TWI483733B

TWI483733B - Ｔｆｐｉ抑制劑及使用方法

Info

Publication number: TWI483733B
Application number: TW100120081A
Authority: TW
Inventors: Michael Dockal; Rudolf Hartmann; Markus Fries; Friedrich Scheiflinger; Hartmut Ehrlich; Ulrich Reineke; Frank Osterkamp; Thomas Polakowski
Original assignee: Baxter Int; Baxter Healthcare Sa
Priority date: 2011-02-11
Filing date: 2011-06-09
Publication date: 2015-05-11
Also published as: AR084969A1; TW201233394A

Description

TFPI抑制劑及使用方法

本發明大體上係關於結合組織因子路徑抑制劑(TFPI)之肽及其用途。

【以引用方式併入】

本申請案主張2010年3月19日申請之美國臨時專利申請案第61/315,758號之優先權，該臨時專利申請案據此以全文引用的方式併入本文中。以下申請案亦以全文引用的方式併入本文中：2008年12月19日申請之美國臨時專利申請案第61/139,272號；及2009年12月21日申請之美國專利申請案第12/643,818號。

止血依賴於複雜凝血級聯，其中由凝血因子介導之一系列事件會導致凝血酶原(prothrombin)轉化成凝血酶(thrombin)。因子X(FX)活化為凝血級聯之內在路徑與外在路徑兩者之中心事件。外在路徑已經提出為凝血級聯之主要活化因子(Mackman等人,Arterioscler. Thromb. Casc. Biol. ,27 ,1687-1693(2007))。循環組織因子(TF)與經活化之因子VII(FVIIa)相互作用而形成介導FX活化之「外在錯合物(extrinsic complex)」。凝血級聯藉由內在路徑放大，在此期間因子XII、XI、IX及VIII之連續活化導致形成「內在(intrinsic)」FIXa-FVIIIa錯合物，其亦介導FX活化。經活化之FX促進凝血酶形成，此為身體產生纖維蛋白(fibrin)及有效抑制出血所需。

諸如血友病(hemophilia)之嚴重出血病症由凝血級聯之破壞引起。作為最常見類型之血友病的A型血友病源自於因子VIII不足，而B型血友病與因子IX(FIX)不足相關。C型血友病由因子XI(FXI)不足引起(Cawthern等人,Blood ,91 (12),4581-4592(1998))。目前無法治癒血友病及其他凝血疾病。因子替代療法為用於凝血病症之最常見治療。然而，凝血因子典型地在投藥之後不久即自血流清除。為了達成療效，患者必須接受頻繁的靜脈內輸注血漿源性或重組因子濃縮物，此舉令人不適；需要臨床環境；代價昂貴；且耗費時間。此外，因子替代療法之治療功效會在形成抑制抗體後急速減弱。約30%患有嚴重A型血友病之患者會產生可中和因子VIII(FVIII)之抑制抗體(Peerlinck及Hermans,Haemophilia ,12,579-590(2006))。存在少數可用於具有抗因子抗體之患者的治療選項。

因此，此項技術中對用於治療凝血病症之組成物及方法存有需要。本發明提供此等組成物及方法。

本發明提供與組織因子路徑抑制劑(TFPI)結合且能夠調節凝血級聯之肽，包括TFPI拮抗肽。舉例而言，本發明提供包含胺基酸序列X₇ X₈ X₉ X₁₀ X₁₁ X₁₂ X₁₃ X₁₄ X₁₅ X₁₆ X₁₇ X₁₈ X₁₉ X₂₀ X₂₁ (SEQ ID NO: 3109)之肽，其中：X₇ 係選自由以下者所組成之群組：L、P、K、S、W、V、N及Q；X₈ 係選自由以下者所組成之群組：L、R、N、F及I；X₉ 係選自由以下者所組成之群組：Y、V、P及C；X₁₀ 係選自由以下者所組成之群組：F、L及G；X₁₁ 係選自由以下者所組成之群組：L、W、V、A、M、T及S；X₁₂ 係選自由以下者所組成之群組：T、F、V、R、A、D、L、E、S及Y；X₁₃ 係選自由以下者所組成之群組：I、M、G、Q、D及R；X₁₄ 係選自由以下者所組成之群組：G、W、Y、L、M及H；X₁₅ 係選自由以下者所組成之群組：N、P、F、H、K及Y；X₁₆ 係選自由以下者所組成之群組：M、D、E、V、G及K；X₁₇ 係選自由以下者所組成之群組：G、I、R、S、T及L；X₁₈ 係選自由以下者所組成之群組：M、K、L及I；X₁₉ 係選自由以下者所組成之群組：Y、G、R及S；X₂₀ 係選自由以下者所組成之群組：A、E、S、C及Y；且X₂₁ 係選自由以下者所組成之群組：A、V、K及E。

在一態樣中，該肽包含一或多個直接與X₇ 連接之N端胺基酸，其中該(等)N端胺基酸包含選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列：X₆ ，X₅ X₆ ，X₄ X₅ X₆ ，X₃ X₄ X₅ X₆ (SEQ ID NO: 3110)，X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ (SEQ ID NO: 3111)，及X₁ X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ (SEQ ID NO: 3112)，其中X₁ 係選自由T及G所組成之群組；X₂ 係選自由F及V所組成之群組；X₃ 係選自由V、W、Y及F所組成之群組；X₄ 係選自由D、Q及S所組成之群組；X₅ 係選自由E、T、N及S所組成之群組；且X₆ 係選自由R、H、K及A所組成之群組。

或者或此外，該肽包含一或多個直接與X₂₁ 連接之C端胺基酸，其中該(等)C端胺基酸包含選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列：X₂₂ ，X₂₂ X₂₃ ，X₂₂ X₂₃ X₂₄ ，X₂₂ X₂₃ X₂₄ X₂₅ (SEQ ID NO: 3113)，X₂₂ X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ (SEQ ID NO: 3114)，及X₂₂ X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ X₂₇ (SEQ ID NO: 3115)，其中X₂₂ 係選自由Q、I、E、W、R、L及N所組成之群組；X₂₃ 係選自由L、V、M及R所組成之群組:X₂₄ 係選自由K、L、A及Y所組成之群組；X₂₅ 為F；X₂₆ 為G；且X₂₇ 為T。

在一態樣中，本發明提供包含如SEQ ID NO: 1-7所示之胺基酸序列的肽，其抑制凝血級聯內之TFPI活性，諸如包含JBT0132、JBT0303、JBT0193、JBT0178、JBT0120及JBT0224中之任一者中所闡述之胺基酸序列的肽。本發明亦提供結合TFPI之肽，其包含與序列Phe-Gln-Ser-Lys-Gly-Asn-Val-Phe-Val-Asp-Gly-Tyr-Phe-Glu-Arg-Leu-Arg-Ala-Lys-Leu(FQSKGNVFVDGYFERLRAKL)(SEQ ID NO: 32)之一致性為至少60%的胺基酸序列。

此外，本發明提供結合TFPI之肽，其中該肽包含式(I)結構：X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020(SEQ ID NO: 3116)。在式(I)中，X1001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W及Y；X1002為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：G、K及Q；X1003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W及Y；X1006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S T、V、W及Y；X1007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、V、W及Y；X1008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、K、W及Y；X1009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、f、I、K、S、T及V；X1010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、C、K、G及Nmg；X1012為Y；X1013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、W及Y；X1014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1015為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：(ω-甲基)-R、D、E、K及R；X1016為L；X1017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W及Y；X1018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X1019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Bhk、K、R及V；且X1020存在或不存在，其中倘若X1020存在，則其為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、Bhl、C、F、G、H、I、K、L、Nml、Q、R、S、T、V、W及Y。

在一態樣中，結合TFPI之肽包含式(III)結構：X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017-X1018-K-K/L(III)(SEQ ID NO: 3117)。在式(III)中，X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1008、X1010、X1014、X1017及X1018各自獨立地選自任何胺基酸。

本發明另外提供TFPI結合肽，其包含式(V)結構：X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011-X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023(V)(SEQ ID NO: 3118)。在式(V)中，X2001、X2002及X2023獨立地為存在或不存在。當存在時，X2001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V及W；且X2002為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V及W。另外，X2003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、I、K、L、R、S、T、V、W及Y；X2004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V及W；X2005為W；X2006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、I、K、L、RV及W；X2007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、Hcy、Dap及K，較佳選自由以下者所組成之群組：C及Hcy；X2008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、R、S及T；X2009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、I、K、L、M、m、Nle、p、R及V；X2010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T及V；X2011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、E、G、S及T；X2012為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、T、t、V、v、W及w；X2013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V及W；X2014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V及W；X2015為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V及W；X2016為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V、W及Y；X2017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W及Y；X2018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C及D(X2018較佳為C)；X2019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、I、L、S、T、V及W；X2020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F及W；X2021為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I、L及V；且X2022為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V及W。

當X2023存在於肽中時，X2023為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W及Y。在一態樣中，該肽包含由X2007與X2018之間的鍵聯(在式(V)中用括號指示)產生的環狀結構。

本發明亦提供結合TFPI之肽，其中該肽至少包含式(VI)結構：X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023(VI)(SEQ ID NO: 3119)之胺基酸3-22。在式(VI)中，X2001、X2002及X2023各自獨立地為存在或不存在。X2008、X2010、X2012、X2013、X2016及X2022以及X2001、X2002及X2023當存在時，各自獨立地選自任何胺基酸。該肽包含由X2007與X2018之間的鍵聯(在式(VI)中用括號指示)產生的環狀結構。

在一態樣中，本發明提供結合TFPI之肽，其中該肽至少包含式(VIII)結構：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(VIII)(SEQ ID NO: 3120)之胺基酸3-21(X3003-X3021)。在式(VIII)中，X3001及X3002各自獨立地為存在或不存在。當存在時，X3001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y；且X3002為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I及L。關於式(VIII)之其餘部分，X3003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W及Y；X3004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及P；X3005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W及Y；X3006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、W、C、K、P、R及H；X3007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W及Y；X3008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y及I；X3009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y及K；X3010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X3011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F及H；X3012為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L及R；X3013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y及I；X3014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及K；X3015為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、K及R；X3016為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、K及R；X3017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A及M；X3018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W及Y；X3019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y及I；X3020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I及P；且X3021為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F及G。

另外，本發明提供TFPI結合肽，其包含式(IX)結構：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(IX)(SEQ ID NO: 3121)，其中X3001、X3002、X3003、X3004、X3005、X3006、X3007、X3008、X3009、X3010、X3011、X3013、X3014、X3017、X3018、X3019、X3020及X3021各自獨立地選自任何胺基酸。此外，本發明包括結合TFPI之肽，其中該肽包含與式(X)序列：Ac-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2(SEQ ID NO: 223)之一致性為至少60%的胺基酸序列。

本發明另外提供TFPI結合肽，其包含式(XI)結構：X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)。關於式(XI)，X4001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta及多巴(Dopa)；X4003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)及Cmc；X4004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；X4005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G(NpropylG)、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz及dtc；X4006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif及Eew；X4007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I、V、T、Chg、Phg及Tle；X4008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy及Y；X4009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle及L-2-胺基-4,4,4-三氟丁酸；X4010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd及C(NEM)；X4011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、G、p、Sar、c及hcy；X4012為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Y、Tym、Pty、多巴及Pmy；X4013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、1Ni、Thi及Bta；X4014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Hcy；X4016為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：L、Hcy、Hle及Aml；X4017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc及Egt；X4018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N及R；X4019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：K、R及Har；且X4020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：K、L、Hcy及Aml。

式(XI)之TFPI結合肽不包含結構式(XII)：X5001-Q-X5003-X5004-X5005-X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017-X5018-K-K/L(XII)。在式(XII)中，X5001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、M及Y；X5003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、E、M、Q、R、S及T；X5004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；X5005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、Q、R及p；X5006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S及V；X5008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H及Y；X5010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、H、D、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X5013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、C及F；X5014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T及V；X5017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nve、Opa、Orn、R及S；且X5018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、L、M、N及R。

本發明亦包括由選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列組成的肽：SEQ ID NO: 4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239；以及由選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列組成的肽：SEQ ID NO: 1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233。

在本發明之情形下，由式(I)至式(XI)中之任一者所涵蓋的任何肽及本文所述之任何TFPI結合肽亦稱為「本發明之肽」及「如本文所述之肽」。

在一些具體實例中，本發明之肽結合TFPI-1(例如TFPI-1α)且視情況改良在不存在FVIII、FIX及/或FXI下TFPI調控之凝血酶的產生。亦提供包含該肽之組成物(例如醫藥組成物)。

此外，本發明提供使用本發明之肽之方法。舉例而言，本發明提供一種抑制TFPI之方法，其包含使該TFPI與如本文所述之肽接觸。本發明亦提供一種增強凝血因子不足之個體中之凝血酶形成的方法；一種增加個體中之血凝塊形成的方法；及一種治療個體之凝血病症的方法。所有該等方法在本文中亦稱為例如「本發明方法」。該等方法包含以可有效增強凝血酶形成之量、可有效增強血凝塊形成之量或可有效治療個體之凝血病症之量向個體投予如本文提供之肽。除非明確相反地指出，否則本文關於一種本發明之肽或本發明方法提供之描述分別適用於每一種本發明之肽及本發明方法。本發明之其他態樣包括本發明之肽用於製造醫藥品之用途；一種靶向呈現TFPI之細胞的方法；一種治療或診斷罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法；一種純化TFPI之方法；及一種鑑別TFPI結合化合物之方法。

本發明亦包括一種鑑別TFPI結合化合物之方法，該方法包含(a)使包含TFPI庫尼茲(Kunitz)域1(KD1)之肽與測試化合物接觸，及(b)偵測該測試化合物與由對應於人類TFPI殘基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55之KD1胺基酸殘基界定之TFPI結合位點的結合。亦提供一種抑制人類TFPI之方法，該方法包含使人類TFPI與在由胺基酸殘基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定之結合位點處結合人類TFPI的抑制劑接觸。本發明另外提供一種具有電腦可執行指令之電腦儲存媒體，當在電腦之處理器上執行時，該等指令實施一種模型化TFPI庫尼茲域1(Kunitz domain 1，KD1)蛋白中之所選三維(3D)點與測試化合物之間的相互作用的方法，以及一種比較測試化合物與TFPI庫尼茲域1(KD1)蛋白中之所選三維點的方法。

所有前述方法在本文中亦稱為例如「本發明方法」。

以下編號段落各自簡明地定義本發明之一或多個例示性變化：

1.　一種結合TFPI之肽，其包含式(XI)結構：X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)，其中X4001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta及多巴；其中X4003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)及Cmc；其中X4004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；其中X4005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz及dtc；其中X4006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif及Eew；其中X4007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I、V、T、Chg、Phg及Tle；其中X4008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy及Y；其中X4009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle及L-2-胺基-4,4,4-三氟丁酸；其中X4010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd及C(NEM)；其中X4011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、A、G、p、Sar、c及hcy；其中X4012為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Y、Tym、Pty、多巴及Pmy；其中X4013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、1Ni、Thi及Bta；其中X4014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Hcy；其中X4016為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：L、Hcy、Hle及Aml；其中X4017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc及Egt；其中X4018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N及R；其中X4019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：K、R及Har；且其中X4020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：K、L、Hcy及Am1；且其中該肽不包含以下式(XII)結構：X5001-Q-X5003-X5004-X5005-X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017-X5018-K-K/L(XII)，其中X5001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、M及Y；其中X5003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、E、M、Q、R、S及T；其中X5004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；其中X5005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、Q、R及p；其中X5006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S及V；其中X5008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H及Y；其中X5010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、H、D、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；其中X5013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、C及F；其中X5014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T及V；其中X5017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nve、Opa、Orn、R及S；且其中X5018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、L、M、N及R。

2.如段落1之肽，其中X4001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、Y、1Ni、Bta及多巴；其中X4003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、E及S；其中X4004為K；其中X4005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：p、Nmg、N丙基G、aze、pip、tic、oic及hyp；其中X4006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、E、K、R、S、V、C(Acm)、Nle、C(NEM)、I及Cit；其中X4007為V或Tle；其中X4008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：H、1Ni、2Ni及Pmy；其中X4009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：V、Abu及Tle；其中X4010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、P、C及T；其中X4011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：G、a、c、hcy及Sar；其中X4012為Y；其中X4013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、1Ni及Bta；其中X4014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、C、E及Hcy；其中X4016為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：L、Aml、Hle及Hcy；其中X4017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、c、Aic、Eca及Deg；其中X4018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、c、L及Hcy；其中X4019為K；且其中X4020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：L、Aml及Hcy。

3.如段落1或段落2之肽，其進一步包含與X4001連接且選自由以下者所組成之群組的N端胺基酸及/或部分：FAM-Ttds、PE、Palm、2-苯基乙醯基、3-苯基丙醯基、2-(萘-2-基)乙醯基、己醯基、2-甲基丙醯基、3-甲基丁醯基、2-萘基磺醯基及1-萘基磺醯基。

4.如段落1-3中任一者之肽，其進一步包含與X4020連接之X4021，其中X4021包含選自由以下者所組成之群組之C端胺基酸及/或部分：C、c、C(NEM)、K(Ttds-順丁烯二醯亞胺基丙醯基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-順丁烯二醯亞胺)、K(AOA)及Cea。

5.如段落1-4中任一者之肽，其中該肽包含環狀結構。

6.如段落5之肽，其中該環狀結構係在X4018與X4021之間形成。

7.如段落6之肽，其中(a)X4018為C或c且(b)X4021為Cea。

8.如段落5之肽，其中該環狀結構係在X4011與X4014之間形成。

9.如段落8之肽，其中(a)X4011為c或hcy且(b)X4014為C或Hcy。

10.如段落1-9中任一者之肽，其包含分子內雙硫鍵。

11.如段落1-10中任一者之肽，其中該肽之IC₅₀ 小於1000 nM。

12.如段落1-10中任一者之肽，其中該肽之IC₅₀ 小於250 nM。

13.如段落1-10中任一者之肽，其中該肽之IC₅₀ 小於50 nM。

14.如段落1-10中任一者之肽，其中該肽之IC₅₀ 小於10 nM。

15.一種肽，其由選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239。

16.一種肽，其由選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233。

17.一種TFPI結合肽，其包含兩種或兩種以上如段落1-16中任一者之肽的均二聚體或均多聚體。

18.一種TFPI結合肽，其包含兩種或兩種以上如段落1-16中任一者之肽的雜二聚體或雜多聚體。

19.如段落1-18中任一者之肽，其中該肽抑制TFPI活性且以小於10 μM的解離常數與TFPI 1-α結合。

20.如段落1-19中任一者之肽，其中該肽與聚乙二醇(PEG)部分結合。

21.如段落1-20中任一者之肽，其中該肽與人類血清白蛋白(HSA)、抗體或其片段、羥乙基澱粉、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸多聚體(PAS化)、C12-C18脂肪酸或聚唾液酸(polysialic acid)結合。

22.如段落1-21中任一者之肽，其中該肽與選自由以下者所組成之群組之部分結合：光敏劑、染料、螢光染料、放射性核種、含有放射性核種之錯合物、酶、毒素、抗體或其片段、及細胞毒性劑。

23.一種用於治療個體之方法中之如段落1-22中任一者之肽。

24.如段落24之肽，其中該方法係用於治療凝血病症。

25.一種如段落1-22中任一者之肽的用途，其係用於製造醫藥品。

26.一種如段落1-22中任一者之肽的用途，其係用於製造用以治療凝血病症之醫藥品。

27.一種醫藥組成物，其包含如段落1-22中任一者之肽及醫藥學上可接受之載劑。

28.如段落28之醫藥組成物，其中該組成物包含另一醫藥學上有效之藥劑。

29.如段落27或段落28之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係用於治療凝血病症之方法中。

30.一種靶向呈現TFPI之細胞的方法，該方法包含使該細胞與如段落1-22中任一者之肽接觸。

31.如段落30之方法，其中該細胞處於哺乳動物中，且接觸該細胞包含向該哺乳動物投予該肽。

32.如段落30或段落31之方法，其進一步包含偵測肽與呈現於該細胞上之TFPI的結合。

33.如段落32之方法，其中肽-TFPI結合係藉由偵測與該肽結合且選自由以下者所組成之群組之部分來偵測：光敏劑、染料、螢光染料、放射性核種、含有放射性核種之錯合物、酶、毒素、抗體及細胞毒性劑。

34.如段落32或段落33之方法，其中肽-TFPI結合係藉由偵測與該肽錯合之相互作用搭配物或與該肽結合之部分來偵測。

35.如段落34之方法，其中該相互作用搭配物係選自由以下者所組成之群組：抗體或其片段、抗運載蛋白(anticalin)、適體、抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、中性鏈親和素(neutravidin)及鏡像體(spiegelmer)。

36.如段落34或段落35之方法，其中該相互作用搭配物包含偵測部分。

37.如段落36之方法，其中該偵測部分係選自由以下者所組成之群組：染料、螢光染料、放射性核種、含有放射性核種之錯合物、及酶。

38.一種治療罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法，該方法包含向該個體投予如段落1-22中任一者之肽，其中該肽與治療劑結合。

39.一種治療罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法，該方法包含向該個體投予如段落1-22中任一者之肽，及向該個體投予(a)結合該肽且(b)為治療劑或與治療劑結合的相互作用搭配物。

40.如段落39之方法，其中該治療劑係選自由以下者所組成之群組：光敏劑、放射性核種、含有放射性核種之錯合物、酶、毒素、抗體或其片段、及細胞毒性劑。

41.如段落39或段落40之方法，其中該相互作用搭配物係選自由以下者所組成之群組：抗體或其片段、抗運載蛋白、適體、抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、中性鏈親和素及鏡像體。

42.一種診斷罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法，其包含(a)向該個體投予與可偵測部分結合的如段落1。22中任一者之肽及(b)偵測該可偵測部分。

43.一種診斷罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法，其包含(a)向該個體投予如段落1-22中任一者之肽，(b)向該個體投予與可偵測部分結合之相互作用搭配物，及(c)偵測該可偵測部分。

44.如段落43之方法，其中該相互作用搭配物係選自由以下者所組成之群組：抗體或其片段、抗運載蛋白、適體、抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、中性鏈親和素及鏡像體。

45.如段落42-44中任一者之方法，其中該可偵測部分係選自由以下者所組成之群組：染料、螢光染料、放射性核種、含有放射性核種之錯合物、酶、及抗體或其片段。

46.如段落38-45中任一者之方法，其中該疾病為凝血病症。

47.一種純化TFPI之方法，其中該方法包含a)使含有TFPI之樣本與如段落1-22中任一者之肽在適合於TFPI與該肽之間形成錯合物之條件下接觸；b)自該樣本移出該錯合物；及視情況而定，c)解離該錯合物以釋放TFPI。

48.如段落47之方法，其中該肽經固定於支撐物上。

49.如段落48之方法，其中該肽經固定於層析固定相上，且步驟(c)包含洗提與該經固定之肽結合之TFPI。

50.如段落48或段落49之方法，其中TFPI係經由親和力層析法來純化。

51.一種鑑別TFPI結合化合物之方法，該方法包含(a)使包含TFPI庫尼茲域1(KD1)之肽與如段落1-22中任一者之TFPI結合肽及測試化合物在允許形成KD1-TFPI結合肽錯合物之條件下接觸，(b)量測步驟(a)中所形成之KD1-TFPI結合肽錯合物，及(c)比較在該測試化合物存在下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物之數量與在不存在該測試化合物下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物之數量，其中相較於在不存在該測試化合物下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物之數量，在該測試化合物存在下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物之數量降低指示該測試化合物為TFPI結合化合物。

52.如段落51之方法，其中該TFPI結合肽包含會產生信號之標記；步驟(b)包含量測由KD1-TFPI結合肽錯合物產生之信號；且步驟(c)包含比較步驟(b)中所量測之信號與由在不存在該測試化合物下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物產生之信號，其中相較於由在不存在該測試化合物下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物產生之信號，由在該測試化合物存在下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物產生之信號降低指示該測試化合物為TFPI結合化合物。

53.如段落51或段落52之方法，其中步驟(a)包含(a1)使該包含KD1之肽與該TFPI結合肽在允許形成KD1-肽錯合物之條件下接觸，及(a2)使步驟(a1)中所形成之KD1-TFPI結合肽錯合物與該測試化合物接觸。

54.一種鑑別TFPI結合化合物之方法，該方法包含(a)使包含TFPI庫尼茲域1(KD1)之肽與測試化合物接觸，及(b)偵測該測試化合物與由對應於人類TFPI殘基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55之KD1胺基酸殘基界定之TFPI結合位點的結合。

55.如段落54之方法，其中該結合位點係由對應於人類TFPI殘基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55之胺基酸殘基界定。

56.如段落54或段落55之方法，其中該結合位點係由對應於人類TFPI殘基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55之胺基酸殘基界定。

57.如段落54-56中任一者之方法，其中步驟(b)包含確定該TFPI結合位點內存在或不存在核磁共振(NMR)化學位移。

58.如段落54-56中任一者之方法，其中步驟(a)包含在測試化合物存在下使該包含TFPI KD1之肽與FVIIa在允許KD1與FVIIa結合之條件下接觸，且步驟(b)包含比較步驟(a)中之KD1-FVIIa結合與在不存在該測試化合物下之KD1-FVIIa結合，其中相較於在不存在該測試化合物下之KD1-FVIIa結合，在該測試化合物存在下之KD1-FVIIa結合減少指示該測試化合物為TFPI結合化合物。

59.如段落54-56中任一者之方法，其中步驟(a)包含在測試化合物存在下使該包含TFPI KD1之肽與FXa在允許KD1與FXa結合之條件下接觸，且步驟(b)包含比較步驟(a)中之KD1-FXa結合與在不存在該測試化合物下之KD1-FXa結合，其中相較於在不存在該測試化合物下之KD1-FXa結合，在該測試化合物存在下之KD1-FXa結合減少指示該測試化合物為TFPI結合化合物。

60.如段落54-56中任一者之方法，其中該包含TFPI KD1之肽進一步包含庫尼茲域2(KD2)，步驟(a)包含在測試化合物存在下使該包含TFPI KD1及TFPI KD2之肽與FXa在允許KD2與FXa結合之條件下接觸，且步驟(b)包含比較步驟(a)中之KD2-FXa結合與在不存在該測試化合物下之KD2-FXa結合，其中相較於在不存在該測試化合物下之KD2-FXa結合，在該測試化合物存在下之KD2-FXa結合減少指示該測試化合物為TFPI結合化合物。

61.如段落54-56及58-60中任一者之方法，其中該測試化合物與該TFPI結合位點之結合係使用酶促檢定來偵測。

62.如段落54-61中任一者之方法，其中該包含TFPIKD1之肽包含人類TFPI之胺基酸1-160。

63.如段落54-61中任一者之方法，其中該包含TFPI KD1之肽為全長人類TFPI。

64.一種組成物，其包含藉由如段落51-63中任一者之方法鑑別的TFPI抑制劑。

65.一種藉由如段落51-63中任一者之方法鑑別之TFPI抑制劑的用途，其係用於製造醫藥品。

66.一種藉由如段落51-63中任一者之方法鑑別之TFPI抑制劑的用途，其係用於製造用以治療凝血病症之醫藥品。

67.一種治療罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法，該方法包含向該個體投予藉由如段落51-63中任一者之方法鑑別之TFPI抑制劑。

68.一種抑制人類TFPI之方法，該方法包含使人類TFPI與在由胺基酸殘基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定之結合位點處結合人類TFPI的抑制劑接觸。

69.一種治療罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法，該方法包含向該個體投予在由胺基酸殘基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定之結合位點處結合人類TFPI的抑制劑。

70.如段落68或段落69之方法，其中該人類TFPI結合位點係由胺基酸殘基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55界定。

71.如段落70之方法，其中該人類TFPI結合位點係由胺基酸殘基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55界定。

72.一種純化抑制FXa活性之化合物之方法，該方法包含(a)使包含TFPI庫尼茲域1(KD1)之肽與化合物在允許形成化合物-KD1錯合物之條件下接觸，(b)移出未結合之化合物，及(c)解離該等化合物-KD1錯合物以釋放該化合物。

73.如段落72之方法，其中步驟(a)包含使該包含KD1之肽與一群測試化合物接觸。

74.一種電腦儲存媒體，其具有電腦可執行指令，該等指令當在電腦之處理器上執行時實施一種模型化TFPI庫尼茲域1(KD1)蛋白中之所選三維(3D)點與測試化合物之間的相互作用的方法，該方法包含：獲得該TFPI KD1蛋白之蛋白質結構3D模型；確定該蛋白質結構中之所選子集之胺基酸之間的3D關係，其中該所選胺基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；模型化由該所選胺基酸子集界定之表面；獲得測試化合物之測試化合物3D模型；匹配該測試化合物3D模型與由該所選胺基酸子集界定之表面；及鑑別該表面之所選胺基酸子集與該測試化合物3D模型之間的接觸點。

75.如段落74之電腦儲存媒體，其中該所選胺基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。

76.如段落74之電腦儲存媒體，其中該所選胺基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。

77.如段落74-76中任一者之電腦儲存媒體，其進一步包含：確定該表面與該測試化合物3D模型之間的接觸點的數目；及記錄該測試化合物3D模型之對應於該接觸點數目的親和力等級。

78.如段落74-77中任一者之電腦儲存媒體，其中該測試化合物為肽。

79.如段落74-78中任一者之電腦儲存媒體，其進一步包含：確定該表面與該測試化合物3D模型之間的各接觸點的結合型式(bond type)；及基於該表面與該測試化合物3D模型之間的各接觸點的結合型式之集合更新該親和力等級。

80.如段落74-79中任一者之電腦儲存媒體，其進一步包含：獲得基於第二測試化合物的更新之測試化合物3D模型；匹配該更新之測試化合物3D模型與由該所選胺基酸子集界定之表面；及在該電腦之顯示器上鑑別該表面之所選胺基酸子集與該更新之測試化合物3D模型之間的該等經鑑別之接觸點。

81.如段落80之電腦儲存媒體，其進一步包含：確定該表面與該更新之測試化合物3D模型之間的該等接觸點的數目；確定該表面與該更新之測試化合物3D模型之間的各接觸點之結合型式；及基於該接觸點數目及該表面與該更新之測試化合物3D模型之間的各接觸點之結合型式之集合記錄新親和力等級。

82.如段落81之電腦儲存媒體，其進一步包含：比較該更新之親和力等級與該新親和力等級以確定該測試化合物或該第二測試化合物是否具有較高親和力等級。

83.如段落80-82中任一者之電腦儲存媒體，其中該第二測試化合物為該測試化合物之變異體。

84.如段落74-83中任一者之電腦儲存媒體，其進一步包含在該電腦之顯示器上顯示該等接觸點。

85.如段落78-84中任一者之電腦儲存媒體，其進一步包含修飾該肽以增加與該所選胺基酸子集之接觸點數目或增加該肽之胺基酸與該所選胺基酸子集之間的結合強度(bond strength)。

86.一種比較測試化合物與TFPI庫尼茲域1(KD1)蛋白中之所選三維點的方法，該方法包含：在電腦之記憶體中產生該KD1蛋白之蛋白質結構；在該電腦之處理器處確定該KD1蛋白中之所選胺基酸子集的三維模型，其中該所選胺基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；在該電腦之處理器處確定測試化合物之三維模型；在該電腦之處理器處將該測試化合物之3D模型與該所選胺基酸子集之3D模型擬合；及在該電腦之處理器處產生該測試化合物對該所選胺基酸子集之親和力，其中該親和力係基於該子集中與該測試化合物接觸之胺基酸之數目及各接觸點處之結合強度。

87.如段落86之方法，其中該所選胺基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。

88.如段落86之方法，其中該所選胺基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。

89.如段落86-88中任一者之方法，其進一步包含：顯示該測試化合物與該所選胺基酸子集之3D模型之間的擬合的3D圖像。

90.如段落86-89中任一者之方法，其進一步包含：對複數種測試化合物重複如段落86之步驟；及儲存該複數種測試化合物各自之各別親和力。

91.一種電腦儲存媒體，其具有電腦可執行指令，該等指令當在電腦之處理器上執行時實施一種比較肽與TFPI庫尼茲域1(KD1)蛋白中之所選三維點(3D)的方法，該方法包含：產生該KD1蛋白之蛋白質結構；確定該KD1蛋白中之所選胺基酸子集的三維模型，其中該胺基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；確定肽之三維模型；將該肽之3D模型與該所選胺基酸子集之3D模型擬合；及產生該肽對該所選胺基酸子集之親和力，其中該親和力係基於該子集中與該肽接觸之胺基酸之數目及各接觸點處之結合強度。

92.如段落91之電腦儲存媒體，其中該所選胺基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55。

93.如段落91之電腦儲存媒體，其中該所選胺基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。

本發明提供結合組織因子路徑抑制劑-1且在一些情況下阻斷凝血級聯內之組織因子路徑抑制劑-1(在本文中稱為TFPI)之抑制活性的肽。在血管損傷後，組織因子(TF)與因子Vlla錯合以形成「外在錯合物」或「外在因子X酶(tenase)錯合物」，其可活化因子IX及X(圖1)。TFPI為TF/FVIIa外在錯合物活性之主要天然調控劑，且廣義而言，其在控制凝血酶產生方面起作用(Panteleev等人,Eur. J. Biochem. ,249 ,2016-2031(2002))。TFPI為一種包含3個庫尼茲型抑制域之43 kDa絲胺酸蛋白酶抑制劑(圖2)。TFPI之庫尼茲域1結合FVIIa且庫尼茲域2結合FXa，從而使抑制劑能夠形成四級FXa-TFPI-FVIIa-TF錯合物，其可阻斷TF/FVIIa外在錯合物之活性(圖3)。TFPI與FXa結合亦會下調凝血級聯之共用路徑，在此期間，FXa將凝血酶原轉化成凝血酶(Audu等人,Anesth. Analg. ,103 (4),841-845(2006))。本發明提供例如阻斷TFPI對凝血級聯之抑制作用，藉此增強凝血酶形成之TFPI抑制肽。

本文提供若干TFPI結合肽之胺基酸序列。習知胺基酸係根據其如表1中所述之標準1字母或3字母碼加以鑑別。

非習知胺基酸及其他肽構築嵌段之實例係根據見於表2中之3字母碼(Ttds及多巴除外，其為常見4字母縮寫)加以鑑別。由含3、4或7個數字/字母之名稱或縮寫表示之其他構築嵌段亦列於表2中。一些構築嵌段之結構經展示有用於將構築嵌段引入肽中之例示性試劑(例如關於2-萘基磺醯基提供之結構包含氯化物)。

本文提供之肽之胺基酸序列係以如將由一般技術者所瞭解之典型肽序列格式展示。舉例而言，習知胺基酸之3字母碼或1字母碼或其他構築嵌段之3、4或7數字/字母碼指示在肽序列內之指定位置處存在該胺基酸或構築嵌段。各非習知胺基酸或構築嵌段之代碼以連字符與序列中之下一及/或前一胺基酸或構築嵌段之代碼連接。鄰近胺基酸以化學鍵(典型地為醯胺鍵)連接。當化學鍵位於鄰近胺基酸左側時(例如Hle-鄰近胺基酸)，該化學鍵之形成自胺基酸之1-羧基移除羥基，且當化學鍵位於鄰近胺基酸右側時(例如鄰近胺基酸-Hle)，該化學鍵之形成自胺基酸之胺基移除氫。應瞭解，兩種修飾可適用於同一胺基酸且適用於存在於胺基酸序列中未以連字符明確示出之鄰近習知胺基酸。當胺基酸在胺基酸側鏈中含有1個以上胺基及/或羧基時，2-胺基或3-胺基及/或1-羧基通常用於形成肽鍵。對於非習知胺基酸，使用3字母碼，其中第一字母指示C-α-原子之立體化學。舉例而言，大寫第一字母指示L型胺基酸存在於肽序列中，而小寫第一字母指示D型相應胺基酸存在於肽序列中。當使用1字母碼時，小寫字母表示D-胺基酸，而大寫字母表示L-胺基酸。除非有相反指示，否則胺基酸序列係以N端至C端方向呈現於本文中。

本文所述之若干TFPI結合肽序列之C端係藉由包括OH、NH₂ 或經由連字符與C端胺基酸碼連接之特定端接胺之縮寫來明確示出。本文所述之若干肽之N端係藉由包括氫(對於自由N端而言)或經由連字符與N端胺基酸碼連接之特定端接羧酸或其他化學基團之縮寫來明確示出。

本發明提供包含胺基酸序列X₇ X₈ X₉ X₁₀ X₁₁ X₁₂ X₁₃ X₁₄ X₁₅ X₁₆ X₁₇ X₁₈ X₁₉ X₂₀ X₂₁ (SEQ ID NO: 3109)之肽，其中(使用胺基酸之單字母碼)：X₇ 係選自由以下者所組成之群組：L、P、K、S、W、V、N及Q；X₈ 係選自由以下者所組成之群組：L、R、N、F及I；X₉ 係選自由以下者所組成之群組：Y、V、P及C；X₁₀ 係選自由以下者所組成之群組：F、L及G；X₁₁ 係選自由以下者所組成之群組：L、W、V、A、M、T及S；X₁₂ 係選自由以下者所組成之群組：T、F、V、R、A、D、L、E、S及Y；X₁₃ 係選自由以下者所組成之群組：I、M、G、Q、D及R；X₁₄ 係選自由以下者所組成之群組：G、W、Y、L、M及H；X₁₅ 係選自由以下者所組成之群組：N、P、F、H、K及Y；X₁₆ 係選自由以下者所組成之群組：M、D、E、V、G及K；X₁₇ 係選自由以下者所組成之群組：G、I、R、S、T及L；X₁₈ 係選自由以下者所組成之群組：M、K、L及I；X₁₉ 係選自由以下者所組成之群組：Y、G、R及S；X₂₀ 係選自由以下者所組成之群組：A、E、S、C及Y；且X₂₁ 係選自由以下者所組成之群組：A、V、K及E。

除上述核心結構X₇ -X₂₁ 之外，特定涵蓋之其他結構為一或多個其他胺基酸與核心結構連接(例如與胺基酸序列X₇ -X₂₁ 之N端或C端連接)之結構。因此，本發明包括包含核心結構且進一步包含一或多個N端胺基酸之肽，該一或多個N端胺基酸包含選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列：X₆ ，X₅ X₆ ，X₄ X₅ X₆ ，X₃ X₄ X₅ X₆ (SEQ ID NO: 3110)，X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ (SEQ ID NO: 3111)，及X₁ X₂ X₃ X₄ X₅ X₆ (SEQ ID NO: 3112)；其中X₆ 直接與核心結構胺基酸序列之X₇ 連接，且X₁ 係選自由以下者所組成之群組：T及G；X₂ 係選自由以下者所組成之群組：F及V；X₃ 係選自由以下者所組成之群組：V、W、Y及F；X₄ 係選自由以下者所組成之群組：D、Q及S；X₅ 係選自由以下者所組成之群組：E、T、N及S；且X₆ 係選自由以下者所組成之群組：R、H、K及A。

在一態樣中，本發明之肽包含胺基酸序列QSKKNVFVFGYFERLRAK(SEQ ID NO: 1)或由該胺基酸序列組成。

在另一具體實例中，包含核心結構之本發明之肽包含一或多個C端胺基酸，其包含選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列：X₂₂ ，X₂₂ X₂₃ ，X₂₂ X₂₃ X₂₄ ，X₂₂ X₂₃ X₂₄ X₂₅ (SEQ ID NO: 3113)，X₂₂ X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ (SEQ ID NO: 3114)，及X₂₂ X₂₃ X₂₄ X₂₅ X₂₆ X₂₇ (SEQ ID NO: 3115)，其中X₂₂ 直接與核心結構胺基酸序列之X₂₁ 連接，且X₂₂ 係選自由以下者所組成之群組：Q、I、E、W、R、L及N；X₂₃ 係選自由以下者所組成之群組：L、V、M及R；X₂₄ 係選自由以下者所組成之群組：K、L、A及Y；X₂₅ 為F；X₂₆ 為G；且X₂₇ 為T。

在一態樣中，本發明之肽包含胺基酸序列VIVFTFRHNKLIGYERRY(SEQ ID NO: 4)或由該胺基酸序列組成。亦預期本發明之肽在核心結構之N端與C端兩者處包含其他胺基酸。在此態樣中，該肽包含胺基酸序列TFVDERLLYFLTIGNMGMYAAQLKF(SEQ ID NO: 3)、GVWQTHPRYFWTMWPDIKGEVIVLFGT(SEQ ID NO: 5)、KWFCGMRDMKGTMSCVWVKF(SEQ ID NO: 6)或ASFPLAVQLHVSKRSKEMA(SEQ ID NO: 7)或由該胺基酸序列組成。

本發明另外包括包含胺基酸序列X₃ X₄ X₅ -F-X₇ -NVF-X₁₁ X₁₂ -GY-X₁₅ X₁₆ -RLRAK-X₂₂ (SEQ ID NO: 2)之肽，其中X₃ 為Y或F；X₄ 為Q或S；X₅ 為N或S；X₇ 為K、N或Q；X₁₁ 為V、A、S或T；X₁₂ 為F、A、D、L、Q、S或Y；X₁₅ 為F、K或Y；X₁₆ 為E或D；且X₂₂ 為L或N。

此外，本發明提供結合TFPI之肽，其中該肽包含式(I)結構：X100I-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019-X1020(SEQ ID NO: 3116)。在式(I)中，X1001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W及Y；X1002為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：G、K及Q；X1003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W及Y；X1006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S T、V、W及Y；X1007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、G、I、K、L、Nmv、P、Q、S、V、W及Y；X1008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、K、W及Y；X1009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、f、I、K、S、T及V；X1010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、C、K、G及Nmg；X1012為Y；X1013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、W及Y；X1014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1015為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：(ω-甲基)-R、D、E、K及R；X1016為L；X1017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W及Y；X1018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；且X1019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Bhk、K、R及V。

X1020存在或不存在於式(I)中(亦即在一些情況下，本發明之肽包含結構X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019(SEQ ID NO: 3116))。當X1020存在時，其為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、Bhl、C、F、G、H、I、K、L、Nml、Q、R、S、T、V、W及Y。

舉例而言，本發明之肽包含式(I)結構，其中X1001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、I、K、L、Nmf、V、M、W及Y；X1002為Q；X1003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、H、K、M、I、N、Q、R、S、T及V；X1004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、D、E、G、H、F、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、V、W及Y；X1005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、Bal、C、d、E、D、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T及Y；X1006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Btq、C、D、G、I、K、H、L、M、N、Q、R、S、V及Y；X1007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I、K、L、Q、V及Y；X1008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H及Y；X1009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：f、I及V；X1010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X1011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：G及Nmg；X1012為Y；X1013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、C、F、H、L、W及Y；X1014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y；X1015為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：E及R；X1016為L；X1017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、Dab、Dap、Eag、Eew、F、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、T、V及Y；X1018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、R、V及W；X1019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：K及R；且X1020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、Bh1、F、K、L、R及W(當X1020存在於肽中時)。

在一態樣中，本發明之肽包含式(I)結構，其中X1001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、Y及M；X1002為Q；X1003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：M、Q、R、S、T及C；X1004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、K、L、P、R、E、G、I、Y、M及W；X1005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Nmg、p、Q、R、A、E、C及M；X1006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、G、H、K、N、Q、R、S及M；X1007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I及V；X1008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H及Y；X1009為V；X1010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、K、M、N、Q、R、F、H、P、S、V、W及Y；X1011為G；X1012為Y；X1013為C或F；X1014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Aib；X1015為R；X1016為L；X1017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S及M；X1018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、L、N、M及R；X1019為K；且X1020為K或L。

當胺基酸X1020不存在於式(I)中時，在一態樣中，本發明之肽另外在式(I)之N端處包含胺基酸X1000，以至於該肽包含以下式(II)結構或由以下式(II)結構組成：X1000-X1001-X1002-X1003-X1004-X1005-X1006-X1007-X1008-X1009-X1010-X1011-X1012-X1013-X1014-X1015-X1016-X1017-X1018-X1019(II)(SEQ ID NO: 3122)。當X1000存在於肽中時，X1000為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、E及P，而X1001-X1019之胺基酸係如上所定義。

在另一態樣中，本發明之TFPI結合肽包含式(III)結構：X1001-Q-X1003-X1004-X1005-X1006-I/V-X1008-V-X1010-G-Y-C/F-X1014-R-L-X1017-X1018-K-K/L(III)(SEQ ID NO: 3117)。如本文所用，用「/」分隔之胺基酸名稱係指在指定位置處之替代胺基酸殘基。舉例而言，關於式(III)，在位置7處之胺基酸殘基為異白胺酸或纈胺酸。式(III)中之X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1008、X1010、X1014、X1017及X1018各自獨立地選自任何胺基酸。舉例而言，在式(III)中，X1001視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Bhf、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、Q、R、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、I、K、L、Nmf、V、M、W及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、Y及M)；X1003視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhs、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、H、K、M、I、N、Q、R、S、T及V(例如胺基酸為M、Q、R、S、T或C)；X1004視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhk、C、D、E、F、G、H、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、D、E、G、H、F、I、K、k、L、M、N、Nmk、P、Q、R、S、V、W及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、K、L、P、R、E、G、I、Y、M及W)；X1005視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、Bal、C、D、d、E、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、Bal、C、d、E、D、F、G、H、K、k、L、M、N、Nmg、p、Q、R、S、T及Y(例如胺基酸為a、Aib、D、d、G、H、K、k、N、Nmg、p、Q、R、A、E、C或M)；X1006視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Btq、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Btq、C、D、G、I、K、H、L、M、N、Q、R、S、V及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、G、H、K、N、Q、R、S及M)；X1008視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、K、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H及Y；X1010視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Nmf、P、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、K、M、N、Q、R、F、H、P、S、V、W及Y)；X1014視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Bhe、C、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y(例如A、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V或Aib)；X1017視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、D、Dab、Dap、E、Eag、Eew、F、G、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：(ω-甲基)-R、A、Aib、Bhr、C、Cha、Cit、Dab、Dap、Eag、Eew、F、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、N、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、T、V及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Dap、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、K、Nle、Nva、Opa、Orn、R、I、L、S及M)：及/或X1018視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Bal、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、I、K、L、M、N、Q、R、V及W(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、L、N、M及R)。

在一些具體實例中，本發明之肽包含一或多個與胺基酸序列之N端或C端連接之其他胺基酸殘基。舉例而言，在一些具體實例中，包含式(I)-式(III)中之任一者之結構的肽另外包含一或多個直接與X1001連接之N端胺基酸，其中該(等)N端胺基酸包含選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列：X1000，X999-X1000，X998-X999-X1000，X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO: 3123)，X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO: 3124)，X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO: 3125)，X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO: 3126)，X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO: 3127)，X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO: 3128)，X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO: 3129)，及X990-X991-X992-X993-X994-X995-X996-X997-X998-X999-X1000(SEQ ID NO: 3130)。

當肽包含一或多個N端胺基酸時，X1000為A或K；X999為V或K；X998為Q或K；X997為L或K；X996為R或K；X995為G或K；X994為V或K；X993為G或K；X992為S或K；X991為K；且X990為K。

除式(I)-式(III)中闡述之核心結構之外，特定涵蓋之其他結構亦為一或多個其他胺基酸與直接與X1020連接之核心結構之C端連接的結構。舉例而言，C端添加視情況包含選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列：X1021、X1021-X1022、X1021-X1022-X1023及X1021-X1022-X1023-X1024(SEQ ID NO: 3131)，其中X1021為T或K；X1022為S或K；且X1023及X1024為K。

本發明另外包括包含以下胺基酸序列或由以下胺基酸序列組成之TFPI結合肽：與胺基酸序列Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(式IV)(SEQ ID NO: 164)之一致性為至少60%(例如一致性為至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)之胺基酸序列。在一些情況下，該肽包含如本文所述之式(I)-式(III)中之任一者的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。本發明亦包括包含選自由SEQ ID NO: 8-978所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽(例如包含選自由SEQ ID NO: 8-741及962-972所組成之群組(諸如SEQ ID NO: 8-741、962-968、971或972)及/或選自由742-961所組成之群組(諸如SEQ ID NO: 744-961)及/或選自由SEQ ID NO: 973-978所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽)。

本發明包括包含環狀結構之肽。就此而言，本發明包括在肽內包含環狀結構(例如一或多個藉由胺基酸(N端及C端胺基酸除外)之間的鍵聯形成的環)之肽、包含藉由末端胺基酸與肽序列內之胺基酸相互作用而形成的環狀結構之肽及頭尾相接環化之肽。肽亦可為藉由圍繞其他胺基酸或化學取代基而形成之較大環狀結構的一部分。在一些情況下，本發明之肽包含分子內雙硫鍵。在一些具體實例中，分子內雙硫鍵係由半胱胺酸殘基形成。亦提供包含由非半胱胺酸殘基、或非半胱胺酸殘基及半胱胺酸殘基形成之環狀結構之肽。舉例而言，在一具體實例中，本發明之肽包含介導環化之至少1個非習知胺基酸或化學部分。適合非習知胺基酸或化學部分包括(但不限於)FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、Hcy、hcy、Cea及c。負責環化之胺基酸或部分被充分隔開以允許形成環結構，例如胺基酸或部分由2、3、4、5、6、7、8或8個以上殘基隔開。

在一態樣中，包含式(I)-式(III)之結構之肽含有至少2個由至少3個胺基酸殘基隔開以便半胱胺酸形成分子內雙硫鍵之半胱胺酸殘基(例如肽含有2個半胱胺酸殘基)。在一些情況下，半胱胺酸由3個以上胺基酸殘基隔開。舉例而言，在包含式(I)、式(II)或式(III)之結構之肽中，X1000、X1001、X1003、X1004、X1005、X1006、X1010、X1011、X1013、X1014、X1017、X1018、X1020及X1021中之任何兩者視情況為能夠形成二硫橋鍵之半胱胺酸。因此，在一些態樣中，肽含有2個半胱胺酸殘基：X1000、X1005、X1010及X1014之一為半胱胺酸，且X1006、X1010、X1017及X1021之一為半胱胺酸。本發明涵蓋所有可能之半胱胺酸對組合，例如X1000及X1006為C；X1000及X1010為C；X1000及X1017為C；X1005及X1017為C；X1010及X1017為C；X1010及X1021為C；或X1014及X1021為C。本發明之其他例示性環狀肽包括例如JBT2441、JBT2450、JBT2466-JBT2469、JBT2489-JBT2495、JBT2497-JBT2499及JBT2513-JBT2518(分別為SEQ ID NO: 4159、4167、4181-4184、4204-4210、4212-4214及4228-4233)。

本發明另外提供結合TFPI之肽，該肽包含式(V)結構：X2001-X2002-X2003-X2004-X2005-X2006-[X2007-X2008-X2009-X2010-X2011-X2012-X2013-X2014-X2015-X2016-X2017-X2018]-X2019-X2020-X2021-X2022-X2023(V)(SEQ ID NO: 3118)，其中該肽形成藉由X2007與X2018之間的鍵聯(例如雙硫鍵)(在式(V)內以括號形式表示)產生的環狀結構。在式(V)中，X2001、X2002及X2023獨立地為存在或不存在。當存在時，X2001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V及W；X2002為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V及W；且X2023為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W及Y。此外，X2003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、I、K、L、R、S、T、V、W及Y；X2004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V及W；X2005為W；X2006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、I、K、L、R、V及W；X2007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、Hcy、Dap及K(例如C或Hcy)；X2008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、R、S及T；X2009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、I、K、L、M、m、Nle、p、R、Sem及V；X2010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T及V；X2011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、E、G、S及T；X2012為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W及w；X2013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V及W；X2014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、R、S、T、V及W；X2015為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、M、Nle、R、S、T、V及W；X2016為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、Sem、T、V、W及Y；X2017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V、W及Y；X2018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C及D(例如X2018為C)；X2019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、I、L、S、T、V及W；X2020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F及W；X2021為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I、L及V；且X2022為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V及W。

在一些情況下，在包含式(V)結構之本發明之肽中，X2001視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、H、K、L、P及S，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、H、K、L及S(當X2001存在時)；X2002視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、H、K、L、P、R及S，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、H、K、L、M、R及S(例如H、F、M或R)(當X2002存在時)；X2003視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、K、L、S及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、S及Y(例如F或Y)；X2004視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、K、L及S(例如K)；X2005視情況為W；X2006視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、K及L(例如F或H)；X2007視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C及HcY(例如X2007為C)；X2008視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G及S；X2009視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、K、L、V、M、m、Nle、Sem及p，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：M、Nle、p及V(例如M、Sem或V)；X2010視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、K、L、P、R及S，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、K、L、P、R及S(例如K、P或R)；X2011視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、G及S(例如D或S)；X2012視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、m、Nle、P、S及s，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、Nle、P、S及Sem(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、l、Sem及M)；X2013視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、d、F、G、K、L、S及s，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、K、L及S(例如D、G、K或S)：X2014視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、F、G、K、L及S(例如D或G)；X2015視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、I、K、L、M、Nle、S及T(例如I或T)；X2016視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、F、K、L、M、Nle、S及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、F、K、L、M、Nle、S、Sem及Y(例如D、F、M、Sem或Y)；X2017視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、K、L、S、T及Y(例如S或T)；X2018視情況為C；X2019視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、L、S及V(例如A或V)；X2020視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F及W(例如W)；X2021視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：L及V(例如V)；X2022視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、K、L、P、R、S及W，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、G、K、L、P、R、S及W(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、K、R、P及W)；且X2023視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、K、L、M、S及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、L M、S及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列：A、D、F、M、S及Y)(當X2023存在時)。

本發明另外包括結合TFPI之肽，其中該肽包含式(VI)結構：X2001-X2002-F/Y-K-W-F/H-[C-X2008-M/V-X2010-D-X2012-X2013-G-I/T-X2016-S/T-C]-A/V-W-V-X2022-X2023(VI)(SEQ ID NO: 3119)。在包含式(VI)結構之肽中，X2001、X2002及X2023各自獨立地為存在或不存在。若X2001、X2002及/或X2023存在，則X2001、X2002及X2023中之任一者獨立地選自任何胺基酸。此外，X2008、X2010、X2012、X2013、X2016及X2022各自獨立地選自任何胺基酸。

在一些態樣中，在式(VI)之肽中，X2001視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、P、R、S、T、V及W，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、H、K、L、P及S(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、H、K、L及S)(當X2001存在時)；X2002視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、R、S、T、V及W，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、H、K、L、M、P、R及S(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、H、K、L、M、R及S，諸如H、F、M或R)(當X2002存在時)；X2008視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、R、S及T，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G及S；X2010視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、I、K、L、P、R、S、T及V，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、K、L、P、R及S(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、K、L、P、R及S，諸如K、P或R)；X2012視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、D、d、E、e、F、f、G、I、I、K、k、L、l、M、m、Nle、nle、P、p、R、r、S、s、Sem、T、t、V、v、W及w，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、m、Nle、P、S、s及Sem(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、d、F、f、G、K、k、L、l、M、Nle、P、S及Sem，諸如F、L、l、Sem或M)；X2013視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、d、E、e、F、G、I、K、L、R、S、s、T、V及W，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、d、F、G、K、L、S及s(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、K、L及S，諸如D、G、K或S)；X2016視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、I、K、L、M、Nle、R、S、Sem、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、F、K、L、M、Nle、S、Sem及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：D、F、K、L、M、Nle、S及Sem，諸如F、Sem或M)；X2022視情況為選自由以下對成之群之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、P、R、S、T、V及W，諸如選自由以下對成之群之胺基酸：A、D、F、G、K、L、P、R、S及W(例如選自由以下對成之群之胺基酸：A、F、G、K、L、P、R、S及W，諸如F、L、K、R、P或W)；及/或X2023視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、E、F、G、I、K、L、R、M、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、K、L、M、S及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、D、F、G、LM、S及Y，諸如A、D、F、M、S或Y)(當X2023存在時)。

在一態樣中，本發明之TFPI結合肽包含與式VII序列：Ac-FYYKWH[CGMRDMKGTMSC]AWVKF-NH2(VII)(SEQ ID NO: 1040)之一致性為至少60%(例如一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)的胺基酸序列。視情況而定，該肽包含如本文定義之式(V)-式(VII)之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。本發明亦包括包含選自由SEQ ID NO: 1001-1293所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽(例如包含選自由SEQ ID NO:1001-1212及1290-1291所組成之群組(諸如SEQ ID NO: 1001-120、1290或1291)及/或選自由SEQ ID NO: 1213-1289所組成之群組及/或選自由1292及1293所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽)。

本發明另外提供TFPI結合肽，其至少包含式(VIII)結構：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-X3012-X3013-X3014-X3015-X3016-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(VIII)(SEQ ID NO: 3120)之胺基酸3-21(X3003-X3021)。在式(VIII)中，X3001及X3002獨立地存在或不存在於該肽中。若存在，則X3001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y：且X3002為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I及L。此外，X3003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W及Y；X3004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及P；X3005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W及Y；X3006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、W、C、K、P、R及H；X3007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W及Y；X3008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y及I；X3009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y及K；X3010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X3011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F及H；X3012為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L及R；X3013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y及I；X3014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及K；X3015為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、K及R；X3016為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、F、K及R；X3017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A及M；X3018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W及Y；X3019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y及I；X3020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I及P；且X3021為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F及G。

在本發明之一些態樣中，該肽包含式(VIII)序列，其中：X3001視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、G、K、L、M、N、P、R、S、T、E、H及Y(當X3001存在時)；X3002視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、H、K、R、S、W、Y、G、I及L，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、K、R、W、Y、G、I及L(當X3002存在時)；X3003視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及W，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、R、S、T及W；X3004視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V及P，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T及P；X3005視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、H、I、K、M、R、T、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、H、K、R及W；X3006視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：P、H及A；X3007視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、G、R、W、A及L，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：L、C、R及W；X3008視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y及I，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、H、K、R、V、W、Y及I；X3009視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、I、R、V及K，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、R、V及K；X3010視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、Q、R、S及T，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、K、L、Q、R及S；X3011視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、I、K、L、M、R、S、V、W、C、F及H，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I、K、L、M、R、V、W、C、F及H；X3012視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：H及R(例如H)；X3013視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、K、L、M、R、V及I，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、K、R、V及I；X3014視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、M、C、F、H、I、L、N、R、S、V、W及K，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、S、C、F、H、I、R及K；X3015視情況為K或R；X3016視情況為K或R；X3017視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、H、A及M，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、H、A及M；X3018視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、K、C、I、L、R及W(例如K、C、I、R或W)；X3019視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、E、H、K、N、Q、R及I，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、E、H、K、R及I；X3020視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、H、L、M、R、V、I及P(例如C、M、I或P)；且X3021視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、F及G，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、F及G。

本發明另外提供結合TFPI且至少包含式(IX)結構：X3001-X3002-X3003-X3004-X3005-X3006-X3007-X3008-X3009-X3010-X3011-H-X3013-X3014-K/R-R-X3017-X3018-X3019-X3020-X3021(IX)(SEQ ID NO: 3121)之胺基酸3-21(X3003-X3021)的肽。在式(IX)中，X3001及X3002獨立地存在或不存在於肽中。若存在，則X3001及/或X3002獨立地選自任何胺基酸。同樣，X3003、X3004、X3005、X3006、X3007、X3008、X3009、X3010、X3011、X3013、X3014、X3017、X3018、X3019、X3020及X3021各自獨立地選自任何胺基酸。當存在時，X3001視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、E、H及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、G、K、L、M、N、P、R、S、T、E、H及Y)。同樣，當存在時，X3002視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、F、H、K、M、N、P、R、S、T、W、Y、G、I及L，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、H、K、R、S、W、Y、G、I及L(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、K、R、W、Y、G、I及L)。此外，關於式(IX)，X3003視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及W(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、R、S、T及W)；X3004視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及P，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V及P(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、N、R、S、T及P)；X3005視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、H、I、K、M、R、T、W及Y(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、H、K、R及W)；X3006視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、W、C、K、P、R及H，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：P、H及A；X3007視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Q、A、C、F、G、H、I、K、L、N、R、S、T、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、G、R、W、A及L(例如L、C、R或W)；X3008視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y及I，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、Y及I(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、H、K、R、V、W、Y及I)；X3009視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、R、S、T、V、W、Y及K，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、I、R、V及K(例如C、R、V或K)；X3010視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、G、H、I、K、L、M、Q、R、S及T(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、K、L、Q、R及S)；X3011視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、G、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y、C、F及H，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、I、K、L、M、R、S、V、W、C、F及H(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I、K、L、M、R、V、W、C、F及H)；X3013視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、R、S、V、W、Y及I，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、K、L、M、R、V及I(例如C、K、R、V或I)；X3014視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y及K，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、M、C、F、H、I、L、N、R、S、V、W及K(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、S、C、F、H、I、R及K)；X3017視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、Y、H、A及M，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W、H、A及M(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、H、A及M)；X3018視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、I、K、L、M、Q、R、V、W及Y，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、K、C、I、L、R及W(例如K、C、I、R或W)；X3019視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、V、W、Y及I，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、E、H、K、N、Q、R及I(例如C、E、H、K、R或I)；X3020視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、F、G、H、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、I及P，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、H、L、M、R、V、I及P(例如C、M、I或P)；及/或X3021視情況為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、F及G，諸如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、Y、F及G(例如選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、H、I、K、L、M、N、Q、R、V、W、F及G)。

在一些態樣中，本發明之TFPI結合肽包含與式(X)序列：Ac-GYASFPWFVQLHVHKRSWEMA-NH2(X)(SEQ ID NO: 223)之一致性為至少60%(例如一致性為至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)的胺基酸序列。視情況而定，該肽包含如本文定義之式(VIII)-式(IX)之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。如本文所用，「至少60%一致性(at least 60% identity)」及類似術語涵蓋自例如60%至100%之任何整數，諸如60%、61%、62%及其類似整數。此外，術語「至少[百分比]一致性(at least[percentage] identity)」涵蓋大於或等於相同胺基酸之數目除以本發明之肽之胺基酸總數目所得值的任何百分比([至少百分比一致性][相同胺基酸之數目]/[本發明之肽之胺基酸總數目])。

本發明亦包括包含選自由SEQ ID NO: 2001-2498所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽(例如包含選自由SEQ ID NO: 2001-2296及2498所組成之群組(諸如SEQ ID NO: 2001-2126、2128-2296、或2498)及/或選自由SEQ ID NO: 2297-2497所組成之群組(諸如SEQ ID NO: 2298-2497)之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽)。本發明另外提供包含選自由SEQ ID NO: 3001-3108所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽(例如包含選自由SEQ ID NO: 3001-3064所組成之群組(諸如SEQ ID NO: 3001-3048、3051-3053、3055、或3057-3064)及/或選自由SEQ ID NO: 3065-3084所組成之群組(諸如SEQ ID NO: 3066-3084)及/或選自由SEQ ID NO: 3085-3108所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽)。

在一些態樣中，SEQ ID NO: 1-7之肽亦包含一或多個連接於SEQ ID NO: 1-7之N端或C端處之胺基酸。舉例而言，本發明包括包含JBT0047、JBT0051、JBT0055、JBT0131、JBT0132、JBT0133、JBT0155、JBT0158、JBT0162、JBT0163、JBT0164、JBT0166、JBT0169、JBT0170、JBT0171、JBT0174、JBT0175或JBT0293之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽，以上所有胺基酸序列皆包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之例示性肽包括包含JBT0294、JBT0295、JBT0296、JBT0297、JBT0298、JBT0299、JBT0300、JBT0301、JBT0302、JBT0303、JBT0304、JBT0305、JBT0306、JBT0307、JBT0308、JBT0309、JBT0310或JBT0311之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽。包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之例示性肽包含JBT0049、JBT0053、JBT0057、JBT0190、JBT0193或JBT0197之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。本發明另外包括包含JBT0050、JBT0054、JBT0058、JBT0129、JBT0130、JBT0205、JBT0208、JBT0211、JBT0212、JBT0217、JBT0218或JBT0219之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽，以上所有胺基酸序列皆包括SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。包含SEQ ID NO: 5之例示性肽包括包含JBT0101、JBT0052、JBT0103、JBT0178或JBT0182之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽。本發明另外包括包含JBT0120、JBT0124、JBT0247、JBT0248、JBT0251或JBT0252之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽，以上胺基酸序列之各者皆包括SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。本發明亦提供包括SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之肽，例如包含JBT0122、JBT0126、JBT0221、JBT0224、JBT0225、JBT0226、JBT0228、JBT0232或JBT0233之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽。本文所述之肽闡述於實施例1之表5中及圖12-18中。

本發明另外包括TFPI結合肽，其包含式(XI)結構：X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)。關於式(XI)，X4001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、M、Y、1Ni、Thi、Bta及多巴(例如F、Y、1Ni、Bta或多巴)；X4003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、E、M、Q、R、S、T、Ede(O)及Cmc(例如D、E或S)；X4004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y(例如K)；X4005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、p、Q、R、N丙基G、aze、pip、tic、oic、hyp、nma、Ncg、Abg、Apg、thz及dtc(例如p、Nmg、N丙基G、aze、pip、tic、oic或hyp)；X4006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、C(NEM)、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S、V、Cit、C(Acm)、Nle、I、Ede(O)、Cmc、Ecl、Eea、Eec、Eef、Nif及Eew(例如C、E、K、R、S、V、C(Acm)、Nle、C(NEM)、I或Cit)；X4007為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：I、V、T、Chg、Phg及Tle(例如V或Tle)；X4008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H、1Ni、2Ni、Pmy及Y(例如H、1Ni、2Ni或Pmy)；X4009為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、V、Chg、Phg、Abu、Cpg、Tle及L-2-胺基-4,4,4-三氟丁酸(例如V、Abu或Tle)；X4010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、d、E、F、H、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y、Nmd及C(NEM)(例如D、P、C或T)；X4011為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、G、p、Sar、c及hcy(例如G、a、c、hcy或Sar)；X4012為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Y、Tym、Pty、多巴及Pmy(例如Y)；X4013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、F、1Ni、Thi及Bta(例如F、1Ni或Bta)；X4014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、C(NEM)、D、E、K、L、M、N、Q、R、T、V及Hcy(例如Aib、C、E或Hcy)；X4016為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：L、Hcy、Hle及Aml；X4017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、a、Aib、C、c、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nva、Opa、Orn、R、S、Deg、Ebc、Eca、Egz、Aic、Apc及Egt(例如A、Aib、C、c、Aic、Eca或Deg)；X4018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、Hcy、hcy、C、c、L、Nle、M、N及R(例如A、Aib、C、c、L或Hcy)；X4019為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：K、R及Har(例如K)；且X4020為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：K、L、Hcy及Aml(例如L、Aml及Hcy)。

式(XI)之TFPI結合肽不包含式(XII)結構：X5001-Q-X5003-X5004-X5005-X5006-I/V-X5008-Aib/V-X5010-G-Y-X5013-X5014-R-L-X5017-X5018-K-K/L(XII)。在式(XII)中，X5001為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、L、M及Y；X5003為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：C、D、E、M、Q、R、S及T；X5004為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：E、G、I、K、L、M、P、R、W及Y；X5005為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：a、A、Aib、C、D、d、E、G、H、K、k、M、N、Nmg、Q、R及p；X5006為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、G、H、K、M、N、Q、R、S及V；X5008為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：F、H及Y；X5010為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、D、E、F、H、D、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y；X5013為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、C及F；X5014為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、D、E、K、L、M、N、Q、R、T及V；X5017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、Aib、C、Cha、Dab、Eag、Eew、H、Har、Hci、Hle、I、K、L、M、Nle、Nve、Opa、Orn、R及S；且X5018為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：A、C、L、M、N及R。

在一態樣中，式(XI)之TFPI結合肽另外包含與X4001連接之N端胺基酸及/或部分。N端胺基酸及/或部分視情況選自由以下者所組成之群組：FAM-Ttds、脯胺酸-麩胺酸標籤(「PE」)、Palm、2-苯基乙醯基、3-苯基丙醯基、2-(萘-2-基)乙醯基、己醯基、2-甲基丙醯基、3-甲基丁醯基、2-萘基磺醯基及1-萘基磺醯基。或者或此外，式(XI)之TFPI結合肽另外包含一或多個與X4020連接之胺基酸及/或部分。C端胺基酸及/或部分在本文中表示為X4021且視情況選自由以下者所組成之群組：C、c、C(NEM)、K(Ttds-順丁烯二醯亞胺基丙醯基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-順丁烯二醯亞胺)、K(AOA)及Cea。

在一具體實例中，該肽包含在X4018與X4021之間形成之環狀結構。就此而言，X4018視情況為C或c，且X4021視情況為Cea。在另一具體實例中，該肽包含在X4011與X4014之間形成之環狀結構。就此而言，X4011視情況為c或hcy，且X4014視情況為C或Hcy。

本發明亦包括由選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列組成的肽：SEQ ID NO: 4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239，以及由選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列組成的肽：SEQ ID NO: 1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233。

在某些具體實例中，本發明之肽包含JBT0047、JBT0049、JBT0101、JBT0120或JBT0122或任何本文所述之本發明之肽(例如包含SEQ ID NO: 1-3108中之任一者之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽，諸如包含SEQ ID NO: 8-741、744-968、971-978、1001-1210、1213-1289、1290-1293、2001-2126、2128-2296、2298-2498、3001-3048、3051-3053、3055、3057-3064及3067-3108中之任一者之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽；包含SEQ ID NO: 4022、4024、4032、4036-4047、4049-4078、4086-4097、4100-4127、4129-4170、4173-4195、4200-4214、4217-4225、4228、4230、4231、4238及4239中之任一者之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽；或包含選自由SEQ ID NO: 1294-1336、4002、4013、4021、4023、4025-4031、4033-4035、4048、4079-4085、4098、4099、4128、4171、4172、4196-4199、4215、4216、4226、4277、4229、4232及4233所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽)或任何前述者之變異體的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。「變異體(variant)」意謂相對於親本胺基酸序列，包含一或多個胺基酸取代、胺基酸缺失或胺基酸添加之肽。變異體包括(但不限於)胺基酸序列與本文提供之胺基酸序列中之任一者的一致性為至少60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同時保留結合TFPI及/或抑制TFPI活性之能力的肽。在一具體實例中，該肽包含JBT0132、JBT0303、JBT0193、JBT0178、JBT0120或JBT0224之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

在一態樣中，本發明之肽由40個或40個以下胺基酸，諸如35個或35個以下胺基酸組成。視情況而定，本發明之肽由25個或25個以下胺基酸、或10個或10個以下胺基酸組成。在各種具體實例中，該肽包含15-35個胺基酸殘基(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個胺基酸殘基)。然而，亦預期本文所述之包含一或多個缺失之肽適於本發明之情形中，只要該肽結合TFPI且視情況阻斷TFPI抑制凝血級聯即可。在一些態樣中，移除胺基酸序列內、N端處及/或C端處之胺基酸。此等肽片段可包含3-14個胺基酸殘基(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸殘基)。

視情況而定，本發明之肽包含一或多個不會破壞該肽結合及/或抑制TFPI之能力的胺基酸取代(以本文提供之胺基酸序列中之任一者為參照)。舉例而言，包含選自由JBT0294、JBT0295、JBT0296、JBT0297、JBT0298、JBT0299、JBT0300、JBT0301、JBT0302、JBT0303、JBT0304、JBT0305、JBT0306、JBT0307、JBT0308、JBT0309、JBT0310或JBT0311所組成之群組之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的肽為JBT0293之胺基酸序列(在N端處直接與苯丙胺酸殘基連接且在C端處直接與離胺酸殘基連接之SEQ ID NO: 1之胺基酸序列)的取代突變體(參見圖4)。

胺基酸取代包括(但不限於)以下取代：(1)降低對蛋白水解之敏感性之取代，(2)降低對氧化之敏感性之取代，(3)改變結合親和力之取代，及/或(4)賦予或改進肽之其他生理化學或功能性質之取代。在一態樣中，取代為保受取代，其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。具有類似側鏈之胺基酸之家族在此項技術內已被定義，且包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸及組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸及麩胺酸)、具有不帶電荷之極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸及半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸及色胺酸)、具有β-分支側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸及異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及組胺酸)。然而，應瞭解專業人員不限於產生保受取代，只要所得肽保留完全或部分下調TFPI活性之能力即可。本發明亦包括包含此項技術中熟知之非典型、非天然存在之胺基酸的TFPI抑制肽。例示性非天然存在之胺基酸包括鳥胺酸、瓜胺酸、羥基脯胺酸、高絲胺酸、苯基甘胺酸、牛磺酸、碘酪胺酸、2,4-二胺基丁酸、α-胺基異丁酸、4-胺基丁酸、2-胺基丁酸、y-胺基丁酸、2-胺基異丁酸、3-胺基丙酸、正白胺酸、正纈胺酸、肌胺酸(sarcosine)、高瓜胺酸、氧化半胱胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、苯基甘胺酸、環己基丙胺酸、β-丙胺酸、氟-胺基酸、3-甲基胺基酸、α-C-甲基胺基酸、N-甲基胺基酸、2-胺基-異丁酸、β-高麩胺酸、β-高苯丙胺酸、β-高離胺酸、β-高白胺酸、β-高天冬醯胺、β-高麩醯胺酸、β-高精胺酸、β-高絲胺酸、β-高酪胺酸、β-高天冬胺酸、β-高纈胺酸、β-高天冬醯胺、(S)-環己基丙胺酸、(S)-瓜胺酸、(S)-2,4-二胺基丁酸、(S)-2,4-二胺基丁酸、(S)-二胺基丙酸、(S)-2-炔丙基甘胺酸、(S)-N(ω)-硝基-精胺酸、L-高苯丙胺酸、(S)-高-精胺酸、(S)-高-瓜胺酸、(S)-高-半胱胺酸、(S)-2-胺基-5-甲基-己酸、(S)-高-離胺酸、(S)-正白胺酸、(S)-N -甲基丙胺酸、(S)-N -甲基-天冬胺酸、(S)-N -甲基-麩胺酸、(S)-N -甲基-苯丙胺酸、N-甲基-甘胺酸、(S)-N -甲基-離胺酸、(S)-N -甲基-白胺酸、(S)-N -甲基-精胺酸、(S)-N -甲基-絲胺酸、(S)-N -甲基-纈胺酸、(S)-N -甲基-酪胺酸、(S)-2-胺基-戊酸、(S)-2-吡啶基-丙胺酸、(S)-鳥胺酸、L-苯基甘胺酸、4-苯基-丁酸及硒甲硫胺酸。適當時，個別胺基酸可具有L或D立體化學，但L立體化學典型地用於肽中之所有胺基酸。

本發明另外包括TFPI抑制肽變異體，其包含一或多個插入在本文提供之胺基酸序列內及/或與N端或C端連接之胺基酸。在一態樣中，肽另外包含一或多個有助於合成、處理或使用肽之胺基酸，包括(但不限於)一或兩個在N端及/或C端處之離胺酸以增加肽之溶解性。適合融合蛋白包括(但不限於)包含與一或多個多肽、多肽片段、或通常未被識別為蛋白質序列之一部分之胺基酸連接的TFPI抑制肽之蛋白質。在一態樣中，融合肽包含兩種或兩種以上肽之全部胺基酸序列，或者包含兩種或兩種以上肽之部分(片段)。除本文所述之TFPI抑制肽之全部或一部分之外，融合蛋白亦視情況包括具有所要生物活性/功能之任何適合肽的全部或一部分。實際上，在一些態樣中，TFPI抑制肽可操作地與例如以下一或多者連接：具有長循環半衰期之肽、標記蛋白、有助於純化TFPI抑制肽之肽、促進形成多聚蛋白質之肽序列或任何前述者之片段。適合融合搭配物包括(但不限於)His標籤、FLAG標籤、strep標籤及myc標籤。視情況而定，TFPI抑制劑肽與一或多個提高肽之半衰期之實體融合。半衰期可藉由例如增加TFPI結合肽之分子量以避免腎清除及/或併入nFc受體介導之再循環路徑之配位體來增加。在一具體實例中，TFPI結合肽與白蛋白多肽或其片段(例如人類血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))融合或化學結合(如以下進一步描述)。白蛋白片段包含全長白蛋白蛋白之10%、25%、50%或75%。或者或此外，TFPI結合肽包含在活體內投予時會結合白蛋白之白蛋白結合域或脂肪酸。其他適合融合搭配物包括(但不限於)脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸多聚體(PAS化)及抗體或其片段(例如抗體之Fc部分)。

在一具體實例中，兩種或兩種以上TFPI抑制肽融合在一起、經多聚化域連接、或經由化學鍵連接以產生TFPI抑制肽錯合物。TFPI抑制劑肽可相同或不同。因此，本發明提供包含本文所述之肽中之任一者或由本文所述之肽中之任一者組成、視情況經一或多個連接子連接的均二聚體(亦即包含兩種相同TFPI結合肽之二聚體)、均多聚體(亦即包含三種或三種以上相同TFPI結合肽之錯合物)、雜二聚體(亦即包含兩種不同TFPI結合肽之二聚體)及雜多聚體(亦即包含三種或三種以上TFPI結合肽之錯合物，其中TFPI結合肽之至少兩者不同)。一種例示性TFPI結合肽二聚體為JBT2496(SEQ ID NO: 4211)。

「衍生物」包括在本發明中且包括已以不同於胺基酸之添加、缺失或取代之某一方式經化學修飾的TFPI抑制肽。就此而言，本文提供之本發明之肽與聚合物、脂質、其他有機部分及/或無機部分化學鍵結。肽及蛋白質修飾之實例於Hermanson,Bioconjugate Techniques, Academic Press,(1996)中給出。本文所述之TFPI結合肽視情況包含有助於與另一部分(例如肽部分)結合之官能基。例示性官能基包括(但不限於)異硫氰酸酯、異氰酸酯、醯疊氮、NHS酯、磺醯氯、醛、環氧化物、環氧乙烷、碳酸酯、芳基化劑、亞胺基酯、碳化二亞胺、酸酐、烷基鹵化物衍生物(例如鹵乙醯基衍生物)、順丁烯二醯亞胺、氮丙啶、丙烯醯基衍生物、芳基化劑、硫醇-二硫化物交換試劑(例如吡啶基二硫化物或TNB硫醇)、重氮烴、羰基二咪唑、N,N'-二琥珀醯基碳酸酯、N-羥基琥珀醯亞胺基氯甲酸酯及肼衍生物。順丁烯二醯亞胺適用於例如產生活體內與白蛋白結合之TFPI結合肽。

在一些情形中製備衍生物以增加溶解性、穩定性、吸收或循環半衰期。各種化學修飾可消除或減弱藥劑之任何非所要的副作用。在一態樣中，本發明包括經共價修飾以包括一或多個水溶性聚合物連接之TFPI結合肽。水溶性聚合物(或其他化學部分)與任何胺基酸殘基連接，但在一些具體實例中，與N端或C端連接較佳。視情況而定，聚合物經由一或多個提供有助於聚合物連接之官能基之胺基酸或構築嵌段與肽連接。舉例而言，JBT2315包含C端半胱胺酸(關於式(XI)為位置X4021)，其有助於添加例如順丁烯二醯亞胺聚乙二醇(PEG)。適用聚合物包括(但不限於)PEG(例如大小為約40 kD、30 kD、20 kD、10 kD、5 kD或1 kD之PEG)、聚氧乙二醇、聚丙二醇、單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、羥乙基澱粉、纖維素、聚-(N-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚唾液酸(PSA)、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇，以及任何前述者之混合物。在一態樣中，本發明之肽為聚乙二醇化肽。PEG部分可以不同形狀，例如直鏈或分支鏈加以利用。關於水溶性聚合物連接之進一步論述，參見美國專利第4,640,835號；第4,496,689號；第4,301,144號；第4,670,417號；第4,791,192號；及第4,179,337號。適用於改良肽半衰期或穩定性之其他部分在本文中有描述且包括例如白蛋白(視情況經修飾以允許與本發明之肽結合)、脂肪酸鏈(例如C12-C18脂肪酸，諸如C14脂肪酸)、抗體或其片段(例如抗體之Fc部分)及脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸多聚體。

在另一態樣中，肽衍生物包括對特定細胞類型、組織及/或器官具有特異性之靶向部分。或者，肽與一或多個有助於純化、偵測、多聚化、與相互作用搭配物結合及特性化肽活性之化學部分連接。一種例示性化學部分為生物素。適於與本發明之TFPI結合肽結合之其他部分包括(但不限於)光敏劑、染料、螢光染料、放射性核種、含有放射性核種之錯合物、酶、毒素及細胞毒性劑。光敏劑包括例如光卟啉(Photofrin)、維速達爾(Visudyne)、聚左旋糖(Levulan)、Foscan、5-胺基酮戊酸甲酯(Metvix)、Hexvix、Cysview^TM 、Laserphyrin、Antrin、Photochlor、Photosens、Photrex、Lumacan、Cevira、Visonac、BF-200 ALA及Amphinex。必要時，His標籤、FLAG標籤、strep標籤或myc標籤與肽結合。

此外，在一態樣中，本發明之肽在肽之N端胺基酸處經醯化。在另一態樣中，本發明之肽在肽之C端胺基酸處經醯胺化。在另一態樣中，本發明之肽在肽之N端胺基酸處經醯化且在肽之C端胺基酸處經醯胺化。

衍生物亦包括包含經修飾或非蛋白原性胺基酸或經修飾連接子基團之肽(參見例如Grant,Synthetic Peptides: A User's Guide ,Oxford University Press(1992))。經修飾胺基酸包括例如胺基及/或羧基經另一基團置換之胺基酸。非限制性實例包括經修飾胺基酸，其併有硫醯胺、脲、硫脲、醯基醯肼、酯、烯烴、磺醯胺、磷醯胺、酮、醇、硼酸醯胺、苯并二氮呯及其他芳族或非芳族雜環(參見Estiarte等人,Burgers Medicinal Chemistry, 第6版，第1卷，第4部分，John Wiley & Sons,New York(2002))。經修飾胺基酸常以至少1個以上提及之官能基替代醯胺鍵與肽連接。非蛋白原性胺基酸包括(但不限於)P-丙胺酸(Bal)、正纈胺酸(Nva)、正白胺酸(Nle)、4-胺基丁酸(y-Abu)、2-胺基異丁酸(Aib)、6-胺基己酸(s-Ahx)、鳥胺酸(Orn)、羥基脯胺酸(Hyp)、牛磺酸、肌胺酸、瓜胺酸(Cit)、氧化半胱胺酸(cysteic acid)(Coh)、環己基丙胺酸(Cha)、甲硫胺酸亞碸(Meo)、甲硫胺酸碸(Moo)、高絲胺酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘胺酸(Eag)、5-氟色胺酸(5Fw)、6-氟色胺酸(6Fw)、3',4'-二甲氧基苯基-丙胺酸(Ear)、3',4'-二氟苯丙胺酸(Dff)、4'-氟苯基-丙胺酸(Pff)、1-萘基-丙胺酸(1Ni)、1-甲基色胺酸(1Mw)、青黴胺(Pen)、高絲胺酸(Hse)、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、苯基甘胺酸(Phg)、苯并噻吩基丙胺酸(Bta)、L-高-半胱胺酸(Hcy)、N-甲基-苯丙胺酸(Nmf)、2-噻吩基丙胺酸(Thi)、3,3-二苯丙胺酸(Ebw)、高苯丙胺酸(Hfe)及S-苯甲基-L-半胱胺酸(Ece)。許多非蛋白原性胺基酸之結構提供於表2中。此等及其他非蛋白原性胺基酸可以D-異構體或L-異構體形式存在。經修飾連接子之實例包括(但不限於)可撓性連接子4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺(Ttds)、甘胺酸、6-胺基己酸、β-丙胺酸(Bal)、戊炔酸(Pyn)以及Ttds、甘胺酸、6-胺基己酸及Bal之組合。

構成本發明之肽之胺基酸的同系物可如表3中所示。在任何具體實例中，TFPI結合肽之一或多個胺基酸經同系物取代。

衍生物亦包括包含具有經修飾取代基之胺基酸(諸如藉由用例如氟、氯、碘或溴鹵化而修飾之胺基酸)的肽。在一些具體實例中，TFPI結合肽包含鹵化芳族胺基酸，諸如苯丙胺酸。

在一些具體實例中，聯接本發明之肽內之胺基酸的肽(CO-NH)鍵聯經逆轉以產生「經逆向修飾之(retro-modified)」肽，亦即相較於參照肽，包含按相反方向(NH-CO鍵)裝配之胺基酸殘基之肽。經逆向修飾之肽包含與參照肽相同之胺基酸手性。「經反轉修飾之(inverso-modified)」肽為包含按與參照肽相同之方向裝配之胺基酸殘基，但胺基酸之手性反轉的本發明之肽。因此，當參照肽包含L-胺基酸時，「經反轉修飾之」肽包含D-胺基酸，反之亦然。經反轉修飾之肽包含CO-NH肽鍵。「經逆向-反轉修飾之(retro-inverso modified)」肽係指包含按相反方向裝配且具有反轉手性之胺基酸殘基的肽。逆向-反轉類似物具有肽鍵之逆轉端及逆轉方向(亦即NH-CO)，同時大致維持見於參照肽中之側鏈拓撲結構。逆向-反轉肽模擬物係使用標準方法，包括Meziere等人,J. Immunol. ,159 ,3230-3237(1997)中描述之方法製備，該文獻以引用的方式併入本文中。部分逆向-反轉肽為僅一部分胺基酸序列經逆轉且經對映異構胺基酸殘基置換之肽。

本發明之TFPI結合肽(包括TFPI抑制劑肽)係以多種方式製備。在一態樣中，肽係藉由固相合成技術合成，該等固相合成技術包括描述於以下中之技術：Merrifield,J. Am. Chem. Soc. ,85 ,2149(1963)；Davis等人,Biochem. Intl. ,10 ,394-414(1985)；Larsen等人,J. Am. Chem. Soc. ,115 ,6247(1993)；Smith等人,J. Peptide Protein Res. ,44 ,183(1994)；O'Donnell等人,J. Am. Chem. Soc. ,118 ,6070(1996)；Stewart及Young,Solid Phase Peptide Synthesis ,Freeman(1969)；Finn等人,The Proteins ,第3版，第2卷，第105-253頁(1976)；及Erickson等人,The Proteins ,第3版，第2卷，第257-527頁(1976)。或者，TFPI結合肽(例如TFPI抑制肽)係藉由將編碼TFPI結合肽(例如TFPI抑制肽)之核酸引入經培養以表現該肽之宿主細胞中來重組表現。此等肽係使用標準蛋白質純化技術自細胞培養物純化而得。

本發明亦涵蓋包含編碼本發明之TFPI抑制肽之核酸序列的核酸。製備DNA及/或RNA分子之方法在此項技術中為熟知的。在一態樣中，編碼本文提供之肽之DNA/RNA分子係使用化學合成技術及/或使用聚合酶鏈反應(PCR)來產生。必要時，將TFPI抑制肽編碼序列併入表現載體中。一般技術者應瞭解此項技術中已知之任何許多表現載體皆適於本發明之情形中，該等表現載體諸如(但不限於)質體、質體-脂質體錯合物及病毒載體。使用描述於例如以下中之標準重組DNA技術製備任何此等表現載體：Sambrook等人,Molecular Cloning ,a Laboratory Manual ,第2版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology ,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,New York,N.Y.(1994)。視情況而定，核酸可操作地與一或多種調控序列(諸如啟動子、活化子、增強子、帽信號、聚腺苷酸化信號或涉及控制轉錄或轉譯之其他信號)連接。

任何本發明之TFPI抑制肽或編碼該等肽之核酸亦以組成物(例如醫藥組成物)形式提供。就此而言，肽與如本文中另外描述之生理學上可接受之(亦即藥理學上可接受之)載劑、緩衝劑、賦形劑或稀釋劑一起調配。視情況而定，肽呈由本發明涵蓋之生理學上可接受之鹽形式。「生理學上可接受之鹽(Physiologically acceptable salts)」意謂醫藥學上可接受之任何鹽。適當鹽之一些實例包括乙酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、羥乙酸鹽及草酸鹽。必要時，組成物包含一或多種其他醫藥學上有效之藥劑。

本文提供之肽視情況抑制至少一種TFPI-1(TFPI-1α或TFPI-1β)活性，諸如(但不限於)下調凝血級聯之活性。在不受任何特定的作用機制束縛之情況下，一種提出之抑制機制可涉及防止形成四級TF-FVIIA-FXA-TFPI錯合物。該肽可抑制TFPI與FXa(例如抑制TFPI庫尼茲域2與因子Xa結合或阻斷TFPI庫尼茲域1與因子Xa之外部位點結合)、TF/FVIIa錯合物(例如抑制TFPI庫尼茲域1與TF/FVIIa錯合物結合)、單獨TF、及/或單獨FVIIa結合(競爭性或別位性)。隨著TFPI活性減弱，TF及FVIIa可隨意活化FX，此又會增強凝血酶原轉化成凝血酶。驚人地，在一具體實例中，結合庫尼茲域1之本發明之肽會干擾FXa之TFPI介導的抑制。因此，本發明提供一種例如藉由向個體投予本文所述之結合庫尼茲域1之肽來抑制凝血級聯之外在及/或共用路徑的TFPI介導之下調，及/或增強FXa介導之凝血酶原向凝血酶轉化之過程的方法。

在一態樣中，本發明之肽在模型及/或原生質系統中展現TFPI拮抗活性。一種用於測定TFPI抑制活性之例示性模型系統為外在因子X酶檢定，其測試候選肽在TFPI(其為FX活化反應之一種天然抑制劑)存在下恢復外在錯合物介導之FX活化的能力(參見例如Lindhout等人,Thromb. Haemost. ,74,910-915(1995))。另一種用於特性化TFPI抑制活性之模型系統為FXa抑制檢定，其中在TFPI存在下量測FXa活性(參見Sprecher等人,PNAS,91 ,3353-3357(1994))。外在因子X酶檢定及FXa抑制檢定進一步描述於實施例3中。視情況而定，本發明之肽在TFPI存在下增強FX活化之半數最大有效濃度(EC₅₀ )小於或等於1×10^-4 M、小於或等於1×10^-5 M、小於或等於1×10^-6 M、或小於或等於1×10^-7 M。

在一態樣中，在基於血漿之檢定中特性化TFPI拮抗劑活性。在候選肽存在下，在實質上缺乏FVIII或FIX活性(例如殘餘凝血因子活性低於1%)之血漿中觸發凝血酶形成。凝血酶形成可使用螢光受質或顯色受質來偵測，如實施例4中所述。一種量測凝血酶活性之系統由Thrombinoscope BV(Maastricht,The Netherlands)提供。凝血酶原轉化係使用例如Thrombograph^TM (Thermo Scientific,Waltham,MA)量測，且將所得資料編譯於由可獲自Thrombinoscope BV之Thrombinoscope^TM 軟體產生的經校正之自動凝血酶生成圖(Thrombogram)中。在某些具體實例中，TFPI抑制肽增加在檢定期間產生之峰值凝血酶之量及/或減少為達成峰值凝血酶形成所需之時間。舉例而言，該肽改良在不存在FVIII下(例如在缺乏FVIII之血漿中)受TFPI調控之凝血酶產生達至正常血漿中TFPI依賴性凝血酶產生之程度的至少1%。一般而言，正常(未患病)血漿含有約0.5 U/mL至約2 U/mL之因子VIII。因此，在一些情況下，TFPI抑制劑肽將增強在不存在FVIII下之凝血酶形成達至在0.5 U/mL至2 U/mL之FVIII存在下所觀測之凝血酶形成程度的至少約1%。在其他具體實例中，該肽增強在不存在因子VIII下之凝血酶形成達至在正常血漿中，亦即在生理含量之因子VIII存在下凝血酶形成之程度的至少約2%、至少約3%、至少約5%、至少約7%、或至少約10%。在各種態樣中，向凝血酶不足或血友病之動物模型投予該肽以特性化活體內TFPI抑制活性。此等活體內模型在此項技術中為已知的且包括例如經投予抗FVIII抗體以誘發A型血友病之小鼠(Tranholm等人,Blood ,102 ,3615-3620(2003))；凝血因子基因剔除模型，諸如(但不限於)FVIII基因剔除小鼠(Bi等人,Nat. Genet .,10 (1),119-121(1995))及FIX基因剔除小鼠(Wang等人,PNAS ,94 (21),11563-66(1997))；誘發有A型血友病之兔(Shen等人,Blood ,42 (4),509-521(1973))；及Chapel Hill HA犬(Lozier等人,PNAS ,99 ,12991-12996(2002))。

各種肽結合來自任何來源(包括(但不限於)小鼠、大鼠、兔、犬、貓、母牛、馬、豬、天竺鼠(guinea pig)及靈長類動物)之TFPI。在一具體實例中，該肽結合人類TFPI。視情況而定，TFPI抑制肽結合來自一種以上物種之TFPI(亦即該肽在多個物種中具有交叉反應性)。在某些態樣中，該肽結合TFPI之解離常數(K_D )小於或等於1×10^-4 M、小於或等於1×10^-5 M、小於或等於1×10^-6 M、或小於或等於1×10^-7 M。親和力可使用例如且不限於多種技術中之任一者、任兩者、或任兩者以上來測定，該等技術諸如有親和力ELISA檢定、競爭性ELISA檢定及/或表面電漿子共振(BIAcore^TM )檢定。當使用競爭性(IC₅₀ )ELISA檢定來特性化時，本發明之肽視情況顯示小於或等於約50,000 nM之IC₅₀ 。舉例而言，該肽顯示小於或等於約10,000 nM之IC₅₀ ，諸如小於或等於約5,000 nM、小於或等於約1,000 nM、或小於或等於約500 nM之IC₅₀ 。在一態樣中，該肽顯示小於或等於約250 nM、小於或等於約100 nM、小於或等於約50 nM、或小於或等於約10 nM之IC₅₀ 。例示性肽及其IC₅₀ 值提供於圖32-39中；在一些情況下，該等肽基於其IC₅₀ 值分成A、B、C、D、E、F及G組(參見實施例1中之表4)。在各種態樣中，本發明提供屬於如表4中定義之A、B、C、D、E、F及/或G組之肽。親和力亦可藉由動力學方法或平衡/溶解方法測定。此等方法進一步詳述於本文中或在此項技術中為已知的。

另一種適用於特性化本發明之肽的檢定為k_off 檢定，其檢驗肽自TFPI之釋放。k_off 檢定結果不為解離速率常數，而為在與TFPI一起培育一段時期之後由測試肽阻斷與TFPI結合之競爭劑肽的百分比。一種例示性k_off 檢定包括以下步驟：1)與一定量之測試肽一起培育經TFPI塗鋪之微量滴定板，從而產生約90% TFPI佔有率；2)移出未結合之測試肽；3)添加可與測試肽競爭結合於TFPI之經生物素標記之示蹤劑(亦即競爭劑)肽；4)培育一段時間，在此期間由測試肽釋放之結合位點由示蹤劑佔有；5)移出未結合之示蹤劑及測試肽；及6)藉由使用抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)結合物進行顯色反應來偵測結合之示蹤劑。所得信號指示結合位點由測試肽釋放。相較於完全解離之分析物，在培育期期間不自TFPI解離之測試肽產生較弱信號。

如同所有結合劑及結合檢定一般，熟習此項技術者認識到結合劑不應以可偵測方式結合以達成生物學(例如治療學)有效性之各種部分將不能窮盡且完全地列出。因此，術語「特異性結合(specifically binds)」係指肽結合TFPI之親和力能夠比其與不為TFPI之無關對照蛋白質結合的親和力大。舉例而言，肽與TFPI結合之親和力可為針對對照蛋白質之親和力的至少5、10、15、25、50、100、250、500、1000或10,000倍。在一些具體實例中，肽結合TFPI之親和力大於其與「抗目標(anti-target)」結合之親和力，該抗目標為肽與之結合可能導致不良反應的人類中之蛋白質或其他天然存在之物質。若干種類之肽或蛋白質為潛在抗目標。因為TFPI抑制肽在血流中及/或在內皮處顯現其活性，所以血漿蛋白為潛在抗目標。含有庫尼茲域(KD)之蛋白質為潛在抗目標，因為不同蛋白質之KD共有顯著類似性。組織因子路徑抑制劑-2(TFPI-2)高度類似於TFPI-1α，且與TFPI-1α類似，其含有KD(Sprecher等人,PNAS ,91 ,3353-3357(1994))。因此，在一態樣中，本發明之肽與TFPI結合之親和力為針對抗目標(諸如TFPI-2)之親和力的至少5、10、15、25或50倍。

視情況而定，TFPI結合肽顯示一或多種本文所述之所要特性，且必要時，肽之胺基酸序列可經修飾以使結合、穩定性及/或活性最佳化。一種例示性TFPI結合肽結合TFPI之K_D 小於或等於20 nM及/或展現對TFPI之結合親和力為針對抗目標之結合親和力的至少100倍。或者或此外，TFPI結合肽在TFPI存在下增強FX活化之EC₅₀ 小於或等於50 nM(如使用任何適合檢定，諸如此處所述之檢定所量測)及/或增強在不存在因子VIII下之凝血酶形成達至含有生理含量之因子VIII之血漿中凝血酶形成之程度的至少約20%(例如40%)。或者或此外，TFPI結合肽達成所要程度之血漿穩定性(例如在12小時之後50%或50%以上之劑量保留在血漿中)及/或顯示所要活體內半衰期(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10小時)。或者或此外，TFPI結合肽展現所要程度之生體可用性，諸如在皮下投藥之後之所要程度的生體可用性(例如大於或等於5%、10%、15%、20%、25%、30%或50%)及/或顯示在既定劑量下之所要程度之活體內TFPI抑制活性。

本發明另外包括一種抑制TFPI-1之方法。該方法包含使TFPI與如本文所述之TFPI結合肽接觸。涵蓋任何程度之TFPI活性抑制。舉例而言，TFPI抑制肽使外在路徑之TFPI抑制減低至少約5%(例如至少約10%、至少約25%、或至少約30%)。在一些具體實例中，相較於在不存在肽下之TFPI活性，TFPI抑制肽使外在路徑內之TFPI活性降低至少約50%、至少約75%、或至少約90%。

在本發明之一態樣中，TFPI結合肽用於活體內或試管內偵測及/或定量TFPI。一種偵測及/或定量樣本中之TFPI之例示性方法包含(a)使樣本與本發明之TFPI結合肽接觸，及(b)偵測該TFPI結合肽與TFPI之結合。

本發明另外包括一種靶向TFPI所位於之生物結構(包括(但不限於)細胞表面及內皮內襯(endothelial lining))之方法。該方法包含使生物結構(例如包括(但不限於)於細胞表面上呈現TFPI之細胞)與視情況與賦予肽額外功能性之部分結合的本文所述之TFPI結合肽接觸。該部分可為染料(諸如螢光染料)、放射性核種或含有放射性核種之錯合物、蛋白質(例如酶、毒素或抗體)或細胞毒性劑。舉例而言，該肽與有助於肽偵測及/或純化及/或具有治療性質之效應部分連接或結合。在一態樣中，向哺乳動物投予TFPI結合肽或肽結合物以靶向該哺乳動物內之TFPI呈現細胞。視情況而定，該方法另外包含偵測TFPI結合肽與TFPI之結合。該方法適用於治療及診斷TFPI為適合診斷標記或TFPI表現細胞為治療方法之目標的疾病。

直接或間接偵測肽-TFPI錯合物。偵測部分在此項技術中廣泛用於鑑別生物物質且包括例如染料(例如螢光染料)、放射性核種及含有放射性核種之錯合物、及酶。在一些態樣中，間接偵測肽-TFPI結合。就此而言，肽視情況與結合本發明之肽而不顯著干擾肽-TFPI結合之相互作用搭配物接觸，且偵測該相互作用搭配物。例示性相互作用搭配物包括(但不限於)抗體、抗原結合抗體片段、抗運載蛋白(anticalin)及抗體模擬物、適體、抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、中性鏈親和素及鏡像體。視情況而定，相互作用搭配物包含偵測部分以有助於偵測相互作用搭配物-肽錯合物。在一些具體實例中，TFPI結合肽經修飾以有助於結合相互作用搭配物。舉例而言，在一態樣中，TFPI結合肽與經包含抗生蛋白鏈菌素之相互作用搭配物結合之生物素結合。一種例示性相互作用搭配物包含與辣根過氧化酶融合之抗生蛋白鏈菌素，該辣根過氧化酶係在例如ELISA樣檢定中偵測。或者，TFPI結合肽經修飾以包括抗體抗原決定基，且偵測相應抗體與肽-TFPI錯合物之結合。偵測例如抗體及其片段之方法在此項技術中已被充分瞭解。

肽-TFPI錯合物及相互作用搭配物-肽錯合物係使用任何許多方法來鑑別，該等方法諸如有(但不限於)生物化學檢定(例如酶促檢定)、光譜分析(例如基於光密度、螢光、FRET、BRET、TR-FRET、螢光偏振、電化學發光或NMR之偵測)、正電子發射斷層攝影術(PET)及單光子放射電腦斷層攝影術(SPECT)。有助於螢光偵測肽-TFPI錯合物或相互作用搭配物-肽錯合物之可偵測部分包括(但不限於)螢光素、Alexa Fluor350、Marina Blue^TM 、Cascade Yellow^TM 、Alexa Fluor405、Pacific Blue^TM 、Pacific Orange^TM 、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Oregon Green488、Alexa Fluor500、Oregon Green514、AlexaFluor514、Alexa Fluor532、Alexa Fluor555、四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)、Alexa Fluor546、若丹明B(Rhodamine B)、Rhodamine Red-X、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Texas Red、Texas Red-X、Alexa Fluor610、Alexa Fluor633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor？ 700、Alexa Fluor750、B-藻紅素(B-Phycoerythrin)、R-藻紅素、別藻藍蛋白(Allophycocyanin)、BODIPY、Cy3、Cy5、TAMRA及螢光蛋白(GFP及其衍生物)。包含螢光偵測部分之TFPI結合肽之一實例為JBT2454(FAM-Ttds-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO: 4171))，其經5,6-羧基螢光素標記。

放射性標記亦用於偵測生物物質(例如TFPI、TFPI結合肽或TFPI結合肽-TFPI錯合物)，且在一些情況下，使用螯合劑與肽或相互作用搭配物連接，該螯合劑諸如有(但不限於)EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA(二伸乙三胺五乙酸)、CDTA(環己基-1,2-二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-O,O'-雙(2-胺乙基)-N,N,N',N'-四乙酸)、HBED(N,N-雙(羥基苯甲基)-乙二胺-N,N'-二乙酸)、TTHA(三伸乙四胺六乙酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮環十二烷-N,N',N",N"'-四乙酸)、HEDTA(羥乙基二胺三乙酸)或TETA(1,4,8,11-四氮環十四烷-N,N',N",N"'-四乙酸)。放射性標記之實例包括^99m Tc、²⁰³ Pb、⁶⁶ Ga、⁶⁷ Ga、⁶⁸ Ga、⁷² As、¹¹¹ In、^113m In、^114m In、⁹⁷ Ru、⁶² Cu、⁶⁴ Cu、⁵² Fe、^52m Mn、⁵¹ Cr、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、⁷⁷ As、⁹⁰ Y、⁶⁷ Cu、¹⁶⁹ Er、^117m Sn、¹²¹ Sn、¹²⁷ Te、¹⁴² Pr、¹⁴³ Pr、¹⁹⁸ Au、¹⁹⁹ Au、¹⁴⁹ Tb、¹⁶¹ Tb、¹⁰⁹ Pd、¹⁶⁵ Dy、¹⁴⁹ Pm、¹⁵¹ Pm、¹⁵³ Sm、¹⁵⁷ Gd、¹⁶⁶ Ho、¹⁷² Tm、¹⁶⁹ Yb、¹⁷⁵ Yb、¹⁷⁷ Lu、¹⁰⁵ Rh及¹¹¹ Ag。順磁性金屬亦為適於與TFPI結合肽或相互作用搭配物視情況經由螯合劑錯合物連接之可偵測部分。順磁性金屬之實例包括例如Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Sm、Yb、Gd、Tb、Dy、Ho及Er。

在一些態樣中，TFPI結合肽本身經修飾以包括一或多個具有可偵測取代基或核種之胺基酸。就此而言，在一具體實例中，TFPI結合肽包含至少1個包含可偵測同位素(例如13C、14C、35S、3H、18O或15N)之胺基酸及/或經例如¹²³ I、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、⁷⁵ Br、⁷⁶ Br、⁷⁷ Br或⁸² Br鹵化之胺基酸。適於鹵化之胺基酸包括(但不限於)酪胺酸及色胺酸。

本發明亦提供一種診斷罹患疾病或病症或處於罹患疾病或病症之風險中之個體的方法，其中該疾病或病症與異常TFPI活性相關或由異常TFPI活性引起。該方法包含向該個體投予TFPI結合肽且偵測TFPI-肽錯合物。在一些情況下，該肽與可偵測部分結合，且該方法包含偵測該可偵測部分。例示性可偵測部分在本文中有描述。在其他情況下，該方法包含向該個體投予結合TFPI結合肽之TFPI結合肽相互作用搭配物且偵測該相互作用搭配物。必要時，相互作用搭配物包含可偵測部分或與可偵測部分結合，且偵測該可偵測部分。可偵測部分之存在指示TFPI之存在，從而允許診斷與TFPI相關之疾病或病症(例如(i)可藉由抑制TFPI來治療或(ii)包含可藉由抑制TFPI來改善或預防之症狀的疾病或病症)。若不需要向該個體投予肽，則自該個體獲得生物樣本，使其與如本文所述之TFPI結合肽接觸，且偵測TFPI-肽錯合物。

本發明之肽結合TFPI且因此適用於自生物樣本(例如生物流體，諸如血清)、醱酵萃取物、組織製備物、培養基及其類似物純化出TFPI或重組TFPI。本發明包括在商業化生產TFPI中或在特性化TFPI分子之方法中使用TFPI結合肽之方法。舉例而言，本發明包括一種純化TFPI之方法。該方法包含使含有TFPI之樣本與如本文所定義之肽在適合於在TFPI與該肽之間形成錯合物之條件下接觸；自該樣本移出該錯合物；及視情況解離該錯合物以釋放TFPI。適合於在TFPI與肽之間形成錯合物之例示性條件揭示於實施例中，且此等條件可容易修改以解離TFPI-肽錯合物。在一些具體實例中，肽固定於支撐物(例如固體支撐物)上以有助於回收TFPI。舉例而言，在一具體實例中，肽固定於層析固定相(例如二氧化矽、親和力層析珠粒或層析樹脂)上，向固定相施加包含TFPI之樣本以便形成TFPI-肽錯合物，自固定相移出樣本剩餘部分，且自固定相洗提TFPI。就此而言，在一態樣中，本發明之肽適用於親和力層析技術中。

亦提供一種增強凝血因子不足之個體中之凝血酶形成的方法。該方法包含在有效於抑制TFPI之條件下向該個體投予本文提供之肽。就此而言，TFPI抑制肽係以一定量且在有效於增強該個體中之凝血酶形成之條件下投予。「凝血因子不足(clotting factor-deficient)」意謂該個體罹患為凝血酶形成所需之一或多種血液因子(諸如FVIII、FIX或FXI)不足的症狀。實際上，在一具體實例中，該個體之FVIII不足。或者或此外，該個體之因子IX不足。凝血因子不足係藉由檢查臨床樣本中之因子之量來鑑別。專業人員根據凝血因子不足之幅度對血友病分類。罹患輕度血友病之個體之因子VIII或因子IX為正常量(1 U/ml)之約5%至30%。中度血友病特徵在於因子VIII、因子IX或因子XI為正常含量之約1%至5%，而罹患重度血友病之個體之因子VIII、因子IX或因子XI小於正常量之1%。不足可藉由活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)測試來間接鑑別。APTT測試量測為形成血凝塊所需之持續時間，相較於凝血因子含量正常之患者，該持續時間對於患有因子VIII不足(A型血友病)、因子IX不足(B型血友病)及因子XI不足(C型血友病)之患者而言較長。幾乎100%之患有重度及中度因子VIII不足之患者可用APTT診斷。本發明另外包括增強未罹患凝血因子不足之個體中之凝血酶形成。該方法包含在有效於增強凝血酶形成之條件下向個體(例如包含正常生理含量之凝血因子之個體)投予本文提供之肽。

在一態樣中，TFPI抑制肽用於增加個體中之血凝塊形成。增加血凝塊形成之方法包含以一定量且在有效於增加血凝塊形成之條件下向該個體投予本文所述之肽。應瞭解該方法無需完全恢復凝血級聯以達成有益(例如治療)效應。涵蓋凝血酶或血凝塊形成之使與凝血因子不足相關之症狀之發作或嚴重性減低的任何增強或增加。測定該方法在促進凝血酶形成及凝血方面之功效的方法在此項技術中為已知的且在本文中有描述。

本發明另外包括一種治療個體之凝血病症之方法，該方法包含以一定量且在有效於治療該個體之該凝血病症之條件下向該個體投予一或多種TFPI抑制肽，諸如本文所述之肽中之任何一或多者。在一態樣中，該肽為可抑制TFPI活性之重組或合成肽。「凝血病症(Coagulation disorders)」包括由凝血因子活性不足及血小板活性不足引起之出血病症。凝血因子包括(但不限於)因子V(FV)、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXIII、FII(引起低凝血酶原血症(hypoprothrombinemia))及馮威里氏因子(von Willebrand's factor)。因子不足係由例如因子之活體內半衰期縮短、因子之結合性質改變、因子之遺傳缺陷及因子之血漿濃度降低引起。凝血病症可為先天性或後天性的。潛在遺傳缺陷包括編碼凝血因子之核苷酸序列內之缺失、添加及/或取代，其各自的不存在、存在及/或取代對該凝血因子之活性具有負面影響。凝血病症亦源於產生針對凝血因子之抑制劑或自體免疫性(例如抗體)。在一實例中，凝血病症為A型血友病。或者，凝血病症為B型血友病或C型血友病。

血小板病症係由血小板功能不足或循環中之血小板數異常低所引起。低血小板計數可能歸因於例如產生不足、血小板螯合或不受控制之血小板破壞。血小板減少(Thrombocytopenia)(血小板不足)可因各種原因而存在，該等原因包括化學療法及其他藥物療法、放射療法、手術、偶然的失血及其他疾病狀況。涉及血小板減少之例示性疾病狀況為：再生不能性貧血(aplastic anemia)；特發性或免疫血小板減少症(ITP)，包括與乳癌相關之特發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)；HIV相關之ITP及HIV相關之栓塞性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura)；導致血小板減少之轉移性腫瘤；全身性紅斑狼瘡症(systemic lupus erythematosus)，包括新生兒狼瘡症候群脾腫大；範可尼氏症候群(Fanconi's syndrome)；維生素B12不足；葉酸不足；梅-海格林異常(May-Hegglin anomaly)；偉-爾二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)；慢性肝病；與血小板減少相關之骨髓發育不良症候群；陣發性夜間血紅素尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)；在C7E3 Fab(阿昔單抗(Abciximab))療法之後之急性深度血小板減少症；同種免疫血小板減少症，包括母體同種免疫血小板減少症；與抗磷脂抗體及栓塞相關之血小板減少症；自體免疫血小板減少症(autoimmune thrombocytopenia)；藥物誘發之免疫血小板減少症，包括卡鉑(carboplatin)誘發之血小板減少症及肝素(heparin)誘發之血小板減少症；胎兒血小板減少症；妊娠性血小板減少症；休斯症候群(Hughes'syndrome)；類狼瘡血小板減少症(lupoid thrombocytopenia)；偶發性及/或大量失血；脊髓增生病症；患有惡性疾病之患者之血小板減少症；栓塞性血小板減少性紫癜，包括在癌症患者中表現為栓塞性血小板減少性紫癜/溶血性尿中毒症候群(hemolytic uremic syndrome)之栓塞性微血管病變；輸血後紫癜(PTP)；自體免疫溶血性貧血；潛隱性空腸憩室穿破(occult jejunal diverticulum perforation)；純紅血球發育不全；自體免疫血小板減少症；流行性腎病(nephropathia epidemica)；利福平(rifampicin)相關之急性腎衰竭；帕里斯-特囉索血小板減少症(Paris-Trousseau thrombocytopenia)；新生兒同種免疫血小板減少症；陣發性夜間血紅素尿；胃癌中之血液學變化；溶血性尿中毒症候群(例如兒童中之尿毒癥病狀)；及與病毒感染相關之血液學表現，包括肝炎A型病毒及CMV相關之血小板減少症。血小板病症亦包括(但不限於)馮威里病、副腫瘤血小板功能障礙、葛蘭曼氏血小板無力症(Glanzman’s thrombasthenia)及伯納德-索里爾病(Bernard-Soulier disease)。可用TFPI抑制肽治療之其他出血病症包括(但不限於)由損傷誘發之出血性病狀；一或多種接觸因子(諸如FXI、FXII、胰舒血管素原(prekallikrein)及高分子量激肽原(kininogen)(HMWK))不足；維生素K不足；血纖維蛋白原(fibrinogen)病症，包括無纖維素原血症(afibrinogenemia)、低纖維素原血症(hypofibrinogenemia)及纖維蛋白原不良血症(dysfibrinogenemia)；及α2-抗血纖維蛋白溶酶(antiplasmin)不足。在一具體實例中，TFPI抑制肽用於治療過度出血，諸如由手術、損傷、腦內出血、肝病、腎病、血小板減少、血小板功能障礙、血腫、內出血、關節積血(hemarthroses)、體溫過低、月經、妊娠及登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever)引起之過度出血。所有上疾病在本發明之情形下皆視為「凝血病症(blood coagulation disorders)」。

在一態樣中，本發明之TFPI抑制肽用於逆轉一或多種抗凝血劑在個體中之效應(完全或部分)。眾多抗凝血劑在此項技術中為已知的且包括例如肝素；香豆素(coumarin)衍生物，諸如華法林(warfarin)或敗壞翹搖素(dicumarol)；TFPI；AT III；狼瘡抗凝血劑；線蟲抗凝血劑肽(NAPc2)；FVIIa抑制劑；活性位點經阻斷之FVIIa(FVIIai)；活性位點經阻斷之FIXa(FIXai)；FIXa抑制劑；FXa抑制劑，包括磺達肝素(fondaparinux)、伊群帕努(idraparinux)、DX-9065a及拉紮沙班(razaxaban)(DPC906)；活性位點經阻斷之FXa(FXai)；FVa或FVIIIa之抑制劑，包括經活化之蛋白C(APC)及可溶性血栓調節蛋白(thrombomodulin)；凝血酶抑制劑，包括水蛭素(hirudin)、比伐蘆汀(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)及希美加群(ximelagatran)；及結合凝血因子(例如FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXIII、FII、FXI、FXII、馮威里因子、胰舒血管素原或高分子量激肽原(HMWK))之抗體或抗體片段。

如本文所用，「治療(treating/treatment)」係指與凝血病症相關之症狀之嚴重性及/或發作程度的任何減輕。因此，「治療」包括治療性及預防性措施。一般技術者應瞭解對凝血病症或與其相關之症狀任何程度之預防或改善皆有益於個體，諸如人類患者。患者之生活品質藉由在任何程度上降低個體之症狀之嚴重性及/或延遲症狀出現來改良。因此，在一態樣中，方法在已確定個體處於顯現凝血病症(例如偵測到凝血因子(例如FVIII、FIX或FXI)不足)之風險中之後儘快或在偵測到凝血病症(例如A型血友病、B型血友病或C型血友病)之後儘快執行。在另一態樣中，投予肽以完全或部分防止在損傷或手術期間過度失血。

鑒於以上，本發明提供一種用於治療個體之方法中之肽，該方法諸如有用於治療抑制TFPI為有益之疾病之方法。在一態樣中，該疾病或病症為凝血病症。該個體正罹患疾病或病症或處於罹患疾病或病症(或不利生物事件，諸如過度失血)之風險中。該方法包含以一定量且在可完全或部分有效治療或預防疾病或病症之條件下向該個體投予本發明之肽。本發明另外提供一種用於製造醫藥品之肽。舉例而言，該肽可用於製造用以治療如本文詳述之凝血病症之醫藥品。

在一些具體實例中，宜向個體投予包含編碼本發明之TFPI結合肽(例如TFPI抑制肽)之核酸序列的核酸。在一態樣中，替代TFPI抑制肽或除TFPI抑制肽之外，提供該種核酸。表現載體、核酸調控序列、投藥方法及其類似內容在本文中及美國專利公開案第20030045498號中有進一步描述。

用於特定個體之特定投藥攝生法應部分視所用的本發明之TFPI抑制肽、所投予之TFPI結合肽(例如TFPI抑制肽)之量、投藥途徑、所治療之特定病痛、與接受者相關之考慮因素以及任何副作用之起因及程度而定。向個體(例如哺乳動物，諸如人類)投予之肽之量及投藥條件(例如投藥時序、投藥途徑、給藥攝生法)足以在合理時間範圍內影響所要生物反應。劑量典型地視多種因素而定，該等因素包括所用之特定TFPI抑制肽、個體之年齡及體重以及個體之任何疾病或病症之存在及嚴重性。劑量大小亦將由投藥之途徑、時序及頻率決定。因此，臨床醫師可確定劑量之效價且修改投藥途徑以獲得最佳治療效應，且習知範圍確定技術為一般技術者所知。僅舉例而言，在一態樣中，方法包含投予例如約0.1 μg/kg至約100 mg/kg或100 mg/kg以上，此視以上提及之因素而定。在其他具體實例中，劑量可在1 μg/kg直至約75 mg/kg；或5 μg/kg直至約50 mg/kg；或10 μg/kg直至約20 mg/kg之範圍內。在某些具體實例中，劑量包含約0.5 mg/kg至約20 mg/kg(例如約1 mg/kg、1.5 mg/kg、2 mg/kg、2.3 mg/kg、2.5 mg/kg、3 mg/kg、3.5 mg/kg、4 mg/kg、4.5 mg/kg、5 mg/kg、5.5 mg/kg、6 mg/kg、6.5 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、或10 mg/kg)之肽。鑒於許多凝血病症具有慢性特質，則可設想個體接受TFPI抑制肽治療之過程將持續數週、數月或數年，且可能需要每日或每週一或多次劑量。在其他具體實例中，投予TFPI抑制肽以在相對較短之治療時期(例如1至14天)內來治療急性病狀(例如由手術或損傷引起之出血、或接受凝血替代療法之個體中之因子抑制劑/自體免疫發作)。

投予包含本文所述之肽的生理學上可接受之組成物(諸如醫藥組成物)之適合方法在此項技術中為熟知的。儘管1種以上途徑可用於投予肽，但特定途徑可提供比另一途徑更即刻且更有效之反應。視情況而定，醫藥組成物被施加或滴注入體腔中、經由皮膚或黏膜吸收、經攝入、經吸入及/或經引入循環中。在一態樣中，靜脈內、動脈內或腹膜內投予包含TFPI抑制肽之組成物以將本發明之肽引入循環中。非靜脈內投藥亦為適當的，尤其是關於低分子量治療劑。在某些情況下，需要經口、局部、舌下、經陰道、經直腸、經肺；經由腦內(實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、門脈內、病灶內、髓內、鞘內、心室內、經皮、皮下、鼻內、尿道注射或經腸方式；藉由持續釋放系統；或藉由植入裝置來傳遞包含TFPI抑制肽之醫藥組成物。必要時，TFPI抑制肽經由饋藥於相關區域之動脈內或靜脈內投藥，例如經由股動脈以傳遞至腿來區域性投予。在一具體實例中，將該肽併入如例如以下所述之微粒中：美國專利5,439,686及5,498,421以及美國專利公開案2003/0059474、2003/0064033、2004/0043077、2005/0048127、2005/0170005、2005/0142205、2005/142201、2005/0233945、2005/0147689.2005/0142206、2006/0024379、2006/0260777、2007/0207210、2007/0092452、2007/0281031及2008/0026068。或者，經由植入已吸附有或囊封有所要分子之膜、海綿或另一適當材料來投予組成物。當使用植入裝置時，在一態樣中，將該裝置植入任何適合組織中，且在各種態樣中，所要分子之傳遞係經由擴散、定時釋放團注或連續投藥來達成。在其他態樣中，在手術程序或治療損傷期間直接向暴露組織投予TFPI抑制肽，或經由輸血程序投予TFPI抑制肽。治療性傳遞方法為熟習此項技術者所熟知，其中一些方法進一步描述於例如美國專利第5,399,363號中。

為了有助於投藥，在一具體實例中，TFPI結合肽(例如TFPI抑制肽)調配成包含載劑(亦即媒劑、佐劑、緩衝劑或稀釋劑)之生理學上可接受之組成物。所用特定載劑僅受化學物理考慮因素(諸如溶解性及缺乏與肽之反應性)及投藥途徑限制。生理學上可接受之載劑在此項技術中為熟知的。適於可注射使用之說明性醫藥形式包括(但不限於)無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑(例如參見美國專利第5,466,468號)。可注射調配物進一步描述於例如以下中：Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J. B. Lippincott公司,Philadelphia. Pa.,Banker及Chalmers.編，第238-250頁(1982)、及ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,第4版，第622-630頁(1986)。包含本文提供之肽之醫藥組成物視情況連同提供關於此等醫藥組成物之使用之說明書的包裝材料一起置放在容器內。一般而言，此等說明書包括描述試劑濃度之明確表述，以及在某些具體實例中，包括可能為復原醫藥組成物所必需之賦形劑成分或稀釋劑之相對量。

適當時，本發明之TFPI結合肽(例如TFPI抑制肽)與其他物質及/或其他治療性醫療器械(modality)組合投予以達成另一或增強之生物效應。共治療劑包括(但不限於)血漿源性或重組凝血因子、血友病預防治療劑、免疫抑制劑、血漿因子抑制抗體拮抗劑(亦即抗抑制劑)、抗纖維蛋白分解藥、抗生素、激素療法、消炎劑(例如非類固醇消炎藥(NSAID)或類固醇消炎物質)、促凝劑(procoagulant)及疼痛舒解劑。在一態樣中，方法為傳統替代因子治療攝生法之輔助療法，其涉及向個體投予例如FXIII、FXII、FXI(例如HEMOLEVEN(Laboratoire francais du Fractionnement et des Biotechnologies,Les Ulis,France)及FXI濃縮物(BioProducts Laboratory,Elstree,Hertfordshire,UK))、FX、FIX(例如凝血因子IX(Wyeth,Madison,NJ)；ALPHANINESD(Grifols,Los Angeles,CA)；MONONINE(CSL Behring,King of Prussia,PA)；BEBULIN-VH^TM (Baxter,Deerfield,IL)；PROFILNINESD(Grifols,Los Angeles,CA)；或PROPLEX T^TM (Baxter,Deerfield,IL))、FVIII(例如ADVATE^TM (Baxter,Deerfield,IL)；HELIXATEFS(CSL Behring,King of Prussia,PA)；REFACTO(Wyeth,Madison,NJ)、XYNTHA^TM (Wyeth,Madison,NJ)、KOGENATE及KOGENATEFS(Bayer,Pittsburgh,PA)；ALPHANATE(Grifols,Los Angeles,CA)；HEMOPHIL M^TM (Baxter,Deerfield,IL)；KOATE-DVI(Talecris Biotherapeutics-USA,Research Triangle Park,NC)；或MONARC-M^TM (Baxter,Deerfield,IL))、FVIIa(例如NOVOSEVENFVIIa(Novo Nordisk,Princeton,NJ)及FVII濃縮物(Baxter Bioscience、Vienna、Austria、或BioProducts Laboratory,Elstree,Hertfordshire,UK))、FV、FVa、FII、及/或FIII。在一些情況下，個體亦接受FEIBA VH Immuno^TM (Baxter BioScience,Vienna,Austria)，其為一種具有因子VIII抑制劑旁路活性之冷凍乾燥無菌人類血漿部分。FEIBA VH Immuno含有近似相等單位之因子VIII抑制劑旁路活性及凝血酶原錯合物因子(因子II、VII、IX、及X及蛋白C)。其他例示性共治療劑包括(但不限於)胰舒血管素原、高分子量激肽原(HMWK)、馮威里氏因子、組織因子、及凝血酶。或者或此外，TFPI抑制肽與一或多種不同TFPI抑制肽一起共調配。在一態樣中，投予TFPI結合肽可使為達成所要生物反應所需之共治療劑之劑量降低。

因此，本發明包括向個體投予本發明之TFPI結合肽(例如TFPI抑制肽)(多種TFPI抑制肽)與一或多種另外適合之物質的組合，各者皆根據適於彼醫藥品之攝生法投予。投藥策略包括並行投予(亦即實質上同時投予)及非並行投予(亦即在不同時間以任何順序投予，無論重疊或不重疊)TFPI抑制肽及一或多種另外適合之藥劑。應瞭解不同組分視情況以同一組成物或以各別組成物形式且藉由相同或不同投藥途徑來投予。

在一些具體實例中，本發明之肽與某一部分，例如治療或診斷部分，諸如上述偵測部分及共治療劑結合。或者或此外，肽與(a)結合該肽且(b)具有治療活性及/或與向相互作用搭配物提供額外功能性之部分(例如治療劑、診斷劑或偵測劑)連接的相互作用搭配物(例如抗體、抗體片段、抗運載蛋白、適體或鏡像體)組合投予。適合部分包括(但不限於)光敏劑、染料、放射性核種、含有放射性核種之錯合物、酶、毒素、抗體、抗體片段及細胞毒性劑，且在一些情況下，部分具有治療活性(亦即會達成有利或所要生物效應)。肽結合物或肽-相互作用搭配物對適用於本文所述之任何方法中，該等方法諸如有治療罹患疾病或病症或處於罹患疾病或病症之風險中之個體的方法。

本發明另外提供一種鑑別TFPI結合化合物(諸如TFPI結合肽)之方法。在一態樣中，該方法包含(a)使包含TFPI庫尼茲域1(KD1)之肽與本文所述之TFPI結合肽及測試化合物在允許形成KD1-TFPI結合肽錯合物之條件下接觸。該方法另外包含(b)量測步驟(a)中所形成之KD1-TFPI結合肽錯合物，及(c)比較在該測試化合物存在下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物之數量與在不存在該測試化合物下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物之數量。相較於在不存在該測試化合物下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物之數量，在該測試化合物存在下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物之數量降低指示該測試化合物為TFPI結合化合物。在一態樣中，該方法另外包含在不存在該測試化合物下形成KD1-TFPI結合錯合物以達成步驟(c)中之比較，但此並非必需，因為資訊可單獨獲得(例如自先前製備之參照標準物獲得)。

KD1、TFPI結合肽及測試化合物同時或依序組合，視情況在添加TFPI結合肽及/或測試化合物之前及/或之後進行洗滌步驟。在一具體實例中，使包含KD1之肽與本文所述之TFPI結合肽在允許形成KD1-TFPI結合肽錯合物之條件下接觸，移出未結合之TFPI結合肽，且使剩餘KD-肽錯合物與測試化合物接觸。TFPI結合肽自TFPI-肽錯合物之置換經偵測到，且指示測試化合物為TFPI結合化合物。置換係藉由例如量測暴露於測試化合物之前及之後KD1-TFPI結合肽錯合物之數量來偵測。

KD1-TFPI結合肽錯合物係使用任何適合偵測手段，包括此項技術中已知之用於偵測樣本中之肽的偵測手段加以偵測及/或量測(定量)。舉例而言，在本發明之一具體實例中，TFPI結合肽包含會產生信號之標記。例示性標記在本文中加以描述且包括例如放射性核種、螢光染料、同位素、酶受質及酶。方法包含量測由KD1-TFPI結合肽錯合物產生之信號及比較由在測試化合物存在下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物產生之信號與由在不存在測試化合物下形成之KD1-TFPI結合肽錯合物產生之信號。來自包含暴露於測試化合物之KD1-TFPI結合肽錯合物之樣本的信號之降低(相較於由未暴露於測試化合物之KD1-TFPI結合肽錯合物之類似樣本產生的信號)指示錯合物形成已經抑制或破壞，且測試化合物為TFPI結合化合物。

本發明亦提供一種鑑別干擾TFPI-FXa相互作用之TFPI結合化合物之方法。該方法至少部分基於TFPI KD1與FXa之外部位點結合且有助於TFPI抑制FXa活性之驚人發現。在一態樣中，該方法包含在測試化合物存在下使基本上由KD1組成之肽(亦即在不存在KD2下包含KD1之肽)與FXa在允許KD1與FXa結合之條件下接觸。該方法另外包含比較在該測試化合物存在下之KD1-FXa結合與在不存在該測試化合物下之KD1-FXa結合。相較於在不存在該測試化合物下之KD1-FXa結合，在該測試化合物存在下之KD1-FXa結合減少指示該測試化合物為TFPI結合化合物。KD1-FXa結合可使用任何方法，諸如本文所述之方法加以偵測及/或定量。舉例而言，對KD1或FXa進行標記，且比較由暴露於測試化合物之KD1-FXa錯合物產生之信號與由未暴露於測試化合物之KD1-FXa錯合物產生之信號。

鑑別TFPI結合化合物之本發明方法特定言之可經受此項技術中已知之各種高產量篩檢技術檢驗。任何「測試化合物(test compound)」(例如小分子、肽、蛋白質(諸如抗體或其片段)、肽模擬物、或聚核苷酸(DNA或RNA))皆適於使用本文所述之方法進行篩檢。必要時，使用本文所述之方法針對TFPI結合(及視情況抗TFPI活性)來篩檢測試化合物之集合、群體或文庫。存在用於鑑別TFPI抑制劑之許多不同文庫，包括(但不限於)化學文庫、天然產物文庫、及包含肽及/或有機分子之組合文庫。在一些態樣中，化學文庫由已知化合物或經由其他篩檢方法鑑別為「匹配物(hit)」或「先導物(lead)」之化合物的結構類似物組成。天然產物文庫為自微生物、動物、植物或海洋有機體分離或由微生物、動物、植物或海洋有機體產生之物質的集合。組合文庫由大量肽或有機化合物(典型地呈混合物形式)構成。本文所述之方法亦適用於篩檢呈現或核酸文庫，諸如酵母呈現文庫、細菌呈現文庫、噬菌體呈現文庫、核糖體呈現文庫、mRNA呈現文庫、RNA文庫或DNA文庫。一種篩檢呈現文庫之方法例示於實施例1中。本發明所涵蓋之高產量篩檢方法包括允許篩檢數萬至數十萬種測試化合物之自動程序。

在另一態樣中，用於鑑別TFPI結合化合物之本發明方法包含使包含KD1(或由KD1組成)之肽與測試化合物接觸，及偵測該測試化合物與由對應於人類TFPI殘基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55之KD1胺基酸殘基界定之TFPI結合位點(諸如由人類TFPI殘基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55界定之結合位點)的結合。在一具體實例中，結合位點係由對應於人類TFPI殘基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55之胺基酸殘基界定。結合位點對應於JBT1857之TFPI結合位點，JBT1857為一種在許多功能性檢定中抑制TFPI活性之TFPI結合肽。

本文所述之TFPI結合位點胺基酸殘基係依據人類TFPI胺基酸序列，且編號係指所述胺基酸相對於人類TFPI之N端之位置。僅出於說明TFPI結合位點之位置之目的，包含KD1之人類TFPI之片段的胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 4234(DSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIGGCEGNQNRFESLEECKKMC TRDNA(編碼KD1之胺基酸26-75用粗體指示))。例如藉由比對多肽之胺基酸序列與SEQ ID NO: 4234來鑑別其他TFPI多肽(諸如來自不同有機體之TFPI多肽、或TFPI多肽片段)之相應胺基酸。儘管在一具體實例中，包含TFPI KD1之肽不包含TFPI蛋白之負責TFPI活性之其他區域，但其他具體實例需要使用包含人類TFPI之胺基酸1-160(包含KD1及KD2)或包含全長人類TFPI(含有KD1-KD3)之肽。

測試化合物與本文定義之TFPI結合位點之結合係使用任何許多方法，包括本文所述之偵測方法來偵測。一種用於偵測結合之例示性方法採用核磁共振(NMR)來識別TFPI結合位點內之胺基酸殘基處的化學位移。在TFPI胺基酸位置28-30、32、46、47及55、及視情況位置27、31、36-38及44處之化學位移表示測試化合物與TFPI上之此等胺基酸接觸點有相互作用。為了確定特定胺基酸處存在或不存在由測試化合物結合引起之化學位移，比較自KD1-測試化合物錯合物獲得之NMR資料與自自由KD1肽獲得之NMR資料。使用NMR來偵測測試化合物與TFPI KD1之間的結合進一步描述於實施例中。

或者，測試化合物與本文定義之TFPI結合位點之結合係藉由偵測TFPI KD1與其天然結合搭配物(例如FVIIa或FXa)之相互作用之能力的改變來間接測定。就此而言，方法包含在測試化合物存在下使包含TFPI KD1之肽與FVIIa在允許KD1與FVIIa結合之條件下接觸，且比較KD1-FVIIa結合與在不存在測試化合物下之KD1-FVIIa結合。或者或此外，方法包含在測試化合物存在下使包含TFPI KD1之肽與FXa在允許KD1與FXa結合之條件下接觸，且比較在測試化合物存在下之KD1-FXa結合與在不存在測試化合物下之KD1-FXa結合。視情況而定，包含KD1之肽亦包含KD2，且方法包含在測試化合物存在下使肽與FXa在允許KD2與FXa結合之條件下接觸，且比較KD2-FXa結合與在不存在測試化合物下之KD2-FXa結合。在測試化合物存在下之KD1-FVIIa結合、KD1-FXa結合、或KD2-FXa結合之減小(相較於在不存在測試化合物下之KD1-FVIIa結合、KD1-FXa結合、或KD2-FXa結合)指示測試化合物為TFPI結合化合物。方法視情況包含在不存在測試化合物下使KD1及/或KD2與FVIIa及/或FXa接觸來作為用於比較在測試化合物存在下之結合的參照。

KD與FVIIa或FXa之結合係使用任何適用於偵測蛋白質-蛋白質相互作用之方法，諸如本文所述之使用可偵測標記之方法加以測定及/或定量。或者，使用酶促檢定來偵測測試化合物與TFPI結合位點之結合。FVIIa或FXa酶促活性為適用於評估蛋白質與TFPI KD1或KD2結合之代用物(surrogate)；結合本文定義之TFPI結合位點之測試化合物抑制TFPI活性，從而導致FVIIa及FXa活性增加。用於評估FVIIa或FXa活性之酶促檢定詳述於本文中。

本發明另外包括在本發明方法中鑑別為TFPI結合化合物之化合物、以及包含一或多種鑑別之化合物之組成物。用於分離或純化化合物，諸如如本文所述鑑別之TFPI結合化合物(例如TFPI結合肽)之方法在此項技術中為已知的且在上文中加以描述。在一些態樣中，如本文所述鑑別之TFPI結合化合物為會下調或除去一或多種TFPI活性之TFPI抑制劑。在一具體實例中，本發明包括一種用於純化抑制FXa活性之化合物之方法。該方法包含使包含TFPI KD1之肽與化合物在允許形成化合物-KD1錯合物之條件下接觸，移出未結合之化合物，及解離化合物-KD1錯合物以釋放結合TFPI之化合物。提供如本文所述鑑別及/或純化之TFPI抑制劑用於製造醫藥品，諸如用於治療凝血病症之醫藥品的用途；以及一種用於治療罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法，其包含向該個體投予該TFPI抑制劑。

此外，提供一種抑制人類TFPI之方法，其中該方法包含使人類TFPI與在由胺基酸殘基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定之結合位點處結合人類TFPI之抑制劑接觸。本發明之另一態樣包括一種治療罹患疾病或處於罹患疾病之風險中之個體的方法。該方法包含向該個體投予在由胺基酸殘基Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55界定之結合位點處結合人類TFPI之抑制劑。在一態樣中，人類TFPI結合位點係由胺基酸殘基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ile38、Ile46、Phe47及Ile55界定，諸如由胺基酸殘基Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55界定之結合位點。接觸本文定義之TFPI結合位點且抑制(下調或除去)一或多種TFPI活性之任何抑制劑皆適用於該方法之情形中。TFPI抑制劑視情況為TFPI結合肽，諸如具有本文所述之特性之TFPI結合肽。

本發明另外包括電腦儲存媒體及用於模型化本文定義之TFPI結合位點中之候選TFPI-化合物的方法。蛋白質之三維(3D)模型化可連同各種測試TFPI結合化合物(例如肽或小分子)之3D模型一起使用來確定化合物與TFPI中之靶向胺基酸之間的擬合。因為若化合物不保持與TFPI連接持續一段足以實現生物反應之時期，則測試化合物抑制TFPI之效用可受限制，所以可預測兩者保持偶合之趨勢以產生親和力等級。

藉由鑒於親和力等級分析TFPI蛋白之3D表面及相應化合物與表面之擬合，可產生對化合物(例如肽)之修飾以改良表面與化合物之間的接觸點的數目與接觸點處之鍵之強度兩者。基於化合物之候選者及基於肽之TFPI抑制劑的效用可使用此技術類似地加以模型化，此有助於合理設計TFPI結合化合物。KD1之三維(3D)表面之電腦模型允許測試各種肽或化合物與界定TFPI結合位點且抑制KD1之鑑別之胺基酸子集連接的能力。KD1蛋白之表面係在電腦上於3D空間中加以模型化，特定言之由KD1中之靶向胺基酸界定之表面。各種肽之3D模型例如可與表面匹配以確定有多少個目標TFPI胺基酸由肽接觸且亦以產生預測肽將保持與目標表面連接多久之親和力等級。

藉由更換肽模型及重複電腦模型化，可快速產生某一肽家族之親和力等級。必要時，最有希望之肽變異體(例如在親本肽之胺基酸序列內包含一或多個取代之第二肽)可揀選出以供進一步物理測試。

本發明提供一種具有電腦可執行指令之電腦儲存媒體，當在電腦之處理器上執行時，該等指令實施一種模型化TFPI KD1蛋白中之所選三維(3D)點與測試化合物之間的相互作用的方法。該方法包含獲得該TFPI KD1蛋白之蛋白質結構3D模型；確定該蛋白質結構中之所選子集之胺基酸之間的3D關係，其中該所選胺基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；模型化由該所選胺基酸子集界定之表面；獲得測試化合物之測試化合物3D模型；匹配該測試化合物3D模型與由該所選胺基酸子集界定之表面；及鑑別該表面之所選胺基酸子集與該測試化合物3D模型之間的接觸點。視情況而定，該方法另外包含確定該表面與該測試化合物3D模型之間的接觸點的數目；及記錄該測試化合物3D模型之對應於該接觸點數目的親和力等級。在一態樣中，該所選胺基酸子集包含Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55(或由該等胺基酸組成)。該方法另外視情況包含獲得基於第二測試化合物的更新之測試化合物3D模型；匹配該更新之測試化合物3D模型與由該所選胺基酸子集界定之表面；及在該電腦之顯示器上鑑別該表面之所選胺基酸子集與該更新之測試化合物3D模型之間的該等經鑑別之接觸點。在一具體實例中，該方法另外包含確定該表面與該更新之測試化合物3D模型之間的該等接觸點的數目；確定該表面與該更新之測試化合物3D模型之間的各接觸點的結合型式；及基於該接觸點數目及該表面與該更新之測試化合物3D模型之間的各接觸點之結合型式之集合記錄新親和力等級。必要時，接著比較該更新之親和力等級與該新親和力等級以確定該測試化合物或該第二測試化合物是否具有較高親和力等級。接觸點可在電腦上顯示，藉此有助於最佳化或設計TFPI結合化合物。

在另一具體實例中，電腦儲存媒體具有當在電腦之處理器上執行時實施一種比較肽與TFPI庫尼茲域1蛋白(KD1)中之所選三維點(3D)之方法的電腦可執行指令，該方法包含產生該KD1蛋白之蛋白質結構；確定該KD1蛋白中之所選胺基酸子集之三維模型，其中該胺基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；確定肽之三維模型；將該肽之3D模型與該所選胺基酸子集之3D模型擬合；及產生該肽對該所選胺基酸子集之親和力，其中該親和力係基於該子集中與該肽接觸之胺基酸之數目及各接觸點處之結合強度。

此外，提供一種比較測試化合物與TFPI KD1蛋白中之所選三維點之方法。該方法包含在電腦之記憶體中產生該KD1蛋白之蛋白質結構；在該電腦之處理器處確定該KD1蛋白中之所選胺基酸子集的三維模型，其中該所選胺基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；在該電腦之處理器處確定測試化合物之三維模型；在該電腦之處理器處將該測試化合物之3D模型與該所選胺基酸子集之3D模型擬合；及在該電腦之處理器處產生該測試化合物對該所選胺基酸子集之親和力，其中該親和力係基於該子集中與該測試化合物接觸之胺基酸之數目及各接觸點處之結合強度。在一些具體實例中，該方法另外包含顯示該測試化合物與該所選胺基酸子集之3D模型之間的擬合的3D圖像，且視情況對複數種測試化合物重複本文所述之步驟及儲存該複數種測試化合物各自之各別親和力。

參考圖58，一種用於實施所主張之方法及設備之例示性系統包括呈電腦110之形式之通用計算裝置。用虛線輪廓顯示之組件在技術上不為電腦110之一部分，而是用於說明圖58之例示性具體實例。電腦110之組件可包括(但不限於)處理器120、系統記憶體130、記憶體/圖形介面121及I/O介面122。系統記憶體130及圖形處理器190可耦接至記憶體/圖形介面121。監視器191或其他圖形輸出裝置可耦接至圖形處理器190。

一系列系統匯流排可耦接各種系統組件，該等組件包括在處理器120、記憶體/圖形介面121及I/O介面122之間的高速系統匯流排123、在記憶體/圖形介面121與系統記憶體130之間的前側匯流排124以及在記憶體/圖形介面121與圖形處理器190之間的高級圖形處理(AGP)匯流排125。系統匯流排123可為若干類型之匯流排結構中之任一者，舉例而言(但不限於)，此等架構包括工業標準架構(ISA)匯流排、微通道架構(MCA)匯流排及增強型ISA(EISA)匯流排。隨著系統架構發展，其他匯流排架構及晶片組可加以使用但一般常遵循此樣式。舉例而言，諸如Intel及AMD之公司分別支持英特爾集線器架構(Intel Hub Architecture，IHA)及Hypertransport^TM 架構。

電腦110典型地包括多種電腦可讀媒體。電腦可讀媒體可為可由電腦110存取之任何可用媒體且包括揮發性媒體與非揮發性媒體、抽取式媒體與非抽取式媒體。舉例而言(但不限於)，電腦可讀媒體可包含電腦儲存媒體。電腦儲存媒體包括在用於儲存資訊(諸如電腦可執行指令、資料結構、程式模組或其他資料)之任何方法或技術中實施之揮發性媒體與非揮發性媒體、抽取式媒體與非抽取式媒體。電腦儲存媒體包括RAM、ROM、EEPROM、快閃記憶體或其他記憶體技術、CD-ROM、數位多功能光碟(DVD)或其他光碟儲存器、磁卡(magnetic cassette)、磁帶、磁碟儲存器或其他磁儲存裝置或實體體現電子資料之其他實體儲存元件且排除任何傳播媒體，諸如無線電波或調變載波信號。

系統記憶體130包括呈揮發性及/或非揮發性記憶體(諸如唯讀記憶體(ROM)131及隨機存取記憶體(RAM)132)形式之電腦儲存媒體。系統ROM 131可含有永久性系統資料143，諸如電腦特定構型資料。RAM 132典型地含有可由處理器120即刻存取及/或馬上操作之資料及/或程式模組。舉例而言(但不限於)，圖58說明操作系統134、應用程式135、其他程式模組136及程式資料137。

I/O介面122可耦接系統匯流排123與將多種內部及外部裝置耦接至電腦110之許多其他匯流排126、127及128。串列周邊介面(SPI)匯流排126可與含有基本常式之基本輸入/輸出系統(BIOS)記憶體133連接，該等常式有助於諸如在起動期間在電腦110內之元件之間轉移資訊。

超級輸入/輸出晶片160可用於與許多『舊式(legacy)』周邊裝置(諸如軟磁碟152、鍵盤/鼠標162及列印機196)連接。在一些具體實例中，超級I/O晶片160可用匯流排127(諸如低接腳計數(LPC)匯流排)與I/O介面122連接。超級I/O晶片160之各種具體實例可在商業市場上廣泛獲得。在一具體實例中，匯流排128可為周邊組件互連(PCI)匯流排。

電腦110亦可包括其他抽取式/非抽取式、揮發性/非揮發性電腦儲存媒體。僅舉例而言，圖58說明自非抽取式、非揮發性磁性媒體讀取或向非抽取式、非揮發性磁性媒體寫入之硬磁碟驅動機140。硬磁碟驅動機140可為習知硬磁碟驅動機。

諸如通用串列匯流排(USB)記憶體153、火線(firewire)(IEEE 1394)或CD/DVD驅動機156之抽取式媒體可直接或經由介面150與PCI匯流排128連接。可用於例示性操作環境中之其他抽取式/非抽取式、揮發性/非揮發性電腦儲存媒體包括(但不限於)卡式磁帶、快閃記憶卡、數位多功能光碟、數位錄影帶、固態RAM、固態ROM及其類似物。

以上論述且於圖58中所示之驅動機及其相關電腦儲存媒體提供電腦可讀指令、資料結構、程式模組及電腦110之其他資料之儲存。在圖58中，舉例而言，硬磁碟驅動機140經圖示為儲存操作系統144、應用程式145、其他程式模組146及程式資料147。應注意此等組分可與操作系統134、應用程式135、其他程式模組136及程式資料137相同或不同。操作系統144、應用程式145、其他程式模組146及程式資料147在此處被給予不同編號以說明至少其為不同複本。使用者可經由輸入裝置，諸如鼠標/鍵盤162或其他輸入裝置組合向電腦20中輸入命令及資訊。其他輸入裝置(圖中未示)可包括微音器、操縱桿、遊戲板、圓盤式衛星電視天線、掃描器或其類似物。此等及其他輸入裝置常經由I/O介面匯流排(諸如SPI 126、LPC 127或PCI 128)之一與處理器120連接，但可使用其他匯流排。在一些具體實例中，其他裝置可經由超級I/O晶片160耦接至平行埠、紅外介面、遊戲埠及其類似物(未示出)。

電腦110可在經由網路介面控制器(NIC)170使用邏輯通信埠通向一或多個遠程電腦(諸如遠程電腦180)的網路環境中操作。遠程電腦180可為個人電腦、伺服器、路由器、網路PC、對等裝置或其他公用網路節點，且典型地包括以上關於電腦110所述之許多或所有元件。圖58中所示之NIC 170與遠程電腦180之間的邏輯連接可包括區域網路(LAN)、廣域網路(WAN)或兩者，但亦可包括其他網路。此等網絡連結環境在辦公室、全企業電腦網路、內部網路及網際網路中為平常的。

圖59說明TFPI蛋白200之3D模型，其顯示構成TFPI蛋白之代表性胺基酸202、204、206。相關TFPI蛋白之特定區域為未明確示出之KD1。所示表面係藉由置放構成蛋白質之胺基酸所形成。當研究或產生TFPI抑制劑時，由KD1區域中之特定胺基酸形成之表面為人所關注。如本文中更詳細論述，KD1之生物效應藉由結合KD1區域內之某些胺基酸而受到抑制。詳言之，此等目標胺基酸包括Ala27、Phe28、Lys29、Ala30、Asp31、Asp32、Lys36、Ala37、Ile38、Phe44、Ile46、Phe47及Ile55。

圖60說明與以上所列目標胺基酸之至少一部分結合之肽300。

圖61為一種模型化KD1與肽之相互作用之方法的圖解。

可獲得蛋白質之3D模型(方框302)且儲存在電腦110之記憶體140上。該模型可使用已知工具局部產生或可自公共來源獲得。在一具體實例中，蛋白質為TFPI KD1 200。

可確定蛋白質結構中所選子集之胺基酸之間的3D關係(方框304)。在一具體實例中，所選胺基酸子集包含Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47及Ile55；且視情況另外包含Ala27、Asp31、Lys36及Ile38；且視情況另外包含Ala37及Phe44，但並非此處所列之每一胺基酸皆為結合以具有抑制(例如治療)效應所需。亦即此組之其他子集亦可具有相關性質。

對於相關胺基酸之特定子集，由所選胺基酸子集界定之表面可經模型化。外部周邊可由在各側上不具有其他相關胺基酸之彼等胺基酸界定。表面之紋理可由子集中之各胺基酸之3D位置界定(方框306)。

可產生相關候選TFPI結合化合物(例如肽)之3D模型且儲存在電腦110之記憶體140處(方框308)。

肽3D模型與由所選胺基酸子集界定之表面匹配或相擬合(方框310)。兩者之間的最佳擬合可在相關點處，亦即在KD1之所選胺基酸上產生。若干電腦工具可用於此3D模型化及擬合且可用於產生3D模型並使一者與另一者匹配。一個實例為描述於以下之HADDOCK工具：「de Vries,S. J.,van Dijk,A. D. J.,Krzeminski,M.,van Dijk,M.,Thureau,A.,Hsu,V.,Wassenaar,T.及Bonvin,A. M. J. J.(2007),HADDOCK versus HADDOCK: New features and performance of HADDOCK2.0 on the CAPRI targets. Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,69: 726-733. doi:10.1002/prot.21723」。

表面之所選胺基酸子集之表面的模型與測試化合物(例如肽)3D模型之間的接觸點可被鑑別，儲存，且視情況在電腦110之監視器191上顯示(方框312)。化合物(例如肽)可被修飾以增加接觸點之數目或接觸點處之鍵之強度。為了有助於模型化此效應，可開發以下進一步描述之度量標準來衡量化合物與相關蛋白質(在吾人之實例中為KD1)結合的親和力。

此外，表面與化合物3D模型之間的接觸點可被計數(方框314)且化合物3D模型之親和力等級可對應於接觸點之數目加以記錄(方框316)。舉例而言，若所有14個以上所列胺基酸被靶向且14者中之12者由化合物3D模型實際上接觸或結合，則12/14或0.86之親和力等級可被計算且記錄。

然而，作為候選化合物偶合得多緊密及因此其可保持與KD1偶合多久之量度的親和力等級可不僅用相關鍵之數目而且可用鍵之類型來更準確地加以描述。亦可確定各接觸點之結合型式(方框318)。關於TFPI結合肽，分子間距離4埃(angstrom)之疏水鍵可與分子間距離為2.6-3.2埃之鍵相區別。在一具體實例中，小於3.2埃之鍵可經指定權重為1.5，且大於3.2埃之鍵可經指定權重為1.25。親和力等級可使用此種加權法或另一加權法鑒於結合型式來更新或再計算(方框320)。舉例而言，在先前實例中，若5個鍵為短鍵且7個鍵為長鍵，則新親和力等級可為(5×1.5+7×1.25)/14=1.16。

若僅靶向KD1之7個胺基酸且4個以短鍵連接，則親和力等級可為(4×1.5)/7=0.86。然而，在此情況下，當與其他親和力等級進行比較時，將考慮較少所靶向的胺基酸。舉例而言，所有等級皆可基於所要目標位點總數相對於標準進行校正。

若不欲再進行迭代，則不可採用方框322之分支且結果可被儲存以供將來分析及決策(方框324)。若欲分析其他肽或先前測試之肽之變異體，則可採用方框322之是(yes)分支且相關肽之新或更新模型可被生成或以別的方式獲得並儲存(方框326)。可重複方框310至320處之步驟且當前操作之結果可與先前操作之結果比較以確定哪些肽/變異體具有較高親和力等級且值得進行更多研究，包括可能之物理測試。

用3D模型化靶向特定位點及產生比較等級之能力允許相對容易地處理若非數千亦有數百個的樣本並作出比較，從而避免x射線結晶術之時間及成本。此技術可尤其適用於與TFPI KD1之Phe28、Lys29、Ala30、Asp32、Ile46、Phe47、I1e55、Ala27、Asp31、Lys36、Ile38、Phe2、Ala37及Phe44胺基酸相關之模型化。

本說明書中引用之所有公開案、專利及專利申請案皆以引用的方式併入本文中，該引用之程度就如同已特定地及個別地指示將各個別公開案或專利申請案以引用的方式併入一般。此外，整個文件意欲以統一揭示內容形式來陳述，且應瞭解，涵蓋本文所述之特徵之所有組合，即使特徵之組合並不一起見於本文件之同一語句或段落或章節中亦如此。舉例而言，當描述蛋白質療法時，明確涵蓋涉及聚核苷酸療法(使用編碼蛋白質之聚核苷酸/載體)之具體實例，且相反亦成立。儘管已出於理解清晰性之目的而藉由圖解及舉例的方式相當詳細地描述了前述發明，但一般技術者將根據本發明之教示而易於顯而易知：可在不脫離隨附申請專利範圍之精神或範疇之情況下對本發明作出某些變化及修改。本發明包括例如在任何情況下範疇皆小於以上明確提及之變化形式的本發明之所有具體實例。關於按屬描述之本發明之態樣，所有個別種類皆個別地視為本發明之各別態樣。關於以「一(個/種)」描述或主張之本發明之態樣，應瞭解，除非上下文明確需要更具限制性之含義，否則此等術語意謂「一或多(個/種)」。關於經描述成某一組內之一或多者之要素，應瞭解，涵蓋該組內之所有組合。最後，除非藉由陳述詞「裝置(means)」及功能而不陳述任何結構來定義申請專利範圍要素，否則任何申請專利範圍要素之範疇不意欲基於35 U.S.C. § 112第6段之運用來解釋。

實施例

藉由參考以下實施例可更容易地理解如此大體描述之本發明，該等實施例係為了說明而提供，而不意欲限制本發明。

實施例1

以下實施例描述適於與TFPI結合之肽的產生、鑑別及篩檢。

自商業供應商(例如PolyPeptide Laboratories SAS(Strasbourg,France)及JPT Peptide Technologies GmbH(Berlin,Germany))獲得肽候選者。以上提供合成候選肽之方法。候選肽以三氟乙酸(TFA)鹽形式合成，純度為>90%或>60%。所有肽皆溶解於DMSO中以獲得10 mM之儲備濃度。使用mRNA呈現文庫鑑別TFPI結合肽序列。mRNA呈現技術因為允許起始池內具有10¹⁴ 種不同序列之多樣性且避免例如為噬菌體呈現所需之活體內步驟而優於其他文庫篩檢技術。簡而言之，該技術涉及經由嘌呤黴素(puromycin)分子直接連接mRNA至其編碼之候選肽(圖5)。mRNA呈現方法進一步描述於國際專利公開案第WO 2005/051985號及Liu等人,Methods in Enzymology,318 ,268-293(2000)中。TFPI經由生物素固定至固體支撐物上且暴露於候選肽-RNA錯合物。分離TFPI結合之候選肽-RNA錯合物，且RNA經逆轉錄以獲得編碼DNA。在使用競爭性洗提策略進行6至10輪選擇之後獲得高親和力結合劑。許多候選肽之長度為31個胺基酸(27個隨機化胺基酸及2個側接兩端之胺基酸)。

合成所選肽且對其使用基於微陣列之掃描分析進行肽最佳化以鑑別保留TFPI結合親和力之肽片段。舉例而言，使用肽之一系列之20個胺基酸的片段進行JBT0047之基於微陣列之掃描，該等片段之序列與19個胺基酸重疊。簡而言之，N端經胺氧基乙酸酯修飾之肽印跡在Corning環氧化物玻璃載片上。在洗滌並乾燥之後，載片在TECAN HS400^TM 培育站中加以處理。載片於含有0.1% TWEEN 20(TBST)之Tris緩衝鹽水中洗滌2分鐘，且於基於Tris之T-20 SuperBlock^TM 緩衝液(5 mM CaCl₂ )(Pierce)中阻斷30分鐘。在阻斷之後，載片於TBST中洗滌2.5分鐘。載片隨後與DYLIGHT^TM 649標記之TFPI(1 μg/ml於基於Tris之T-20 SuperBlock^TM 緩衝液(5mM CaCl₂ )中)一起培育45分鐘，且用連續流動之TBST持續10分鐘洗滌2次。對載片用鹽水-檸檬酸鈉緩衝液作最終洗滌持續2分鐘，且空氣乾燥4分鐘。將載片在Axon GenePix4000B掃描器中作掃描，且使用GenePixPro軟體分析掃描圖。N端及C端截短分析補充掃描分析。微陣列掃描結果證明肽JBT0293以最高親和力結合TFPI。產生基於JBT0293之胺基酸序列之一系列取代突變體且測試其TFPI結合性質。

經由用經生物素標記之肽進行之酶聯免疫吸附檢定(ELISA)樣檢定(結合(EC₅₀ )ELISA)證明一子集之肽對TFPI的親和力。96孔MaxiSorp板(Nunc)經含3 μg/mL TFPI之塗鋪緩衝液(15 mM Na₂ CO₃ ，35 mM NaHCO₃ ，pH 9.6)塗鋪隔夜。板用350 μl洗滌緩衝液(HNaT：175 mM NaCl，25 mM HEPES，5 mM CaCl₂ ，0.1%吐溫80(Tween 80)，pH 7.35)洗滌3次，且隨後用200 μl含2%酵母抽提物之HNaT阻斷2小時。板接著用350μl HNaT洗滌3次。經生物素標記之候選肽自DMSO儲備溶液開始以200倍稀釋於HNaT中。若在200倍稀釋10 mM肽儲備溶液期間無沈澱出現，則初始肽濃度為50 μM。若形成沈澱，則對肽於DMSO中之儲備溶液進行預稀釋。經稀釋之肽施加至Maxisorp板上，產生連續稀釋液(1/3)，且在室溫下培育稀釋液1.5小時。在培育之後，進行3步洗滌(350 μl HNaT)。結合肽藉由與辣根過氧化酶結合之抗生蛋白鏈菌素一起培育(1小時)加以偵測，隨後用HNaT進行3步洗滌且隨後進行所添加TMB(3,3'5,5'-四甲基聯苯胺)之顯色轉化。檢定結果展示於圖6A中。

一般而言，與經固定TFPI結合之肽顯著在背景以上。經生物素標記之肽之EC₅₀ 值在圖32-39中給出。一種TFPI結合肽JBT0132之結合曲線描述於圖7中。JBT0132之EC₅₀ 經計算為約2.2 nM。

此外，使用作為「示蹤劑(tracers)」之經生物素標記之TFPI結合肽與未經生物素標記之候選肽競爭結合TFPI來進行競爭(IC₅₀ )ELISA。檢定原理描述於圖6B中。96孔MaxiSorp板(Nunc)經含3 μg/mL TFPI之塗鋪緩衝液(15 mM Na₂ CO₃ ，35 mM NaHCO₃ ，pH 9.6)塗鋪隔夜。TFPI之濃度可視特定檢定條件而改變；在本文參考之其他IC₅₀ ELISA檢定中，塗鋪緩衝液含有0.05 μg/ml TFPI。板用350 μl洗滌緩衝液(HNaT：175 mM NaCl，25 mM HEPES，5mM CaCl₂ ，0.1%吐溫80，pH 7.35)洗滌3次，且用200 μl含2%酵母抽提物之HNaT阻斷2小時。板接著用350 μl HNaT洗滌3次。經生物素標記之示蹤肽以對應於其在結合ELISA中測定之各別EC₉₀ 值的濃度(若n>2，則取中值)加以施用。肽之競爭劑儲備溶液(10 mM)以33.3倍稀釋於不含HSA之HNaT中，且用含3% DMSO之HNaT製備連續3倍稀釋液。用於特定檢定中之稀釋策略將視肽之親和力而定。稀釋液進一步用經生物素標記之示蹤肽以1:6之比率(20 μl競爭劑稀釋液與100 μl示蹤肽)稀釋。競爭劑與示蹤肽之混合物施加至經TFPI塗鋪之微量滴定板上且培育1.5小時。板用350 μl HNaT洗滌3次。肽-TFPI結合藉由以下加以偵測：向微量滴定板施加HRP結合之抗生蛋白鏈菌素，培育混合物1小時，用350 μl HNaT將板洗滌3次，施加TMB(3,3'5,5'-四甲基聯苯胺)，且偵測隨後由HRP對TMB進行之顯色轉化。代表性未經生物素標記之肽之IC₅₀ 圖提供於圖8A-8D中。肽JBT0303、JBT0120及JBT0224之IC₅₀ 量測結果闡述於表3中。

除競爭ELISA(IC₅₀ )檢定之外，亦採用篩檢檢定來平行量測更多數目之肽。篩檢ELISA類似於競爭IC₅₀ ELISA，例外之處為僅採用3種不同濃度之競爭劑(對於JBT0047種類而言為300 nM、100 nM及33.3 nM，且對於JBT0122種類而言為50000 nM、16667 nM及5556 nM)。在一些情況下，篩檢結果表示為示蹤信號相對於競爭肽(對於JBT0047家族而言為競爭肽JBT0477，且對於JBT0122家族而言為競爭肽JBT1697)之抑制百分比。根據本文闡述之方法製備且篩檢之肽之競爭IC₅₀ 檢定結果及篩檢檢定結果提供於圖32-39中。圖32-39中呈現之平均IC₅₀ 值係基於數目大於表3中呈現之值之檢定數目的檢定，且因此值可能略微不同。篩檢ELISA之結果呈現為示蹤肽JBT0131結合之抑制百分比。使用IC₅₀ ELISA分析之若干肽根據其如表4中所闡述之結合親和力在圖32-39中加以分類。

使用本文所述之方法鑑別之例示性TFPI結合肽呈現於表5中。一些肽經生物素標記，且許多包含N端及C端離胺酸以促進溶解性。如下所述，若干肽在模型及/或原生質檢定系統中展現TFPI抑制活性。

此實施例提供產生及特性化TFPI抑制肽之例示性方法。發現表5中之所有肽皆結合人類TFPI-1α。突變分析證明TFPI結合肽中之至少1個胺基酸可經取代，同時該肽保留對TFPI之親和力。表5之於ELISA檢定中測試之肽結合TFPI-1α之EC₅₀ 小於10 μM(1×10^-5 M)且IC₅₀ 小於50 μM。

實施例2

進一步在「抗目標(anti-target)」結合方面特性化所選TFPI結合肽。此實施例證明TFPI抑制肽展現對非TFPI-1蛋白之親和力降低。

TFPI-2由於其與TFPI-1之類似性而被選作抗目標。使用BIAcore 3000^TM 表面電漿子共振檢定(GE Healthcare,Chalfont St. Giles,UK)研究TFPI結合肽對人類TFPI-1(在C端，殘基29-282與含10個His之標籤融合；MW 41 kDa(R&D Systems,Minneapolis,MN；目錄號2974-PI))、鼠類TFPI-1(在C端，殘基29-289與含10個His之標籤融合；MW 41kDa(R&D Systems；目錄號2975-PI))、及TFPI-2(R&D Systems,Minneapolis,MN)之結合動力學。TFPI蛋白係藉由胺偶合化學以500 RU為目標固定在C1晶片(GE Healthcare,訂購碼：BR-1005-40)上。若干TFPI結合肽用作用於與固定之TFPI蛋白相互作用之分析物。利用30 μl/min之流速。在180秒之後，以在3.84 nM至656.25 nM之範圍內之6種不同濃度注射180 μl肽溶液，隨後解離480秒之時間。晶片用45 μl 10 mM NaOH再生。各結合實驗皆先前進行且隨後用HBS-P緩衝液(10 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，0.005% P20)外加1% DMSO及0.8% P80進行4次量測。BIAevaluation第4.1版軟體(GE Healthcare)用於分析資料。相對於1:1朗繆爾(Langmuir)結合曲線擬合感測器圖譜(sensorgram)以確定k_on 及k_off 且計算K_D 。

某些經測試之肽(例如JBT0050、JBT0121、JBT0205及JBT0211)與空白細胞結合且彼等感測器圖譜之結合常數不可確定。JBT0133顯示與TFPI-1結合微弱。其他肽之感測器圖譜給出可靠結合常數。若干TFPI抑制肽之BIAcore分析結果提供於表6及圖19-21中。表6中列出之各肽皆呈現小於10 μM之K_D 。除以下所列之肽之外，JBT0293在胺基酸位置5處(JBT0375)或胺基酸位置5及10處(JBT0477)經取代之突變體JBT0375及JBT0477亦展現小於10 μM之K_D 。圖9A及9B提供兩種肽之感測器圖譜。

亦檢查與TFPI-2抗目標之相互作用。由候選肽與人類TFPI-2相互作用所產生之最大信號比用TFPI-1作為相互作用搭配物所獲得之信號低得多。低TFPI-2結合信號之動力學分析易於出錯；因此，感測器圖譜之目視比較用於估計結合親和力。說明JBT0120與TFPI-1及TFPI-2結合之感測器圖譜以圖10A及10B形式提供。相較於JBT0120對TFPI-1之結合親和力，其結合TFPI-2之親和力低10倍。亦發現JBT0132展現對TFPI-1之親和力比對TFPI-2之親和力大至少10倍。

由此實施例提供之資料證實TFPI抑制肽特異性結合TFPI-1。

實施例3

以下實施例描述使用FXa抑制及外在因子X酶抑制檢定來特性化實施例1中鑑別之所選肽的TFPI抑制活性。兩種檢定均預測原生質系統中之活性。外在因子X酶檢定給出對肽對(a)FXa與TFPI之相互作用及(b)FXa-TFPI錯合物與TF-FVIIa錯合物之相互作用之影響的理解。FXa抑制檢定僅量測肽對FXa與TFPI之相互作用的影響。

外在因子X酶錯合物負責在起始凝血過程後活化FX及FIX。外在錯合物由FVIIa、組織因子(TF)及FX受質構成。為了確定肽對外在因子X酶錯合物之TFPI介導之抑制的影響，建立偶合酶檢定。肽自10 mM儲備溶液(於DMSO中)起始稀釋6.25倍且進一步以連續4倍稀釋度於緩衝液或DMSO中加以稀釋以防止不合需要之沈澱。TFPI於HNaCa-HSA或BSA(25 mM HEPES；175 mM NaCl；5 mM CaCl₂ ；0.1% HSA或BSA；pH 7.35)中稀釋。添加皆於HNaCa-HSA中稀釋之FVIIa、脂質化TF、磷脂小泡(DOPC/POPS 80/20)及對FXa具有特異性之顯色受質(S-2222(可得自DiaPharma,West Chester,OH))至96孔板中。在一段培育期之後，添加TFPI及肽稀釋液，從而產生2.5% DMSO(若存在於肽儲備溶液中)之最終濃度。藉由添加FX至孔中來起始FX活化。藉由使用微板讀取器觀測吸光度之增加來測定FXa介導之顯色受質轉化。在某些時間點產生之FXa之量根據OD讀數來計算。在反應開始之後20分鐘時產生之FXa經考慮用於根據肽濃度相對於TFPI之抑制(%)之曲線來計算EC₅₀ 。

亦使用FXa抑制檢定檢查TFPI之功能性抑制。添加均於HNaCa-HSA中稀釋之FXa特異性顯色受質(S-2222)及TFPI至96孔板中。肽自10 mM儲備溶液(於DMSO或Aqua-Dest中)起始稀釋6.25倍且進一步以連續4倍稀釋度於緩衝液或DMSO中加以稀釋以防止不合需要之沈澱。添加肽稀釋液(2.5 μl)至96孔板中，從而產生2.5% DMSO(若存在於肽儲備溶液中)之最終濃度。顯色受質之轉化藉由添加FXa來觸發，且於微板讀取器中量測轉化之動力學。因為TFPI緩慢抑制FXa，所以在115分鐘之後之OD讀數經考慮用於根據肽濃度相對於TFPI之抑制(%)之曲線來計算EC₅₀ 。

外在因子X酶檢定及FXa抑制檢定之結果提供於表7及圖22-27中。

參考表7，JBT0120、JBT0132及JBT0224以<2 μM之EC₅₀ 恢復在TFPI-1存在下之外在錯合物介導之FX活化，從而導致抑制介於約20%至約60%之間的TFPI活性。JBT0047(EC₅₀ =1.4 μM)、JBT0131(EC₅₀ =2.2 μM)及JBT0293(EC₅₀ =2.9 μM)亦恢復在TFPI-1存在下之外在錯合物活性。此外，JBT0120、JBT0132、JBT0224及JBT0303以<5 μM之EC₅₀ 恢復FXa抑制檢定中在TFPI-1存在下之FXa活性，從而導致抑制介於約5%至約50%之間的TFPI活性。JBT0047(EC₅₀ =0.7 μM)、JBT0131(EC₅₀ =8.2 μM)、JBT0293(EC₅₀ =1.3 μM)、JBT0297(EC₅₀ =0.6 μM)及JBT0305(EC₅₀ =2.3 μM)亦恢復FXa抑制檢定中在TFPI-1存在下之FXa活性。此實施例證實本發明之肽為TFPI拮抗劑。

實施例4

在此實施例中，使用基於血漿之檢定測定肽之TFPI抑制活性。

在凝血酶特異性螢光受質Z-Gly-Gly-Arg-AMC緩慢裂解之後，一式兩份在Fluoroskan Ascent讀取器(Thermo Labsystems,Helsinki,Finland；濾波器為390 nm激發及460 nm發射)中經由校正自動血拴圖像(calibrated automated thrombography)量測肽對凝血酶產生之影響(Hemker,Pathophysiol. Haemost. Thromb .,33,4-15(2003))。獲得患有FVIII或FIX不足之患者之血漿(George King Bio-Medical公司，Overland Park,KN)以用於測試。各血漿之殘餘凝血因子活性皆低於1%。作為抗體介導之FVIII不足之模型，冷凍匯合之正常血漿(George King Bio-Medical公司，Overland Park,KN)與添加後獲得50 BU/mL之於山羊中產生之高效價熱不活化抗人類FVIII血漿(4490 BU/ml；Baxter BioScience,Vienna,Austria)一起培育。血漿與玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)(Hematologic Technologies公司,Essex Junction,VT)混合以抑制因子XIIa污染，從而產生40 μg/mL之最終濃度。

添加預先溫熱(37℃)之血漿(80 μL)至96孔微板(Immulon 2HB，透明U形底部；Thermo Electron,Waltham,MA)之各孔中。為了觸發由組織因子產生凝血酶，添加10 μL含有低量(12 pM)重組人類組織因子之低PPP試劑及由磷脂醯絲胺酸、磷脂醯膽鹼及磷脂醯乙醇胺構成之磷脂小泡(48 μM)(Thrombinoscope BV,Maastricht,The Netherlands)。肽自10 mM儲備溶液起始用DMSO稀釋7.5倍，且進一步用Aqua-Dest稀釋8.33倍，從而產生12%之DMSO濃度，提供最終檢定混合物中0.5%之DMSO濃度。僅在將板放入預加溫(37℃)之讀取器之前，添加5 μL含5 mg/mL人類血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司，St. Louis,Missouri,USA)之HEPES緩衝鹽水或含12% DMSO之Aqua-Dest，隨後添加肽稀釋液或參照蛋白質(FVIII Immunate參照標準物(Baxter BioScience,Vienna,Austria)；因子VIII抑制劑旁路活性(FEIBA)參照標準物(Baxter BioScience,Vienna,Austria)；NovoSeven(Novo Nordisk,Denmark)；及純化人類血漿FIX(Enzyme Research Laboratories,South Bend,IL))。凝血酶產生係藉由將20 μL 含有螢光受質之FluCa試劑(Thrombinoscope BV,Maastricht,The Netherlands)及經HEPES緩衝之CaCl₂ (100 mM)分配入各孔中來起始。在37℃下記錄螢光強度。

使用Thrombinoscope^TM 軟體(Thrombinoscope BV,Maastricht,The Netherlands)及修正內部濾波器影響及受質消耗影響之凝血酶校正劑來計算所得凝血酶產生曲線之參數(Hemker,Pathophysiol .Haemost .Thromb .,33,4-15(2003))。為了計算與參照蛋白質(例如FVIII Immunate參照標準物、FEIBA參照標準物)等效之某些肽濃度的凝血酶產生活性，各凝血酶產生曲線之峰值凝血酶量(峰值凝血酶，nM)相對於標準濃度進行繪圖，且藉由非線性演算法進行擬合。基於此校正，計算FVIII Immunate、FIX、FEIBA或NovoSeven之等效活性。各種肽之結果提供於圖12-18及28-30中。代表性結果提供於表8中(*表示FVIII不足血漿係自不同供體獲得)。

參考表8，JBT0120、JBT0132、JBT0224及JBT0303改良缺乏FVIII之血漿中之TFPI依賴性凝血酶產生至超過含有FVIII之血漿中之凝血酶產生程度的1%程度(FVIII等效活性%)。測試之肽在FVIII不足血漿中展現約5%-40%之FVIII等效活性。JBT0120及JBT0132以劑量依賴性方式改良峰值凝血酶及峰值時間，如圖11A及11B中所示。

基於JBT0293之胺基酸序列之取代突變體亦在基於血漿之檢定以及實施例3中描述之FXa抑制及外在因子X酶抑制檢定中加以測試。代表性結果提供於表9中。

另外，包含JBT0293之胺基酸序列但在JBT0293序列之胺基酸位置5及10處經取代之JBT0477改良FVIII不足血漿中之凝血酶產生等效於413 mU/ml FVIII(在1 μM肽下)。JBT0293之取代突變產生就對TFPI之親和力而言經高度最佳化之肽且改良FXa抑制檢定、外在因子X酶抑制檢定及基於血漿之檢定中之活性。

實施例5

以下實施例證明本發明之肽可藉由添加會增強該等肽之物理化學或藥物動力學性質之部分加以修飾。如以下所說明，向本文所述之肽中添加40 kDa PEG顯著改良該等肽之藥物動力學特性。該實施例亦描述TFPI結合肽JBT1857之最佳化以降低對蛋白水解之敏感性。

使化學或生物部分與肽結合之方法在此項技術中為已知的。為了向本文所述之肽中添加PEG(聚乙二醇)，添加官能基(AOA=胺氧基乙酸酯)至肽之N端中以達成與醛及酮偶合。或者，添加半胱胺酸至肽之C端部分中以達成與順丁烯二醯亞胺偶合(Hermanson,Bioconjugate Techniques ,Academic Press(1996))。肽(JBT1586)AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO: 166)及(JBT1587)Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO: 167)分別用於以PEG進行之N端修飾及C端修飾。AOA-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO: 166)及Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO: 167)分別與過量40 kDa mPEG-丙醛(SUNBRIGHT ME-400AL2，NOF,Japan)及40 kDa mPEG-順丁烯二醯亞胺(SUNBRIGHT ME-400MA，NOF,Japan)一起培育。相較於起始結構Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(JBT0740)(SEQ ID NO: 66)，所得聚乙二醇化肽JBT1852及JBT1855顯示類似親和力。

所得聚乙二醇化肽在小鼠中顯示顯著增加之血漿穩定性及延長之血漿半衰期。圖31說明在向小鼠靜脈內投藥之後，相較於C端聚乙二醇化肽JBT1855(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKLC(PEG(40kD))-NH2)(SEQ ID NO: 252)，自由肽JBT0740(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO: 66)之藥物動力學分析結果。與未聚乙二醇化肽相反，在投藥後100分鐘時，聚乙二醇化肽以高濃度存在於小鼠血漿中。未聚乙二醇化肽快速自血漿清除。圖40說明在皮下注射之後，JBT1855之藥物動力學分析結果。JBT1855亦強烈改良實施例4中描述之檢定中之凝血酶產生(圖41)。

JBT1852及JBT1855肽亦在實施例1-4中描述之檢定中加以特性化且與JBT0740及JBT0047家族中之其他肽進行比較。代表性結果提供於以下闡述之表10中。

亦檢定表10中列出之肽與TFPI-2抗目標之相互作用，且產生之信號對於可靠親和力量測而言過低。資料表明聚乙二醇化不除去本發明之肽之抑制活性或負面影響對TFPI-1之選擇性。

基於細胞之外在因子X酶檢定

上述TFPI結合肽恢復外在因子X酶錯合物介導之轉化FX至FXa的能力亦使用基於細胞之外在因子X酶檢定加以確定。基於細胞之外在因子X酶檢定亦採用來研究聚乙二醇化對本發明之例示性TFPI結合肽JBT0740之影響。人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)經計數且以每孔1.5×10個細胞之密度接種於96孔板(黑色扁平狀，具有透明底部)中之完全生長培養基中。使細胞生長隔夜(約16至18小時)，用預加溫之基本培養基洗滌2次，在37℃下用1 ng/ml重組TNFα(Sigma Aldrich(目錄號T6674))於200 μl基本培養基中刺激4小時，且用200 μl預加溫之細胞培養緩衝液洗滌2次。含有FVIIa(Enzyme Research Laboratories)之緩衝液(50 μl)、TFPI結合肽(溶解於DMSO或有或無0.1%吐溫80之Hepes緩衝鹽水中)或αTFPI抗體施加至細胞中，且在37℃下培育20分鐘，從而允許FVIIa/TF錯合物形成及TFPI拮抗劑與TFPI結合。在培育期之後，50 μl含有FX及FXa特異性受質(Fluophen FXa(HYPHEN BioMed))之細胞培養緩衝液施加於細胞上，從而產生最終體積100 μl之細胞培養緩衝液混合物。最終濃度為：39 pM FVIIa；170 nM FX；250 μM Fluophen FXa及2.5% DMSO(當肽溶解於DMSO中時)。

將96孔板轉移至預加溫(37℃)之螢光讀取器中以用於偵測由FXa進行之FXa特異性螢光受質轉化，FXa係由TF/FVIIa錯合物在經刺激之HUVEC之表面上產生。在培育9分鐘之後獲取之讀數用於計算TFPI結合肽或抗體之TFPI抑制效應。在以下肽(屬於JBT0047家族)之各種濃度下觀測之TFPI的近似抑制百分比闡述於表11中：JBT0717(Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERLRAKL-NH2)(SEQ ID NO: 61)、JBT0740(Ac-FQSKGNVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO: 66)、JBT1584(Ac-FQSK-Nmg-NVFVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO: 164)及JBT1857(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO: 178)。

亦使用基於細胞之外在因子X酶檢定測試聚乙二醇化肽。JBT0740(SEQ ID NO: 66)在N端處與1 kD PEG部分結合以產生JBT1853或在C端處結合以產生JBT1854。JBT1853及JBT1854抑制TFPI 20%或20%以下，視檢定中使用之肽之量而定。在C端處包含40 kD PEG部分之JBT1855(親本肽JBT0740)在基於細胞之檢定中表現優於在N端處包含40 kD PEG部分之JBT1852。JBT1855介導20-30% TFPI抑制，而JBT1852抑制TFPI活性達10%或10%以下。

JBT0120家族之肽JBT0120、JBT0415、JBT0444、JBT1426及JBT1837亦在基於細胞之外在因子X酶檢定中加以測試且發現其相較於JBT0047家族之肽，在較小程度上抑制TFPI。降低或部分抑制活性可為本發明之一些具體實例中所需。與JBT0047家族之肽類似，肽最佳化使JBT0120家族肽之TFPI抑制劑活性增加。

在檢查JBT1857之穩定性及抑制活性之過程中，確定肽之胺基酸序列在Val9與Asp10之間含有蛋白酶裂解位點。位置9處之Tle之取代(產生JBT2431)及位置10處之Pro之取代(產生JBT2432)阻斷肽之裂解且使肽之血漿穩定性增強約3倍，即自27%(JBT1857)至82%(JBT2431)及76%(JBT2432)。在Gly11與Tyr12之間鑑別出另一推定裂解位點。Glla取代(產生JBT2414)進一步使肽之穩定性改良至100%。所有穩定性皆在於人類血漿中培育24小時之後藉由定量ELISA測定。

上述結果證明利用非習知胺基酸進行本文所述之TFPI結合肽之最佳化改良TFPI抑制及血漿穩定性。另外，本發明之聚乙二醇化肽在基於細胞之外在因子X酶檢定中抑制TFPI活性，其中C端聚乙二醇化肽表現優於N端聚乙二醇化肽。本發明之TFPI結合肽抑制自由TFPI與細胞結合之TFPI兩者之活性。

實施例6

以下實施例說明本文所述之肽降低動物模型中出血之能力。

10週齡之C57Bl/6NCrl小鼠在研究之前經舍養(housed)2週。在爪甲修剪之前30分鐘，向動物投予(a)JBT1855(10 mg/kg)，經由尾靜脈靜脈內(i.v.)或在頸區中皮下(s.c.)，(b)抗TFPI抗體(18 mg/kg；i.v.)，或(c)媒劑(175 mM NaCl，25 mM HEPES(pH 7.35)；10 ml/kg；i.v.)。在爪甲修剪之前10分鐘用80 mg/kg戊巴比妥(pentobarbital)麻醉動物。為了達成出血，移除右後爪之小趾之爪甲。將爪浸沒於0.9% NaCl溶液中以用於收集血液持續60分鐘之時期。在溶解之後藉由分光光度法對失血進行定量。溫度在整個實驗過程中保持恆定於37℃。研究結果說明於圖42中且概述於表11中。

相較於用單獨媒劑處理，靜脈內或皮下投予本發明之聚乙二醇化肽JBT1855減少小鼠中之失血。

實施例7

以下實施例描述經由核磁共振及x射線結晶學對TFPI-肽相互作用進行特性化。特定言之，在分子層面上使用2D¹⁵ N-雜核單量子相干(HSQC)光譜研究拮抗肽JBT0303、JBT0122及JBT0415之TFPI結合位點；JBT0303、JBT0122及JBT0415之與TFPI160相互作用之殘基；及錯合及自由JBT0303、JBT0122及JBT0415之二級結構。使用x射線結晶學檢查JBT1857與TFPI之KD1之相互作用，且定位TFPI KD1之介導JBT 1857結合之殘基。

鑑別TFPI160上之JBT0303結合位點

¹⁵ N-標記之TFPI160製備物用於以JBT0303進行之TFPI160的滴定實驗。在30℃下在Varian 600 MHz光譜儀上記錄不含及含遞增量之肽之約500 μM¹⁵ N-TFPI160樣本的HSQC光譜。肽-蛋白質相互作用顯示緩慢交換特性(k_ex <<Δω)，意味各TFPI殘基對自由蛋白質及蛋白質-肽錯合物產生有限之信號。不同於混合物僅產生1個根據物種群體之具有平均位置之峰的快速交換特性(k_ex >>Δω)，緩慢交換特性不允許在肽結合後追蹤信號。因此，為了定位結合位點，需要賦值TFPI160-JBT0303錯合物之移位峰(shifted peak)。此需要製備¹³ C/¹⁵ N-TFPI160及JBT0303之樣本。

最初，用992 μM¹³ C/¹⁵ N-TFPI160及1190 μM JBT0303製備樣本。然而，NMR樣本產生不允許賦值錯合物之不良品質光譜。樣本發生膠化，可能由於形成高分子量聚集體。因此，所得NMR資料主要顯示由經同位素標記之TFPI160之最具可撓性部分產生的信號。因此，再研究樣本條件以用於進一步實驗。根據對TFPI160-JBT0303錯合物進行之一系列¹⁵ N-HSQC實驗，推斷凝膠形成可藉由樣本稀釋及在高溫下獲取資料加以避免。¹³ C/¹⁵ N-TFPI160之最終濃度為331 μM且JBT0303之最終濃度為397 μM。光譜品質得以改良。歸因於較低濃度及降低之雜訊比，必須基於HNCA、HNCO及HNCOCA實驗進行賦值。

除4個先前賦值之殘基以外，脫輔基TFPI160(apo-TFPI160)中可賦值之所有殘基皆可在TFPI160-JBT0303錯合物中賦值。一些殘基之賦值由於3D光譜中缺乏峰而不明確。此外，3個殘基之峰僅在來自原始滴定實驗之HSQC光譜中可見。然而，附近之所有峰皆經明確賦值，且因此此等殘基之賦值可能為正確的。

相較於自由TFPI160，與JBT0303結合之¹⁵ N-TFPI160之HSQC信號的化學位移變化說明於圖43中。經受最強化學位移之殘基僅在庫尼茲域1上。殘基F25、F28、D32、A37、T48及Y56之化學位移移位最大(>2 ppm)。殘基I38、I46、F47及F54亦移位超過1.5 ppm。不明確是否F25之殘基N端涉及與JBT0303之相互作用，因為殘基20-24未經賦值。L19顯示化學位移總計變化約0.6 ppm。因此，與先前咸信TFPI之殘基1-18內之胺基酸涉及於肽結合中相反，本資料表明即使有亦僅有少許肽與TFPI之N端尾部結合。圖44中闡述TFPI蛋白之二級結構之帶狀模型，其說明相較於自由TFPI160，與JBT0303結合之TFPI160之HSQC信號的化學位移變化之區域。

為了更特定鑑別TFPI160上之JBT0303結合位點，測定¹⁵ N-TFPI160及¹⁵ N-TFPI160+JBT0303之醯胺交換速率。醯胺交換實驗主要藉由量測醯胺基之H交換來偵測肽骨架之環境中的變化。用足夠高以致不因鬆弛而消散之能量來照射H₂ O頻率，從而導致H₂ O信號之完全飽和及抑制。H₂ O信號抑制之此方法之副作用在於抑制轉移至與溶劑交換(H/H交換)之可交換醯胺NH。飽和轉移取決於半定量之H/H交換速率。對於經更多保護之NH基團而言，該作用降低(亦即未經保護之NH比經保護之NH衰減更多)。若經保護之NH處於配位體之H-α附近，則相較於脫輔基形式，較高交換速率被觀測到。類似地，H交換可由Ser、Thr或Tyr之OH基團介導。

記錄脫輔基¹⁵ N-TFPI160及¹⁵ N-TFPI160-JBT0303錯合物之無及有水抑制的HSQC光譜。藉由計算有及無水抑制之HSQC光譜中之峰強度的比率來確定TFPI160之各殘基之相對交換速率。¹⁵ N-TFPI160之資料集與¹⁵ N-TFPI160+JBT0303之資料集之比較揭示TFPI殘基25、26、36、62、63、127、132及152在錯合物中展現降低大於10%之醯胺交換速率，而殘基29、30、42、45、49、50、56、66及98展現增加超過10%之交換速率。

包括以下源於醯胺交換實驗之約束來計算改進之HADDOCK模型：(a)扭轉角係取自JBT0303之K4、K5、V7、F8、Y12-A18之TALOS的計算值(化學位移實驗)；(b)KD1之化學位移變化超過1.5 ppm之以下殘基涉及於結合JBT0303中：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54及Y56(化學位移實驗)；(c)JBT0303之兩性螺旋之疏水側與KD1結合：JBT0303之Y12或L16或L20與KD1之D32或A37或I38或F54或Y56結合(化學位移實驗)；(d)JBT0303之R15或K19與KD1之D31或D32或E60結合(化學位移實驗)；(e)JBT0303之F8或V9與KD1之F25或F28結合(化學位移實驗)；(f)JBT0303之Y12或F13與KD1之I46或F47或T48結合(化學位移實驗)；(g)JBT0303之Q2與KD1之Y56結合(化學位移實驗)；(h)JBT0303之F1與KD1之M39或F66結合(醯胺交換實驗)；(i)JBT0303之S3或K4或K5與F66結合(醯胺交換實驗)；(j)JBT0303之V7或F8或V9與KD1之F25或C26或N62或Q63結合(醯胺交換實驗)；(k)JBT0303之V9或D10或G11或R15與KD1之F28或K29或A30結合(醯胺交換實驗)；(1)JBT0303之Y12或F13與KD1之N45結合(醯胺交換實驗)；(m)Y12或F13或E14或R15與KD1之R49或Q50結合(醯胺交換實驗)；及(n)JBT0303之L20與KD1之K36結合(醯胺交換實驗)。資料彙集成KD1+JBT0303錯合物之基本上1個模型。

鑑別TFPI160上之JBT0122結合位點

如同¹³ C/¹⁵ N-TFPI160+JBT0303錯合物一樣，¹³ C/¹⁵ N-TFPI160+JBT0122 NMR樣本由於形成凝膠而產生品質不良之光譜。723 μM¹³ C/¹⁵ N-TFPI160+JBT0122之濃度導致形成高次(higher order)聚集體。樣本稀釋至361.5 μM且在37℃下記錄光譜，從而產生改良之光譜品質。獲得HNCO、HNCA及HNCOCA光譜。除5個殘基以外，脫輔基TFPI160之所有先前賦值之峰可在TFPI160-JBT0122錯合物中加以賦值。經受最強化學位移變化且可能與肽相互作用之殘基常不在3D光譜中產生峰。然而，庫尼茲域1(KD1)與庫尼茲域2(KD2)之間的連接區域中之峰亦展現較低強度。因此，此等峰之賦值不明確。一些峰僅在原始滴定實驗之HSQC中可見。在大多數情況下，其賦值為確定的，因為在TFPI160及TFPI160+JBT0122 HSCQ光譜中峰重疊。

與JBT0122結合之¹⁵ N-TFPI160相較於自由TFPI160之HSQC信號的化學位移變化展示於圖45中。僅發現KD2之殘基的顯著化學位移變化。一般而言，由JBT0122與TFPI160結合引起之化學位移變化之程度比JBT0303與TFPI160結合由引起之化學位移變化之程度不明顯。具有最強化學位移擾動之殘基為F96、G128、G129、G132、N133及N136。C97、E101、T111、F114、N135及F137經擾動，展現超過0.5 ppm之化學位移變化。圖46中闡述TFPI蛋白之二級結構之帶狀模型，其說明相較於自由TFPI160，與JBT0122結合之TFPI160之HSQC信號的化學位移變化之區域。

鑑別JBT0122之與TFPI160相互作用之殘基

為了對JBT0122進行依序骨架信號賦值，重組產生經¹³ C/¹⁵ N標記之肽。簡而言之，在大腸桿菌(E. coli )中以與硫氧還蛋白(thioredoxin)之融合蛋白形式表現肽。使用含有3.0 g/l¹³ C-葡萄糖及1.0 g/l¹⁵ NH₄ Cl之M9培養基製備經¹³ C/¹⁵ N標記之肽。使用Ni螯合管柱及聚組胺酸標籤對融合蛋白進行親和力純化。肽係由凝血酶裂解。分別使用Ni螯合管柱及苯甲脒管柱移除硫氧還蛋白/His標籤及凝血酶。接著藉由逆相層析純化肽。藉由SDS-PAGE、RP-HPLC及質譜驗證純度、完整性及身分。重組JBT0122命名為JBT0788且在其N端處具有2個額外殘基甘胺酸及絲胺酸，其表示凝血酶裂解位點之殘留物。

JBT0788之賦值係基於在10℃下在Varian 600 MHz光譜儀上記錄之HSQC、HNCACB、HNCA、HNCO及HNN光譜來進行且使用SPARKY軟體加以賦值。相較於用TFPI160進行之NMR實驗，降低溫度以改良光譜品質。根據記錄之光譜，賦值大多數殘基之羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、醯胺質子(H)及醯胺氮(N)。殘基H13及R17之賦值不明確。HNCOCA導致對此等殘基之明確賦值。

JBT0788之賦值表提供於圖47中。在JBT0788之光譜中觀測到殘基4-12之兩組信號。因為JBT0788之一級結構未兼顧，所以兩組信號可能由F6與P7之間的肽鍵之順/反異構化引起。基於HSQC光譜中之相應信號之強度的主要：次要構形之比率確定為76:24。如根據脯胺酸之Cα位移所判斷，主要構形可能為反式，因為其63.16 ppm之Cα值高於次要構形(62.49 ppm)。

賦值之1個目的在於根據Cα化學位移擷取肽之二級結構。Cα化學位移受角φ及Ψ且因此受肽之二級結構影響。在β股中，Cα通常以較小ppm移位；在α螺旋中，Cα通常以較大ppm移位。藉由自表列無規捲曲值減去量測之Cα值，計算得到β股中之殘基之負值及α螺旋中之殘基之正值。因此，一批連續負值指示β股而一批連續正值指示α螺旋。

JBT0788展現一大塊增加之Cα值(Δδ(Cα)=Cα_量測 -Cα_無規捲曲 )，其指示包含殘基8至26之α螺旋。天然蛋白質之三級結構內之穩定α螺旋的Δδ(Cα)值典型介於3-4 ppm之間。JBT0788之α螺旋之Δδ(Cα)值上升至約1.7 ppm，指示可撓性大於蛋白質內之一般螺旋。JBT0788之另一特徵為位置處7之N端指向α螺旋之脯胺酸，其配合良好，因為蛋白質中之α螺旋常以N端處之脯胺酸終止。殘基6具有較強負值，其由已知迫使其N端相鄰胺基酸成為β股樣構形之相鄰脯胺酸引起。C端殘基31之較強正值對於無C端相鄰胺基酸之殘基而言亦為典型的。JBT0788中F6與P7之間的肽鍵採用2種構形，即反式(76%)及順式構形(24%)。此位置處之構形會影響連續殘基之構形。在反式同功異構物中，α螺旋緊接P7之後開始；順式同功異構物之α螺旋直至殘基L12才開始。圖48中闡述說明自由JBT0788之二級結構之帶狀模型。

JBT0788內之化學位移亦可用來使用TALOS軟體計算扭轉角。TALOS為一種用於使用既定蛋白質或肽序列之5種(HA、CA、CB、CO、N)化學位移賦值之組合來經驗預測φ及Ψ骨架扭轉角的資料庫系統。TALOS方法為許多種二級化學位移(亦即化學位移與其相應無規捲曲值之間的差異)與蛋白質二級結構之態樣相關之觀測的延伸。TALOS之目標在於使用二級位移及序列資訊來定量預測蛋白質骨架角φ及Ψ，且提供此等預測之不確定性之量度。TALOS使用既定殘基之二級位移來預測彼殘基之φ及Ψ角。當對既定殘基作預測時，TALOS亦包括來自下一及前一殘基之資訊。潛於TALOS之後之想法為若可發現已知結構之蛋白質中之殘基的三聯體具有與目標蛋白中之三聯體類似的二級位移及序列，則已知結構中之φ及Ψ角將為目標中之角之適用預測物。在實踐中，TALOS搜尋資料庫中與目標蛋白中之既定三聯體的10個最佳匹配。

為了賦值與TFPI160錯合之JBT0788之HSQC光譜，製備由400 μM¹³ C/¹⁵ N-JBT0788及400 μM TFPI160組成之樣本。如同肽及TFPI160之先前NMR樣本一樣，樣本發生膠化。稀釋樣本且將丸粒溶解於氘化DMSO中，從而產生約300 μM¹³ C/¹⁵ N-JBT0788+TFPI160及5% DMSO之最終濃度。在40℃下進行量測。此改良所得光譜之品質。在考慮部分聚集之樣本之鬆弛性質的TROS Y模式中獲得實驗結果。歸因於樣本中之蛋白質-肽錯合物之低濃度，採用Varian 600 MHz光譜儀上之冰凍探針技術。當利用冰凍探針技術且一式兩份獲得三重共振實驗結果時，所得資料品質足以獲得JBT0788之骨架位移。基於HNCA、HNCOCA及HNCO光譜進行與TFPI160之錯合物中之JBT0788的賦值。根據記錄之光譜，賦值大多數殘基之羰基碳(C)、α碳(CA)、醯胺質子(H)及醯胺氮(N)。與TFPI160錯合之JBT0788之賦值表提供於圖49中。

脫輔基JBT0788之一特徵為存在胺基酸殘基4-12之兩組信號，可能由F6與P7之間的肽鍵之順/反異構化引起。在JBT0788-TFPI160錯合物中，僅觀測到1組峰，意味僅1種構形與TFPI160結合。脫輔基JBT0788亦展現一大塊增加之Cα值(Δδ(Cα)=Cα_量測 -Cα_無規捲曲 =正數)，指示α螺旋自殘基8延伸至殘基26。如上所提及，天然蛋白質之三級結構內之穩定α螺旋的Δδ(Cα)值典型地介於3-4 ppm之間。脫輔基JBT0788之α螺旋之Δδ(Cα)值增加至約1.7 ppm，指示可撓性大於蛋白質內之一般螺旋。當與TFPI錯合時，殘基8至26展現介於3-5 ppm之間的值，指示形成一或多個穩定α螺旋。圖50中闡述說明JBT0788在與TFPI160錯合時之二級結構之帶狀模型。由與TFPI160結合引起之JBT0788內之較大化學位移變化均勻分佈於肽之整個長度上。經受最強化學位移擾動之殘基為化學位移超過4 ppm之殘基S5、A9、Q11、Y28及K29。殘基Y3、A4、V10、L12、S15、M21、A22、L23及A24擾動超過3 ppm。

鑑別JBT0303之與TFPI160相互作用之殘基

使用與以上關於JBT0122所述相同之程序重組產生JBT0303且用¹³ C及¹⁵ N進行同位素標記。重組JBT0303命名為JBT0616且在其N端處具有另一甘胺酸及絲胺酸。基於在10℃下在Varian 500 MHz光譜儀上記錄之HSQC、HNCACB及HNN光譜進行JBT0616之賦值，且使用SPARKY軟體加以賦值。JBT0616之光譜之品質優於JBT0788之光譜之品質，但關於緩衝液、溫度、NMR管及NMR參數之實驗條件為相同的。賦值大多數殘基之α碳(CA)、β碳(CB)、醯胺質子(H)及醯胺氮(N)。賦值主要基於敏感性較小但資訊性更大之HNCACB而非HNCA。與HNN光譜組合，此導致對所有源於JBT0303之殘基進行明確賦值。

JBT0616之賦值表提供於圖51中。二級結構係擷取自Cα化學位移且藉由使用H、CA、CB、CO及N之賦值進行TALOS加以確定。與JBT0788類似，JBT0616展現指示α螺旋構形之一塊正Δδ(Cα)值。螺旋位於肽之C端部分且包含殘基10-18。就JBT0788而言，計算Δδ(Cα)值多達約1.8 ppm，從而鑑定此螺旋對於該種短肽而言相對穩定。圖52中闡述說明JBT0616之二級結構之帶狀模型。與JBT0788中之殘基31類似，C端殘基20之較強正值對於無C端相鄰胺基酸之殘基而言為典型的。JBT0616之N端殘基1-9展現略微正Δγ(Cα)值，表明偏向於α螺旋結構。

使用經¹³ C/¹⁵ N標記之肽樣本及過量未標記TFPI160進行與TFPI160之錯合物中之JBT0616的賦值。在Varian 800 MHz光譜儀上記錄HSQC、HNCA、HNCOCA及HNCO光譜且使用SPARKY軟體加以賦值。在30℃下記錄光譜。使用此等光譜，賦值大多數殘基之α碳(CA)、β碳(CO)、醯胺質子(H)及醯胺氮(N)，如圖53中之表中所闡述。與TFPI160之錯合物中之JBT0616的二級結構擷取自Cα化學位移且由TALOS計算。與自由肽類似，與TFPI160之錯合物中之JBT0616展現指示α螺旋構形的一塊C端正Δδ(Cα)值。在錯合物形成後，α螺旋之穩定性增加。此研究結果表明JBT0616之C端區為核心結合基元。N端殘基之Δδ(Cα)值亦變化，但程度較小。JBT0616在與TFPI錯合時之二級結構說明於圖54中之帶狀模型中。

在錯合物形成後，觀測到JBT0616之殘基Q2、K5、F8、V9及A18之化學位移變化之最顯著，超過7 ppm。殘基F13、R17、K19及L20亦經擾動且顯示化學位移變化超過4 ppm。在N端處之殘基之強化學位移變化指示並不僅僅只有兩性C端α螺旋驅動肽與TFPI 160結合。

NMR實驗結果與JBT0477取代之分析之組合用於使用HADDOCK(高不明確性驅動之蛋白質-蛋白質對接(High Ambiguity Driven protein-protein D OCKing))軟體產生與JBT0303之錯合物中之KD1的模型。HADDOCK為一種用於模型化生物分子錯合物之資訊驅動之可撓性對接方法。HADDOCK用以下事實將自身與從頭開始(ab-initio )之對接方法相區別：其用不明確相互作用限制(ambiguous interaction restraint，AIR)編碼來自鑑別或預測之蛋白質界面的資訊以驅動對接過程。如藉由化學位移資料揭示之TFPI160及肽上之結合位點的鑑別、如藉由軟體TALOS確定之肽的扭轉角、及JBT0477之取代分析為模型計算提供限制。

對於計算KD1-JBT0303 HADDOCK模型，採用以下限制：(a)扭轉角係取自JBT0303之K4、K5、V7、F8、Y12-A18之TALOS的計算值；(b)KD1之化學位移變化超過1.5 ppm之以下殘基涉及於與JBT0303之結合中：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54及Y56；(c)JBT0303之兩性螺旋之疏水側與KD1結合：JBT0303之Y12或L16或L20與KD1之D32或A37或I38或F54或Y56結合；(d)JBT0303之R15或K19與KD1之D31或D32或E60結合；(e)JBT0303之F8或V9與KD1之F25或F28結合；(f)JBT0303之Y12或F13與KD1之I46或F47或T48結合；及(g)JBT0303之Q2與KD1之Y56結合。Q2JBT0303-Y56 KD1相互作用亦視為模型計算之限制。

觀測到JBT0303之K5在錯合物形成後之強化學位移變化。對於JBT0303之經考慮驅動肽-蛋白質相互作用之其餘殘基，模型與資料良好相符。KD1-JBT0303之能量最低之模型將JBT0303之F8置放在TFPI之F25及F28附近，從而解釋觀測之化學位移變化及來自取代分析之資料。JBT0303之V9與KD1之疏水塊(包括F54)相互作用。JBT0303之Y12、F13、L16及L20亦面對KD1之疏水塊。Y12與F28、I46、T48；F13與F47、T48；L16與F54；及L20與A37、I38鄰近引起錯合物中之彼等殘基之NMR化學位移的所觀測擾動；Y12及L16之保守可能歸因於此等殘基與蛋白質之廣泛相互作用。JBT0303之K19處於允許與KD1之D32相互作用的位置中。JBT0303之R15之作用似乎為與KD1之疏水塊以及與D32相互作用。此外，模型解釋為何帶負電荷之天冬胺酸在JBT0303之位置10處較佳；其可與KD1之帶正電荷之K29相互作用。JBT0303之在位置11處之甘胺酸歸因於在此位置處之立體及構形限制而存在。與JBT0303之錯合物中之KD1(包含KD1之TFPI殘基22-79)的HADDOCK模型提供於圖55中。

與KD1結合之JBT0740及JBT1857之模型

肽JBT0740及JBT1857(FQSK-dP-NBHBDGYFERL-Aib-AKL(SEQ ID NO: 178))，為JBT0303之兩種衍生物，在FXa-TFPI抑制檢定中顯示顯著增強之EC₅₀ 值(分別為0.11 μM及0.0023 μM)及如藉由Biacore測定之較低K_d 值。與TFPI KD1(TFPI160之殘基22-79)之錯合物中之JBT0740及JBT1857的模型係藉由使用與關於JBT0303類似之約束進行HADDOCK加以計算：(a)修正JBT0740及JBT1857之殘基4及5之扭轉角的約束以考慮在JBT0303衍生物之位置5處之取代；(b)扭轉角係取自JBT0303之V7、F8、Y12-A18之TALOS的計算值，且與JBT0303相反，不對K4及NmetG5/dP5之φ及Ψ給予固定值；(c)NmetG5及dP5係呈順式構形；(d)KD1之化學位移變化超過1.5 ppm之以下殘基涉及於與JBT0303之結合中：F25、F28、D32、A37、I38、I46、F47、T48、F54及Y56；(e)JBT0303之兩性螺旋之疏水側與KD1結合；(f)JBT0303之Y12或L16或L20與KD1之D32或A37或I38或F54或Y56結合；(g)JBT0303之R15或K19與KD1之D31或D32或E60結合；(h)JBT0303之殘基F8或V9與KD1之F25或F28結合；(i)JBT0303之殘基Y12或F13與KD1之I46或F47或T48結合；及(j)JBT0303之殘基Q2與KD1之Y56結合。

JBT0740及JBT1857之能量最有利之HADDOCK模型說明相較於JBT0303不同的結合模式。最明顯差異在殘基5至11之區域中。在肽之N端及C端處觀測到顯著性較小之偏差。然而，不同之端結合亦可能有助於JBT0303衍生物與TFPI之最佳化結合。

與KD1結合之JBT1857之X射線晶體結構

測定與KD1結合肽JBT1857之錯合物中之KD1的晶體結構。TFPI重組表現於大腸桿菌中且自包涵體氧化再摺疊。在聯接KD1及KD2之TFPI連接子序列內包含凝血酶裂解位點之TFPI胺基酸1-150(TFPI1-150-凝血酶(MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNTFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMC TRDNANRLVPRGS QQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLEECKNIC EDG(SEQ ID NO: 4235)))選殖入大腸桿菌表現載體(pET19b)中。TFPI 1-150-凝血酶序列在N端處包含作為重組表現之人工產物(artifact)且不為野生型TFPI胺基酸序列之一部分的2個胺基酸。編碼庫尼茲域1及2之序列用粗體顯示。大腸桿菌(BL21(DE3)pLysS)在MagicMedia^TM 中培養且TFPI1-150-凝血酶以不溶性包涵體形式表現。藉由與BugBuster Master混合物一起培育來溶解大腸桿菌以收集包涵體且在用50 mM Tris/HCl(pH 8)、0.1%吐溫20洗滌後加以純化。將包涵體溶解於8 M脲、50 mM Tris/HCl(pH 8.0)中且TFPI 1-150-凝血酶在添加20 mM DTT後經還原。藉由快速10倍稀釋入含有50 mM Tris/HCl(pH 10)及1.1 mM經氧化谷胱甘肽之緩衝液中，隨後相對於20 mM Tris/HCl(pH 7)進行過度透析來進行氧化再摺疊。再摺疊之TFPI1-150-凝血酶藉由使用Q Sepharose FF陰離子交換及肽親和力(JBT131)介質進行依序純化方案加以純化。經純化之TFPI1-150-TFPI藉由與凝血酶(每毫克TFPI1-150-凝血酶1U凝血酶，裂解位點：LVPR/GS)一起培育而經蛋白水解消化，從而導致產生N端KD1-凝血酶(MADSEEDEEHTIITDTELPPLKLMHSFCAFKADDGPCKAIMKRFFFNIFTRQCEEFIGGCEGNQNRFESLEECKKMC TRDNANRLVPR (SEQ ID NO: 4236))及KD2-凝血酶(GS QQEKPDFCFLEEDPGICRGYITRYFYNNQTKQCERFKYGGCLGNMNNFETLE ECKNIC EDG(SEQ ID NO: 4237))。N端KD1-凝血酶係依次使用欲移除凝血酶之苯甲脒瓊脂糖、以及JBT131肽親和力管柱而自消化混合物加以純化。經純化之N端KD1-凝血酶用於與JBT1857形成錯合物且進一步進行結晶。

藉由固相合成製備拮抗肽JBT1857。在100 mM MES(pH 6.5)、20% PEG 4000、600 mM NaCl下獲得等莫耳錯合物之成功共結晶。儘管具有一些非缺面形雙晶，但晶體繞射優於2.5解析度。繞射資料用來自CCP4程式包之iMosflm及SCALA處理，從而揭示具有以下單位晶胞大小之單斜晶體形式：a=113.67、b=69.32、c=42.37、α=90.0°、β=92.97°、γ=90.0°、晶格群C2(Leslie,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62(Pt 1),48-57(2006)；Evans,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62(Pt 1),72-82(2006))。自身旋轉計算值指示近似雙重非結晶學對稱性。與此一致，2個分子以170°旋轉相關定位於不對稱單元中。藉由使用程式PHASER及作為搜尋模型之可用庫尼茲域2晶體結構的結構整體進行帕特生(Patterson)搜尋(McCoy等人,J Appl Crystallogr, 40(Pt 4),658-674(2007))。單位晶胞含有約64%溶劑。用Coot、Refmac、MAIN及CNS程式進行非結晶學電子密度平均化及模型構建及模型改進。當前模型對於JBT1857肽之複本及與蛋白質之相互作用兩者而言為完全確定的，當前R=0.257，R自由=0.298，與理想幾何結構之偏差rms(鍵)=0.008、rms(角)=1.8°。

JBT1857結構： JBT1857之結構可區段成(i)由乙醯化Phe1_AP -Gln2_AP 組成之N端錨(anchor)；(ii)包含Ser3_AP -Asn6_AP 之Ω形環；(iii)自Val7_AP 及His8_AP 構建之中間區段；(iv)含有Val9_AP -Gly11_AP 之緊密甘胺酸環；及(v)包含Tyr12_AP -Leu20_AP 之C端α螺旋。如本文所用，下標_AP 指示「拮抗肽(antagonistic peptide)」JBT1857中之序列編號。α螺旋之構形由位於螺旋之中心處(位置17_AP )之非天然α-甲基丙胺酸；完成α螺旋之1-4氫鍵結樣式之C端醯胺；及His8_AP 、Tyr12_AP 及Phe13_AP 之芳族側鏈形成之堆疊叢集加以穩定。此等作用協作以自發穩定溶液中之C端α螺旋，與肽之圓二色性資料一致。觀測之芳族側鏈堆疊(His8_AP 、Tyr12_AP 、Phe13_AP )強制產生僅可由位置11_AP 處之甘胺酸達成之緊密轉角(tight turn)。此結構約束由在用任何其他胺基酸置換Gly11_AP 後結合親和力顯著損失來反映。N端環區段之構形由已知會誘導緊密轉角構形之D-脯胺酸、及由Ser3_AP 之羰基氧與Asn6_AP 之醯胺氮形成之1-4氫鍵部分穩定。所有環側鏈(Tyr1AP、Pro5AP、His8AP、Tyr12AP、Phe13AP)點皆朝向同一方向，使其能夠與TFPI之KD1域相互作用。

JBT1857與KD1之相互作用： 測定JBT1857與KD1之間的相互作用。疏水性接觸為分子間距離4之相互作用，而氫鍵具有介於2.6-3.2之間的距離。Phel_AP 與TFPI非特異性相互作用，從而與Phe2及Ala27接觸。相反，Gln2_AP 接觸TFPI之深埋袋且與Phe28、Lys29、Ile46及Phe47進行疏水性相互作用。此外，Gln2_AP 之醯胺基與Phe28-CO、Phe44-CO及Ile46-NH形成H鍵。JBT1857之包含Ser3_AP -Asn6_AP 之Ω環介導而非限制與蛋白質之疏水性相互作用；Ser3_AP 、Pro5_AP 及Asn6_AP 與Lys29及Phe47相互作用。JBT1857之中間區段之Va17AP亦與Lys29及Phe47結合。His8_AP 主要促使與Tyr12_AP 及部分與Phe13_AP 之分子內芳族堆疊相互作用，且展現與TFPI之Ala30之疏水性相互作用。類似地，甘胺酸環Va19_AP -Gly11_AP 促使與庫尼茲域之少數接觸。Va19_AP 藉由與Ala30之羰基形成氫鍵及與Asp32之疏水性相互作用而直接與KD1相互作用。Tyr12_AP 介導經由其羥基與Ile55之醯胺氮形成之氫鍵及與Asp30之疏水性相互作用。Leu16_AP 為與Ile55之疏水性接觸之一部分。除肽之C端螺旋與蛋白質之大部分疏水性相互作用之外，在Arg15_AP 與Asp32之間亦有靜電相互作用。此外，Lys19_AP 藉由與Ala37之羰基形成氫鍵而有助於與TFPI結合且與Lys36及Ile38接觸。TFPI接觸表面具有包含一些圖示熱點(hot spot)之總體疏水性特性，且與JBT1857形成錯合物之驅動力為立體表面互補性。

此實施例描述本發明之例示性肽之二級結構的特性化且將結構與肽之抑制功能關聯。該實施例亦鑑別與JBT1857(一種抑制TFPI活性之TFPI結合肽)相互作用之TFPI胺基酸殘基。

實施例8

以下實施例描述藉由添加會增強肽之物理化學或藥物動力學性質之部分而修飾的其他TFPI結合肽。該實施例另外描述一種使用旋轉血栓彈性描記術(thromboelastography)評估全血中凝塊形成之方法。

JBT1857(JBT0047肽家族)與不同PEG部分結合，且檢查聚乙二醇化肽之結合親和力及TFPI抑制活性。JBT1857藉由添加C端半胱胺酸而經修飾以產生JBT2315(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKLC-NH2(SEQ ID NO: 4077))，使用實施例5中描述之方法使JBT2315在C端處與具有以下遞增大小之線性順丁烯二醯亞胺PEG部分結合：5 kD、12 kD、20 kD、30 kD及40 kD。所得聚乙二醇化肽如下所示：

聚乙二醇化肽之穩定性、結合親和力及TFPI抑制活性

聚乙二醇化肽在小鼠及人類血漿中顯示顯著增加之血漿穩定性。添加肽至小鼠或人類血漿之樣本中，且在添加之後24小時剩餘在血漿中之肽之初始量的百分比藉由在經0.05 mg/ml TFPI塗鋪之Maxisorp板上進行IC₅₀ ELISA(2.26 nM示蹤肽JBT2271)加以量測。小於約10%初始量之JBT1857及JBT2317剩餘在血漿中，而在24小時之後剩餘有40%或40%以上初始量之聚乙二醇化TFPI結合肽。偵測到約60%或60%以上之JBT2327及JBT2329。相較於未經修飾之肽，聚乙二醇化肽在人類血漿中亦顯著更穩定。在24小時之後剩餘有約60%或60%以上之聚乙二醇化肽。未經修飾之肽在人類血漿中比在小鼠血漿中更穩定；在培育24小時之後，剩餘有約20%或20%以上之初始量。

亦在實施例1-4中描述之檢定中對聚乙二醇化肽進行特性化且與JBT1857進行比較。代表性結果提供於以下闡述之表13中。如實施例4中所述進行凝血酶產生檢定，且結果以對應於改良峰值凝血酶(nM)半數最大之肽濃度的EC₅₀ 提供。

相較於JBT1857，添加用NEM阻斷之C端半胱胺酸不顯著影響FXa抑制、外在因子X酶檢定或凝血酶產生檢定中JBT2317之結合親和力或肽之活性。PEG大小不顯著影響TFPI結合肽恢復在TFPI-1存在下之FXa活性的能力。在實施例3之外在因子X酶檢定中，抑制活性隨PEG部分之分子量增大而增加(直至20 kD PEG)。對於30 kD或40 kD PEG部分，活性不進一步改良。在使用人類血漿之實施例4的凝血酶產生檢定中，EC₅₀ 隨PEG大小而減小，且TFPI之最大抑制(如藉由峰值FIIa(nM)所量度)隨PEG大小而增加。在小鼠血漿中，40 kD PEG與TFPI結合肽之連接增加TFPI之最大抑制。

聚乙二醇化TFPI結合肽恢復用於將FX轉化成FXa之外在因子X酶錯合物活性的能力亦使用利用實施例5之方法進行之基於細胞的外在因子X酶檢定確定。相較於JBT1857，添加用NEM阻斷之C端半胱胺酸不顯著影響JBT2317在基於細胞之外在因子X酶檢定中的活性。PEG部分(5kD、20kD、30kD或40kD)與JBT2317結合使TFPI抑制活性增加5-20%。

旋轉血栓彈性描記術

藉由在存在或不存在肽下用全血製備物進行旋轉血栓彈性描記術來進行人類全血凝塊形成及堅實度(firmness)的連續黏彈性評估。將來自健康個體之血液樣本吸入含檸檬酸鹽之Sarstedt Mono S(0.106 M或3.2%(w/v)檸檬酸鈉)(5 ml)中，混合1份檸檬酸鹽與9份血液，使用第21號蝴蝶針(butterfly needle)。一部分血液樣本與添加後獲得51 BU/mL之於山羊中產生之高效價熱不活化抗人類FVIII抗血清(3876 BU/ml；Baxter BioScience,Vienna,Austria)一起培育。測試樣本藉由溶解大量肽於DMSO或HEPES緩衝鹽水(有或無0.1%吐溫80)中製備。

在37℃下使用ROTEM血栓彈性描記凝血分析器(Pentapharm,Munich,Germany)進行記錄。簡而言之，添加血液至於經加熱之比色管固持器中之拋棄式比色管中。拋棄式插腳(感測器)固定於旋轉軸頂端。軸由高精度球軸承系統引導且往返旋轉。軸與用於量測彈性之彈簧連接。軸之精確位置由光在於軸上之小鏡上之反射偵測。當樣本凝結時，彈性損失導致軸之旋轉發生變化。所得資料經電腦分析且於凝血彈性描記圖中加以觀測。凝血彈性描記圖顯示相對於時間(s)之彈性(mm)。在開始形成凝塊之前，觀測到彈性為約0。在零線以上及以下之鏡像跡線指示凝塊形成對軸之旋轉之影響。

在開始各實驗之前，含檸檬酸鹽之全血與玉米胰蛋白酶抑制劑(CTI)(Hematologic Technologies公司,Essex Junction,VT,USA)混合(從而提供用於特異性抑制FXIIa最終濃度62 μg/mL)以抑制FXIIa介導之接觸活化。分析方案如下：向20 μL測試樣本或對照中添加300 μL預加溫(37℃)之經CTI處理之含檸檬酸鹽的全血，隨後添加20 μL含有重組人類組織因子(rTF，3 pM)(TS40,Thrombinoscope BV,Maastricht,The Netherlands)之TF PRP試劑的1:15稀釋液。凝血藉由添加20 μL 200 mM CaCl₃ (star-TEM，Pentapharm,Munich,Germany)起始且允許進行記錄至少120分鐘。檢定中之rTF之最終濃度為11或44 fM。

根據製造商說明書記錄血栓彈性描記參數凝血時間(CT)、凝塊形成時間(CFT)及最大凝塊堅實度(MCF)。CT定義為自開始量測至開始形成凝塊之時間。CFT定義為自開始形成凝塊直至達到20 mm之振幅之時間。MCF為檢定期間兩個跡線之間的最大振幅差異。繪製凝血彈性描記圖之資料之一階導數以獲得速度(mm/s)相對於時間(s)之圖。根據此圖，確定最大速度(maxV)。亦確定獲得最大速度之時間(maxV-t)。

例示性結果說明於圖56及57中。JBT1857及JBT2317恢復HemA血液中之凝血參數。聚乙二醇化(40 kD)TFPI結合肽JBT2329亦恢復Hem A血液中之延長之凝血的參數，如圖57中所說明。JBT2317之聚乙二醇化降低凝結時間及凝塊形成時間。

爪甲修剪研究

亦研究JBT2329對純原始小鼠中失血之影響。在爪甲修剪之前30分鐘，以10 ml/kg向C57BL6小鼠靜脈內投予媒劑、1 mg/kg JBT2329、或0.1 mg/kg JBT2329(N=各組19或20)。在爪甲修剪之前10分鐘用80 mg/kg戊巴比妥(腹膜內(i.p.))使動物麻醉。在時間=0分鐘時，切割右後爪之小趾之就在爪床(nail bed)之前的爪甲。爪轉移至用0.9% NaCl溶液預填充之小瓶中。在爪甲修剪之後之前30分鐘及此後接著30分鐘期間收集血液樣本用於分析，且計算並比較各組之平均收集體積。經媒劑處理之小鼠中之平均失血為歷時前30分鐘約30.5 μl，歷時第二30分鐘時期52.1 μl，從而導致歷時60分鐘失血約82.6 μl。相反，投予0.1 mg/kg JBT2329使失血降低歷時前30分鐘約50%(16.0 μl)及歷時第二30分鐘時期約64%(18.7 μl)，從而導致相較於經媒劑處理之小鼠，歷時60分鐘總失血降低約60%(34.7 μl)。增加JBT2329之劑量至1.0 mg/kg進一步使失血降低至少約10%；歷時前30分鐘收集12.2 μl，歷時第二30分鐘時期收集10.6 μl，從而導致歷時整個60分鐘收集時期收集22.8 μl。相較於經媒劑處理之純原始小鼠，當皮下投予時，JBT2329亦有效降低出血；相較於經媒劑處理之個體，皮下注射10 mg/kg JBT2329使爪甲修剪之後60分鐘期間之失血降低約58%。

上述結果係使用包含線性PEG部分與肽之C端連接之JBT1857衍生物及在N端處包含PEG部分之JBT1586衍生物產生。亦產生包含替代結合位點或替代化學部分之肽。40 kD線性PEG部分與JBT1857之殘基14結合以產生JBT2404。JBT2329之線性40 kD PEG部分經40 kD分支PEG部分置換以產生JBT2401。JBT1857亦經修飾以在C端處包含K(Ttds-順丁烯二醯亞胺基丙醯基)(JBT2374)。JBT2374用於產生JBT2410，即JBT2374之一種HSA結合物。JBT2375，即JBT1857之包含K(AOA)之衍生物，用於將PSA醛與肽JBT1857偶合，從而產生JBT2430。使用上述檢定對JBT2401、JBT2404、JBT2410及JBT2430進行特性化。代表性結果概述於表14中：

此實施例證明本發明之例示性TFPI結合肽JBT1857為TFPI之強力抑制劑且可經官能基化並與PEG結合而不損失活性。聚乙二醇化使若干功能檢定中之TFPI抑制活性增加。驚人地，與較高重量PEG部分結合之肽顯示增強之TFPI抑制活性。包含40 kD線性PEG部分之JBT2329顯著降低臨床相關動物模型中之失血。在JBT1857之胺基酸序列內之PEG結合、分支PEG部分之使用、及HSA與PSA之連接不破壞肽之活性。

實施例9

以下實施例描述本發明之兩種TFPI結合肽JBT1837及JBT1857之特性化。JBT1837(Ac-SYYKWH[CAMRDMKGTMTC]VWVKF-NH)(SEQ ID NO: 1044)為JBT0120家族之結合TFPI之KD1及KD2的環狀肽。JBT1857(Ac-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2)(SEQ ID NO: 178)為JBT0047家族之結合TFPI之KD1的線性肽。使用實施例1-4中描述之檢定來檢查JBT1837及JBT1857之親和力及TFPI抑制活性，其結果概述於表15中。

經由BiaCore量測之肽與人類TFPI之親和力小於-1 nM。JBT1837及JBT1857之藉由ELISA量測之親和力(IC₅₀ )分別為4.8 nM及2.5 nM。JBT1837自人類TFPI之解離比JBT1857更緩慢(亦即相較於JBT1857，JBT1837持續較長時期保持與人類TFPI結合)。使用全長人類TFPI(「f1TFPI」)與截短人類TFPI(254個胺基酸「R&D TFPI」)兩者進行FXa抑制檢定(0.1 nM FXa，0.5 nM TFPI，0.25% DMSO)。在0.5 nM TFPI下，截短TFPI之活性由JBT1837與JBT1857兩者完全抑制，而全長TFPI由JBT1857及JBT1837分別抑制85%及95%。在較高濃度之f1TFPI(例如10 nM f1TFPI)下，JBT1837完全抑制TFPI活性，而JBT1857部分抑制TFPI活性。當f1TFPI用於FXa抑制研究中時，EC₅₀ 亦較高。

在外在因子X酶檢定中，約85%之截短TFPI由兩種肽抑制。全長TFPI活性由JBT1837及JBT1857分別抑制約56%及48%。驚人地，在基於細胞之外在因子X酶檢定中，JBT1837抑制細胞相關之TFPI活性約50%，而JBT1857幾乎完全抑制細胞結合之TFPI之活性。在基於血漿之功能檢定中，JBT1837在人類FVIII受抑制之血漿及FIX不足之血漿中比JBT1857更有效抑制TFPI。JBT1837修正實施例8中描述之ROTEM檢定中FVIII受抑制之血液中的凝血參數JBT1857亦正面影響凝血參數，但在檢定中表現之有效性低於JBT1837。

此實施例比較靶向TFPI蛋白之不同區域之環狀及線性TFPI結合肽的親和力及TFPI抑制活性。JBT1837(屬於家族JBT0120之環狀肽)及JBT1857(屬於家族JBT0047之線性肽)以小於1 nM之親和力有效結合人類TFPI且為強力抑制劑。在低TFPI濃度下，FXa-TFPI相互作用完全由兩種肽阻斷，而在較高濃度之TFPI存在下，JBT1857對TFPI之抑制降低。兩種肽均部分抑制外在因子X酶檢定中之全長TFPI的活性，且相較於JBT1837，JBT1857在較大程度上抑制基於細胞之外在因子X酶檢定中之TFPI活性。相較於JBT1857，JBT1837在FVIII不足之血漿中更有效抑制TFPI。兩種肽均藉由降低凝結時間來改良FVIII受抑制之人類全血之凝血參數，而相較於JBT1837，JBT1857在較小程度上改良凝塊形成速度。

實施例10

此實施例說明本發明之TFPI結合肽在臨床相關動物模型中之活體內活性。如下所述，當以FVIII及 FIX之次最佳劑量時，例示性TFPI結合肽顯著降低動物中之失血。

在基因剔除小鼠及FIX基因剔除小鼠中，在尾尖出血模型中測試與人類及鼠類TFPI交叉反應之JBT2329，一種聚乙二醇化(40 kD)TFPI結合肽(JBT0047家族)。FVIII基因剔除小鼠密切反映A型血友病患者之病狀，且尾尖出血模型廣泛用於藉由量測例如出血時間、失血或存活來評估藥物功效之研究中。ADVATE，一種市售rFVIII，充當參照，且經ADVATE緩衝液處理之動物充當陰性對照。各組皆含有16個FVIII基因剔除小鼠(8個雌性+8個雄性)。在切割尾尖之前30分鐘投予JBT2329(1 mg/kg或0.1 mg/kg)或抗TFPI抗體(maTFPI；18 mg/kg)。在切除尾部之前5分鐘投予ADVATE(10 IU/kg或50 IU mg/kg)或ADVATE緩衝液。經由側尾靜脈注射以靜脈團注形式投予測試及對照物質。藉由腹膜內注射100 mg/kg氯胺酮及10 mg/kg甲苯噻使動物麻醉。約10分鐘後，切除2 mm尾尖。將尾尖置放於溫熱鹽水(約37℃)中且歷時60分鐘之觀測期收集血液。以重量分析方式測定血液之量。在60分鐘之觀測期結束時，動物在自麻醉恢復之前藉由頸椎脫位術(cervical dislocation)人道殺死。

經緩衝液處理之動物中之中值總失血為930 mg。經鼠類抗TFPI抗體(maTFPI)處理之個體中之中值總失血為724 mg。當與ADVATE一起向個體投予maTFPI時，中值總失血之降低更明顯。maTFPI+10 IU/kg ADVATE之組合導致136 mg之中值總失血，經maTFPI+50 IU/kg ADVATE處理之動物經歷13 mg之中值總失血。經單獨10或50 IU/kg ADVATE處理之動物之中值失血分別經歷798及364 mg之中值失血。對於maTFPI+50 IU/kg ADVATE相對於50 IU/kgADVATE而言，maTFPI+ADVATE之組合處理超越單獨ADVATE之優越性以統計方式顯示(p=0.0010)。儘管不為統計學上顯著優越的，但經maTFPI+10 IU/kg ADVATE處理之動物中之失血有區別地低於經單獨10 IU/kg ADVATE處理之動物中之失血。

展示以1 mg/kg與10及50 IU/kg ADVATE組合給藥以及以0.1 mg/kg與50 IU/kg ADVATE組合給藥之JBT2329之功效，即定義為超越2.5%含量下之緩衝液之統計顯著優越性(p<0.0004)。經JBT2329與ADVATE之組合處理之動物展示失血之臨床相關降低，但結果不統計顯著(p0.0506)。在不存在ADVATE下投予1 mg/kg JBT2329不會使中值總失血降低超過經緩衝液處理之動物中觀測到的中值總失血(930 mg)。

亦在FIX基因剔除尾尖出血小鼠模型中測試JBT2329，該模型為B型血友病人類患者之一種臨床相關模型。方法實質上類似於以上關於FVIII基因剔除模型所述之方法。替代ADVATE，重組FIX(rFIX)充當參照。經緩衝液處理之動物中之中值總失血為935 mg。經鼠類抗TFPI抗體(maTFPI)處理之動物中之中值總失血為774 mg。當動物接受maTFPI與rFIX之組合治療時，中值總失血進一步降低。maTFPI+10 IU/kg rFIX之組合導致25 mg之中值總失血，而經maTFPI+50 IU/kg rFIX處理之動物展現10 mg之中值總失血。經單獨10或25 IU/kg rFIX處理之動物之中值失血分別經歷888及774 mg之中值失血。

展示當以1 mg/kg與10 IU/kg rFIX組合給藥以及以0.1mg/kg與10 IU/kg rFIX組合給藥時JBT2329之功效，即定義為超越2.5%含量下之緩衝液之統計顯著優越性。觀測到JBT2329與rFIX組合超越單獨投予rFIX之優越性(p<0.0172)，而相較於經緩衝液處理之動物，用單獨1 mg/kg JBT2329處理不導致中值總失血顯著降低(p=0.321)。

總而言之，在所有經測試之劑量下，當與次最佳劑量之FVIII及rFIX共投予時，JBT2329促進失血之臨床相關降低。此外，靜脈內投予JBT2329在跨越所有處理組之所有個體中皆耐受良好而無任何急性毒性徵象。

實施例11

本文所述之TFPI結合肽適於偵測樣本，諸如生物樣本中之TFPI。此實施例描述一種使用本發明之肽在ELISA樣檢定形式中偵測TFPI之方法。

JBT1857之肽序列係藉由添加生物素基-Ttds部分而經N端修飾以產生JBT2271(生物素基-Ttds-FQSKpNVHVDGYFERL-Aib-AKL-NH2(SEQ ID NO: 4033))。在室溫下，96孔微量滴定板(Maxisorp,Nunc)經每孔50 μl含有一定範圍之TFPI濃度(0-3 μg/ml，人類重組TFPI，R&D Systems)之塗鋪緩衝液(15 mM Na₂ CO₃ ，35 mM NaHCO₃ ，pH 9.3)塗鋪1小時。板用每孔350 μl洗滌緩衝液(175 mM NaCl，5mM CaCl₂ ，25 mM HEPES，0.1%吐溫80，pH 7.35)洗滌3次。板接著在室溫下用100 μl阻斷緩衝液(2%酵母抽提物，175 mM NaCl，5 mM CaCl₂ ，25 mM HEPES，0.1%吐溫80，pH 7.35)阻斷1小時。板接著用350 μl洗滌緩衝液洗滌3次。添加50 μl含不同濃度JBT2271之洗滌緩衝液溶液(100-0 nM)至各孔中。將板培育1小時且用350 μl洗滌緩衝液洗滌3次。向各孔中添加50 μl抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶結合物(R&D Systems,1:200於洗滌緩衝液中)。在室溫下培育1小時之時期之後，板用洗滌緩衝液洗滌3次。添加50 μl TMB溶液(SeramunBlau fast,Seramun)至各孔中。在室溫下培育1.5分鐘之後，藉由添加每孔50 μl 1 M H₂ SO₄ 來終止反應。在450及620 nm下，在光度計(Molecular Devices Spectramax M5)中量測吸光度。

JBT2271允許偵測每孔少至4.1×10^-14 莫耳之TFPI。上述檢定之結果說明本發明之肽為鑑別及/或定量樣本中之TFPI之強力工具。

實施例12

此實施例描述用於特性化TFPI結合肽之例示性k_off 檢定的條件。

在室溫下，微量滴定板(96孔，Maxisorp,Nunc)之各孔經含1.6 nM TFPI之塗鋪緩衝液(15 mM Na₂ CO₃ ，35 mM NaHCO₃ ，pH 9.3)塗鋪2小時。板接著用350 μl洗滌緩衝液(175 mM NaCl，5mM CaCl₂ ，25 mM HEPES，0.1%吐溫80，pH 7.35)洗滌3次，且各孔用100 μl阻斷緩衝液(2% 酵母抽提物，175 mMNaCl，5mM CaCl₂ ，25mM HEPES，0.1%吐溫80，pH7.35)阻斷。若採用24小時之培育期，則各孔經阻斷至少1小時。用於15分鐘培育期之對照孔再經阻斷23.5小時。

在24小時培育期中，各孔用350 μl洗滌緩衝液洗滌3次且與50 μl含測試肽之洗滌緩衝液一起培育。測試肽之濃度視於例如本文所述之TFPI IC₅₀ ELISA檢定中確定之個別IC₉₀ 濃度而定。經TFPI塗鋪之各孔暴露於測試肽中約15分鐘。各孔隨後用350 μl洗滌緩衝液洗滌3次且添加50 μl示蹤肽(競爭劑)。一種例示性示蹤肽為JBT2271(1.13 nM於洗滌緩衝液中)。對照孔(最大信號)僅與示蹤劑一起培育。缺乏TFPI之空白孔僅與示蹤劑一起培育。示蹤肽之添加使24小時培育期開始。

若測試肽之IC₉₀ 濃度導致最大信號降低90%，則採用15分鐘培育期作為對照。再阻斷23.5小時之各孔用350 μl洗滌緩衝液洗滌3次以移除阻斷緩衝液。隨後，添加50 μl含分析物之洗滌緩衝液且培育各孔15分鐘。所用測試肽之濃度視使用例如TFPI IC₅₀ ELISA檢定確定之肽之IC₉₀ 濃度而定。在培育15分鐘後，用350 μl洗滌緩衝液洗滌3次且添加50 μl示蹤肽。對照孔(最大信號)僅與示蹤劑一起培育。缺乏TFPI之空白孔亦僅與示蹤劑一起培育。

板用350 μl洗滌緩衝液洗滌3次，且添加50 μl抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶結合物(R&D Systems，1:200於洗滌緩衝液中)至各孔中。在室溫下培育1小時之時期之後，板用洗滌緩衝液洗滌3次。添加TMB溶液(每孔50 μl；SeramunBlau fast,Seramun)。在室溫下培育1.5分鐘之後，藉由添加每孔50 μl 1 M H₂ SO₄ 來終止反應。在450及620 nm下，使用光度計(Spectramax M5，Molecular Devices)量測吸光度。檢定結果呈現為暴露於測試肽及示蹤肽中之各孔相對於僅暴露於示蹤劑中之經TFPI塗鋪之各孔的修正光密度(OD450-OD620)之百分比。

實施例13

TFPI藉由經由庫尼茲域1(KD1)與FVIIa結合來抑制FVIIa/TF活性。此實施例描述一種評估TFPI結合肽對FVIIa/TF之TFPI抑制之影響的例示性方法。

在25℃下在96孔微量滴定板中於25 mM HEPES、175 mM NaCl、5 mM CaCl₂ 、0.1% BSA(pH 7.3)中進行動力學量測。混合最終濃度分別為100 nM及5 nM之20 μl可溶性組織因子(殘基33-251；Creative Biomart)及20 μlFVIIa(ERL)且培育15分鐘。添加20 μl最終濃度變化(0-2 μM)之TFPI結合肽至混合物中且再培育15分鐘。為了量測FVIIa/sTF錯合物之殘餘活性，反應混合物與20 μl TFPI(200 nM)一起培育60分鐘。反應藉由添加顯色受質Chromozym-tPA(Roche)(1 mM)起始。藉由使用Labsystems iEMS ELISA讀取器持續30分鐘監測405 nm下之吸光度變化。在不存在TFPI下量測之FVIIa/sTF活性視為在檢定之情形下之「100%活性(100% activity)」。藉由繪製肽濃度相對於殘餘活性之關係圖來確定EC₅₀ 值。

相對於TFPI160、TFPI1-150-凝血酶、NTermKD1、KD1及KD2(陰性對照)篩檢JBT1857及JBT1837。JBT1857顯示對TFPI160、TFPI1-150-凝血酶、NTermKD1及KD1之EC₅₀ 為約0.21-0.23 μM。結合KD1及KD2之JBT1837顯示對TFPI160及TFPI1-150-凝血酶之EC₅₀ 為約0.17-0.19 μM，而在涉及NTermKD1及KD1之檢定中之活性約為背景值。

上述結果證明TFPI結合肽有效抑制TFPI-FVIIa/TF相互作用。JBT1857有效抑制含有KD1作為最小功能實體之TFPI片段。因此，此酶促檢定證實將JBT1857之結合位點置放在KD1內之X射線結晶學資料。JBT1837抑制含有前2個庫尼茲域之TFPI片段，表明JBT1837結合位點位於TFPI之KD1-連接子-KD2區內。庫尼茲域與凝血酶裂解之TFPI之片段(1-150)的組合不恢復顯色檢定中JBT1837之抑制活性。本文所述之酶促檢定為適用於偵測TFPI結合肽(或測試化合物)與TFPI結合之代用物，且適用於檢查TFPI結合化合物之TFPI抑制效應。

實施例14

此實施例描述PEG及HSA結合對例示性TFPI結合肽之活體內影響。

在藥物動力學分析中，C57B16小鼠用與不同分子量PEG及HSA結合之各種TFPI結合肽處理。肽-PEG及肽-HSA結合物之劑量校正至1 mg/kg(肽含量)。校正保證不同分子量之結合物之間的可比較性。將肽結合物溶解於175 mM NaCl、25 mM HEPES(pH 7.35)中且經由尾靜脈靜脈內或在頸區中皮下投予。在投藥之後若干時間點時自3個動物(後延髓)獲取血液抽取物且收集在肝素化小瓶中。離心樣本，且藉由ELISA對血漿中之肽-結合物含量進行定量。

圖63說明在投藥之後在若干時間點時於血漿中偵測之聚乙二醇化TFPI肽的濃度，且表16提供關於JBT2325-JBT2329、JBT2401、JBT2404及JBT2410之終末半衰期及生體可用性之詳細資訊。

JBT2329、JBT2401及JBT2404為與40 kDa線性PEG(JBT2329及JBT2404)或40 kDa分支PEG(JBT2401)結合之肽。相較於與較小PEG結合之肽，在靜脈內投藥之後，40 kDa結合物展現較長終末半衰期(HL_λ_z)。由皮下投予肽產生之濃度-時間曲線之曲線下面積(AUC)與在靜脈內投藥之後產生之AUC進行比較以計算肽之生體可用性。結果展示於表16中。資料證明TFPI結合肽與較高分子量分子之結合提供超過30%之皮下生體可用性。

圖64A-C說明由向小鼠皮下及靜脈內投予肽所產生之JBT2401、JBT2404及JBT2410的藥物動力學特徵。JBT2404包含與在關於式(XI)之位置X4014中之半胱胺酸結合的PEG。JBT2401包含分支PEG，且JBT2410與HSA結合。圖64A證明較高分子量分子與TFPI結合肽在內部位置處融合會增加半衰期。若使用相較於具有較小大小之PEG之結合物(例如JBT2325)或自由肽，使JBT2410之活體內半衰期增加(參見圖31)的分支PEG(JBT2401)及HSA，則半衰期亦增加。

此實施例說明本文所述之各種肽之活體內性質可藉由與較高分子量分子(如PEG)及/或nFcR配位體(如HSA)結合而加以改良。

圖1為凝血級聯之圖解。

圖2為組織因子路徑抑制劑-1之二級結構之圖解。

圖3為包含組織因子、因子Xa(FXa)、因子VIIa(FVIIa)及TFPI之四級錯合物之形成的圖解。

圖4為各種TFPI抑制肽之胺基酸序列列表，其以肽JBT0293為參照指出胺基酸取代(粗體且加下劃線)。

圖5為TFPI抑制肽之mRNA呈現選擇的圖解。

圖6A為EC₅₀ 結合ELISA之圖解且圖6B為實施例1中所述之IC₅₀ ELISA的圖解。

圖7為經生物素標記之肽JBT0132之結合ELISA曲線，其比較OD%(y軸)與濃度[nM](x軸)。

圖8A-8D為本發明之例示性肽之競爭ELISA曲線，其比較OD%(y軸)與濃度[nM](x軸)。

圖9A及9B為肽JBT0120及JBT0132之感測器圖譜，其繪示RU(y軸)與時間(以秒計)(x軸)之關係。

圖10A及10B為肽JBT0120與組織因子路徑抑制劑-1及組織因子路徑抑制劑-2之相互作用的感測器圖譜，其繪示RU(y軸)與時間(以秒計)(x軸)之關係。

圖11A及11B為比較基於血漿之檢定中肽JBT0120及肽JBT0132之所產生凝血酶量(nM)(y軸)與時間(以分鐘計)(x軸)的圖。

圖12-18為列出各種TFPI抑制肽之胺基酸序列、FXa抑制檢定中觀測之EC₅₀ 及TFPI之抑制百分比、外在因子X酶抑制檢定中觀測之EC₅₀ 及TFPI之抑制百分比、以及基於血漿之檢定中之FEIBA、因子VIII(FVIII)Immunate或因子IX(FIX)等效活性(mU/mL)的表。「*」表示陰性對照。

圖19-21為列出關於若干TFPI結合肽之BIAcore分析結果的表。「*」表示陰性對照。

圖22-30為列出各種TFPI結合肽之胺基酸序列、FXa抑制檢定中觀測之EC₅₀ 及TFPI之抑制百分比、外在因子X酶抑制檢定中觀測之EC₅₀ 及TFPI之抑制百分比、以及基於血漿之檢定中之FEIBA、FVIII Immunate或FIX等效活性(mU/mL)的表。「*」表示陰性對照。

圖31為比較聚乙二醇化TFPI結合肽之藥物動力學特性(肽之濃度(y軸)對比投藥後之時間(x軸))與缺乏PEG之相同肽之藥物動力學特性的圖。以10 mg/kg之劑量向C57B16小鼠靜脈內投予該等肽。分析3個生物樣本中在各時間點時之肽之存在。

圖32-39為列出本發明之各種肽之胺基酸序列及IC₅₀ 或EC₅₀ 值的表。「*」表示陰性對照。

圖40為說明在以10 mg/kg之劑量向小鼠皮下投藥之後，聚乙二醇化TFPI結合肽之藥物動力學特性(肽之濃度(nM)(y軸)對比投藥後之時間(分鐘)(x軸))的圖。

圖41為顯示肽JBT1855在A型血友病患者血漿之基於血漿之檢定中的所產生凝血酶量(nM)(y軸)與時間(分鐘)(x軸)之關係的圖。

圖42為說明經JBT-1855(靜脈內或皮下投藥)、抗TFPI抗體(靜脈內投藥)或媒劑(靜脈內投藥)(x軸)處理之小鼠中在爪甲修剪之後觀測之失血量(μl：y軸)的圖。

圖43為繪示TFPI160胺基酸殘基(x軸)與自由TFPI160及與JBT0303結合之TFPI160之HSQC信號的化學位移差異(y軸)之關係的圖。

圖44為TFPI之二級結構之帶狀模型，其說明相較於未錯合(自由)之TFPI160，當TFPI160與JBT0303錯合時，HSQC信號之化學位移變化的區域。

圖45為繪示TFPI160胺基酸殘基(x軸)與自由TFPI160及與JBT0122結合之TFPI160之HSQC信號的化學位移差異(y軸)之關係的圖。

圖46為TFPI蛋白之二級結構之帶狀模型，其說明相較於未錯合(自由)之TFPI160，當TFPI160與JBT0122錯合時，HSQC信號之化學位移變化的區域。

圖47為列出JBT0788之羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、醯胺質子(H)及醯胺氮(N)基於HSQC、HNCACB、HNCA、HNCO及HNN光譜之賦值的表。

圖48為自由JBT0788之二級結構之帶狀模型。

圖49為列出與TFPI160錯合之JBT0788之羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、醯胺質子(H)及醯胺氮(N)基於HSQC、HNCACB、HNCA、HCCOCA及HNCO光譜之賦值的表。

圖50為JBT0788當與TFPI160錯合時之二級結構之帶狀模型。

圖51為列出JBT0616之羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、醯胺質子(H)及醯胺氮(N)基於HSQC、HNCACB及HNN光譜之賦值的表。

圖52為自由JBT0616之二級結構之帶狀模型。

圖53為列出與TFPI錯合之JBT0616之羰基碳(C)、α碳(CA)、β碳(CB)、醯胺質子(H)及醯胺氮(N)基於HSQC、HNCO、HNCA及 HNCOCA光譜之賦值的表。

圖54為JBT0616當與TFPI160錯合時之二級結構之帶狀模型。

圖55為與JBT0303之錯合物中之KD1(殘基22-79)的能量最小化最佳模型之帶狀結構，其中經提出驅動蛋白質-蛋白質相互作用之殘基以棒形式顯示。用斜體表示且加下劃線之殘基屬於JBT0303；其餘殘基屬於TFPI之KD1。

圖56為顯示JBT2317之樣本彈性(mm)與時間(秒(s))之關係的旋轉凝血彈性描記圖(rotational thromboelastogram)。

圖57為顯示JBT2329之樣本彈性(mm)與時間(秒(s))之關係的旋轉凝血彈性描記圖。

圖58為計算裝置之圖解。

圖59為KD1蛋白之三維(3D)模型之圖解。

圖60為TFPI結合肽之3D模型之圖解。

圖61為模型化蛋白質與肽之相互作用之方法的圖解。

圖62為列出本發明之各種肽之胺基酸序列及IC₅₀ 或EC₅₀ 值的表。符號「n.a.」為「未分析出(not analyzed)」。使用實施例3中所描述之FXa抑制檢定以及重組人類全長TFPI獲得進展曲線資料。進展曲線檢定之檢定濃度為0.0025%(於肽稀釋緩衝液中使用之0.1%吐溫80)。

圖63為顯示肽JBT2325-JBT2329之濃度(nM)(y軸)與靜脈內投藥後之時間(小時)(x軸)之關係的圖。包含較高重量PEG部分之肽在小鼠中展現延長之活體內半衰期。各時間點皆由藉由ELISA定量之3個獨立樣本之平均值表示。

圖64A-64C為顯示肽JBT2401、JBT2404及JBT2410之濃度(nM)(y軸)與靜脈內投藥後之時間(小時)(x軸)之關係的圖。各時間點皆由藉由ELISA定量之3個獨立樣本之平均值表示。實心圓圈代表靜脈內資料，實心三角代表皮下資料。

圖65為列出本發明之各種肽之胺基酸序列的表。

Claims

一種結合TFPI之肽，其包含式(XI)結構：X4001-Q-X4003-X4004-X4005-X4006-X4007-X4008-X4009-X4010-X4011-X4012-X4013-X4014-R-X4016-X4017-X4018-X4019-X4020(XI)，其中X4001為F；其中X4003為S；其中X4004為K；其中X4005為p；其中X4006為N或S；其中X4007為V；其中X4008為H；其中X4009為Tle；其中X4010為D；其中X4011為a或G；其中X4012為Y；其中X4013為F；其中X4014為E；其中X4016為L或Hle；其中X4017為選自由以下者所組成之群組之胺基酸：Aib、Hle、Deg、Eca及Aic；其中X4018為A；其中X4019為K；且其中X4020為L。
如申請專利範圍第1項之肽，其中該肽由選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列組成：SEQ ID NO：4133、4137、4153-4155及4158。
如申請專利範圍第1或2項之肽，其進一步包含與X4001連接且選自由以下者所組成的群組的N端胺基酸及/或部分：FAM-Ttds、PE、Palm、2-苯基乙醯基、3-苯基丙醯基、2-(萘-2-基(naphtha-2-yl))乙醯基、己醯基、2-甲基丙醯基、3-甲基丁醯基、2-萘基磺醯基及1-萘基磺醯基。
如申請專利範圍第1或2項之肽，其進一步包含與X4020連接的X4021，其中X4021包含選自由以下者所組成的群組的C端胺基酸及/或部分：C、c、C(NEM)、K(Ttds-順丁烯二醯亞胺基丙醯基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-順丁烯二醯亞胺)、K(AOA)及Cea。
如申請專利範圍第3項之肽，其進一步包含與X4020連接的X4021，其中X4021包含選自由以下者所組成的群組的C端胺基酸及/或部分：C、c、C(NEM)、K(Ttds-順丁烯二醯亞胺基丙醯基(EtSH))、FA19205、FA19204、FA19203、FA03202、K(Tdts-順丁烯二醯亞胺)、K(AOA)及Cea。
一種肽，其包含以下胺基酸序列之任一者：(i)選自由以下者所組成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO：4133、4137、4153-4155及4158；(ii)與上述(i)之序列具有至少90%一致性的胺基酸序列；及(iii)在上述(i)之序列中包含一或兩個胺基酸取代、缺失或插入之胺基酸序列。
一種肽，其由SEQ ID NO：1334之胺基酸序列組成。
如申請專利範圍第1、2、6及7項中任一項之肽，其中該肽抑制TFPI活性且以小於10μM的解離常數與TFPI 1-α結合。
如申請專利範圍第1、2、6及7項中任一項之肽，其進一步包含至少一個用於改善肽之半衰期的部分。
如申請專利範圍第1、2、6及7項中任一項之肽，其中該肽與聚乙二醇(PEG)部分結合。
如申請專利範圍第1、2、6及7項中任一項之肽，其中該肽與人類血清白蛋白(HSA)、抗體或其片段、羥乙基澱粉、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸多聚體(PAS化)、C12-C18脂肪酸或聚唾液酸(polysialic acid)結合。
一種如申請專利範圍第1、2、6及7項中任一項之肽的用途，其用於製造用以治療罹患凝血病症或處於罹患凝血病症的風險中的個體的醫藥品。
一種TFPI結合肽，其包含兩個或兩個以上如申請專利範圍第1、2、6及7項中任一項之肽的均二聚體或均多聚體。
一種TFPI結合肽，其包含兩個或兩個以上如申請專利範圍第1、2、6及7項中任一項之肽的雜二聚體或雜多聚體。
一種如申請專利範圍第13項之肽的用途，其用於製造用以治療罹患凝血病症或處於罹患凝血病症的風險中的個體的醫藥品。
一種如申請專利範圍第14項之肽的用途，其用於製造用以治療罹患凝血病症或處於罹患凝血病症的風險中的個體的醫藥品。