CN1305885C

CN1305885C - 海带中l－褐藻糖的制备方法

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Publication number: CN1305885C
Application number: CNB2004100757126A
Authority: CN
Inventors: 徐祖洪; 赵增芹; 张全斌; 牛锡珍; 张虹; 李智恩
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2004-12-31
Filing date: 2004-12-31
Publication date: 2007-03-21
Anticipated expiration: 2024-12-31
Also published as: CN1670028A

Abstract

本发明是一种以青岛产海带为原料制备L-褐藻糖的简单方法，是经水提醇沉法提取并纯化得到提纯的褐藻多糖硫酸酯；再经如下步骤：硫酸水解，过滤，滤液上柱脱盐，除酸脱色，过滤，滤液真空旋转浓缩，乙醇沉淀，滤液真空旋转浓缩至糖浆，乙醇沉淀，滤液真空旋转浓缩至糖浆，加入适量的乙醇和丙酮的混合物，加入数粒L-褐藻糖标准接种，结晶。本发明的L-褐藻糖制备方法工艺简单，分解制得的L-褐藻糖产品的纯度为98.1%，产率为16.2%～17.0%。为确定其在医药领域的应用具有重要的理论意义和应用价值，L-褐藻糖制备方法对我国海带资源的高值利用做出新的贡献。

Description

海带中L-褐藻糖的制备方法

技术领域

本发明涉及精制单糖制备方法的改进及应用，特别是一种海带中L-褐藻糖的制备方法，其属于海带深加工技术领域。

背景技术

海带，为一种大型食用褐藻类，大叶藻科植物大叶藻的全草(Laminaria japonicaAresch)，它属于褐藻门(phaeophyta)、海带目(laminariales)、海带科(laminariceae)的海带(laminaria)。该属中有50多个种，世界上已广泛食用的有四种：海带(Laminariajaponica aresch)、利尻海带(L.ochotensis-Miy)、狭叶海带(L.angustata kjellm)和长海带(L.longissima Mijabe)。我国目前自然生长和人工养殖的是海带(Laminariajaponica aresch)。在海藻工业发展初期，我国对海带的综合作用研究主要集中在碘、甘露醇、褐藻胶等的大宗提取物上。近年来，由于受化学合成及其它方法的影响，市场竞争激烈；同时，由于目前海带加工工艺存在着耗水量大、耗能大、污染严重等问题，致使三大产品生产成本居高不下，导致许多海带加工企业处于微利或亏损的边缘。中科院海洋所徐祖洪、李智恩等利用原来生产碘、甘露醇、褐藻胶生产线所生产的废渣、废液提取褐藻多糖硫酸酯的成功(已申请了专利)，并已形成产业化，不仅有效解决了海带加工业的环境污染问题，同时也大幅度降低了上述产品的生产成本，提高了海带综合工业的高附加值，促进了我国海藻工业及养殖业的进一步发展。在此基础上的进一步制备L-褐藻糖，必将极大的提高上述行业产品的质量档次，为海带产业化建立完善的技术平台，从而更好的综合利用我国丰富的海带资源，创造更大的经济效益，是对海带综合工业的高附加值的有力促进。

L-褐藻糖(L-fucose)又名L-岩藻糖、6-脱氧-L-半乳糖，是一种以L-异构体天然存在的稀有糖类。在生物体内，L-褐藻糖主要存在于大多糖蛋白和糖酯等复合物糖苷链的非还原端及分子量较大的糖酯及血型抗原中。此外，还存在于某些微生物的胞外多糖(EPS)中，但它更多地存在于褐藻多糖硫酸酯中。褐藻多糖硫酸酯是褐藻细胞间的一种多糖，是褐藻细胞分泌产生的粘性物质，为褐藻利用光和营养所必需。其含量随海藻种类、产地、季节和藻体部位的不同而不同。它的分子量相当大，分子结构非常复杂，主要由1，2-联结的聚α-L-吡喃褐藻糖组成，平均每个单糖上有一个活性基团-硫酸酯，主要存在于C₄的羟基位置上，少量在C₃的羟基位置上。其次，它还伴随有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、糖醛酸、鼠李糖及蛋白质等。

国内外大量研究发现单糖——L-褐藻糖在糖复合物的生理和生物学功能中起着重要作用，如其可抑制肺部肿瘤细胞的增生(即抗癌效应)、抑制白血细胞形成(即消炎作用)、治疗风湿性关节炎及合成某些免疫抗原等等。现已有大量文献报道癌症患者血清蛋白中的L-褐藻糖含量较高是由于褐藻糖酰转移酶高度活跃，这就说明细胞转化作用(致癌作用)与L-岩藻糖代谢间存在某些联系；在糖尿病患者血清中L-褐藻糖含量较高，说明它是抑制肌醇转移的一种潜在抑制剂；肿瘤患者尿中游离的L-褐藻糖水平反应了糖复合物中糖链的代谢程度，在临床上可以作为肿瘤标记。最近又发现L-褐藻糖可以促进人体纤维细胞的增生；可以作为抗自由基干扰的保护剂等。同时，鉴于L-褐藻糖的保湿润肤作用及抗过敏效应也将其应用于化妆品方面。因此，L-褐藻糖在医药、化妆品等领域有广阔的应用前景。此外，L-褐藻糖还是一种很重要的生化试剂，具有多方面的生物活性。它被广泛用于化学分析、生物工程、细胞工程和糖工程等。现有技术中L-褐藻糖的制备方法有很多，如：化学合成、微生物合成、酶合成及采用化学或酶水解含有L-褐藻糖的微生物胞外多糖(EPS)等等。其中，化学合成方法通常是由常见单糖如L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖等等通过一系列的化学反应转化成L-褐藻糖，反应步骤繁琐并且产率低，难以实现产业化生产；微生物合成法类似于化学合成，步骤繁琐，产率低；酶合成方法目前尚未成熟，仅仅处于探索之中；含有L-褐藻糖的微生物胞外多糖(EPS)的化学或酶降解方法虽然为有效制备L-褐藻糖开辟了一条新途径，但因涉及微生物多糖级分的高粘度性、菌链的选择等等众多因素，要高效制备褐藻糖，此方法尚需改进。而以褐藻为原料来制备L-褐藻糖的方法大致有两种：苯肼结晶法和乙醇结晶法。有人对从沟鹿角菜、墨角藻、泡叶藻中制备L-褐藻糖进行了研究。直到1966年有人又通过优化水解分离条件得到晶状L-褐藻糖，但都因产品的纯度和质量不高。其工艺不够完善，难以被应用于工业化生产。经研究发现不同来源的褐藻多糖硫酸酯的化学组成含量及其单糖组分的摩尔比率有明显的差异，其分析测定结果见表1，表2：

表1不同来源的褐藻多糖硫酸酯的化学组成

褐藻种类	L-褐藻糖％)	硫酸根(％)	氮(％)	灰分
褐藻种类	L-褐藻糖％)	硫酸根(％)	氮(％)	灰分	海黍子	26.5	14.8	0.6	20.8
鼠尾藻	25.4	17.0	1.0	22.6	海黍子	26.5	14.8	0.6	20.8
鼠尾藻	25.4	17.0	1.0	22.6	冬青叶马尾藻	13.3	12.6	1.3	20.8
海带(大连产)	24.0	30.0	0.9	27.3	冬青叶马尾藻	13.3	12.6	1.3	20.8
海带(大连产)	24.0	30.0	0.9	27.3	海带(福建产)	29.3	30.8	1.2	29.8
海带(青岛产)	28.8	30.2	1.4	31.2	海带(福建产)	29.3	30.8	1.2	29.8

表2不同来源的褐藻多糖硫酸酯单糖组分的摩尔比率

褐藻种类	L-褐藻糖	半乳糖	木糖	葡萄糖
褐藻种类	L-褐藻糖	半乳糖	木糖	葡萄糖	海黍子	1.00	0.24	0.05	0.04
鼠尾藻	1.00	0.24	-	0.03	海黍子	1.00	0.24	0.05	0.04
鼠尾藻	1.00	0.24	-	0.03	冬青叶马尾藻	1.00	0.36	0.16	0.08
海带(大连产)	1.00	0.15	-	-	冬青叶马尾藻	1.00	0.36	0.16	0.08
海带(大连产)	1.00	0.15	-	-	海带(福建产)	1.00	0.09	-	-
海带(青岛产)	1.00	0.36	-	-	海带(福建产)	1.00	0.09	-	-

研究结果表明从海带提取的褐藻多糖硫酸酯的单糖组分主要是L-褐藻糖和D-半乳糖，而青岛产海带提取的褐藻多糖硫酸酯中的单糖组分比例为1.00∶0.36。与其它褐藻类海黍子、鼠尾藻等所含有的组分有显著性差异。因此，从青岛产海带中分离出褐藻多糖硫酸酯，然后再用简单的方法分离出L-褐藻糖是可行的。

发明内容

本发明的目的是要提高我国海带综合工业的高附加值，扩大海带深加工技术，提供一种制备海带中L-褐藻糖的制备方法，为确定其在医药领域的应用具有重要的理论意义和应用价值，对海带资源的高值利用做出新的贡献。

本发明需要解决的技术方案是研制了海带中L-褐藻糖的制备方法，它是一种6-脱氧己糖类单糖的制备方法。

本发明是在提纯的褐藻多糖硫酸酯基础上进一步精制得海带中L-褐藻糖。本发明以青岛产海带为原料，首先通过水提醇沉法提取出粗多糖，具体方法是：把海带切成细片后，用一定浓度的甲醛溶液浸泡过夜，然后添加蒸馏水沸水提取，硅藻土过滤，滤液透析，浓缩，75％乙醇沉淀，真空干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗多糖重溶于水，在0.05mol/L MgCl₂存在下20％乙醇沉淀，以除去水溶性褐藻胶，滤液透析，浓缩后用75％乙醇沉淀，真空干燥即可得到提纯的褐藻多糖硫酸酯。

本发明的海带中L-褐藻糖的制备方法是以海带为原料，经水提醇沉法提取并纯化得到提纯的褐藻多糖硫酸酯；再按如下精制步骤：

1)取一定量的提纯褐藻多糖硫酸酯加水再加酸进行水解反应，按该多糖与水、浓酸的重量比例1∶40-80∶1.96——19.6加水再加酸，轻沸回流水解时间为3-4小时；

2)水解液冷却后，用碳酸钡中和至pH7±0.2，过滤，去除沉淀；

3)将2)步所得的滤液通过732强酸阳离子树脂柱，收集流出液，去除K、Na、Ca、Mg等无机盐，然后用该滤液0.5-1体积倍的蒸馏水洗涤，收集合并流出液和洗涤液为阳树脂流份；

4)将适量的IRA-67弱碱阴离子树脂加入到3)步所得的阳树脂流份中，不间断搅拌，观察pH值至终点，分离该阴离子树脂去除糖醛酸及硫酸基；再用该分离液0.05-0.1体积倍的蒸馏水洗涤该阴离子树脂；收集合并分离液和洗涤液为阴树脂流份；

5)将4)步所得的阴树脂流份真空浓缩至原体积的1/100，再按该浓缩液与95％的乙醇的体积比1∶10-20加入95％乙醇，过滤，除去沉淀；将该滤液再真空浓缩至原体积的1/150的糖浆状；

6)将5)步所得的糖浆，溶于50-100体积倍的无水乙醇中，过滤，除去沉淀；该滤液再真空浓缩至原体积的1/100糖浆状；

7)将6)步所得的糖浆，溶于50-100体积倍的蒸馏水中，并加入该蒸馏水重量的0.04-0.07倍的活性炭，煮沸30分钟，不停搅拌，然后趁热硅藻土过滤，滤液再真空浓缩至原体积的1/100的糖浆状；

8)将7)步所得到的糖浆转移至称量瓶中，加入该糖浆体积的5.0-10.0倍的无水乙醇溶解该糖浆，然后加入该糖浆体积的2.0-4.0倍的丙酮，过滤，弃去滤出物；

9)将8)步所得的滤液，按重量投种比0.5‰投入标准L-褐藻糖晶种，置于5℃的冰箱中，3-7天后结晶，过滤，滤液仍置于冰箱中，以待进一步结晶，取滤出结晶物用无水乙醇洗涤2次，再真空干燥，即得粗制的L-褐藻糖晶体混合物；

10)由于9)步所得的粗制L-褐藻糖尚含有18.9-21.7％的半乳糖，需将粗制褐藻糖晶体混合物中加入50～60倍体积的甲醇-丙酮混合溶液，其中甲醇-丙酮体积比为9∶5；在5℃溶解5～8小时，不断搅动，使L-褐藻糖较多地溶出；

11)将10)步所得的混合液过滤，取滤液，在55℃～60℃真空浓缩至原体积的1/90的糖浆状，

12)将11)步所得的糖浆加入到5.0-10.0倍体积的无水乙醇中溶解，再按重量投种比5‰投入标准L-褐藻糖晶种，置于5℃的冰箱中3～7天后，过滤，真空干燥，即得纯度高的L-褐藻糖晶体；所得L-褐藻糖晶体的产率为16.2％～17.0％。

所述的水解反应，其反应温度为：100℃-110℃。

所述的3)步的732强酸阳离子树脂柱规格为：Φ3.5×54～60cm；所述的滤液过树脂柱的流速为：1～2倍树脂柱体积/小时；所述的洗涤液过树脂柱的流速为1～2倍树脂柱体积/小时；该滤液和洗涤液过树脂柱的总时间2～4小时，即可达到脱盐的目的。

所述的4)步中的观察终点为pH 7±0.2。

所述的5)，6)，7)，11)步中真空浓缩的工艺技术条件为：真空度控制在0.09～0.1MPa，控制温度为55～60℃，真空浓缩3～4小时。

本发明的优点在于：由于本发明的1)步将10g的褐藻多糖硫酸酯置于配有搅拌器、恒温温度计及冷凝管的三口瓶中，加入800ml水用硫酸调至0.25mol/L，在100℃-110℃轻沸回流水解4小时；使得褐藻多糖硫酸酯中的单糖组分：L-褐藻糖和D-半乳糖在轻沸回流中，得以分解游离出来。由于青岛产海带提取的褐藻多糖硫酸酯中的单糖组分比例为1.00∶0.36。与其它褐藻类海黍子、鼠尾藻等所含有的组分有显著性差异。这样，本发明以青岛产海带为原料制备L-褐藻糖方法，其工艺简单，分解的L-褐藻糖产品的纯度和产率较高。又由于确定了滤液同过树脂柱的合适的流速为：1～2倍树脂柱体积/小时；和确定了洗涤液过树脂柱的合适的流速为1～2倍树脂柱体积/小时；该滤液和洗涤液过树脂柱的总时间2～4小时，使得分解游离出来的L-褐藻糖与金属盐离子彻底脱离，达到脱盐的目的，提高了L-褐藻糖产品的纯度。由于确定了5)，6)，7)，11)步中真空浓缩的工艺技术条件为：真空度控制在0.09～0.1MPa，控制温度为55～60℃，真空浓缩3～4小时；使得L-褐藻糖产品的质量和产率都较高。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的内容详细说明；

实施例1：

取青岛产海带为原料，经水提醇沉法提取并纯化得到提纯的褐藻多糖硫酸酯；再按如下精制步骤：

1)取一定量的提纯褐藻多糖硫酸酯加水再加酸进行水解反应，按该多糖与水、浓酸的重量比例1∶80∶19.6加水再加酸，在100℃-110℃轻沸回流水解4小时；

2)水解液冷却后，用碳酸钡中和至pH7±0.2，过滤，去除沉淀；

3)将2)步所得的滤液通过732强酸阳离子树脂柱，收集流出液，去除K、Na.Ca、Mg等无机盐，然后用该滤液1体积倍的蒸馏水洗涤，收集合并流出液和洗涤液为阳树脂流份；

4)将适量的IRA-67弱碱阴离子树脂加入到3)步所得的阳树脂流份中，不间断搅拌，观察pH值至终点，分离该阴离子树脂去除糖醛酸及硫酸基；再用该分离液0.1体积倍的蒸馏水洗涤该阴离子树脂；收集合并分离液和洗涤液为阴树脂流份；

5)将4)步所得的阴树脂流份真空浓缩至原体积的1/100，再按该浓缩液与95％的乙醇的体积比1∶20加入95％乙醇，过滤，除去沉淀；将该滤液再真空浓缩至原体积的1/150的糖浆状；

6)将5)步所得的糖浆，溶于80体积倍的无水乙醇中，过滤，除去沉淀；该滤液再真空浓缩至原体积的1/100糖浆状；

7)将6)步所得的糖浆，溶于100体积倍的蒸馏水中，并加入该蒸馏水重量的0.07倍的活性炭，煮沸30分钟，不停搅拌，然后趁热硅藻土过滤，滤液再真空浓缩至原体积的1/100的糖浆状；

8)将7)步所得到的糖浆转移至称量瓶中，加入该糖浆体积的10.0倍的无水乙醇溶解该糖浆，然后加入该糖浆体积的4.0倍的丙酮，加入的适量无水乙醇使糖浆溶解，又加入丙酮，如生成白色絮状物，需过滤，弃去滤出物；

10)由于9)步所得的粗制L-褐藻糖尚含有18.9-21.7％的半乳糖，需将粗制褐藻糖晶体混合物中加入55倍体积的甲醇-丙酮混合溶液，其中甲醇-丙酮体积比为9∶5；在5℃溶解5～8小时，不断搅动，使L-褐藻糖较多地溶出；

11)将10)步所得的混合液过滤，取滤液，在55℃～60℃真空浓缩至原体积的1/90的糖浆状；

12)将11)步所得的糖浆加入到10.0倍体积的无水乙醇中溶解，再按重量投种比5‰投入标准L-褐藻糖晶种，置于5℃的冰箱中3～7天后，过滤，真空干燥，即得纯度高的L-褐藻糖晶体所得单糖产率为16.2％，溶点为135℃-137℃，比旋光度为[α]_D ²⁰为-76.9。

实施例2：

取褐藻多糖硫酸酯10g置于配有搅拌器、恒温温度计及冷凝管的三口瓶中，加入400ml水用硫酸调至0.5mol/L，在100℃轻沸回流水解4小时。其余条件同实施例1。

实施例3：

按褐藻多糖硫酸酯样品与硫酸重量比例为10∶1.96，取一定量的褐藻多糖硫酸酯样品置于安培管中，封管水解3小时，其余条件同实施例1。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims

1、海带中L-褐藻糖的制备方法，其特征在于：所述的制备方法是以海带为原料，经水提醇沉法提取并纯化得到提纯的褐藻多糖硫酸酯；再按如下精制步骤：

1)取一定量的提纯褐藻多糖硫酸酯加水再加酸进行水解反应，按该多糖与水、浓酸的重量比例1∶40-80∶1.96-19.6加水再加酸，轻沸回流水解时间为3-4小时；

2)水解液冷却后，用碳酸钡中和至pH7±0.2，过滤，去除沉淀；

3)将2)步所得的滤液通过732强酸阳离子树脂柱，收集流出液，去除K，Na，Ca，Mg无机盐，然后用该滤液0.5-1体积倍的蒸馏水洗涤，收集合并流出液和洗涤液为阳树脂流份；

10)由于9)步所得的粗制L-褐藻糖尚含有18.9-21.7％的半乳糖，需将粗制褐藻糖晶体混合物中加入50～60倍体积的甲醇-丙酮混合溶液，其中甲醇-丙酮体积比为9∶5；在5℃溶解5～8小时，不断搅动，使L-褐藻糖溶出；

2、根据权利要求1所述海带中L-褐藻糖的制备方法，其特征在于：所述的3)步的732强酸阳离子树脂柱规格为：Φ3.5×54～60cm；所述的滤液过树脂柱的流速为：1～2倍树脂柱体积/小时；所述的洗涤液过树脂柱的流速为1～2倍树脂柱体积/小时；该滤液和洗涤液过树脂柱的总时间2～4小时。

3、根据权利要求1所述海带中L-褐藻糖的制备方法，其特征在于：所述的4)步中的观察终点为pH 7±0.2。

4、根据权利要求1所述海带中L-褐藻糖的制备方法，其特征在于：所述的5)，6)，7)和11)步中任一步的真空浓缩的工艺技术条件为：真空度控制在0.09～0.1MPa，控制温度为55～60℃，真空浓缩3～4小时。