CN1749280A - 鲍鱼多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
鲍鱼多糖的提取方法，是将鲍鱼去壳取肉(包括内脏)，用组织捣碎机破壁，加水混合均匀于20～80℃浸提2～6h，离心分离，不溶物再次加水重复提取1～2次，上清液合并。浓缩提取液至含糖1.5～3.0％，加3～4倍体积的95％乙醇，0～4℃下醇沉12～16h，离心后真空法或喷雾法干燥得产品。提取还可以用加碱提取、超声波提取、酶提取。酶提取可以用单一酶、双酶、复合酶、自溶酶和复合法提取。酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶等。本发明开创了从鲍鱼(特别是其腹足和脏器)提取鲍鱼多糖的工艺路线，有效地将鲍鱼多糖提取出来。由于鲍鱼多糖的药用用途的研究不断深入，本发明为其进一步开发提供了技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖的提取方法，属于生物制品领域。
背景技术
近几年来，随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖、蛋白质与核酸一样是涉及生命活动本质的三类生物大分子之一。多糖是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，又称多聚糖，它不仅是人体生命必需的成分，而且也存在于一切细胞膜结构中，并参与多种生命功能活动。进年来，发现多糖对人体具有增强免疫功能，还有抗癌、抗辐射、抗炎、降血糖等生理活性，因此受到广泛关注和重视。
目前，国内外研究较多的是食用、药用菌多糖，随着对多糖研究的深入，人们也逐渐把目光转向动物多糖，尤其是海洋动物多糖的研究，也日益成为科研工作者研究的热点和焦点。由于鲍鱼生长期长，在海洋的高盐、高压、低温这种特殊环境中生活，身体中富集了大量生理活性物质。近年来，有研究从鲍鱼中分离和纯化能高效抑制鼻咽癌细胞的纯多糖。大量研究论文报道也显示鲍鱼多糖具有很好的抗肿瘤活性和增强机体免疫功能。中国医药资讯网(http：//www.yy2000.com)载文称，鲍鱼多糖、紫菜多糖已证明有抗肿瘤、防治心血管疾病作用，这种药用的研究正在继续，将会取得更多、更好的效果。然而，从动物中提取多糖的研究较少，至于从海洋动物中提取多糖的研究更是凤毛麟角。从鲍鱼身上有效提取鲍鱼多糖的研究则还未见报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺方法，以去壳鲍鱼整体、鲍鱼腹足、鲍鱼脏器为原料，有效地提取鲍鱼多糖。
本发明的技术方案是：鲍鱼经原料的处理、提取、醇沉、干燥而得鲍鱼多糖。具体工艺步骤为：
一、原料处理
原料鲍鱼可用新鲜的，也可用冷冻品，还可以用干燥品。处理时可分鲍鱼肉整体(不分腹足和脏器)、鲍鱼的腹足和脏器。鲍鱼的腹足和脏器也可单独提取鲍鱼多糖。
取新鲜的或解冻的鲍鱼，洗净去壳得到鲍鱼肉整体，也可以分离得到鲍鱼腹足和脏器，可以分别或混匀加入5～10倍水用组织捣碎机破壁、匀浆待用；干燥品是是带壳冷冻鲍鱼，缓化5～10分钟，去壳，得到鲍鱼肉整体，也可以分离得到鲍鱼的腹足和脏器，将其分别或混匀冻干或烘干、粉碎，其粒度为在100目以下，待用。
二、鲍鱼多糖的提取
提取鲍鱼多糖的方法采用水浸提法、碱液提取法、超声波提取法和酶提取法，还可以酶与前三种方法相结合，以提高得率。
1、水浸提法
向浆料或干粉中加入重量10～50倍的水，混匀，在20～80℃的温度下，浸提2～6小时后，离心分离，得到离心上清液和不溶物。不溶物再加10～40倍的水，在20～80℃的温度下，浸提2～6小时后再次离心分离，合并两次所得的上清液，待用。
2、碱液提取法
向浆料或干粉中加入重量10～50倍的水，混匀，加入0.5mol/L的NaOH或KOH溶液，调pH为8～9，在20～60℃的温度下，浸提2～6小时后，离心分离得到上清液和不溶物。不溶物再加10～40倍的水，保持PH为8～9，重复上述操作1～2次，合并所得的上清液，用酸中和待用。
3、超声波提取法
将原料处理中得到的鲍鱼浆料或鲍鱼干粉，加鲍鱼量10～50倍的水，用20～30KHZ超声波处理10～60分钟，离心分离得到上清液和不溶物。向不溶物中再添加10～40倍的水，再用超声波处理10～60分钟，离心分离得到上清液和不溶物。合并两次所得的上清液。
4、酶提取法
酶提取法是鲍鱼浆料或鲍鱼干粉加水，用酶在所用酶适宜的pH值和温度等条件下进行酶解，所用的酶可以是单一酶、双酶、复合酶或自溶酶，也可与上述提取法相接合，均可达到提取目的。所述的单一酶、双酶、复合酶的品种为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等。
(1)单、双、复合酶酶解法
1)单酶酶解法：经处理后的原料加鲍鱼量10～50倍的水搅拌混合，用6mol/L HCl调pH为1～5，加入溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在35～50℃搅拌酶解2～5小时，水解时保持上述pH值；`再用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为中性，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加水10～40倍重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。其它品种酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等)的酶解操作上同上，只是用碱液或酸液调到所用酶适宜的范围。
2)双酶酶解法：经处理后的原料加鲍鱼量10～50倍的水搅拌混合，用6mol/L HCl调pH为1～5，加入溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在20～60℃搅拌酶解1～6小时，水解时保持上述pH值；`再用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为7～9，加入溶液重量0.05～3.00％的胰蛋白酶，在20～60℃水浴中搅拌酶解1～6小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调pH为中性，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加10～40倍水重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。
3)复合酶酶解法：将原料处理中得到的鲍鱼浆料或鲍鱼干粉，加鲍鱼量10～50倍的水，用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为7～9，加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，添加量为溶液重量的0.05～3.00％，三种酶的比例为1.0∶0.1～1.0∶0.1～1.0，在20～60℃的温度下，酶解1～6小时后，用酸调pH7，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加10～40倍水重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。
(2)结合提取法
1)自溶与外源酶相解合法：(1)自溶：可以用下述任一方法进行自溶：①鲍鱼浆料加重量10～50倍水，用紫外线照射10～30分钟，用0.06～0.08mol/L NaCl在pH为7.0～7.5、30～50℃下使其利用自身酶自溶；②将鲍鱼浆料加鲍鱼量10～50倍水置入无菌酶罐中，在pH6.0～7.5、常温下自溶6～8小时；③将鲍鱼浆料加10～50倍水置入无菌酶罐中，在pH6.0～7.5下，0～4℃自溶24～48小时。(2)外源酶酶解：将上述自溶的溶液用6mol/L的HCl调pH为1～5，加入溶液重量0.3～0.5％的胃蛋白酶，于40～60℃酶解1～2小时，酶解后调pH为中性，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加10～40倍水重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。
2)水提和双酶结合法：将原料处理中得到的鲍鱼浆料或鲍鱼干粉，加鲍鱼量10～50倍的水，在20～80℃浸提2～6小时；用6mol/L HCl调pH为1～5，加入溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在20～60℃搅拌酶解1～6小时，水解时保持上述pH值；`再用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为7～9，加入0.05～3.00％的胰蛋白酶，在20～60℃水浴中搅拌酶解1～6小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调pH为中性，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀也可加10～40倍水重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。
上述操作由于两种酶水解时需要pH值不同，所以分前后两次酶解；如果两种酶需要pH值相同则可同时加两种酶，一次酶解即成。如木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解时需要pH值相同，均为7～9，就可以在这一pH值下同时加其中两种酶。
3)超声波和单酶结合法：将原料处理中得到的鲍鱼浆料或鲍鱼干粉，加鲍鱼量10～50倍的水，用20～30KHZ超声波处理10～60分钟，离心分离得到上清液和不溶物。向不溶物中再添加10～40倍的水，用0.5mol/L的NaOH或KOH溶液调pH为7～9，加入木瓜蛋白酶，添加量为溶液重量的0.05～3.00％，20～60℃酶解1～6小时后，用酸调pH7，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；上清液待用，沉淀还可加10～40倍水重复上述步骤1～2次，离心分离的上清液合并待用。
从上述操作可以看出，超声波、碱液、水提和单酶、双酶以及复合酶结合都是可行的，仅仅是调整酶的最适合的pH值以及酶的添加量。
上述所有离心分离均为3000～6000转/分钟高速离心10分钟左右的操作。
三、鲍鱼多糖的浓缩
将上述所得的离心上清液，真空浓缩至多糖含量为1.5～3.0％。
四、鲍鱼多糖的醇沉
向浓缩液中加入3～4倍体积的95％乙醇，在0～4℃的温度下，醇沉12～16小时左右。
五、鲍鱼多糖的离心
醇沉后的多糖，高速离心10分钟左右，得到的沉淀即鲍鱼多糖。
六、鲍鱼多糖的干燥
鲍鱼多糖的干燥可以用如下任一方法均可达到目的：
1、将纯化得到的离心不溶物，在50～60℃的温度下，真空干燥，得到干燥的鲍鱼多糖。
2、将纯化得到的离心不溶物，用水稀释至比重为1.05～1.10左右，进行喷雾干燥，喷雾干燥设备入口温度160～180℃，出口温度50～60℃，得到干燥的鲍鱼多糖。
如果需要，还可将上述得到的鲍鱼多糖，用粉碎机粉碎至160目以下。
用本发明的方法提取的鲍鱼多糖为棕色粉末，多糖提取率为20％～40％(干品比)，多糖含量为6～18％，易溶于热水，微溶于冷水。可在食品行业广泛应用。如果再进一步纯化、脱蛋白，多糖含量可达40％～60％，可以广泛应用于药品行业。
本发明所具有的特点是：
1.工艺合理，开创了从鲍鱼体内(除壳外)提取鲍鱼多糖的工艺路线，极大限度地将鲍鱼多糖提取出来；
2.在提取工艺上，广泛地研究并确定了多种有效的提取方法；
3.由于鲍鱼多糖的药用用途的研究不断深入，其药用价值逐渐升值，本发明为提高其经济效益提供了技术基础；
4.除壳以外的鲍鱼体都用作提取原料，特别是可以利用鲍鱼的腹足和脏器提取多糖，既充分利用资源又无废料排放；
5.本发明中，采用了海洋生物的自溶技术，可以大大节约外源酶的使用量，降低成本。
具体实施方式：
实例1
取鲍鱼整体1000克，加水5000克，用组织捣碎机匀浆，加入25000克水，搅拌均匀，在50℃的温度下，浸提5小时后，高速离心，得到上清液和沉淀。将沉淀加入25000克水，搅拌均匀，在80℃的温度下，浸提3小时后，高速离心，得到上清液和沉淀。合并所得的上清液。将上清液真空浓缩至多糖含量为3％(苯酚硫酸法检测)；向浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇21000毫升，在4℃的温度下，醇沉16小时，高速离心10分钟左右，得到离心不溶物。将此不溶物在60℃的温度下，真空干燥，得到干燥的鲍鱼粗多糖61.6克。用粉碎机粉碎至160目以下。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为8.1％。
实例2
取冻干的鲍鱼整体粉1000克，加水50000克，搅拌均匀，向其中加入0.1N氢氧化钠溶液，调PH为9，在20℃的温度下，浸提6小时后，用6mol/L HCl中和至pH为7，高速离心，得到上清液和沉淀。向沉淀加水30000克，搅拌均匀，向其中加入0.5mol/L的NaOH溶液，调PH为8，在80℃的温度下，浸提3小时后，用6mol/L HCl中和至pH为7，高速离心，得到上清液和沉淀。合并所得的上清液。浓缩、醇化、离心如实例1。将此不溶物在50℃的温度下，真空干燥，得到干燥的鲍鱼粗多糖298克。用粉碎机粉碎至160目以下。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为9.3％。
实例3
取鲍鱼腹足1000克，处理如同实例1，用20KHZ超声波处理60分钟，高速离心，得到离心上清液和沉淀。将沉淀加入25000克水，用27KHZ超声波处理20分钟，高速离心，得到离心上清液和沉淀。合并所得的上清液。浓缩、醇化、离心如实例1。将此不溶物在50℃的温度下，真空干燥，得到干燥的鲍鱼多糖粗65.2克。用粉碎机粉碎至160目以下。其多糖含量为8.8％。
实例4：
取鲍鱼腹足1000克，处理如同实例1，向其中加入0.5mol/L的NaOH溶液，调pH为8，加入900克胰蛋白酶(酶活力2500u/mg)，在37℃的温度下，酶解5小时后，用6mol/L HCl调pH为7左右，5分钟升温至100℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心，得到上清液和和沉淀。将沉淀加入25000克水，向其中加入0.5mol/L的KOH溶液，调PH为8，加入150克胰蛋白酶(酶活力2500u/mg)，在50℃的温度下，酶解2小时后，用6mol/L HCl调pH为7左右，5分钟升温至90℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心，得到上清液和和沉淀。合并所得的上清液。浓缩、醇化、离心如实例1。将得到的离心不溶物，用水稀释至比重为1.07，进行喷雾干燥，入口温度160℃，出口温度50℃，得到干燥的鲍鱼多糖43.2克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为14.8％。
实例5：
取鲍鱼腹足干粉1000克，加入50000克水，搅拌均匀，用6mol/L HCl调pH为3，加入1500克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在50℃水浴中搅拌酶解2小时，水解时保持上述pH值；`再用0.5mol/L KOH液调pH为中性，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；沉淀加水30000克，加入500克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃水浴中搅拌酶解4小时，水解时保持上述pH值；`再用0.5mol/L的KOH溶液调pH为中性，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；离心分离的上清液合并待用。浓缩、醇化、离心如实例1。将得到的离心不溶物，用水稀释至比重为1.06，进行喷雾干燥，入口温度160℃，出口温度50℃，得到干燥的鲍鱼多糖236克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为13.9％。
实例6：
取鲍鱼腹足干粉1000克，加鲍鱼量50000克水，搅拌均匀，加入1000克的中性蛋白酶(酶活力为100u/mg)，在40℃水浴中搅拌酶解5小时，2分钟升温至90℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；沉淀加水30000克，加入150克的中性蛋白酶(酶活力为100u/mg)，在40℃水浴中搅拌酶解3小时，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀。合并所得的上清液。浓缩、醇化、离心如实例1。将得到的离心不溶物，用水稀释至比重为1.1，进行喷雾干燥，入口温度180℃，出口温度60℃，得到干燥的鲍鱼多糖225.5克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为14.2％。
实例7：
取鲍鱼腹足干粉1000克，加鲍鱼量40000克水，搅拌均匀，用0.5mol/L的KOH溶液调pH为8.5，加入600克木瓜蛋白酶(酶活力为1200u/mg)，在50℃水浴中搅拌酶解4小时，水解时保持上述pH值；`再用6mol/L HCl液调pH为中性，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；沉淀加水35000克，搅拌均匀，用0.5mol/L的KOH溶液调pH为9.0，加入175克木瓜蛋白酶(酶活力为1200u/mg)，在35℃水浴中搅拌酶解3小时，水解时保持上述pH值；`再用6mol/L HCl液调pH为中性，5分钟升温至90℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；合并所得的上清液。浓缩、醇化、离心如实例1。将得到的离心不溶物，用水稀释至比重为1.1，进行喷雾干燥，入口温度170℃，出口温度55℃，得到干燥的鲍鱼多糖234克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为15.2％。
实例8：
取鲍鱼脏器1000克，加水5000克，用组织捣碎机匀浆，加入25000克水，搅拌均匀，用6mol/L HCl调pH为1，加入900克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在35℃水浴中搅拌酶解2小时，水解时保持上述pH值；`再用0.5mol/L的KOH溶液调pH为9，加入300克胰蛋白酶(酶活力2500u/mg)，在55℃水浴中搅拌酶解4小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调pH为中性，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；沉淀加水10000克，重复上述步骤1次，离心分离的上清液合并待用。余下操作如实例7，得到干燥的鲍鱼多糖50.2克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为8.4％。
实例9：
取鲍鱼整体1000克，处理如同实例1，向其中加入0.5mol/L的KOH溶液，调pH为7，加入300克木瓜蛋白酶(酶活力为1200u/mg)、100克中性蛋白酶(酶活力为100u/mg)和100克胰蛋白酶(酶活力为2500u/mg)，在37℃的温度下，酶解6小时后，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温(20℃)，高速离心，得到上清液和沉淀。沉淀加水20000克，向其中加入0.5mol/L的KOH溶液，调pH为7，加入200克木瓜蛋白酶(酶活力为1200u/mg)、50克中性蛋白酶(酶活力为100u/mg)和20克胰蛋白酶(酶活力为2500u/mg)，在50℃的温度下，酶解4小时后，调pH为7左右，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温(20℃)，高速离心，得到上清液和沉淀。离心分离的上清液合并待用。余下操作如实例7，得到干燥的鲍鱼多糖50.9克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为14.6％。
实例10：
取鲍鱼整体1000克，处理如同实例1，将得到的浆液，用紫外线照射30分钟，用浓度为0.06mol/l的Nacl在PH7.5，50℃下自溶，获得的自溶液用6mol/LHCl调pH至5，加入150克胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃下酶解2小时。调PH为7，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心，得到离心上清液和和沉淀。将沉淀加入25000克水，用6mol/L HCl调pH至5，加入80克胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在60℃的温度下，酶解1小时后，用0.5mol/L的KOH溶液调pH为7左右，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心，得到上清液和和沉淀。合并所得的上清液。余下操作同实例1。得到干燥的鲍鱼粗多糖51.3克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为14.6％。
实例11：
取鲍鱼整体1000克，处理如同实例1，将得到的浆液，用紫外线照射10分钟，用浓度为0.08mol/l的Nacl在PH 7，30℃下自溶。余下操作同实例10。得到干燥的鲍鱼粗多糖50.9克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为14.4％。
实例12：
取鲍鱼脏器1000克，处理如同实例1，将得到的浆液放入无菌酶解罐中，调pH为6，常温自溶8小时；然后将获得的自溶液用6mol/L HCl调pH至3，加入30克胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃下酶解2小时。调PH为7，3分钟升温至90℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心，得到离心上清液和和沉淀。余下操作同实例10。得到干燥的鲍鱼粗多糖66.2克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为6.5％。
实例13：
取鲍鱼脏器1000克，处理如同实例1，将得到的浆液放入无菌酶解罐中，调pH为7.5，常温自溶6小时。将上述自溶的溶液用6mol/L HCl调pH为5，加入溶液重量100克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，于40℃酶解1～2小时，酶解后调pH为中性，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀，沉淀加水重复上述步骤1次，离心分离的上清液合并待用。余下操作同实例10。得到干燥的鲍鱼粗多糖64.8克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为6.8％。
实例14：
取鲍鱼腹足1000克，处理如同实例1，50℃浸提3小时，用6mol/L HCl调pH为3，加入150克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃水浴中搅拌酶解5小时，水解时保持上述pH值；`再用0.5mol/L的KOH溶液调pH为7～9，加入100克的胰蛋白酶，在.55℃水浴中搅拌酶解2小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调pH为中性，5分钟升温至98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀；沉淀加水重复上述步骤1次，离心分离的上清液合并待用。浓缩、醇化、离心如实例1。将得到的离心不溶物，用水稀释至比重为1.08，进行喷雾干燥，入口温度170℃，出口温度55℃，得到干燥的鲍鱼多糖50.3克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为16.1％。
实例15：
取鲍鱼腹足1000克，处理如同实例1，用20KHZ超声波处理60分钟，离心分离得到上清液和不溶物。向不溶物中再添加25000克水，用0.5mol/L的KOH溶液调pH为8.0，加入500克木瓜蛋白酶(酶活力为1200u/mg)，酶解4小时后，用6mol/L HCl调pH为7，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀。合并上清液。浓缩、醇化、离心如实例1。将得到的离心不溶物，用水稀释至比重为1.08，进行喷雾干燥，入口温度180℃，出口温度50℃，得到干燥的鲍鱼多糖49.2克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为15.8％。
实例16：
取鲍鱼腹足1000克，处理如同实例1，用30KHZ超声波处理30分钟，离心分离得到上清液和不溶物。向不溶物中再添加25000克水，用6mol/L HCl调pH为3，加入100克的胃蛋白酶(酶活50u/mg)，在40℃水浴中搅拌酶解5小时，水解时保持上述pH值；`再用0.5mol/L的KOH溶液调pH为7～9，加入80克的胰蛋白酶，在.55℃水浴中搅拌酶解2小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调pH为中性，5分钟升温至95℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离，得上清液和沉淀。离心分离的上清液合并待用。浓缩、醇化、离心如实例1。将得到的离心不溶物，用水稀释至比重为1.10，进行喷雾干燥，入口温度180℃，出口温度55℃，得到干燥的鲍鱼多糖58.2克。用苯酚硫酸法检测，其多糖含量为17.4％。
Claims (19)
1、鲍鱼多糖的提取方法，包括鲍鱼经原料处理、提取、浓缩、醇沉、干燥的工艺步骤而得产品；
其中所述原料处理是去壳整体鲍鱼肉用组织捣碎机破壁，加5～10倍水匀浆；
所述提取是将经处理好的鲍鱼原料加10～50倍水搅拌混合均匀，在20～60℃下浸提1～6小时，离心分离得不溶物和上清液，不溶物加10～30倍水，重复1～2次上述操作，上清液合并；
所述浓缩是将提取所得清液浓缩至含糖1.5～3.0％；
所述醇沉是加浓缩液3～4倍体积的95％乙醇，在0～4℃下放置12～16小时，离心分离，得不溶物即鲍鱼多糖；
所述干燥是将醇沉所得鲍鱼多糖50～60℃真空干燥而得到产品。
2、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述原料处理是从去壳整体鲍鱼肉分离得到鲍鱼腹足和脏器，可以分别或混匀加入5～10倍水用组织捣碎机破壁、匀浆待用。
3、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述原料处理是去壳整体鲍鱼肉、分离得到鲍鱼的腹足和脏器分别或混匀冻干或烘干、粉碎，其粒度为在100目以下而成的干粉。
4、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将经处理的鲍鱼原料加10～50倍水搅拌混合均匀，用20～30KHZ超声波处理10～60分钟，离心分离得不溶物和上清液加10～30倍水，重复1～2次上述操作，上清液合并。
5、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将经处理的鲍鱼原料加10～50倍水搅拌混合均匀，用NaOH或KOH调整其pH值8～9，在20～60℃提取1～6小时，离心分离得不溶物和上清液，加10～30倍水，再次用NaOH或KOH调整其pH值8～9，重复1～2次上述操作，上清液合并，用HCl中和至中性。
6、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将经处理的鲍鱼原料加10～50倍水搅拌混合均匀，用HCl调整其pH值2～5，加溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，搅拌均匀，在20～60℃处理1～6小时，速升温90～98℃灭酶10分钟，速冷至20～30℃，离心分离得不溶物和上清液，上清液用NaOH或KOH调整其pH为中性。
7、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将经处理的鲍鱼原料加10～50倍水搅拌混合均匀，用NaOH或KOH调整其pH值8～9，加溶液重0.05～3.00％的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，搅拌均匀，在20～60℃处理1～6小时，速升温90～98℃灭酶10分钟，速冷至20～30℃，离心分离得不溶物和上清液，上清液用NaOH或KOH调整其pH为中性。
8、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将经处理的鲍鱼原料加10～50倍水搅拌混合均匀，用NaOH或KOH调整其pH值8～9，加溶液重量0.05～3.00％的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，其两比为1∶0.01～1.0，搅拌均匀，在20～60℃处理1～6小时，速升温90～100℃灭酶10分钟，速冷至20～30℃，离心分离得不溶物和上清液，上清液用Hcl中和至中性。
9、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将原料处理后得到的鲍鱼原料，加10～50倍的水，用HCl调pH1～5，加入溶液重量的0.05～3.00％胃蛋白酶，在20～60℃水浴中搅拌酶解1～6小时，同时保持pH在上述范围内；再用NaOH或KOH调pH7～9，加入溶液重量的0.05～3.00％胰蛋白酶，在20～60℃水浴中搅拌酶解1～6小时，同时保持pH在上述范围内；酶解后调pH为7左右，2～5分钟升温至90～100℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心得不溶物和上清液。
10、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将经处理的鲍鱼原料加10～50倍水搅拌混合均匀，用NaOH或KOH调pH为7～9，加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，添加总量为溶液重量的0.05～3.00％，三种酶的比例为1∶0.01～1∶0.01～1，在20～60℃的温度下，酶解1～6小时后，调pH为7左右，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温(20℃)，高速离心得不溶物和上清液。
11、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将经处理的鲍鱼原料的浆液，用紫外线照射10～30分钟，用浓度为0.06～0.08mol/l的NaCl在PH7～7.5，温度为30～50℃，使其利用自身的酶自溶；用6摩尔/升HCl调pH至1～5，加入溶液重量的0.05～3.00％胃蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小时；调PH为7左右，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心10分钟左右得不溶物和上清液。
12、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将鲍鱼内脏的浆液放入无菌酶解罐中，于pH6～7.5、常温自溶6～8小时；用HCl调pH至1～5，加入溶液重量的0.05～3.00％胃蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小时，调PH为7左右，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心10分钟左右，得到不溶物和上清液。
13、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将鲍鱼内脏的浆液放入无菌酶解罐中，于pH6～7.5、于0～4℃温度下自溶24～48小时；用HCl调pH至1～5，加入溶液重量的0.05～3.00％胃蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小时；调PH为7左右，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟内冷却至室温，高速离心10分钟左右，得不溶物和上清液。
14、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将原料处理后的鲍鱼原料，加鲍鱼量10～50倍的水，在20～80℃浸提3～6小时；用HCl调pH为1～5，加入溶液重量0.05～3.00％的胃蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小时，水解时保持上述pH值；再用0.5mol/LNaOH或KOH液调pH为7～9，加入0.05～3.00％的胰蛋白酶，在20～60℃酶解1～6小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调pH为中性，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离得不溶物和上清液。
15、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将原料处理后的鲍鱼原料，加鲍鱼量10～50倍的水，在20～80℃浸提3～6小时；用NaOH或KOH液调pH为7～9，加入溶液重量0.05～3.00％的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的两两组合，在20～60℃水浴中搅拌酶解1～6小时，水解时保持上述pH值；酶解后用酸调pH为中性，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离得不溶物和上清液。
16、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取是将原料处理后的鲍鱼原料，加鲍鱼量10～50倍的水，用20～30KHZ超声波处理10～60分钟，离心分离得到上清液和不溶物；向不溶物中再添加15～25倍的水，用0.5mol/LNaOH或KOH液调pH为7～9，加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或其两两组合，添加量为溶液重量的0.05～3.00％，在20～60℃酶解1～6小时后，用酸调pH7，2～5分钟升温至90～98℃灭酶10分钟，5分钟冷至室温，离心分离得不溶物和上清液；得上清液和沉淀；沉淀加水重复上述步骤1～2次，离心分离得上清液。
17、根据权利要求6～15中任一项权利要求所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述提取中离心分离所得的不溶物加10～40倍水，重复提取1～2次，离心分离所得的全部上清液合并。
18、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述干燥是将醇沉所得鲍鱼多糖在50～60℃下真空干燥。
19、根据权利要求1所述鲍鱼多糖的提取方法，其特征在于所述干燥是将纯化醇沉所得鲍鱼多糖用水稀释至其比重为1.05～1.10，进行喷雾干燥，喷雾干燥装置出、入口温度分别为50～60℃和160～180℃。
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