CN108866135B - 一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的鲎血蛋白水解肽的制备方法 - Google Patents

一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的鲎血蛋白水解肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有α‑葡萄糖苷酶抑制活性的鲎血蛋白水解肽的制备方法。本发明是以制备鲎试剂残留的废血细胞组织为原料，通过碱性蛋白酶酶解，冷冻离心得鲎血蛋白活性肽。本发明采用碱性蛋白酶酶解，酶种单一不复杂，且只需在一定的pH、温度和浓度条件下，将酶液与样品混合进行制备，操作条件温和，步骤不繁琐，生产效率高；本发明获得鲎血蛋白活性肽是一种生物蛋白水解肽，易吸收，无副作用，不仅能有效抑制α‑葡萄糖苷酶还可以清除羟自由基，可应用于制备糖尿病的药物和辅助治疗药物；本发明方法解决了生产废料的再利用问题，不仅提高原料利用率、还扩大了鲎血的应用范围。

Description

一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的鲎血蛋白水解肽的制备 方法
技术领域
本发明涉及一种血蛋白水解肽的制备方法，具体是一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的鲎血蛋白水解肽的制备方法，属于天然活性物质提取技术领域。
背景技术
糖尿病是由于胰岛素分泌不足导致血糖过高代谢障碍，是一种严重危害人类健康的疾病，糖尿病时长期存在的高血糖，使各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。根据世界卫生组织最近估计，2030年预计全球患者将会达到3.66亿，导致全球每年有320万人死亡。目前我国是糖尿病的第二高发病国，患病率为2.51%，预计今后将以每年100万的数量增加。
糖尿病的治疗手段主要靠药物，α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药是临床使用的主要降糖药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂的降糖机制是，通过抑制肠黏膜上的α-葡萄糖苷酶，使淀粉分解为葡萄糖的速度减缓，减少和延缓小肠对葡萄糖的吸收，以降低血糖，其对餐后高血糖的作用比较明显，而且不抑制蛋白质和脂肪的吸收，不会造成营养物质的吸收障碍，不良反应较少。不良反应主要表现为腹胀、腹痛、腹泻、恶心、呕吐，也可出现胃肠痉挛性疼痛、顽固性便秘等，少数患者可见乏力、眩晕及皮肤瘙痒等。葡萄糖苷酶抑制剂不刺激胰岛素的分泌，单独使用此类药物通常不会引发低血糖，因此可帮助减少血糖的波动，可以明显降低糖尿病患者发生心血管病变的概率，对心肌梗死的改善作用最为显著。目前，临床常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要是阿卡波糖、伏格列波糖，有必要加大力度对α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选，扩大药源。
鲎具有多种先天性免疫的防御系统，是血液学研究的绝好材料，鲎血蛋白的多种功能使得其有很高的研究利用价值，开发鳖血蛋白不仅可以合理利用资源，而且为血肽制品的开发研制提供依据。鲎最常见的开发是制备鲎试剂，用于制药、临床以及科研等领域，用于细菌内毒素和真菌葡聚糖检测。鲎试剂的制备过程，鲎血是主要的生产废料，其中仍含有可利用的成分，将这一生产废料再利用，不仅可提高原料利用率、还可扩大了鲎血的应用范围。
发明内容本发明的目的在于提供一种利用鲎试剂生产废料制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的鲎血蛋白水解肽的方法，解决现有鲎试剂生产废料的综合利用问题，为糖尿病的药物和辅助治疗药物。
本发明的技术方案如下：一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的鲎血蛋白水解肽的制备方法，包括如下具体步骤：
（1）将鲎血血细胞置于低温下冷冻，然后在4℃融化，反复三次；在4℃下磁力搅拌5-10min，使鲎血细胞破裂；
（2）将步骤（1）处理后的鲎血血细胞低温离心，离心转速4000-5000r/min，收集固体沉淀，并用蒸馏水冲洗至无杂质，即得到鲎血细胞组织；
（3）用碱性蛋白酶酶解鲎血细胞组织，酶解条件：pH 9.0-11.0，酶解温度48-58℃，酶浓度1.5-2.5mg/mL，底物浓度5.0-7.0 mg/mL，酶解时间4-6h，得酶解液；
（4）将酶解液置于低温冷冻离心机中，离心分离，得上清液，冷冻干燥上清液，获得鲎血细胞蛋白水解肽。
优选的，步骤（1）所述鲎血血细胞置于-18℃下低温冷冻12 h，然后4℃融化，在4℃下磁力搅拌5min。
优选的，步骤（2）所述低温为4℃；离心转速4000r/min，离心时间20min；蒸馏水冲洗至无杂质。
优选的，步骤（3）所述碱性蛋白酶用量为2mg/mL。
进一步的，步骤（3）所述酶解条件为：pH10.0，酶解温度55℃，酶浓度2mg/mL，底物浓度 6.4mg/mL，酶解时间5h。
优选的，步骤（4）所述低温为4℃，离心分离条件：4000 r/min，20min。
测试采用本发明方法制得的水解肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果显示其对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50达到0.073mg/mL，实验过程中采用糖尿病药物阿卡波糖作为阳性对照，而阿卡波糖的半抑制浓度IC50为0.024mg/mL。鲎血细胞蛋白水解肽浓度为0.12mg/mL时，对羟自由基的抑制率是49.5%。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明通过低温-18℃下冷冻，然后4℃冻融和磁力搅拌，工艺简单，易操作；
（2）用碱性蛋白酶酶解鲎血细胞组织，酶种单一不复杂，且只需在一定的pH、温度和浓度条件下，将酶液与样品混合，操作条件温和，步骤不繁琐，生产效率高；
（3）获得的产物鲎血蛋白活性肽是一种生物蛋白水解肽，易吸收，无副作用，不仅能有效抑制α-葡萄糖苷酶还可以清除羟自由基，可应用制备糖尿病的药物和辅助治疗药物；
（4）本发明是以鲎试剂生产废料鲎血血细胞为原料，解决了生产废料的再利用问题，提高了原料的利用率。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，本发明实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1 采用以下步骤实现本发明：
（1）将鲎血血细胞置于-18℃下低温冷冻12h，然后在4℃融化，反复三次；在4℃下磁力搅拌15-25min，使鲎血细胞破裂；
（2）将步骤（1）处理后的鲎血血细胞在4℃低温离心20min，离心转速4000r/min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗至无杂质，即得到鲎血细胞组织；
（3）用碱性蛋白酶酶解鲎血细胞组织，酶解条件：pH10.0，酶解温度55℃，酶浓度2mg/mL，底物浓度6.4 mg/mL，酶解时间5h，得酶解液；
（4）将酶解液置于低温冷冻离心机中，在4℃以4000r/min离心分离20min，得上清液，冷冻干燥上清液，获得鲎血细胞蛋白水解肽。
测试获得的鲎血细胞水解肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果显示其对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50达到0.073mg/mL，实验过程中采用糖尿病药物阿卡波糖作为阳性对照，而阿卡波糖的半抑制浓度IC50为0.024mg/mL。鲎血细胞蛋白水解肽浓度为0.12mg/mL时，对羟自由基的抑制率是49.5%。
实施例2 采用以下步骤实现本发明：
（1）将鲎血血细胞置于-18℃下低温冷冻12h，然后在4℃融化，反复三次；在4℃下磁力搅拌5-10min，使鲎血细胞破裂；
（2）将步骤（1）处理后的鲎血血细胞在4℃低温离心20min，离心转速4000r/min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗至无杂质，即得到鲎血细胞组织；
（3）用木瓜蛋白酶酶解鲎血细胞组织，酶解条件：pH7.0，酶解温度55℃，酶浓度2mg/mL，底物浓度6.4 mg/mL，酶解时间5h，得酶解液；
（4）将酶解液置于低温冷冻离心机中，在4℃以4000r/min离心分离20min，得上清液，冷冻干燥上清液，获得鲎血细胞蛋白水解肽。
测试获得的鲎血细胞水解肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果显示其对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50达到1.671mg/mL，实验过程中采用糖尿病药物阿卡波糖作为阳性对照，而阿卡波糖的半抑制浓度IC50为0.024mg/mL。鲎血细胞蛋白水解肽浓度为0.12mg/mL时，对羟自由基的抑制率是12.4%。
实施例3 采用以下步骤实现本发明：
（1）将鲎血血细胞置于-18℃下低温冷冻12h，然后在4℃融化，反复三次；在4℃下磁力搅拌5-10min，使鲎血细胞破裂；
（2）将步骤（1）处理后的鲎血血细胞在4℃低温离心20min，离心转速4000r/min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗至无杂质，即得到鲎血细胞组织；
（3）用胃蛋白酶酶解鲎血细胞组织，酶解条件：pH2.0，酶解温度37℃，酶浓度2mg/mL，底物浓度 6.4mg/mL，酶解时间4h，得酶解液；
（4）将酶解液置于低温冷冻离心机中，在4℃以4000r/min离心分离20min，得上清液，冷冻干燥上清液，获得鲎血细胞蛋白水解肽。
测试获得的鲎血细胞水解肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果显示其对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50达到0.199mg/mL，实验过程中采用糖尿病药物阿卡波糖作为阳性对照，而阿卡波糖的半抑制浓度IC50为0.024mg/mL。鲎血细胞蛋白水解肽浓度为0.12mg/mL时，对羟自由基的抑制率是35.9%。
实施例4 采用以下步骤实现本发明：
（1）将鲎血血细胞置于-18℃下低温冷冻12h，然后在4℃融化，反复三次；在4℃下磁力搅拌5-10min，使鲎血细胞破裂；
（2）将步骤（1）处理后的鲎血血细胞在4℃低温离心20min，离心转速4000r/min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗至无杂质，即得到鲎血细胞组织；
（3）用胰蛋白酶酶解鲎血细胞组织，酶解条件：pH8.0，酶解温度37℃，酶浓度2mg/mL，底物浓度6.4 mg/mL，酶解时间4h，得酶解液；
（4）将酶解液置于低温冷冻离心机中，在4℃以4000r/min离心分离20min，得上清液，冷冻干燥上清液，获得鲎血细胞蛋白水解肽。
测试获得的鲎血细胞水解肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果显示其对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50达到0.903mg/mL，实验过程中采用糖尿病药物阿卡波糖作为阳性对照，而阿卡波糖的半抑制浓度IC50为0.024mg/mL。鲎血细胞蛋白水解肽浓度为0.12mg/mL时，对羟自由基的抑制率是16.1%。
实施例5 采用以下步骤实现本发明：
（1）将鲎血血细胞置于-18℃下低温冷冻12h，然后在4℃融化，反复三次；在4℃下磁力搅拌5-10min，使鲎血细胞破裂；
（2）将步骤（1）处理后的鲎血血细胞在4℃低温离心20min，离心转速4000r/min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗至无杂质，即得到鲎血细胞组织；
（3）用胰酶粉酶解鲎血细胞组织，酶解条件：pH8.0，酶解温度55℃，酶浓度2mg/mL，底物浓度6.4 mg/mL，酶解时间5h，得酶解液；
（4）将酶解液置于低温冷冻离心机中，在4℃以4000r/min离心分离20min，得上清液，冷冻干燥上清液，获得鲎血细胞蛋白水解肽。
测试获得的鲎血细胞水解肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果显示其对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50达到18.261mg/mL，实验过程中采用糖尿病药物阿卡波糖作为阳性对照，而阿卡波糖的半抑制浓度IC50为0.024mg/mL。鲎血细胞蛋白水解肽浓度为0.12mg/mL时，对羟自由基的抑制率是7.48%。
实施例1-5获得的鲎血细胞水解肽的对比
实施例 酶种类 pH 温度 肽得率 对α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度（mg/mL） 羟自由基的清除率
实施例1 碱性蛋白酶 10.0 55℃ 9.50% 0.073 49.5%
实施例2 木瓜蛋白酶 7.0 55℃ 8.17% 1.671 12.4%
实施例3 胃蛋白酶 2.0 37℃ 6.83% 0.199 35.9%
实施例4 胰蛋白酶 8 37 7.67% 0.903 16.1%
实施例5 胰酶粉 8 55 11.67% 18.261 7.48%

Claims (6)

1.一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的鲎血蛋白水解肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将鲎血血细胞置于低温下冷冻，然后在4℃融化，反复三次；在4℃下磁力搅拌5-10min，使鲎血细胞破裂；
（2）将步骤（1）处理后的鲎血血细胞低温离心，离心转速4000-5000r/min，收集固体沉淀，并用蒸馏水冲洗，即得到鲎血细胞组织；
（3）用碱性蛋白酶酶解鲎血细胞组织，酶解条件：pH 9.0-11.0，酶解温度48-58℃，酶浓度 1.5-2.5mg/mL，底物浓度5.0-7.0mg/mL，酶解时间4-6h，得酶解液；
（4）将酶解液置于低温冷冻离心机中，离心分离，得上清液，冷冻干燥上清液，获得鲎血细胞蛋白水解肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述鲎血血细胞置于-18℃下低温冷冻12h，然后4℃融化，在4℃下磁力搅拌10min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述低温为4℃；离心转速4000r/min，离心时间20min；蒸馏水冲洗至无杂质。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述碱性蛋白酶用量为2mg/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述酶解条件为：pH10.0，酶解温度55℃，酶浓度2mg/mL，底物浓度6.4mg/mL，酶解时间5h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述低温为4℃，离心分离条件为4000 r/min离心20min。
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