涉及的原料为褐藻，主要为我国人工养殖的海带(即LaminariaJapomica)，也可用我国产量最大的野生褐藻、马尾藻(Sorgassum)，其体内除含有工业中有较广泛用途的褐藻胶外，还含有岩藻多糖酯(Fucoidin)，迄今为止，我国褐藻工业仅限于对褐藻胶的提取，岩藻多糖酯的提取只限于实验室制备阶段，有些工业化提取的岩藻多糖酯的方法，得率甚低，例如中国专利公开号CN1129109A褐藻多糖硫酸酯作为治肾衰和血管病的药品及其制备方法。该专利技术公开的是“由于的海带经浸泡，再经五次过滤，二次乙醇提取，一次乙醇洗涤，配合调节pH值的范围”的碱凝析法，采用这种方法岩藻多糖酯的总收率仅为0.22～0.35％。

发明内容

本发明的目的就是要克服上述已有技术存在的缺点，使岩藻多糖的总收率为碱凝析法的10倍左右，提供一种用于预防治疗由病毒引起的各种疾病的、以岩藻多糖酯为原料药的抗病毒及免疫调节剂，该原料药达到医药级水平。

本发明的另一个目的是提供以海带或其他褐藻为原料提取岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂的制备方法，该方法工艺简单、得率高、纯度高、易于工厂化生产。

本发明的第一个目的可以通过以下方案实现；该用于预防治疗由病毒引起的疾病的、以岩藻多糖酯(Fucoidin)为原料药的抗病毒及免疫调节剂，其有效成分为岩藻多糖酯，其中L-岩藻糖的含量为20％-32％，硫酸根(SO₄ ^2-)含量为20％-35％。所述的岩藻多糖酯原料药外观呈浅色粉末，其溶解性为易溶于水，不溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等；所述的有效成份为岩藻多糖酯的抗病毒及免疫调节剂的剂型可以是抗病毒针剂、粉剂、水剂、抗病毒免疫调节剂，以及饲料抗病毒添加剂，并且不同用途和对象的使用剂量不同。

本发明的第二个目的可以通过以下技术方案实现：

以海带或其它褐藻为原料，从中提取岩藻多糖酯，其制备工艺步骤如下：

第一，提取粗岩藻多糖酯：

1)海藻的预处理；

2)控温搅拌浸提；

3)离心分离；

4)浸提液的浓缩；

5)乙醇沉淀海藻酸；

6)岩藻多糖酯沉淀、脱水；

第二，由粗岩藻多糖酯制取精制岩藻多糖酯：

7)制取食品级岩藻多糖酯；

8)制取医药级岩藻多糖酯；

第三，以精制岩藻多糖酯为原料药制备抗病毒及免疫调节剂。

所述第一提取粗岩藻多糖酯的步骤是：

1)海藻的预处理：

干海藻(水份14％-30％)粉碎成1×1cm碎片经筛分，风选除去杂质。用干法处理海藻，可节约大量浸泡、清洗用水，有利于环保和节水并且便于运输、库存和操作，该步工序在海藻的原产地完成。

2)控温搅拌浸提：

预处理后的海藻在浸提反应罐中加入部分浓缩冷凝水和RO分离水再补加自来水，再55℃下机械搅拌，浸提2小时，使岩藻多糖酯提取率可达85％以上，使浸提液中海藻酸含量最低，以便进一步分离纯化处理。

3)离心分离：

浸提液经高速离心分离掉残渣，其残渣不经处理即可直接用于海藻精生产消化工艺中。

4)浸提液的浓缩：

浸提液经高速离心分离和预过滤除去残留的固体物质，用反渗透装置浓缩至原体积的1/2，利用海藻精生产中的低温二次蒸汽再继续浓缩，至所需浓度，使热能充分利用。在确定反渗透浓缩倍数时，考虑如下因素：①反渗透膜寿命及工作压力；②与海藻精生产中的二次蒸汽量相匹配；③适合于反渗透工艺的进行；④能最大限度的降低乙醇用量；并综合考虑确定其为原体积的1/2。浓缩分离的水全部返回浸提工艺和海藻精消化工序，使工艺过程无废水排放。

5)乙醇沉淀海藻酸：

浓缩液中主要杂质是海藻酸。海藻酸在30％乙醇中溶解度较低，用30％乙醇沉淀海藻酸后高速离心分离海藻酸；用30％乙醇洗涤海藻酸，分离出的海藻酸直接投入海藻精制做过程中。

6)再加95％乙醇至浓缩溶液中，乙醇含量达到60％V/V，使岩藻多糖酯沉淀，分别经95％乙醇和无水乙醇脱水，烘干得原料级岩藻多糖酯。

第二，由粗岩藻多糖酯制取精制岩藻多糖酯：

7)用水配制原料级岩藻多糖酯10％溶液，用乙醇分级沉淀海藻酸和岩藻多糖酯经两次无水乙醇脱水，烘干得食品级岩藻多糖酯；

8)用纯水配制食品级岩藻多糖酯5％溶液，用活性炭脱色，离子交换树脂脱盐，再用乙醇沉淀，经两次无水乙醇脱水后，真空干燥得医药级岩藻多糖酯；

第三，以精制岩藻多糖酯为原料药制备抗病毒及免疫调节剂：

针剂，将精制的岩藻多糖酯再经脱蛋白高压灭菌后，将药品级岩藻多糖酯100g用生理盐水充分溶解配成1000ml用0.2μm的滤膜过滤除菌去病原并经高压消毒后装入50ml安瓶中，每瓶装50ml，供注射用。饲料抗病毒添加剂为5％的水剂或岩藻多糖酯粉剂，在饲料中的添加量为0.005％-0.01％。

上述步骤2)中控温搅拌浸提，其搅拌速度为10-60转/分，原料与水量之比为1∶15-25；

上述步骤3)中浸提液经高速离心分离，分离掉残渣，转速为3000-10000rpm；

上述步骤4)中浸提液浓缩，用40℃-80℃减压浓缩，反渗透浓缩至原体积的1/4-1/16；

上述步骤5)，6)中对浓缩液用乙醇分级沉淀分离纯化岩藻多糖酯，具体方法是浓缩液中加入95％的乙醇，使乙醇含量为30％V/V，乙醇加入要在搅拌下缓慢加入，沉淀出海藻酸。在清液中加入95％乙醇，使乙醇含量60％V/V，离心分离出的沉淀为粗岩藻多糖酯。提取岩藻多糖酯的原料可以是人工养殖的海带，也可以是野生褐藻马尾藻。

本发明的优点是：

1)采用本发明的制备方法制取岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂，具备得率高、操作简便、反应条件易于控制、工艺成本低等特点，制取的岩藻多糖酯原料，分别达到食品级和医药级水平。其提取后的藻体仍可作为生产海藻液肥的原料，利于综合开发。使得褐藻的开发取得很好的经济效益，岩藻多糖酯的制备方法与本人的另一发明“一种利用海藻生物制备功能型复合液肥的方法”(申请号：97115095.8)形成上下游二级产品，提高了原料的利用价值。

2)该方法不影响藻体用于海藻肥的生产，仍可提取天然植物生长调节剂。在提取过程中先将原料粉碎，并适当加热，可使岩藻多糖酯的得率提高。

3)该方法对岩藻多糖酯的有效成份采用乙醇分级沉降的方法，去除褐藻酸，比用酸碱调节的方法更要有利，由于提取过程中未加酸、碱及盐，可以避免增加阴阳离子，减少杂质的残留，提高岩藻多糖酯的纯度。

4)本发明的制备方法，其精制步骤只需乙醇，原料和工艺成本低，乙醇可以回收反复利用，因而该方法适用于大批量工业生产。

5)采用本发明的制备方法制取的岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂是系列产品，如制成鱼虾宠物抗病毒饲料添加剂、畜禽疫苗抗病毒及免疫调节剂、畜禽及宠物抗病毒针剂。产品可制成粉剂、水剂、针剂等剂型。用该方法制备的抗病毒原料药，达到医药级水平。

附图说明

附图是本发明产品原料药岩藻多糖酯的优点结构的红外光谱图

具体实施方式

本发明的实施方式分三部分描述如下：一、岩藻多糖酯制备实例：

1)海藻的预处理：

干海藻(水份14％-30％)粉碎成1×1cm碎片经筛分，风选除去杂质。用干法处理，海藻可节约大量浸泡、清洗用水，有利于环保和节水并且便于运输、库存和操作，该步工序在海藻的原产地完成。

2)控温搅拌浸提：

3)离心分离：

浸提液离心分离掉残渣，其残渣不经处理即可直接用于海藻精生产消化工艺中。

4)浸提液的浓缩：

浸提液经高速离心分离，和预过滤除去残留的固体物质用反渗透装置，浓缩至原体积的1/2，利用海藻精生产中的低温二次蒸汽再继续浓缩，至所需浓度，使热能充分利用。在确定反渗透浓缩倍数时，考虑如下因素：①反渗透膜寿命及工作压力；②与海藻精生产中的二次蒸汽量相匹配；③适合于反渗透工艺的进行；④能最大限度的降低乙醇用量；并综合考虑确定其为原体积的1/2。浓缩分离的水全部返回浸提工艺和海藻精消化工序，使工艺过程无废水排放。

5)乙醇沉淀海藻酸：

6)再加95％乙醇至浓缩溶液中，乙醇含量达到60％(V/V)，使岩藻多糖酯沉淀。分别经95％乙醇和无水乙醇脱水，烘干得原料级岩藻多糖酯。

7)用水配制岩藻多糖酯(原料级)10％溶液，用乙醇分级沉淀海藻酸和岩藻多糖酯经两次无水乙醇脱水，烘干得食品级岩藻多糖酯。

8)用纯水配置岩藻多糖酯(食品级)5％溶液，用活性炭脱色，超滤装置脱盐，再用乙醇沉淀，经两次无水乙醇脱水后，真空干燥得医药级岩藻多糖酯。二.岩藻多糖酯化学结构的测定、分析结果及产品指标；

1)活性物质的化学结构：

岩藻多糖酯(Fucoidan)也称褐藻糖胶，主要成份是L-岩藻糖-4-硫酸酯，也称为含褐藻糖的硫酸多糖(Fucose-containing Sulfated Polysaccharides)，其次还伴随有少量的半乳糖、甘露醇、糖醛酸、阿拉伯糖及蛋白质等。人们常以岩藻糖(L-Fucose)的含量或以岩藻糖含量乘以1.75或2.00来表示岩藻多糖酯的含量【1.75是计算值，即吡喃岩藻多糖酯硫酸酯/吡喃岩藻糖＝(128+96)/128＝1.75。在有些情况下，因半乳糖总存在于制备的岩藻多糖酯中，所以也有用乘2.00来表示】。岩藻多糖酯的结构特征是1、2连结的聚α-L-吡喃岩藻糖，而硫酸酯主要是在氧的4位的羟基上。旋光度为-75°-140°。2)产品结构的红外结构光谱分析：

产品的外观为黄色至灰白色粉末，易溶于水，不溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。产品1％的水溶液则显示出有粘性，其粘度为0.5～10厘泊，将产品的水溶液加至65～70％或低浓度的蔗糖浆中，则显示出明显的粘稠性质，可以拉出l米多长的丝。产品用凝胶柱层析方法测定分子量约为15～25万，经北京大学化学与分子工程学院用红外光谱测定，在1232cm^-1～1260cm^-1(S＝O伸缩振动)处有较强的吸收带，与日本岩藻多糖酯样品1252cm^-1处吸收一致；在853cm^-1(C-O-S₁平伏键)处有吸收与日本岩藻多糖酯样品850cm^-1处吸收相同；在1628cm^-1处有吸收与日本岩藻多糖酯样品1638cm^-1处吸收相同。从整个红外光谱图来看，本发明的产品与日本岩藻多糖酯样品非常相似(参见附图)。3)岩藻多糖酯的高效液相色谱分析及主要化学指标的分析结果：

4)岩藻多糖酯得主要指标：

项目	指标
	指标		医药级	食品级
	岩藻糖％	≥27.0	医药级	食品级	≥20.0
硫酸根％(SO₄ ^2-)	岩藻糖％	≥27.0	≥25.0	≥20.0	≥20.0
硫酸根％(SO₄ ^2-)	糖醛酸％	≤35.0	≥25.0	≥20.0	≤40.0
水份％	糖醛酸％	≤35.0	≤3.0	≤3.0	≤40.0

三、抗病毒及免疫调节剂制剂的制备；

1)原料级岩藻多糖酯的制备及其工艺：

15Kg粉碎干海带(Laminaria Japomica)加200Kg水，在300L搪瓷反应罐中，55-60℃搅拌浸提4小时，冷却至室温，过滤得浸提液120Kg，通过CZRO-2反渗透装置浓缩至30Kg，然后在不锈钢浓缩罐中浓缩至10Kg，于搪瓷反应罐中在搅拌下以15L/H流速加入乙醇至乙醇含量30％V/V继续搅拌1小时后，离心分离沉淀海藻酸，清液继续加入乙醇至乙醇含量60％V/V，离心分离沉淀岩藻多糖酯经一次乙醇两次无水乙醇脱水后烘干得粗岩藻多糖酯330g。

2)食品级岩藻多糖酯的制备及其工艺：

取粗岩藻多糖酯500g加水配成10％水溶液，离心分离不溶物沉淀得清液，在搅拌下以每分钟20ml流速加入乙醇至乙醇含量30％V/V继续搅拌1小时后，离心分离沉淀海藻酸，清液继续加入乙醇至乙醇含量60％V/V，离心分离沉淀岩藻多糖酯，经一次乙醇两次无水乙醇脱水后真空干燥得粗岩藻多糖酯420g。

3)医药级岩藻多糖酯的制备及其工艺：

取食品级岩藻多糖酯200g用蒸馏水配成5％的溶液，经活性炭脱色，用孔径为2000的超滤装置进行脱盐处理至溶液含盐量合格并使为1升溶液；以每分钟20ml流速加入乙醇至乙醇含量30％V/V继续搅拌1小时后，离心分离沉淀海藻酸，清液继续加入乙醇至含量60％V/V，离心分离沉淀岩藻多糖酯，经一次乙醇两次无水乙醇脱水后真空烘干得粗岩藻多糖酯150g。

4)50ml岩藻多糖酯针剂：

将药品级岩藻多糖酯100g用生理盐水充分溶解配成1000ml用0.2μm的滤膜过滤除菌去病原并经高压消毒后装入50ml安瓶中，每瓶装50ml。

5)70％岩藻多糖酯超微粉剂：

取食品级岩藻多糖酯700g与300g淀粉混合经超微粉碎，得70％岩藻多糖酯超微粉剂。

6)4％岩藻多糖酯水剂：

将食品级岩藻多糖酯42g用蒸馏水800ml搅拌溶解，再用蒸馏水定容至1000ml。500ml玻璃瓶装，密封后，进行高压灭菌。四、药效试验结果；

1)岩藻多糖酯抗病毒活性试验：70％岩藻多糖酯超微粉，每天每1Kg体重100mg，第4天鱼虾接种白斑病毒，添加岩藻多糖酯处理组的成活率75％以上，对照组全部死亡。

2)岩藻多糖酯治疗鸡病试验：我们用4％岩藻多糖酯水剂稀释100-200倍后治疗自然感染IBDV的肉鸡，取得了较满意的效果，死亡率降低约50％；用4％岩藻多糖酯水溶液稀释NDV后，接种鸡胚，初步结果表明，岩藻多糖酯对NDV有拮抗作用。

3)岩藻多糖酯对鸡新城疫LaSoda疫苗株试验：4％-5％的岩藻多糖酯与鸡新城疫LaSoda疫苗株在4℃作用过夜后，接种鸡胚，可以使HA下降2-4个滴度。这种结果表明岩藻多糖酯对鸡新城疫LaSoda疫苗株具有一定的拮抗作用。

4)在每吨鱼虾饲料中添加岩藻多糖酯超微粉100-360g；或在饲料添加剂中喷混4％岩藻多糖酯水利，每吨1000-2000ml可使鱼虾的白斑病死亡率降低20％-30％。

5)4％岩藻多糖酯水剂可作为畜禽饮水剂，在病毒病发病前期400倍饮用5-10天，每只鸡每天饮水约100ml，可减少鸡因病毒病引起的死亡率30％。

Claims

1、一种岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂，其特征在于：该用于预防治疗由

病毒引起的疾病的、以岩藻多糖酯为原料药的抗病毒及免疫调节剂，有效成

分为岩藻多糖酯，其中L-岩藻糖的含量20％～32％，硫酸根含量为20％-35％。

2、根据权利要求1所述的岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂，其特征在于：

所述的岩藻多糖酯原料药外观呈浅色粉末，其溶解性为易溶于水，不溶于有

机溶剂；所述的有效成分为岩藻多糖酯的抗病毒及免疫调节剂的剂型可以是

抗病毒针剂、粉剂、水剂，不同用途和对象的使用剂量不同。

3、一种岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂的制备方法，以海带或其他褐藻为

原料从中提取岩藻多糖酯，其特征在于：其制备工艺步骤如下，

第一，提取粗岩藻多糖酯：

1)海藻的预处理；

2)控温搅拌浸提；

3)离心分离；

4)浸提液的浓缩；

5)乙醇沉淀海藻酸；

6)岩藻多糖酯沉淀、脱水；

第二，由粗岩藻多糖酯制取精制岩藻多糖酯：

7)制取食品级岩藻多糖酯；

8)制取医药级岩藻多糖酯；

4、根据权利要求3所述的岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂的制备方法，其

特征在于：

所述步骤1)海藻的预处理是：

干海藻粉碎成1×1cm碎片经筛分，风选除去杂质；

所述步骤2)控温搅拌浸提是：

预处理后的海藻在浸提反应罐中加入部分浓缩冷凝水和RO分离水再补加自

来水，在45℃-65℃下机械搅拌，浸提2-4小时；

所述步骤3)离心分离是：

浸提液经高速离心分离掉残渣，将残渣不经处理即可直接用于海藻精生产消

化工艺中；

所述步骤4)浸提液的浓缩是：

浸提液经高速离心分离和预过滤除去残留的固体物质，用反渗透装置浓缩

至原体积的1/2，利用海藻精生产中的低温二次蒸汽再继续浓缩，至所需浓

度，浓缩分离的水全部返回浸提工序和海藻精消化工序；

所述步骤5)乙醇沉淀海藻酸是：

浓缩液中主要杂质是海藻酸，用30％乙醇沉淀海藻酸后高速离心分离海藻

酸，用30％乙醇洗涤海藻酸，分离出的海藻酸直接投入海藻精制过程中；

所述步骤6)岩藻多糖酯的沉淀、脱水是：

再加95％乙醇至浓缩溶液中，使乙醇含量达到60％V/V，使岩藻多糖酯沉淀，

分别经95％乙醇和无水乙醇脱水，烘干得原料级岩藻多糖酯；

所述步骤7)制取食品级岩藻多糖酯是：

用水配制原料级岩藻多糖酯10％溶液，用乙醇分级沉淀海藻酸和岩藻多糖酯

经两次无水乙醇脱水，烘干得食品级岩藻多糖酯；

所述步骤8)制取医药级岩藻多糖酯是：

用纯水配制食品级岩藻多糖酯5％溶液，用活性炭脱色，超滤装置脱盐，

再用乙醇沉淀，经两次无水乙醇脱水后，真空干燥得医药级岩藻多糖酯；

所述以精制岩藻多糖酯为原料药制备抗病毒及免疫调节剂：

针剂，将精制的岩藻多糖酯再经脱蛋白高压灭菌后，将药品级岩藻多糖酯100g用生理盐水充分溶解配成1000ml用0.2μm的滤膜过滤除菌去病原并经高压消毒后装入50ml安培瓶中，每瓶装50ml；饲料抗病毒添加剂为4％的水剂或岩藻多糖酯粉剂，在饲料中的添加量为0.005％-0.01％。

5、根据权利要求3或4所述的岩藻多糖酯作为抗病毒及免疫调节剂的制备方法

其特征在于：

所述步骤2)中控温搅拌浸提，其搅拌速度为10-60转/分，原料与水量之比

为1∶15-25；

所述步骤3)中浸提液经高速离心分离，分离掉残渣，转速为3000-10000rpm；

所述步骤4)中浸提液浓缩，用40℃-80℃减压浓缩，反渗透浓缩至原体积的

1/4-1/16；

所述步骤5)，6)中对浓缩液用乙醇分级沉淀分离纯化岩藻多糖酯，具体方

法是浓缩液中加入95％的乙醇，使乙醇含量为30％V/V，乙醇加入要在搅

拌下缓慢加入，沉淀出海藻酸，在清液中加入95％乙醇，使乙醇含量60％V/V；

离心分离出的沉淀为粗岩藻多糖酯。

6、根据权利要求3所述的岩藻多糖酯作为抗病毒免疫调节剂的制备方法，其特

征在于：提取岩藻多糖酯的原料可以是人工养殖的海带，也可以是野生褐藻

马尾藻。