CN107857823A - 木耳多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了木耳多糖的提取方法，其具体步骤为：将木耳超微粉碎得木耳超微粉；向木耳超微粉加水，加入酵母破壁酶进行酶解破壁，得木耳酶解液和木耳渣；向木耳渣中加水，微波提取得木耳提取液；将木耳酶解液和木耳提取液合并，过滤，加入蛋白酶酶解，离心，再将上清液用Sevage法去蛋白得脱蛋白多糖液；将脱蛋白多糖液浓缩，再利用乙醇沉淀多糖，离心，沉淀冷冻干燥得木耳多糖。本发明提取方法简单可行，木耳多糖的提取率高、纯度高，具有良好的应用价值和市场潜力；能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，保持多糖的活性不被破坏。

Description

木耳多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及天然活性成分提取领域，特别涉及木耳多糖的提取方法。

背景技术

木耳(Auriculariaauriculajudae)又称耳子、光木耳，属真菌门担子菌纲的食药用菌，它是生长在朽木上的一种腐生菌，由菌丝体和子实体两部分组成。木耳味道鲜美、营养丰富，不仅仅是营养价值很高的食用菌，同时也是药用价值较高的药用菌，是世界公认的保健品。从药用价值看，木耳具有延缓衰老、辅助降血脂、抗凝血、抗癌、增加免疫、辅助降血糖、抗氧化等功能，大量研究表明，食用菌的生理功能与其多糖成分密切相关，因此近年来对于多糖的研究也层出不穷。天然多糖类物质作为一类重要的生物大分子，近些年来，人们对其生物学功能有了许多新的认识和发现，已成为生命科学的研究热点，多糖在食品和医药领域的应用也展示出诱人的前景。且随着食用菌多糖的研究进展，对木耳多糖的研究也逐渐成为热点。木耳子实体含酸性粘多糖，由L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和葡萄糖醛酸等单糖组成。从木耳中提取的木耳多糖，具有降血糖、降血脂、降低胆固醇、抑制血小板聚集、提高机体免疫功能、抗血栓形成、抗衰老、抗溃疡、抗放射的功效。木耳多糖目前的提取方式主要有:热水浸提法、碱浸提法、酶法、超声波辅助萃取法、微波辅助提取法等。

现有技术如授权公告号为CN103641924B的中国发明专利，公开了一种从木耳中提取木耳多糖的方法，其是选取干木耳为原料，经浸泡、清洗、捣碎后加入纤维素酶，控制酶解条件酶解破除细胞壁；酶解后的木耳渣采取热水浸提；木耳酶解液与木耳浸提液合并后经过滤，再加入鞣酸溶液去除过滤液中的蛋白，离心收集的多糖溶液采用乙醇溶液醇沉；最后经真空干燥而成多糖产品。上述提取方法工艺合理，操作简单，成分保留全面，多糖得率及纯熟高，产品安全性好。该提取方法利用鞣酸溶液去除过滤液中的蛋白，会引起木耳多糖的变性，进而影响木耳多糖的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，机械化操作成度高，耗时短，木耳多糖的提取率高、纯度高，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力的木耳多糖的提取方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

木耳多糖的提取方法，包括超微粉碎、酶解破壁、微波提取、酶解法-Sevage法除蛋白、醇沉，其具体步骤为：

超微粉碎：将木耳洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.011-0.013向木耳粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得木耳超微粉，备用，助磨剂为重量比为1:0.33-0.38的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物，超微粉碎可使木耳加工成微微纳米级的微粉，使得部分木耳细胞破壁，进而使多糖被大量的释放出来，从而使得多糖溶出率增大，而助磨剂的加入可防止大分子的多糖结构在超微粉碎时发生断裂而产生寡糖，减少了多糖在超微粉碎中的损失，避免超微粉碎对多糖平均分子量的影响，保持多糖的活性不被破坏，且助磨剂可在后续多糖提取及纯化步骤中彻底除去，无残留；

酶解破壁：按料料液比为1:25-30向木耳超微粉超微加水，搅拌均匀，按酶添加量为300-500U/g加入酵母破壁酶，再加入山梨醇缓冲液和β-巯基乙醇，在温度为25-35℃下酶解70-90min，酶解完成后在90-100℃下灭酶20-30min，然后在4000-6000rpm下离心14-18rnin，得木耳酶解液和木耳渣，该破壁方法温和、无残留、破壁效果好，能有效提高木耳多糖的提取率，缩短提取时间；

微波提取：按料液比为1:10-13向木耳渣中加水，在温度为70-80℃、功率为700-1000W下微波提取3-5min，然后在4000-6000rpm下离心14-18rnin，重复提取2-3次，合并上清液得木耳提取液，该步骤中细胞壁受到高频的电磁波影响后导致细胞内温度迅速升高，压力增大，使其破裂、溶解并释放出胞内多糖大大加速了提取过程；

酶解法-Sevage法除蛋白：将木耳酶解液和木耳提取液合并，然后采用100-200目的滤布进行过滤，去除木耳小颗粒及其他不溶性杂质，按酶添加量为200-300U/g和300-500U/g依次加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为50-60℃、pH为7.7-8.5的条件下酶解2-3h，酶解完成后在90-100℃下灭酶20-30min，冷却至室温，然后在4000-6000rpm下离心8-12min，再将上清液中以体积比1:3-5加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇20-30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2-3次，得到脱蛋白多糖液，酶解法能够将糖液中游离的蛋白质和部分糖蛋白水解，从而大大的降低多糖中的蛋白质含量，但是加酶量不适宜易引入外来的蛋白质，因此在酶解之后，再用Sevage法处理，能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，并保证多糖的存在，有效的降低了多糖的损失率；

醇沉：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的20-30%，再加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，进行沉淀多糖，静置过夜，在6000-8000rpm下离心15-20min，沉淀冷冻干燥得木耳多糖。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提取方法简单可行，机械化操作成度高，耗时短，能够提高原材料的利用率，木耳多糖的提取率高、纯度高，易于工业化规模生产，具有良好的应用价值和市场潜力；本发明采用超微粉碎和助磨剂相结合，使得部分木耳细胞破壁，进而使多糖被大量的释放出来，从而使得多糖溶出率增大，同时可防止大分子的多糖结构在超微粉碎时发生断裂而产生寡糖，保持多糖的活性不被破坏；本发明能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，并保证多糖的存在，有效的降低了多糖的损失率，且反应条件温和，试剂使用量少，符合国家倡导的绿色生产。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

木耳多糖的提取方法，包括超微粉碎、酶解破壁、微波提取、酶解法-Sevage法除蛋白、醇沉，其具体步骤为：

1）超微粉碎：将木耳洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.011-0.013向木耳粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得木耳超微粉，备用，助磨剂为重量比为1:0.33-0.38的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物；

2）酶解破壁：按料料液比为1:25-30向木耳超微粉超微加水，搅拌均匀，按酶添加量为300-500U/g加入酵母破壁酶，再加入山梨醇缓冲液和β-巯基乙醇，在温度为25-35℃下酶解70-90min，酶解完成后在90-100℃下灭酶20-30min，然后在4000-6000rpm下离心14-18rnin，得木耳酶解液和木耳渣；

3）微波提取：按料液比为1:10-13向木耳渣中加水，在温度为70-80℃、功率为700-1000W下微波提取3-5min，然后在4000-6000rpm下离心14-18rnin，重复提取2-3次，合并上清液得木耳提取液；

4）酶解法-Sevage法除蛋白：将木耳酶解液和木耳提取液合并，然后采用100-200目的滤布进行过滤，去除木耳小颗粒及其他不溶性杂质，按酶添加量为200-300U/g和300-500U/g依次加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为50-60℃、pH为7.7-8.5的条件下酶解2-3h，酶解完成后在90-100℃下灭酶20-30min，冷却至室温，然后在4000-6000rpm下离心8-12min，再将上清液中以体积比1:3-5加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇20-30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复2-3次，得到脱蛋白多糖液；

5）醇沉：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的20-30%，再加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，进行沉淀多糖，静置过夜，在6000-8000rpm下离心15-20min，沉淀冷冻干燥得木耳多糖。

实施例2：

木耳多糖的提取方法，包括超微粉碎、酶解破壁、微波提取、酶解法-Sevage法除蛋白、醇沉，其具体步骤为：

1）超微粉碎：将木耳洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.013向木耳粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得木耳超微粉，备用，助磨剂为重量比为1:0.33的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物；

2）酶解破壁：按料料液比为1:30向木耳超微粉超微加水，搅拌均匀，按酶添加量为500U/g加入酵母破壁酶，再加入山梨醇缓冲液和β-巯基乙醇，在温度为25℃下酶解70min，酶解完成后在100℃下灭酶20min，然后在6000rpm下离心14rnin，得木耳酶解液和木耳渣；

3）微波提取：按料液比为1:11向木耳渣中加水，在温度为80℃、功率为700W下微波提取5min，然后在6000rpm下离心14rnin，重复提取3次，合并上清液得木耳提取液；

4）酶解法-Sevage法除蛋白：将木耳酶解液和木耳提取液合并，然后采用100-200目的滤布进行过滤，去除木耳小颗粒及其他不溶性杂质，按酶添加量为200U/g和500U/g依次加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为50℃、pH为8.5的条件下酶解3h，酶解完成后在100℃下灭酶20min，然后在6000rpm下离心14rnin，再将上清液中以体积比1:3加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇30min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复3次，得到脱蛋白多糖液；

5）醇沉：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的20%，再加入5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，进行沉淀多糖，静置过夜，在6000rpm下离心20min，沉淀冷冻干燥得木耳多糖。

实施例3：

木耳多糖的提取方法，包括超微粉碎、酶解破壁、微波提取、酶解法-Sevage法除蛋白、醇沉，其具体步骤为：

1）超微粉碎：将木耳洗净，烘干，粗粉碎，按重量比1000:0.012向木耳粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得木耳超微粉，备用，助磨剂为重量比为1:0.35的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物；

2）酶解破壁：按料料液比为1:27向木耳超微粉超微加水，搅拌均匀，按酶添加量为400U/g加入酵母破壁酶，再加入山梨醇缓冲液和β-巯基乙醇，在温度为30℃下酶解80min，酶解完成后在98℃下灭酶25min，然后在5000rpm下离心16rnin，得木耳酶解液和木耳渣；

3）微波提取：按料液比为1:12向木耳渣中加水，在温度为75℃、功率为800W下微波提取4min，然后在5000rpm下离心16rnin，重复提取2次，合并上清液得木耳提取液；

4）酶解法-Sevage法除蛋白：将木耳酶解液和木耳提取液合并，然后采用200目的滤布进行过滤，去除木耳小颗粒及其他不溶性杂质，按酶添加量为250U/g和400U/g依次加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在温度为55℃、pH为8.0的条件下酶解2.5h，酶解完成后在98℃下灭酶25min，冷却至室温，然后在5000rpm下离心16rnin，再将上清液中以体积比1:4加入Sevage试剂，混合后剧烈振摇25min，静置分层，分去下层变性蛋白质及交界处有机溶剂，反复3次，得到脱蛋白多糖液；

5）醇沉：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的25%，再加入4倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，进行沉淀多糖，静置过夜，在7000rpm下离心18min，沉淀冷冻干燥得木耳多糖。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.木耳多糖的提取方法，包括超微粉碎、酶解破壁、微波提取、酶解法-Sevage法除蛋白、醇沉，其特征在于：所述超微粉碎步骤为：将木耳洗净，烘干，粗粉碎，向木耳粗粉加入助磨剂，超微粉碎，即得木耳超微粉。

2.根据权利要求1所述的木耳多糖的提取方法，其特征在于：所述超微粉碎步骤中木耳粗粉和助磨剂的重量比1000:0.011-0.013，所述助磨剂为重量比为1:0.33-0.38的甲苯磺丁脲和伏格列波糖混合物。

3.根据权利要求1所述的木耳多糖的提取方法，其特征在于：所述酶解破壁步骤为：向木耳超微粉超微加水，搅拌均匀，加入酵母破壁酶，再加入山梨醇缓冲液和β-巯基乙醇，酶解，灭酶，离心，得木耳酶解液和木耳渣。

4.根据权利要求1所述的木耳多糖的提取方法，其特征在于：所述酶解破壁步骤中按料料液比为1:25-30，酶添加量为300-500U/g，酶解温度为25-35℃，酶解时间为70-90min。

5.根据权利要求1所述的木耳多糖的提取方法，其特征在于：所述微波提取步骤为：按料液比为1:10-13向木耳渣中加水，在温度为70-80℃、功率为700-1000W下微波提取3-5min，然后将提取液离心，重复提取2-3次，合并上清液得木耳提取液。

6.根据权利要求1所述的木耳多糖的提取方法，其特征在于：所述酶解法-Sevage法除蛋白步骤为：将木耳酶解液和木耳提取液合并，过滤，加入木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，酶解，灭酶，冷却至室温，离心，再将上清液用Sevage法处理，得到脱蛋白多糖液。

7.根据权利要求1所述的木耳多糖的提取方法，其特征在于：所述酶解法-Sevage法除蛋白步骤中木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的添加量为200-300U/g和300-500U/g，酶解温度为50-60℃、pH为7.7-8.5、时间为2-3h。

8.根据权利要求1所述的木耳多糖的提取方法，其特征在于：所述酶解法-Sevage法除蛋白步骤中上清液和Sevage试剂的体积比为1:3-5。

9.中以体积比1:3-5加入根据权利要求1所述的木耳多糖的提取方法，其特征在于：所述醇沉步骤为：将脱蛋白多糖液浓缩至原体积的20-30%，再加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇，静置过夜，离心，沉淀冷冻干燥得木耳多糖。