CN103906764A

CN103906764A - 犬源化抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN103906764A
Application number: CN201280054104.XA
Authority: CN
Inventors: 大卫·吉尔芮
Original assignee: NVIP Pty Ltd
Current assignee: Jelinek Eastwood Australia Pty Ltd
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2012-09-05
Publication date: 2014-07-02
Also published as: JP2016040322A; SG11201400405TA; WO2013034900A1; US20140328838A1; JP2019089772A; JP2016171812A; JP2017110015A; KR20140062127A; KR20190094253A; CA2835094C; CA2835094A1; CA2847824A1; NZ622326A; EP2753645B1; ES2665016T3; TW201326206A; JP2014527806A; AU2012306067B2; AU2012306067B9; AU2012306067A1

Abstract

本发明提供了产生施用于靶标种的非免疫原性免疫球蛋白的方法，其中该方法包括：用衍生自靶标种的至少一个免疫球蛋白的框架区的对应位置上存在的氨基酸残基取代供体免疫球蛋白框架区中的氨基酸残基。还提供了通过本发明的方法产生的抗体，包括新的人源化和犬源化抗NGF抗体。本发明延及编码人源化和犬源化抗NGF抗体的核酸，以及使用所述抗体和/或核酸治疗人的疼痛和关节炎的方法。

Description

犬源化抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及用于产生可用于治疗方法中的非免疫原性结合剂，特别是免疫球蛋白和其片段的方法。特别是，该方法允许供体免疫球蛋白受到修饰，使其施用于靶标种时，针对其产生的中和抗体的风险最小。本发明进一步延及由所述方法产生的免疫球蛋白和其在治疗中的应用。

背景技术

重组DNA技术的发展产生了针对药学应用而研发的多种蛋白。这已带来多种基于蛋白的药物，其通常称为指生物制品，是临床试验或市场认可的对象。由于其固有的性质和结构，基于蛋白的药物比更传统的基于小分子的有机分子和无机分子明显更大且更复杂。特别是蛋白的三级折叠结构对其生物功能是至关重要的。

抗体是蛋白质家族的一员，正被广泛地研发并用于人的治疗应用中。治疗应用中抗体的普及是由于其能够特异性地靶向几乎任何期望的靶分子的通用性。大部分基于蛋白的治疗产品是单克隆抗体。然而，与使用基于单克隆抗体的疗法相关的明显缺陷在于，当施用至个体时，产生针对治疗性单克隆抗体的中和抗体。这些中和抗体的产生是由于个体的免疫系统将施用的单克隆抗体中存在的氨基酸序列视为外来的。结果，产生了针对施用的治疗性抗体的免疫反应。由个体产生的中和抗体可明显消弱继续用治疗性单克隆抗体治疗的能力。通常，一旦个体内已产生中和抗体，由于中和抗体有效减低或消除施用的单克隆抗体的治疗效果，因此需要增加治疗性抗体的使用。这可能将治疗抗体的使用仅限于初始治疗，结果无法选择重复性或长期剂量的治疗性抗体。简言之，针对治疗性抗体产生的中和抗体会明显限制该抗体的治疗用途，进而这会明显限制或完全阻止抗体在治疗慢性疾病或复发性疾病中的用途。

为了尝试降低针对治疗性抗体产生中和抗体的可能性，已研发了多种方法，其设计成通过改变抗体的结构降低其免疫原性。这类方法的一种产生嵌合抗体，，所述抗体的重链和轻链恒定结构域衍生自从与施用所述抗体的个体相同的物种获得的抗体。由于大部分治疗性抗体已研发用于人类，因此这类嵌合抗体通常包含与来源于非人抗体的重链和轻链可变区连接的人来源的重链和轻链恒定结构域，所述非人抗体通常是小鼠和大鼠来源的抗体。

降低治疗性抗体免疫原性的其他方法采用称为人源化的技术。术语人源化所反映出的事实是，使所修饰的抗体更像是人产生的抗体，从而限制免疫反应产生的可能性。人源化技术延及使抗体更似人抗体的多种不同方法。

一种常用的人源化技术是CDR移植技术，通过CDR移植，衍生自供体抗体如鼠来源的抗体的互补性决定区(CDR)与衍生自人来源的抗体的框架区结合，以形成重链与轻链可变结构域，然后将其与人抗体衍生的重链和轻链恒定结构域结合。因此，所得抗体仅含有有限数量的非人来源的氨基酸，这用于限制将会被人免疫系统视为外来者的表位的存在。

与人源化相关的一个明显缺点在于，其常常导致所得的人源化抗体的结合亲和性相对于非人源化供体抗体呈现的结合亲和性有明显的降低。就如同产生针对治疗性单克隆抗体的中和抗体的情况，这会导致该抗体的治疗性用途明显受损。特别是，结合亲和性的降低导致需要施用更高剂量的治疗性抗体，这可能也会进一步需要待增加剂量频率。这两种因素导致治疗成本增加以及对患者的不适用性增加。此外，对个体施用更大量的抗体导致将会产生针对治疗性抗体的中和抗体的风险增加。

在人源化抗体结合期望表位的亲和性低于原始供体抗体的情况下，这可能是由于框架区序列与表位结合CDR序列的结构比对不相容所致。通过用在供体抗体的同一位置的氨基酸回复突变人的残基的重复过程，常常可以恢复人源化抗体的亲和性。尽管回复突变过程可能还会导致非人氨基酸残基重新引入人源化抗体中，但所得的抗体仍被称为是人源化的，无论最终序列中是否存在明显的供体氨基酸。

通过直接类推，使框架改变成维持修饰的抗体的结合特异性的需要同样使用于除人类外的物种的抗体种源化(speciesisation)受损，同时降低选择的靶标种中生成的抗体的免疫原性。从商业前景来看，抗体在人类以外的物种中的用途是需要的，因为可以有效治疗许多常见的疾病过程，特别是高价值物种如伴侣动物(猫和狗)和有耐力动物(马和骆驼)的疾病过程，或者改善食品动物如牛、羊、猪和鸡的肉质。因此，能够简单地转化这些物种中所用的抗体的方法会是十分必要的。

因此需要一种修饰供体抗体的改良方法，从而使所得的抗体施用至靶标个体时，不会导致抗体呈现出与靶抗原的结合亲和性损失，同时使来自接受者(recipient)抗体序列结合亲和性的变化最小，从而降低针对受体抗体产生中和抗体的可能性。由此得出结论，十分需要以最小的数量变化将供体抗体序列转化为靶标种序列的方法，以获得对CDR结构影响最小的靶标种框架结构。

发明内容

本发明描述了修饰在靶标种中使用的供体抗体的方法，从而使产生的抗体在框架区内的任何位置上都不含有在该物种的该位置上会是外来的任何氨基酸。由此，修饰的抗体将保持供体抗体的特异性和亲和性，但同时会得到修饰，从而不会产生潜在的外来表位。因此，修饰的抗体在靶标种中不会被视为是外来的，且因此将不会引起可能导致中和其功效的免疫反应，尤其是经过长期施用后。通过该方法可以达到此目的，克服了以前的方法固有的内在缺陷，并且还以卓越的简易性和优异性为特征。

经过大量的努力，本发明人意外地研发出一种用于改变供体抗体或从其衍生的抗原结合片段的方法，使得施用于靶标种时，其是完全或明显非免疫原性的，所述靶标种是不同于供体抗体的来源物种的物种。通常，在对个体施用后，不产生针对所产生抗体的中和抗体。此外，改变抗体使其是非免疫原性的，不会导致与目的靶标的结合特异性或亲和性降低。

本发明的第一个方面提供了产生用于施用至靶标种的非免疫原性免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

-鉴别来自除靶标种外的物种的供体免疫球蛋白，其中所述供体免疫球蛋白对靶标种中存在的靶表位有结合特异性，

-确定所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区的氨基酸序列，

-将所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与衍生自靶标种的一种或多种免疫球蛋白的框架区氨基酸序列中对应位置存在的氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区氨基酸序列内，不存在于衍生自靶标种的一种或多种免疫球蛋白中的至少一种的框架区氨基酸序列中对应位置的一个或多个氨基酸残基，以及

-用衍生自靶标种的一种或多种免疫球蛋白中的至少一种的框架区氨基酸序列中对应位置存在的氨基酸残基，取代存在于所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区的氨基酸序列中，但不存在于衍生自靶标种的一种或多种免疫球蛋白中的至少一种的框架区氨基酸序列中对应位置中的一个或多个鉴别出的氨基酸残基。

所述方法保留未改变的(即未取代的)任何氨基酸，其存在于供体免疫球蛋白的特定框架(FW)区位置，也存在于衍生自靶标种的免疫球蛋白的至少一个对应框架区位置中。在某些实施方案中，靶标种免疫球蛋白框架区的氨基酸序列包含可以与供体免疫球蛋白对应位置中存在的氨基酸残基相比的残基库。通常，这种库包含衍生自多种靶标种免疫球蛋白的位置特定的氨基酸残基。通常，所述库包含衍生自尽可能多的靶标种免疫球蛋白的框架区序列数据，并且如果可以，包含存在于公开数据库中的具体物种已知的所有免疫球蛋白的所有框架区序列。

衍生自不同物种的免疫球蛋白框架区的氨基酸序列可以来自本领域技术人员已知的公众可获得的多个数据库。例如，国家生物技术信息中心(NCBI)设立的数据库包括衍生自各种物种的抗体的免疫球蛋白序列信息。其他数据库可包括囊括公开可用种系和表达的cDNA序列的任何数据库，并且可包括出版物或数据域，例如但不限于，免疫球蛋白序列的卡巴特(Kabat)数据库(网址:www.kabatdatabase.com)和人抗体数据库VBASE(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。准备可能的靶氨基酸表的方案对本领域技术人员而言是常规的。

尽管所述比较可以在供体序列和靶序列的单个成员之间进行，但明显的是，与靶序列库的比较是优选的，因为这将扩大靶标种中每一卡巴特位置上自然选择的数目。这不仅将增加供体和靶标之间匹配的机会，而且也将扩大不存在匹配时的替换的选择。

如本文所限定的，非免疫原性免疫球蛋白是当施用至靶标种时，不具有针对其产生免疫反应的免疫球蛋白。特别是，针对抗体，特别是针对包含衍生自框架(FW)区的氨基酸残基的表位，不介导体液(抗体介导的)反应。

当供体氨基酸和靶氨基酸在任何卡巴特编号上均不同时，氨基酸必须选自在靶标的该位置上是天然的氨基酸。这将导致多种可能的序列，其中任何一个可以导致本发明的优选或至少合适的序列。在需要取代供体免疫球蛋白框架区中存在的氨基酸残基时，通常保守取代的原则来进行。通常，保守取代需要用与其具有相似特性和性质的同源氨基酸残基替换氨基酸。这种替换可称为同源取代。

在确定是否可以用保守氨基酸替换取代的氨基酸时，评价可以由以下因素组成，例如但不限于，(a)取代区域中多肽主链的结构，例如，片层或螺旋构象；(b)靶位点分子的电荷或疏水性；或者(c)侧链的体积。如果可以用具有共有特性如相似的侧链或相似的电荷或疏水性的残基取代残基，则优选这种残基作为取代物。

考虑靶标种免疫球蛋白残基库中不存在而存在于对应位置的供体免疫球蛋白衍生的残基是否可被保守取代时，可以优选基于根据其侧链性质的相似性而被归为一组的氨基酸，评价对于该特定位置，同源氨基酸在衍生自靶标种的对应残基库中是否可用。(A.L.Lehninger,inBiochemistry(生物化学中),2nd Ed.,73-75,Worth Publishers,New York(1975))。例如，可以确定以下分组：(1)非极性的:Ala(A)、VaI(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)无电荷极性的:GIy(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的:Asp(D)、GIu(E)；和(4)碱性的:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。因此氨基酸残基用同一组中存在的另一个来取代是优选的。

或者，氨基酸可以按以下分组：(1)芳香的:Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)；(2)非极性的:Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Ala(A)、Met(M)；(3)脂肪族的:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)；(4)酸性的:Asp(D)、Glu(E)；(5)碱性的:His(H)、Lys(K)、Arg(R)；和(6)极性的:Gln(Q)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)、Tyr(Y)。再者，氨基酸残基用同一组中存在的另一个来取代是优选的。

或者，基于侧链的共有性质，可以将氨基酸残基分组：(1)疏水性的：Met(M)、Ala(A)、VaI(V)、Leu(L)、Ile(I)；(2)中性亲水性的:Cys(C)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gin(Q)；(3)酸性的:Asp(D)、GIu(E)；(4)碱性的:His(H)、Lys(K)、Arg R)；(5)影响链方向的残基:GIy(G),Pro(P)；和(6)芳香的:Trp(W)、Tyr(Y)、Phe(F)。而且再次，氨基酸残基用同一组中存在的另一个来取代会是优选的。

因此，保守型取将需要这些类的一员交换(取代)成同一类的另一员。在某些实施方案中，引入供体免疫球蛋白的氨基酸残基是限定在衍生自靶标种的免疫球蛋白库的那个特定位置的共有氨基酸(consensusamino acid)。共有氨基酸是免疫球蛋白的该位置上最常出现的氨基酸，其包含对库有贡献的靶标种免疫球蛋白的集合。

通常，取代框架区的残基不会导致免疫球蛋白与目标配体的结合降低。特别是，不降低结合亲和性和特异性。

在某些实施方案中，所述方法还包括用衍生自源于靶标种的免疫球蛋白的等同的重链和/轻链替换供体免疫球蛋白的重链和/或轻链的至少一个且优选全部的恒定结构域的步骤。在某些实施方案中，衍生自靶标种的恒定结构域是抗体亚型免疫球蛋白G(IgG)。

在某些实施方案中，用于评价框架区氨基酸残基的供体免疫球蛋白氨基酸序列库，可限定于衍生自靶标种的免疫球蛋白亚型，例如来自κ轻链或λ轻链。

在不希望被理论束缚的情况下，该方法仅对供体免疫球蛋白框架区序列产生最小数量的关键变化(氨基酸取代)，同时确保产生的框架区序列中所有氨基酸与靶标种的氨基酸匹配。结果，这使得将来自供体免疫球蛋白的抗体修饰成当施用于靶标种时完全或基本是非免疫原性的抗体而产生的结构变化最小。由于该方法包含取代最少的残基，因此该方法可以称为简约的基础翻译(Parsimonious Essential Translation,PET)。引申开来，当施用于靶动物物种时，对供体免疫球蛋白进行的使其是非免疫原性的改变可以称作PET化(PETisation)，且产生的抗体可以称作被PET化。例如，该方法可以导致现有的人类、小鼠或大鼠的抗体种源化，从而使其可以施用于另一靶标种，特别是动物物种，如人、狗、猫或马，而不在其中产生针对其的中和抗体。

在某些实施方案中，靶标种是哺乳动物靶标种。在一个实施方案中，所述靶哺乳动物物种时动物，特别是伴侣动物，例如但不限于，狗、猫或马或家畜动物。在其他实施方案中，所述哺乳动物靶标种是人。

在某些实施方案中，靶表位是神经生长因子(NGF)或肿瘤坏死因子(TNF)。

在各种其他实施方案中，提供了含有通过本发明前述方面的方法提供的免疫球蛋白或其抗原结合片段的组合物。所述组合物还可以包含至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。又一方面提供了通过本发明前述方面的方法产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段在制备治疗或预防疾病的药物中的用途。在各种其他方面，本发明延及前述免疫球蛋白或其抗原结合片段在治疗和诊断方法中的用途。本发明进一步延及权利要求1-15中任一项产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段在治疗或预防疾病中的用途。

本发明的又一方面涉及将本文限定的任意方法产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段施用于个体，特别是哺乳动物个体，以治疗或预防疾病。

去免疫

在各种其他方面，本发明延及修饰治疗性免疫球蛋白，从而使其在施用于特定物种时是非免疫原性的。可以将所述修饰应用于嵌合抗体，即通过CDR移植技术产生的抗体，或应用于人源化抗体。

因此，在另一方面，本发明提供了用于修饰治疗性免疫球蛋白使其是非免疫原性的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供供体治疗性免疫球蛋白，

-确定供体免疫球蛋白轻链和/或重链可变结构域的至少一个框架区的氨基酸序列，

-获得与衍生自施用免疫球蛋白的靶标种的免疫球蛋白轻链和/或重链可变结构域的至少一个框架区相关的氨基酸序列库，

-将供体免疫球蛋白轻链和/或重链的至少一个框架区的氨基酸序列的氨基酸残基与所述氨基酸序列库中具有相同卡巴特编号的氨基酸残基进行比较，以及

-当供体免疫球蛋白轻链和/或重链的至少一个框架区的氨基酸序列中存在的氨基酸残基不同于所述氨基酸序列库中具有相同卡巴特编号的氨基酸残基时，用所述氨基酸序列库中具有相同卡巴特编号的氨基酸残基取代供体免疫球蛋白轻链和/或重链的至少一个框架区的氨基酸序列的任何氨基酸残基。

通常，使用该方法重新人源化治疗性免疫球蛋白产生了免疫原性低于未变化的供体治疗性抗体的免疫球蛋白。此外，修饰的抗体保留其结合亲和性和特异性。因此，产生的修饰抗体治疗上更有效。

在某些实施方案中，因而产生的PET化抗体或其结合片段以K_D为1x10^-8或更小的结合亲和性结合期望的靶表位。

本发明的又一方面延及提供用于免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的至少一个框架区。本发明这方面的方法在如抗体人源化的过程或在抗体施用于非人物种前用于修饰抗体以使其去免疫的等同过程中，具有特殊的用途。可将本发明的这方面提供的框架区引入将要进行人源化或相似的种源化过程的抗体中，或者可以后引入(retrospectively introduced)预先进行种源化的抗体中。特别是，可以将修饰的框架区引入通过例如CDR移植已进行或将进行修饰的抗体中，或者可以引入嵌合抗体中，在所述嵌合抗体中，抗体的Fab区衍生自第一物种，抗体的Fc区衍生自第二物种。

因此，该另一方面提供了修饰供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的至少一个框架区的氨基酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

-确定供体免疫球蛋白的至少一个框架区序列的氨基酸序列，

-基于逐个残基，将供体免疫球蛋白的至少一个框架区的每一位置上的特定氨基酸残基与数据库进行比较，所述数据库包含衍生自待施用修饰的来源免疫球蛋白的物种的抗体中发现的框架区序列中对应氨基酸位置上发现的氨基酸残基库；

-用存在于对应氨基酸位置上发现的氨基酸残基库中的氨基酸残基取代存在于供体免疫球蛋白的至少一个框架区的特定位置上但不存在于对应氨基酸位置上发现的氨基酸残基库中的任何氨基酸残基；以及

-保留存在于供体免疫球蛋白的至少一个框架区的特定位置上并且也存在于对应氨基酸位置上发现的氨基酸残基库中的未改变的任何氨基酸残基。

通常，用与被替换的氨基酸残基最同源的氨基酸残基取代任何被替换的氨基酸残基。如前面所限定的，氨基酸残基的同源组是已知的。如果库中不存在同源的氨基酸残基，则氨基酸可以被在该特定位置最常见的氨基酸残基即所谓的共有氨基酸残基取代。

在某些实施方案中，该方法延及用于产生修饰抗体的方法，包括以下步骤：表达修饰的框架区序列以及互补性决定区(CDR)和重链和/或轻链恒定区，从而产生包含所述修饰的框架区序列的异四聚体抗体。

本发明的某些其他方面延及提供表达修饰的框架区的氨基酸序列的寡核苷酸，以及所述寡核苷酸在宿主细胞中的表达。

本发明的又一方面涉及用于产生具有非免疫原性框架区的治疗性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

-通过将框架区的氨基酸序列与衍生自待施用治疗性抗体的物种的多种免疫球蛋白的对应氨基酸位置上存在的对应氨基酸残基库进行比较，以鉴别出在特定位置上不同的一个或多个氨基酸残基，鉴别出待取代的框架区氨基酸残基；以及

-用对应氨基酸残基库中存在的氨基酸残基取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基。

在某些实施方案中，通过进行序列与库残基的比对，鉴定出框架区氨基酸序列是否存在于抗体将要施用的物种的氨基酸残基的对应位置库中。关键是，取代的残基不会降低产生的修饰抗体的结合活性。也就是说，被取代的残基可以在不明显影响抗体的结合特性的情况下取代成不同的氨基酸。这最主要是通过用同源氨基酸取代氨基酸来获得，所述同源氨基酸即具有相似或相关特性如靶标位点的分子的尺寸、极性/电荷性或疏水性或侧链的体积的氨基酸。或者，残基可以用靶标物种对应位置上出现的共有残基来取代。

被取代(或可被取代)的氨基酸残基存在于可称为变异耐受位置(variant tolerant position)的位置上。也就是说，将该残基取代为另一残基并不改变介于框架区之间的互补性决定区的结合特异性。由于存在于一物种的框架区特定位置的残基可能在第二物种框架区序列的对应位置上是缺少的，因此这种取代可视为是必要的。因此，当氨基酸通常不存在于框架区序列的该位置时，通过形成被物种的免疫系统视为外来的表位，该氨基酸可能会引起针对其的免疫原性反应。使用用存在于靶标种的同源残基或共有残基取代该异常的残基的方法，可以将潜在为外来的表位改变为形成将不会被识别为外来的表位。因此，从抗体的框架区去除所有这种表位可以阻止在抗体施用于与最初衍生抗体的物种是不同的物种的个体时针对抗体的该部分产生的体液反应。

普遍存在的物种特异性框架区的产生

发明人进一步限定了一系列框架区(FR)，其可以与互补性决定区(CDR)结合形成非免疫原的PET化的重链可变结构域和轻链可变结构域。每一个重链结构域和轻链结构域均具有4个框架区，称为FR1、FR2、FR3和FR4。该方法可应用于，使任何抗体(免疫球蛋白)去免疫，从而使其可以施用于期望的物种。然而，仅出于举例的目的，下面记录的实施例将说明基于人、犬、猫和马的抗体中的这种框架区的产生和用途。

抗体结构

抗体分子可包含重链可变结构域，其包含CDR1、CDR2和CDR3区以及相关的插入框架区。重链可变结构域(VH)CDR称为VHCDR，根据卡巴特编号系统(Kabat numbering system)在下列位置可以找到这些CDR:VHCDR1–卡巴特残基31-35、VHCDR2–卡巴特残基50-65和VHCDR3–卡巴特残基95-102(Kabat EA et al.(1991)Sequences ofproteins of immunological interest(具有免疫学重要性的蛋白质序列),5thedition.Bethesda:US Department of Health and Human Services)。

而且，抗体还包含轻链可变结构域，其包含CDR1、CDR2和CDR3区以及相关的插入框架区。轻链可变结构域(VL)CDR称为VLCDR，根据卡巴特编号系统在下列氨基酸残基位置可以找到这些CDR:VLCDR1–卡巴特残基24-34、VLCDR2–卡巴特残基50-56、VLCDR3–卡巴特残基89-97。

轻链可变结构域或重链可变结构域包含四个框架区，即FR1、FR2、FR3和FR4，按下列排列插入CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

本发明的又一方面提供了用于施用于靶标种的免疫球蛋白，其包含：

-衍生自靶标种的免疫球蛋白的轻链和重链恒定结构域，

-衍生自供体免疫球蛋白的互补性决定区(CDR)，其中所述供体免疫球蛋白特异性结合存在于靶标种的配体，以及

-衍生自所述供体免疫球蛋白的框架区，其中在靶标种的任意免疫球蛋白中对应位置上不存在的任何氨基酸被靶标种的对应位置发现的氨基酸取代。

通常对抗体CDR区不进行氨基酸取代。此外，在某些实施方案中，框架区包含不多于7个被靶标种的残基取代的连续氨基酸残基。此外，在某些实施方案中，框架区包含不多于5个被靶标种的残基取代的连续氨基酸残基。此外，在某些实施方案中，框架区包含不多于3个被靶标种的残基取代的连续氨基酸残基。

此外，在某些实施方案中，供体免疫球蛋白框架区(重链FR1、FR2、FR3和FR4以及轻链FR1、FR2、FR3和FR4)的不多于10个氨基酸残基被来自靶标种的残基取代。此外，在某些实施方案中，供体免疫球蛋白框架区(重链FR1、FR2、FR3和FR4以及轻链FR1、FR2、FR3和FR4)的不多于7个氨基酸残基被来自靶标种的残基取代。此外，在某些实施方案中，供体免疫球蛋白框架区(重链FR1、FR2、FR3和FR4以及轻链FR1、FR2、FR3和FR4)的不多于5个氨基酸残基被来自靶标种的残基取代。

在某些实施方案中，靶标种是哺乳动物物种。特别是，靶标种可以是人、犬、猫或马。

因此，在将免疫球蛋白施用于作为靶标种的犬的实施方案中,所述免疫球蛋白包含衍生自犬来源的一个或多个抗体的恒定结构域区域,并且取代成供体免疫球蛋白框架区的残基来自于对应的犬框架区氨基酸残基。

在将免疫球蛋白施用于作为靶标种的猫的实施方案中，所述免疫球蛋白包含衍生自猫来源的一个或多个抗体的恒定结构域区域，并且取代成供体免疫球蛋白框架区的残基来自于对应的猫框架区氨基酸残基。

在将免疫球蛋白施用于作为靶标种的马的实施方案中，所述免疫球蛋白包含衍生自马来源的一个或多个抗体的恒定结构域区域，并且取代成供体免疫球蛋白框架区的残基来自于对应的马框架区氨基酸残基。

在将免疫球蛋白施用于作为靶标种的人的实施方案中，所述免疫球蛋白包含衍生自人来源的一个或多个抗体的恒定结构域区域，并且取代成供体免疫球蛋白框架区的残基来自于对应的人框架区氨基酸残基。

在各种其他实施方案中，提供了含有本发明的前述方面的免疫球蛋白或其抗原结合片段的组合物。所述组合物可以还包含至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。又一方面提供了本发明前述方面的免疫球蛋白或其抗原结合片段在制备治疗或预防疾病的药物中的用途。在各种其他方面，本发明延及前述的免疫球蛋白或其抗原结合片段在治疗和诊断方法中的用途。本发明进一步延及本发明前述方面的免疫球蛋白或其抗原结合片段在治疗或预防疾病中的用途。

本发明的又一方面涉及将本发明前述方面的免疫球蛋白或其抗原结合片段施用于个体，特别是哺乳动物个体，以治疗或预防疾病。

本发明的又一方面提供产生免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：

-将编码重链和轻链的核苷酸引入细胞，其中所述核苷酸编码包含根据本文限定的方法产生的框架区的轻链可变结构域和重链可变结构域,和

-在细胞中表达所述核苷酸，以产生免疫球蛋白。

本发明的又一方面提供产生施用于靶标种时基本上为非免疫原性的免疫球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将供体免疫球蛋白重链和/或轻链框架区序列与靶标种免疫球蛋白重链和/或轻链框架区序列的集合进行比较；

(2)用存在于靶标种免疫球蛋白框架区序列集合的对应位置上的氨基酸残基取代存在于供体免疫球蛋白框架区的特定位置上但不存在于靶标种免疫球蛋白框架区序列集合的对应位置上的任何氨基酸残基；

(3)合成编码重链可变区和/轻链可变区的DNA区段，其包含来自供体免疫球蛋白可变区的CDR和取代的框架区，以及物种适宜的重链和/或轻链恒定结构域；

(4)将所述DNA区段引入细胞中；并且

(5)在细胞中表达所述DNA区段，以产生免疫球蛋白。

在某些实施方案中，所述方法还包括对供体免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区测序的步骤。在某些实施方案中，所述方法还包括纯化免疫球蛋白的步骤。

在某些实施方案中，所述方法还包含将所述免疫球蛋白配制于药学上可接受的载体或稀释剂中的步骤。

本发明的其他方面提供了能够特异性结合人神经生长因子(NGF)的中和抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:13或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列，所述重链可变区包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:14或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。

可以通过本发明的方法制备所述抗体。

在某些实施方案中，所述轻链包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:25或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。

在某些实施方案中，所述重链包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:24或与其具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。

发明人进一步限定了一系列框架区(FR)，其可以与互补性决定区(CDR)结合形成人源化重链和轻链可变结构域。每一个人重链结构域和轻链结构域均具有4个框架区，称为FR1、FR2、FR3和FR4。

因此，还提供了能够特异性结合人神经生长因子(NGF)的中和抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含以下中的至少一个：

包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:60组成的FR1框架区；

包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:61组成的FR2框架区；

包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:62组成的FR3框架区；和

包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:63组成的FR4框架区；

所述重链可变区包含以下中的至少一个：

包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:64组成的FR1框架区；

包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:65组成的FR2框架区；

包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:66组成的FR3框架区；和

包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:67组成的FR4框架区。

在某些实施方案中，所述轻链包含所有的轻链FR1、FR2、FR3和FR4，和/或所述重链包含所有的重链FR1、FR2、FR3和FR4。

在某些实施方案中，本发明以上方面的抗体或结合片段以平衡解离常数(K_D)为1x10^-8或更小的结合亲和性特异性结合人NFG。

在某些实施方案中，本发明以上方面的抗体或结合片段抑制人NGF结合p75或TrkA人NGF受体的能力。

优选地，本发明以上方面的抗体或结合片段对人不是免疫原性的。

通常，本发明以上方面的抗体包含衍生自源于人的免疫球蛋白的轻链和/或重链恒定结构域。

在某些实施方案中，本发明以上方面的抗体选自单链Fv(scFv)抗体片段、Fab抗体片段、Fab’抗体片段和F(ab’)₂抗体片段。

在各种其他方面，本发明延及编码本发明的抗体或抗原结合片段的分离的核酸。

因此，本发明的另一方面提供了编码根据本发明任意前述方面的抗体或抗原结合片段的分离的核酸。

在某些实施方案中，多核苷酸编码抗NGF抗体或抗原结合片段的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:13或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

还提供了编码抗NGF抗体或抗原结合片段的轻链的分离的核酸，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:25或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，多核苷酸编码抗NGF抗体或抗原结合片段的重链可变结构域，所述重链可变结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:14或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

还提供了编码抗NGF抗体或抗原结合片段的重链的分离的核酸，所述重链具有氨基酸序列SEQ ID NO:24或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述分离的核酸还包含编码与其可操作地连接的一个或多个调控序列。

在另一方面，提供了包含编码本发明的重链和/或轻链可变结构域，或重链和/或轻链的多核苷酸的表达载体。在某些实施方案中，所述表达载体还包含一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述载体是质粒或逆转录病毒载体。

本发明的另一方面提供了并入了本发明前述方面的表达载体的宿主细胞。本发明的另一方面提供了产生本发明任意前述方面的抗体的宿主细胞。

本发明的又一方面提供了产生人源化NGF中和抗体的方法，该方法包括以下步骤：培养本发明前述方面的宿主细胞以允许该细胞表达人源化NGF中和抗体。

本发明的又一方面提供了产生本发明的NGF中和抗体的方法，包括以下步骤：在合适的宿主细胞内表达本发明前述方面的一个或多个多核苷酸/核酸或载体，其表达本发明抗体的轻链和/或重链；回收表达的多肽，其可以在一个宿主细胞内一起表达或者在不同的宿主细胞内单独表达；以及分离抗体。

在某些方面，提供了本发明的抗体或结合片段，和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。

本发明的又一方面提供了本发明的以上方面的抗体或结合片段、核酸、药物组合物或表达载体在制备用于治疗或预防疾病如关节炎，或用于治疗、预防或减轻疼痛如与疾病相关的疼痛(例如神经性疼痛、术后疼痛、慢性疼痛、肿瘤疼痛等)的药物中的用途。在各种其他方面，本发明延及本发明以上方面的抗体或结合片段在治疗和诊断方法中的用途。

本发明的又一方面涉及将本发明以上方面的抗体或结合片段、核酸、药物组合物或表达载体施用于个体，特别是哺乳动物个体，用于治疗或预防疾病(如关节炎)或疼痛。

在某些实施方案中，所述疾病是由对神经生长因子(NGF)敏感性增加引起、与其相关或导致其的病症。在某些实施方案中，所述疾病与被NGF引起增殖的肿瘤(如骨肉瘤)有关。

在某些实施方案中，本发明的前述方法还包括共施用至少一种另外的药剂的步骤，该药剂可以提高和/或补充本发明的抗NGF抗体的有效性。例如所述抗体或其抗原结合片段可以与至少一种镇痛剂、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇、透明质酸或玻璃酸共同施用。

本发明的另一方面提供了产生本发明的抗人NGF中和单克隆抗体或其片段的细胞系或其衍生细胞或后代细胞。

本发明的又一方面提供了用于治疗人的疼痛或者用于治疗与疼痛相关的病症或者用于治疗、减轻或抑制与骨关节炎、类风湿性关节炎和炎症相关的疼痛的试剂盒，其包含本发明任意前述方面的抗NGF抗体及其使用说明。

本发明的又一方面提供了用于体外、离体和体内检测流体中抗人NGF单克隆抗体的诊断试剂盒，用于确定所述抗体的浓度。该试剂盒可以包含本发明的任意抗体或其结合片段。该试剂盒可以包含其使用说明。

本发明的其他方面提供了能够特异性结合犬肿瘤坏死因子(TNF)的中和抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:71或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列，所述重链可变区包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:16或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。

可以通过本发明的方法制备所述抗体。通常，本发明以上方面的抗体包含衍生自源于犬的免疫球蛋白的轻链恒定结构域和/或重链恒定结构域。在某些实施方案中，所述重链包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:18、19、20或21，或与其具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。

在某些实施方案中，本发明以上方面的抗体或结合片段以平衡解离常数(K_D)为1x10^-8或更小的结合亲和性特异性结合犬TNF。优选地，本发明的以上方面的抗体或结合片段对犬不是免疫原性的。

在某些实施方案中，本发明的以上方面的抗体选自单链Fv(scFv)抗体片段、Fab抗体片段、Fab’抗体片段和F(ab’)₂抗体片段。

在某些实施方案中，多核苷酸编码抗TNF抗体或抗原结合片段的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:71或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述分离的核酸还包含编码与其可操作地连接的一个或多个调控序列。在另一方面，提供了包含多核苷酸的表达载体，该多核苷酸编码本发明的重链和/或轻链可变结构域，或重链和/或轻链。在某些实施方案中，所述表达载体还包含一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述载体是质粒或逆转录病毒载体。本发明的另一方面提供了并入了本发明前述方面的表达载体的宿主细胞。本发明的另一方面提供了产生本发明任意前述方面的抗体的宿主细胞。

本发明的又一方面提供了产生犬源化TNF中和抗体的方法，该方法包括以下步骤：培养本发明前述方面的宿主细胞以允许该细胞表达犬源化TNF中和抗体。

本发明的又一方面提供了产生本发明的TNF中和抗体的方法，包括以下步骤：在合适的宿主细胞内表达本发明前述方面的一个或多个多核苷酸/核酸或载体，其表达本发明抗体的轻链和/或重链；回收表达的多肽，其可以在一个宿主细胞内一起表达或者在不同的宿主细胞内单独表达；以及分离抗体。

本发明的又一方面提供了本发明以上方面的抗体或结合片段、核酸、药物组合物或表达载体在制备用于治疗或预防疾病，特别是治疗犬的由犬TNF表达增加或对TNF敏感性增加引起的或与其相关的或导致其的任何病症的药物中的用途。在各种其他方面，本发明延及本发明以上方面的抗体或结合片段在治疗和诊断方法中的用途。

本发明的又一方面涉及将本发明以上方面的抗体或结合片段、核酸、药物组合物或表达载体施用于犬，用于治疗或预防疾病。

本发明的另一方面提供了产生本发明的抗犬TNF中和单克隆抗体或其片段的细胞系或其衍生细胞或后代细胞。

本发明的其他方面提供了能够特异性结合犬神经生长因子(NGF)的中和抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:1或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列，所述重链可变区包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:69或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。

可以通过本发明的方法制备所述抗体。

在某些实施方案中，所述轻链包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:7或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。

在某些实施方案中，所述重链包含、组成为或基本组成为氨基酸序列SEQ ID NO:70或与其具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述同一性是在至少约15个氨基酸，优选约20个氨基酸，更优选约25个氨基酸的长度上。

在某些实施方案中，本发明的以上方面的抗体或结合片段以平衡解离常数(K_D)为1x10^-8或更小的结合亲和性特异性结合犬NFG。在某些实施方案中，本发明的以上方面的抗体或结合片段抑制犬NGF结合p75或TrkA犬NGF受体的能力。优选地，本发明的以上方面的抗体或结合片段对犬不是免疫原性的。

通常，本发明的以上方面的抗体包含衍生自源于犬的免疫球蛋白的轻链和/或重链恒定结构域。

因此，本发明的另一方面提供了编码本发明任意前述方面的抗体或抗原结合片段的分离的核酸。

在某些实施方案中，多核苷酸编码抗NGF抗体或抗原结合片段的轻链可变结构域，所述轻链可变结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:1或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

还提供了编码抗NGF抗体或抗原结合片段的轻链的分离的核酸，所述轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO:7或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，多核苷酸编码抗NGF抗体或抗原结合片段的重链可变结构域，所述重链可变结构域具有氨基酸序列SEQ ID NO:69或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

还提供了编码抗NGF抗体或抗原结合片段的重链的分离的核酸，所述重链具有氨基酸序列SEQ ID NO:70或与其具有至少85％、90％、95％或99％的同一性的氨基酸序列。

在另一方面，提供了包含多核苷酸的表达载体，该多核苷酸编码本发明的重链和/或轻链可变结构域，或重链和/或轻链。在某些实施方案中，所述表达载体还包含一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述载体是质粒或逆转录病毒载体。

本发明的另一方面提供了并入本发明前述方面的表达载体的宿主细胞。本发明的另一方面提供了产生本发明任意前述方面的抗体的宿主细胞。

本发明的又一方面提供了产生犬源化NGF中和抗体的方法，该方法包括以下步骤：培养本发明前述方面的宿主细胞以允许该细胞表达犬源化NGF中和抗体。

在某些实施方案中，提供了本发明的抗体或结合片段，和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。

本发明的又一方面提供了本发明以上方面的抗体或结合片段、核酸、药物组合物或表达载体在制备用于治疗或预防犬的疾病如关节炎，或用于治疗、预防或减轻犬的疼痛如与疾病相关的疼痛(例如神经性疼痛、术后疼痛、慢性疼痛、肿瘤疼痛等)的药物中的用途。在各种其他方面,本发明延及本发明以上方面的抗体或结合片段在治疗和诊断方法中的用途。

本发明的又一方面涉及将本发明以上方面的抗体或结合片段、核酸、药物组合物或表达载体施用于犬，用于治疗或预防疾病(如关节炎)或疼痛。

在某些实施方案中，所述疾病是由对神经生长因子NGF敏感性增加引起的、与其相关或导致其的病症。在某些实施方案中，所述疾病与被NGF引起增殖的肿瘤(如骨肉瘤)有关。

本发明的另一方面提供了产生本发明的抗犬NGF中和单克隆抗体或其片段的细胞系或其衍生细胞或后代细胞。

本发明的又一方面提供了用于治疗犬的疼痛或者用于治疗与疼痛相关的病症或者用于治疗、减轻或抑制与骨关节炎、类风湿性关节炎和炎症相关的疼痛的试剂盒，其包含本发明任意前述方面的抗NGF抗体及其使用说明。

本发明的又一方面提供了用于体外、离体和体内检测流体中抗犬NGF单克隆抗体的诊断试剂盒，用于确定所述抗体的浓度。该试剂盒可以包含本发明的任意抗体或其结合片段。该试剂盒可以包含其使用说明。

附图说明

图1示出了大鼠αD11抗体轻链的框架区序列FR1至FR4与犬、猫和马物种特定版本的比对(SEQ ID NO:28至43)。

图2示出了大鼠αD11抗体重链的框架区序列FR1至FR4与犬、猫和马物种特定版本的比对(SEQ ID NO:44至59)。

图3示出了犬版本αD11抗NGF MAb的重链可变结构域(SEQ IDNO:2)和轻链可变结构域(SEQ ID NO:1)以及完整轻链(SEQ ID NO:7)和重链(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列。

图4示出了猫版本αD11抗NGF MAb的重链可变结构域(SEQ IDNO:4)和轻链可变结构域(SEQ ID NO:3)以及完整轻链(SEQ ID NO:9)和重链(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。

图5示出了马版本αD11抗NGF MAb的重链可变结构域(SEQ IDNO:6)和轻链可变结构域(SEQ ID NO:5)以及完整轻链(SEQ ID NO:11)和重链(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列。

图6示出了具有犬、猫和马种源化版本的αD11MAb表达的凝胶。

图7A显示犬NGF的表达和纯化的犬MAb具有生物活性。图7B显示猫NGF的表达和纯化的猫MAb具有生物活性，而图7C显示马NGF的表达和纯化的马MAb具有生物活性。图7D是对犬MAb、猫MAb和马MAb中和NGF生物活性的能力进行比较的图。

图8A是氨基酸的比对，显示出已知的人源化版本的大鼠αD11抗体(Pavone et al,WO06/131951)和新型人源化变体αD11(New Hu–SEQ IDNO:60-63)之间轻链框架区修饰的比较。图8B是已知的人源化版本的大鼠αD11抗体(Pavone et al,WO06/131951)和新型人源化变体αD11(NewHu–SEQ ID NO:64-67)之间重链框架区修饰的比较。

图9A显示图8的新型人源化αD11抗体轻链可变结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:13)和重链可变结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:14)-CDR标有下划线。图9B显示使用图9A中示出的轻链和重链可变结构域设计的完整重链和完整轻链(SEQ ID NO:24和25)。图9C显示比较由图9B的序列制成的抗体与通过如Pavone及其同事曾描述过的CDR移植设计的抗体的ELISA测定。图9D显示通过图9C使用的αD11单克隆抗体的两种人源化变体对TF-1细胞NGF增殖的抑制。

图10显示基于人MAb D2E7(Salfield et al.,US Patent No.6,090,382)的犬源化抗TNF抗体的轻链(SEQ ID NO:15)和重链(SEQ ID NO:16)可变结构域氨基酸序列。

图11显示犬源化抗TNF抗体的κ轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。

图12显示犬源化抗TNF抗体的4个亚型(重链A、B、C和D型)的重链氨基酸序列。

图13显示嵌合的人-犬抗TNF抗体的完整轻链(SEQ ID NO:22)和重链(SEQ ID NO:23)氨基酸序列。

图14A显示使用蛋白A纯化且通过SDS-PΑGE分析的犬源化(Ca)和嵌合(Ch)抗TNF抗体共表达的结果；而图14B显示表达重组蛋白与犬TNF-α结合的ELISA结果。示出了从5ug/ml至0.05ug/ml不同稀释度的抗体的结果。

图15示出使用以NF-kB-EGFP报道构建体pTRH1转染的293-HEK细胞对犬TNF生物活性的抑制。这些细胞通过荧光响应犬TNF。犬源化(图15Α)和嵌合(图15B)MΑb均同样良好地抑制TNF诱导的荧光，其在图15C中量化。

图16显示与基于CHO细胞中表达且使用蛋白A层析纯化的抗TNFMAb克隆148的另一犬源化MAb(A图，左泳道)的比较。与来自图14的基于犬源化(Ca)和嵌合(Ch)D2E7的MAb比较，测试了MAb与人TNF(B图)和犬TNF(C图)的结合(背景阴性对照结合用箭头表示)。

图17显示犬源化MAb148的重链(SEQ ID NO:26–ca148-HCB)和轻链(SEQ ID NO:27–ca148-kLC)。

图18显示通过本发明的方法制备的抗犬NGF单克隆抗体降低狗的炎性疼痛。

发明详述

本发明延及用于设计和制备供体抗体变体的新方法，当施用于不同于衍生抗体的物种时，所述供体抗体变体的免疫原性降低，同时其维持(即不降低)抗体对靶标配体的结合亲和性、亲合力或特异性。特别是，评价抗体或抗体结合片段的框架区序列，并将其修饰成去除不存在于衍生自待施用抗体的物种的抗体库的对应位置上的残基。

特别是，本发明的方法修饰供体(亲本)抗体的框架，从而使在目标接受者是除供体外的物种时，其与目标接受者的相容最优。

本领域迄今为止最常用的使抗体去免疫的方法是，从接受者物种的种系序列选择相容的框架，并将CDR区移植到该框架中。这种方法的问题在于，所选择的框架对CDR很少有完美的匹配，结果，与目标靶表位的结合亲和性降低。然后需要亲和性成熟，这导致引入在其被引入的位置上对接受者有时是外来的氨基酸。解决方法是本发明的方案，其中供体框架区的修饰仅在当氨基酸在特定位置上对接受者是外来的情况下发生。替换选自作为本发明一部分而汇集的选项列表中。结果，本发明的关键是，基本上没有对供体框架进行结构修饰，因此基本上没有使CDR构象变形，但同时框架内没有“非自身”氨基酸，且所得免疫球蛋白缺少在靶标种中是外来的框架表位。本方法可以用于修饰施用于任何期望靶标种的免疫球蛋白。

在至今为止对免疫球蛋白序列种类的最广泛研究中，Glanville及其同事(2009)研究了由654个人类供体的天然IgM扩增的近100000条重链和轻链cDNA的氨基酸组成。95％的序列各自与种系的不同多达30个突变。据证明，仅经体细胞突变而突变的CDR1和CDR2未从种系DNA改变，仅17％的倍数和78％的CDR1和CDR2序列具有1-6个氨基酸的差异。这项研究没有描述本文所示的表中记载的非CDR框架残基的突变。鉴于体细胞超变通过易错DNA复制机制，在观察到的CDR1或CDR2和剩余框架区序列之间突变率本身不太可能是不同的，而且，在免疫反应成熟期间，在抗原刺激的所有组成成分中(repertoire)，在体细胞超变后进行深层次级选择，会在框架区内允许进一步的氨基酸多样化。由于这些原因，本文所述的人、犬、马和猫IgG序列的集合中观察到的多样化很可能是循环IgG序列的代表。令人惊讶的是，体细胞超变后，每个物种的免疫球蛋白的同源“卡巴特”框架位置上编码的氨基酸之间有大量的重复，结果，根据本发明的方法，这减小了从一个物种向另一物种转化所需的变化。

作为本发明的实施例，且经过大量实验，本发明人已获得D2E7抗人TNF抗体和αD11大鼠抗小鼠NGF抗体，其结合犬TNFα或犬NGF是未知的，并且令人惊讶的是，发明人使用其作为基础，产生了适合用于犬的非免疫原性抗体。产生的非免疫原性抗体并不是使用标准CDR移植技术产生的，经证明，其分别表现出对犬TNF和NGF的高亲和结合性。此外，抗体已设计成使框架区和恒定区仅并入存在于犬IgG分子的残基，从而当施用于犬时，不可能产生针对它们的异种抗体。因此，本发明的犬源化抗体适合长时间施用，以治疗犬的疾病。类似地，本发明的猫源化、人源化和马源化NGF抗体适合长时间施用，以分别治疗猫、人和马的疾病。

发明人采用的产生本发明的抗体的重链和轻链可变结构域的方法导致靶(例如犬)残基替换对靶标(例如犬)在该位置已知是外来的特定供体氨基酸残基，基于发明人的分析，这种替换将保留CDR区的构象，并因此维持亲和特异性和亲合力，同时降低了如果以未改变的形式施用于靶(例如犬)时可能导致针对抗体产生中和抗体的免疫原性表位的存在。具体而言，制备本发明抗体的方法(被称为PET化)包括：通过将供体抗体框架区的序列与衍生自靶标(例如犬)的抗体或抗体库的序列进行比较，评价供体(例如人)抗体框架区的序列施用于靶(例如犬)的适宜性。尽管所述比较可以在供体序列和单个成员的靶序列之间进行，但显而易见的是，与靶序列库的比较是优选的，因为这将扩大靶标种中每一卡巴特位置上自然选择的数目。这不但将增加供体与靶标之间匹配的可能性，而且还将扩大不存在匹配的替换的选择。因此，将能够选择出与供体特征尽可能相近的替换。当供体序列与犬序列在任何卡巴特编号或对应的位置上不同时，修饰供体序列以用靶(例如犬)中该位置的已知是天然的氨基酸残基来取代所提及的氨基酸残基。

在需要取代供体免疫球蛋白框架区中存在的氨基酸残基时，通常采用保守型取代的原则进行取代，其中氨基酸残基是用天然地位于靶标(例如犬)的卡巴特位置并且在大小、电荷、疏水性方面与供体序列中被取代的氨基酸尽可能密切相关的氨基酸残基来替换。目的是选择对供体抗体的三维结构不会引起扰动或破坏或仅引起至少最低程度的扰动或破坏的替换。在某些情况下，将没有明显的选择，并且每一选择都有利弊。最终的决定可能需要各种备选序列的三维建模甚至表达。然而，通常利用明显的偏好。作为该步骤的结果，当残基在靶中是外来的并且该替换氨基酸与被其替换的氨基酸尽可能密切相关时，仅对供体序列作出改变。因而，避免了外来表位的产生，但是由于维持了整个三维结构，因此，还维持了亲和性和特异性。本发明的这方面的示例性实例包括：

-轻链序列SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、25、27和71。

-重链序列SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、24、26、68、69和70。

抗体的产生

可以通过化学合成来完全或部分地产生本发明的抗体和结合成员。例如，可以通过本领域技术人员熟知的技术，例如标准液相肽合成或固相肽合成方法，来制备本发明的抗体和结合成员。或者，用液相肽合成技术或者进一步通过固相、液相和溶液化学的组合，可以在溶液中制备抗体和结合成员。

本发明进一步延及通过在合适的表达系统中表达编码包含本发明抗体的至少一个氨基酸的核酸来产生本发明的抗体或结合成员，使得可以编码期望的肽或多肽。例如，可以表达编码氨基酸轻链的第一核酸和编码氨基酸重链的第二核酸，以提供本发明的抗体。

因此，在本发明的某些另外的方面，提供了编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸。

通常，可以以分离的或纯化的形式，或者以除一个或多个调控序列之外，基本上没有可以与其天然相关的材料的形式，提供编码形成本发明的抗体或结合成员的氨基酸序列的核酸。表达本发明的抗体或结合成员的核酸可以是完全或部分合成的，并且其可以包括但不限于DNΑ、cDNΑ和RNΑ。

熟练技术人员可以利用本领域技术人员熟知的技术容易地制备编码本发明的抗体或结合成员的核酸序列，例如Sambrook et al.(“MolecularCloning”,Αlaboratory manual(分子克隆:实验室手册),cold SpringHarbor Laboratory Press,Volumes1-3,2001(ISBN-0879695773),)和Αusubel et al.(Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的小方法).John Wiley and Sons,4th Edition,1999(ISBN-0471250929))中描述的技术。所述技术包括(i)使用聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸样品；(ii)化学合成；或(iii)制备cDNΑ序列。可以以本领域技术人员已知的任何合适的方式产生和使用编码本发明的抗体或结合成员的DNΑ，包括对编码DNΑ取样、确定待表达的部分的任一侧的合适的限制酶识别位点和从DNΑ切离该部分。然后将切离的部分可操作地连接至合适的启动子并在合适的表达系统中表达，例如可商购获得的表达系统。或者，可以通过使用合适的PCR引物扩增DNΑ的相关部分。可以通过定点诱变对DNΑ序列进行修饰。

可以以含有如上所述至少一个核酸的质粒、载体、转录盒或表达盒形式的构建体，提供编码本发明的抗体或结合成员的核酸序列。构建体可以包含在包含一个或多个上述构建体的重组宿主细胞内。可以通过在合适的条件下培养含有合适的核酸序列的重组宿主细胞，便利地实现表达。表达后，可以使用任何合适的技术将抗体或抗体片段分离和/或纯化，然后视情况使用。

用于在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母、昆虫和杆状病毒系统。本领域用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、海拉细胞(HeLa cell)、仓鼠崽肾细胞和NS0小鼠骨髓瘤细胞。常见的优选细菌宿主是E.coli(大肠杆菌)。在本领域中已完全建立了在原核细胞例如E.coli中表达抗体和抗体片段。作为产生结合成员的选项，在培养的真核细胞中表达对本领域技术人员而言也是可用的。

用于产生抗体的一般技术是本领域人员熟知的，这样的方法讨论于例如Kohler and Milstein(1975)Nature256:495-497；US Patent No.4,376,110；Harlow and Lane,Antibodies:a Laboratory Manual(抗体：实验室手册),(1988)Cold Spring Harbor中。用于制备重组抗体分子的技术在上述文献中也有描述，并且在例如欧洲专利第0368684号中也有描述。

在本发明的某些实施方案中，使用包含编码抗体或结合成员的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的插入物的重组核酸。按照定义，这样的核酸包含单链核酸、由所述编码核酸和由其互补的核酸组成的双链核酸或者这些互补(单链)核酸本身。

而且，编码抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸可以是酶促或化学合成的具有编码天然存在的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的真实序列或其突变体的核酸。

本发明的抗体不但通过重组方式直接产生，而且可以作为与异源多肽的融合多肽产生，异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽。所选的异源信号序列优选为可被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，该信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp(复合天然氨基酸)或热稳定肠毒素II前导序列(heat-stableenterotoxin II leaders)的原核信号序列取代。

当用于提及本发明的抗体或由其衍生的结合成员或编码其的多核苷酸时，术语“分离的”指所述抗体、结合成员或核酸(多核苷酸)以分离的和/或纯化的形式提供的状态，也就是说将它们从其天然环境中隔离、分离或纯化，并且以基本纯或均质的形式提供，或者在核酸的情况下，以没有或基本上没有除了编码具有所需功能的多肽的序列外的起源的核酸或基因的方式提供。因此，这类分离的抗体、结合成员和分离的核酸将没有或基本上没有与其天然相关的材料，例如当这种制备是在体外或体内通过重组DNΑ技术实施时，在它们的天然环境或制备环境(例如细胞培养物)中发现的其他多肽或核酸。

抗体、结合成员和核酸可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且出于实际目的，其仍可以视为以分离的形式提供。例如，如果用于在免疫测定中涂覆微量滴定板，可以将抗体和结合成员与明胶或其他载体混合，或者当用于诊断或治疗时，将抗体和结合成员与药学上可接受的载体或稀释剂混合。可以自然地或通过异源真核细胞(例如CHO或NSO细胞)使抗体或结合成员糖基化，或者抗体或结合成员(例如，如果通过在原核细胞中表达来生产时)可以是非糖基化的。

包含抗犬TNF犬源化抗体分子的异源制剂也构成本发明的一部分。例如，这样的制剂可以是具有全长重链的抗体和具有缺少C端赖氨酸的重链的抗体和具有不同糖基化程度的抗体和/或具有衍生氨基酸(例如N端谷氨酸环化以形成焦谷氨酸残基)的抗体的混合物。

定义

除非另有限定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有本发明的领域内本领域技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清楚,然而，在发生歧义的情况下,本文给出的定义优先于任何字典或外来的定义。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”或“包括(include)”或变体例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”、“包括(includes)”或“包括(including)”，应理解为表示包含所述整数或整数组，但并不排除任何其他的整数或整数组。

如本文所使用的，除非文中明确要求，诸如“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”的术语包括单数个或复数个参照物。因此，例如，提到“一种活性剂(an active agent)”或“一种药学活性剂”包括一种单一的活性剂和两种或以上不同的活性剂组合，而提到“载体”，其包括两种或以上载体的混合物以及单一载体等。而且，除非文中另有要求，单数的术语包括复数并且复数的术语也包括单数。

术语“对应的氨基酸”是指当比对两条或更多条氨基酸序列以允许序列间的最大序列同一性时，在同一位置(即它们相互交叉)出现的氨基酸残基。对应位置上的氨基酸残基具有相同的卡巴特编号。特别是，可以比对不同抗体的框架区氨基酸序列，或者可以将一个抗体的框架区序列的氨基酸序列与衍生自特定物种的多个免疫球蛋白的位置特定的框架区氨基酸残基库进行比较。用于比对和对抗体序列标号的方法是本领域技术人员熟知的，并记载于Kabat et al.(Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学研究的蛋白序列),Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242)，其内容通过引用的方式并入。

如本文使用的“互补性决定区(CDR)”指一起限定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列，如同Kabat et al.(Kabat,E.Α.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition.NIHPublication No.91-3242，免疫学研究的蛋白质的序列)中所述的。如本文所使用的，术语“框架区(FR)”指插入在CDR之间的氨基酸序列。抗体的这些部分用来将CDR保持在合适的方向(允许CDR结合抗原)。

如本文所使用的，术语“恒定区(CR)”指抗体分子赋予效应子功能的部分。在本发明中，恒定区通常指靶标种的恒定区，也就是说，主题种源化抗体的恒定区来源于靶标种免疫球蛋白。例如，犬抗体中，重链恒定区可以选自四种同种型Α、B、C或D中的任何一种。

本文所用的术语“嵌合抗体”指含有衍生自两种不同抗体的序列的抗体，所述不同抗体通常来源于不同物种。最典型的是，嵌合抗体包含衍生自供体物种且特异性结合靶表位的可变结构域和从待施用该抗体的靶标种获得的抗体衍生的恒定结构域。

本文所用的术语“免疫原性”指当施用于接受者时对引起免疫反应(体液反应或细胞反应)的寻靶蛋白或治疗部分的能力的衡量。本发明涉及主题种源化抗体的免疫原性。优选本发明的抗体不具有免疫原性，也就是说，当施用于靶标种时，将不会产生针对它们的异种抗体。

本文所用的术语“基本上由…组成(consists essentially of)”或“基本上由…组成(consisting essentially of)”表示，多肽可以含有除所描述的以外的其他特征或元素，条件是这样的特征或元素并不会实质影响抗体或抗体片段结合期望的靶的结合特异性的能力。也就是说，包含多肽的抗体或抗体片段可以具有不干扰抗体或抗体片段结合期望的靶并且不抵消其功能活性的能力的其他特征或元素。可以将这样的修饰引入氨基酸序列中，从而降低抗体的免疫原性。例如，基本上由特定序列组成的多肽在该序列的一端或两端可以含有一个、两个、三个、四个、五个或更多个添加、缺失或取代的氨基酸，条件是这些氨基酸并不干扰、抑制、阻断或中断抗体或片段结合期望的靶并隔离其生物功能的作用。同样，有助于本发明的对抗性抗体的多肽分子可以被一个或多个官能团进行化学修饰，条件是这类官能团不干扰抗体或抗体片段结合期望的靶并抵消其功能的能力。

现将参考以下实施例描述本发明，所提供的实施例用于说明的目的，并非意图视为限制本发明。

实施例

实施例1-鼠抗体向犬抗体、猫抗体、马抗体和人抗体的转化

根据物种，利用ClustalW程序，使用BLOSUM Cost Matrix且缺口开放罚分(Gap open cost)为10，缺口延伸罚分(Gap extend cost)为0.1，对来自公众可获得的表达的cDNA序列数据库和公开物的人、猫、犬和马来源的免疫球蛋白γ(IgG)可变结构域重链(VH)和轻链(VL)蛋白序列在组中比对。从比对中删除同源性低的低质量序列，以避免框架区内的假缺口(spurious gap)。根据卡巴特命名法鉴别框架区和CDR区，鉴别每个卡巴特框架区位置上的氨基酸残基，并按照轻链和重链制表(图1-8)。尽管轻链表是由κ轻链的集合构建的，但相似的表可以由λ轻链构建，用于根据本专利所述方法将λ轻链从一个物种转化到另一物种。

四个物种的IgG序列之间在轻链框架Q6、C23、W35、P44、Y83、C85和G98位置和重链框架G8、C22、W36、R38、D86、Y90、C92和G106位置上的序列保守性证明，在起始数据组中通过简单的核苷酸序列错误的合并的氨基酸数据的污染最小。通过可用数据对每个物种确定表1-8中每一框架区存在的残基库的组成。对衍生自任何被分析的物种的免疫球蛋白的其他氨基酸序列的确定，可能使表中任意位置上的组成选择进一步多样化。对于猫来源的可变轻链，目前在文献中仅有单个实施例，本发明人通过使简并寡核苷酸引发聚合酶链反应扩增猫脾组织mRNAIgG轻链序列而产生新的集合，如表1-8所示的，特别是如此。尽管如此，如将在下面展示的，下面的表格可以与本文公开的方法一同使用，以产生适合施用于多个不同物种的抗体。

本发明的方法使用表1-8所提供的信息，将供体免疫球蛋白轻链和/重链框架区每一位置上存在的氨基酸残基与衍生自靶标种的免疫球蛋白的库中存在的残基进行比较。如果供体框架区的特定位置上存在的氨基酸残基不是衍生自靶标种的免疫球蛋白的库中该位置存在的氨基酸，则用库中存在的与该位置相关的氨基酸取代所述氨基酸。在确定哪个氨基酸应替换供体序列中被取代的残基时，优选用库中同源性最接近的残基取代供体的残基。也就是说，该取代优选是保守型取代。如果没有同源残基，则靶标种的共有库氨基酸(即该位置最常出现的氨基酸)可优选用于取代。

在确定是否可以用保守的氨基酸替换取代的氨基酸时，评价可以由以下因素组成，例如但不限于，(a)取代区域中多肽主链的结构，例如片层或螺旋构象；(b)靶位点的分子的电荷或疏水性；或者(c)侧链的体积。

当考虑靶标库中不存在的供体氨基酸是否可以被保守取代时，可以优选根据其侧链性质的相似性，评价基于分在一组的氨基酸是否存在同源氨基酸。(L.Lehninger,Biochemistry(生物化学中),2nd Ed.,73-75,WorthPublishers,New York(1975)).例如，可以确定以下分组：(1)非极性的:Ala(A)、VaI(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)无电荷极性的:GIy(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的:Asp(D)、GIu(E)；和(4)碱性的:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。

或者，基于侧链的共有性质，可以将氨基酸残基分组：(1)疏水性的：Met、Ala、VaI、Leu、Ile；(2)中性亲水性的:Cys、Ser、Thr、Asn、GIn；(3)酸性的:Asp、GIu；(4)碱性的:His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基:GIy、Pro；以及(6)芳香的:Trp、Tyr、Phe。

保守型取代将需要这些类的一员交换(取代)成同一类的另一员。

通过举例的方式，将由大鼠抗鼠NGF单克隆抗体(αD11)确定的供体免疫球蛋白轻链和重链可变结构域序列与这些表比对,设计并构建PET化的犬、马和猫的变体用于表达。对每一物种选择的框架区残基如图1所示，与供体大鼠序列的差异如图2所示。由图1和图2可知，对于每一物种，制备犬、猫或马版本的αD11所需的改变在数目和类型上是不同的。

通过与各物种的恒定结构域的C末端融合，如图3、4和5所示(可变结构域SEQ ID NO1-6，全抗体SEQ ID NO7-12)，并在转染到CHO细胞的表达载体中共表达合适的重链和轻链对，将犬、猫和马版本的αD11的可变结构域表达为全抗体。通过SDS-PAGE分析含有作为整个IgG的表达的重链和轻链对的上清液，并检测其抑制通过培养中的神经生长因子引起的TF-1增殖的能力。在考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶中观察到重链和轻链(图6)，并且上清液能够抑制由神经生长因子诱导的TF-1增殖(图7)。通过对比，αD11的犬源化变体的纯化样品在抑制NGF活性方面与人源化版本(Pavone et al.WO2006/131951)的αD11一样有效，这表明，与Pavone等用于人源化抗体的CDR移植标准方法相比，本文描述的PET化技术不会导致抗体自身结构的功效降低。犬、猫和马版本的αD11的近似生物活性进一步显示于图7D。

表1-轻链可变结构域FR1残基

表2-轻链可变结构域FR2残基

表3-轻链可变结构域FR3残基

表4-轻链可变结构域FR4残基

表5-重链可变结构域FR1残基

表6-重链可变结构域FR2残基

表7-重链可变结构域FR3残基

表8-重链可变结构域FR4残基

实施例2-抗人NGF去免疫抗体的产生

PET化技术也可以用于通过使用前述方法将具有备选的人氨基酸重链和轻链序列的人用途的抗体(本文前面称之为“重新人源化”)转化为Pavone等所述的抗体，人来源的框架区位置特定的氨基酸残基显示于表1-8中。

除所产生的VH和VL序列(图9A)外，显示了轻链(图8A)与重链(图8B)的重新人源化的框架序列的比较。明显的是，使用本文公开的方法(对框架区改变3个氨基酸)相比Pavone及其同事的标准CDR移植方法所用的方法(改变43个氨基酸)，需要对于人源化αD11MAb进行少得多的改变。

重新人源化的αD11抗体的可变重链(VH)和(VL)的蛋白序列(New-HuαD11，图9A)分别用来自大鼠αD11的N末端信号序列和来自IgG4重链与人κ轻链C末端人IgG恒定结构域(图9B)来设计。编码这些的合成基因通过基于寡核苷酸的基因合成来制备，并且将每个合成基因亚克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1+中。共转染到CHO细胞中，使用蛋白A层析从细胞上清液中纯化，产生纯化的抗体。通过ELISA测试抗体与NGF的结合，并与Pavone等人(WO06/131951，通过CDR移植设计的)描述的通过αD11的人源化变体的结合进行比较。从图9C中的ELISA结果可以看出，本专利的New HuαD11变体与NGF的结合与Pavone等人所述的是有区别的。通过图7C所述的方法，测试了图9C中描述的抗体对NGF的抑制。两种人源化抗体显示出等同的生物活性。

实施例3-对犬TNF具有亲和特异性的犬抗体的产生

通过进一步举例的方式，以结合肿瘤坏死因子的人抗体D2E7作为起始点，使用本专利的PET化方法，从而制备其犬变体。

下面所示的表9-16显示了人单克隆抗体D2E7的轻链和重链可变结构域的框架区与犬免疫球蛋白框架序列的每一位置上限定的氨基酸残基的库比对(如表1-8所示)。在该卡巴特序列位置上曾被认为是外来的某些残基(表9中标记*的)，现在被视为对犬是天然的，因此不再进行在标记*的位置上显示的变化，或者可以选择更保守的残基(表10中标记**的)。基于这些额外的信息，三个轻链位置会是不改变的，包括Ser9、Ala13和Gly16(表9中标记*的)。轻链His42会是在该位置上的备选(表10中标记**的)。在这些位置上的犬源化D2E7框架残基的修饰，以及包含这样的修饰的抗体意图位于本发明的范围内。这样的抗体会包含具有SEQ IDNO:15所示的序列的轻链可变结构域，除了在位置9上提供丝氨酸残基，在位置13上提供丙氨酸残基以及在位置16上提供甘氨酸残基，以取代SEQ ID NO:15的那些位置上所示的残基。任选地，可将组氨酸残基提供在SEQ ID NO:15的位置42上来取代谷氨酸。SEQ ID NO:71提供了显示这些变化的修饰的序列。本发明延及包含轻链可变结构域的抗体,所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:71,以及衍生自所述抗体的抗原结合片段。

表9-人来源的D2E7单克隆抗体的犬源化轻链FR1序列

表10-人来源的D2E7单克隆抗体的犬源化轻链FR2序列

表11-人来源的D2E7单克隆抗体的犬源化轻链FR3序列

表12-人来源的D2E7单克隆抗体的犬源化轻链FR4序列

表13-人来源的D2E7单克隆抗体的犬源化重链FR1序列

表14-人来源的D2E7单克隆抗体的犬源化重链FR2序列

表15-人来源的D2E7单克隆抗体的犬源化重链FR3序列

表16-人来源的D2E7单克隆抗体的犬源化重链FR4序列

图10、11和12显示编码SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:21中的D2E7的犬PET化Mab变体的可变结构域(图10)和全抗体(图11(轻链)和图12(重链))序列。使用寡核苷酸合成构建序列作为DNA，将其亚克隆至表达载体，并转染到上述的CHO细胞中。特别是，设计SEQ IDNO:17(轻链)和SEQ ID NO:18-21(重链同种型A、B、C和D)的序列，使用寡核苷酸合成将其构建成DNA，亚克隆至pcDNA3.1+表达载体，并以各种组合转染到CHO细胞中。

编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:17(轻链)和SEQ ID NO:19(重链，同种型B)的犬源化抗TNF单克隆抗体和具有SEQ ID NO:22的氨基酸的轻链和SEQ ID NO:23(图13)的重链的嵌合抗TNF单克隆抗体的cDNA亚克隆至具有氨基末端分泌信号序列(未示出)的pcDNA3.1+(Invitrogen/Life technologies)中。用犬源化重链和轻链序列(ca-HCB+ca-kLC)的组合或嵌合的重链和轻链(ch-HCB+ch-kLC)的组合共转染CHO细胞。将所得上清液在蛋白A上纯化，用SDS-PAGE进行分析(图14)，并通过ELISA在指定的抗体浓度下测试对TNFα(以5ug/ml涂覆；R&D systems)的结合，并使用抗犬多克隆抗体-辣根过氧化物酶缀合物(SigmaΑ9042)检测(图14B)。阴性对照是仅在包覆的抗原上进行多克隆检测。

使用pTRH1转染的293-HEK细胞产生通过荧光响应人TNF的TNF敏感NF-kB-EGFP报告细胞系(Vince et al,Cell131,682,2007)，测试纯化的抗体抑制犬TNF活性的能力。首次证明了犬TNF活化这些细胞中的GFP表达，然后测试图14示出的犬抗体抑制1ng/mL犬TNF的能力。

如图15(A-C)所示，在本试验中，犬源化抗体和嵌合抗体都是犬TNF的有效抑制剂。

这些结果共同显示，经ELISΑ和抑制试验，本发明的犬源化抗体和人-犬嵌合抗体都结合犬TNF，且两者效果相当，这表明犬源化(caninisation)方法产生了原D2E7抗体的完全活化的犬版本抗体(canineversion)。

图16示出犬源化和嵌合D2E7单克隆抗体(MAb)与基于抗人TNFMAb克隆148的另一犬源化抗体的比较。将犬源化抗人TNF MAb148(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27，图17)在CHO细胞中表达，并使用蛋白A层析纯化(Α图，左泳道)。与来自图14和图15的基于犬源化(Ca)和嵌合(Ch)D2E7的MAb比较，测试了犬源化148MAb与人TNF(B图)和犬TNF(C图)的结合(背景阴性对照结合用箭头表示)。由B图和C图可知，犬源化MAb148结合人TNF，但不结合犬TNF。因此，基于D2E7的犬源化MAb和嵌合MAb以及本发明的主题显示出与犬TNF出乎意料的强结合，其相当于与人TNF的结合，而犬源化MAb148显示仅与人TNF结合。因而，基于犬源化D2E7的MAb出乎意料地用于治疗犬TNF介导的犬疾病。

总之，犬、马、猫和新型的人版本的PET化大鼠抗NGF MAbαD11和犬PET化版本的人抗TNF MAb证明，通过本专利所述方法的可变结构域的PET化转化是有效且可再现的，并且可应用于多种MAb的多物种转化。

实施例4-抗犬NGF单克隆抗体在降低体内炎性疼痛方面的作用

抗体治疗

在CHO细胞中表达衍生自表达SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:70(犬HCA型重链)的表达载体的抗犬NGF单克隆抗体，并通过离子交换层析、疏水作用层析和尺寸排阻层析的组合纯化，并缓冲交换到磷酸盐缓冲盐水中。

犬的炎症模型

所有试验均是在事先得到机构伦理委员会(CRL,Ireland)的许可之下实施的。对贝高犬(Beagle dog)的一条后腿的足垫中注射高岭土(＝第-1天)，以在大约24小时后开始产生自分解性(self-resolving)炎症，其导致狗暂时跛足。在该模型中，一旦对高岭土的起始炎症反应减弱，狗的跛足在约1-2周期间内稳定地减弱，然后完全恢复。

对3只狗的组以200μg/kg体重静脉内注射抗犬NGF单克隆抗体，或静脉内注射作为媒介空白的磷酸盐缓冲盐水(＝第0天)。通过视觉评分方法在7天内评价够的跛足程度(0分，无跛足(支撑全部重量))；1分，轻微跛足(并非支撑全部重量，但步行良好)；2分，中度跛足(轻微地支撑重量，但步行不好)；3分，严重跛足(无法支撑重量))。观察员看不知道哪只狗接受了注射。

结果如图18所示。相对于媒介对照，接受抗NGF单克隆抗体的狗在注射3天后，跛足评分降低，这表明，抗NGF单克隆抗体相对于仅有媒介时，具有降低狗的疼痛的作用。抗犬NGF单克隆抗体的血浆药代动力学证明，缓慢的组织分布(α)相约为30小时，以及足垫区域血管形成相对较少，延迟的活性与这些一致。图18所示的结果显示，通过本发明的方法产生的抗犬NGF抗体降低狗的炎性疼痛，结果减轻了跛足。

通过引用的方式将本文说明书中提及的所有文献并入本文中。在不背离本发明范围的情况下，对本发明记载的实施方案进行各种修改和变化对本领域技术人员是显而易见的。虽然就具体优选的实施方案对本发明进行了描述，但应该理解，请求保护的本发明不应该不适当地限制为这些具体的实施方案。事实上，本发明意图涵盖对本领域技术人员显而易见的所记载的实施本发明的方式的各种修改。

Claims

1.产生用于施用于靶标种的非免疫原性免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

-鉴别来自除所述靶标种外的物种的供体免疫球蛋白，其中所述供体免疫球蛋白与所述靶标种中存在的靶表位具有结合特异性，

-将所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与衍生自所述靶标种的一种或多种免疫球蛋白框架区氨基酸序列中对应位置上存在的氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的框架区氨基酸序列内，不存在于衍生自所述靶标种的一种或多种免疫球蛋白中的至少一种的框架区的氨基酸序列中对应位置上的一个或多个氨基酸残基，以及

-用衍生自所述靶标种的一种或多种免疫球蛋白中的至少一种的框架区氨基酸序列中对应位置上存在的氨基酸残基取代存在于所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的框架区氨基酸序列中，但不存在于衍生自所述靶标种的一种或多种免疫球蛋白中的至少一种的框架区氨基酸序列中对应位置上的一个或多个鉴别出的氨基酸残基。

2.如权利要求1所述的方法，其中将所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与氨基酸残基库进行比较，所述氨基酸残基库包含衍生自所述靶标种的多个免疫球蛋白框架区氨基酸序列的对应位置上存在的氨基酸残基。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，使用保守型取代的原则进行所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区的氨基酸序列中存在的氨基酸残基的取代。

4.如权利要求3所述的方法，其中保守型取代包括用衍生自所述靶标种的一种或多种免疫球蛋白中至少一种的框架区的氨基酸序列中对应位置上存在的氨基酸残基同源取代所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区的氨基酸序列中存在的氨基酸残基。

5.如权利要求4所述的方法，其中，用保守氨基酸残基替换所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区的氨基酸序列中存在的氨基酸残基，所述保守氨基酸残基与被取代的氨基酸具有共同特征，例如相似侧链、相似电荷和相似疏水性中的至少一种。

6.如权利要求5所述的方法，其中被取代的氨基酸残基和所述替换氨基酸残基都是同一氨基酸组的成员，其中所述组包括：

-(1)非极性残基：Ala(A)、VaI(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；

-(2)无电荷极性的残基：GIy(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；以及

-(3)酸性残基：Asp(D)、GIu(E)；以及

(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。

7.如权利要求5所述的方法，其中被取代的氨基酸残基和所述替换氨基酸残基都是同一氨基酸组的成员，其中所述组包括：

-(1)芳香的：Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)；

-(2)非极性的：Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Ala(A)、Met(M)；

-(3)脂肪族的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)；

-(4)酸性的：Asp(D)、Glu(E)；

-(5)碱性的：His(H)、Lys(K)、Arg(R)；和

-(6)极性的：Gln(Q)、Asn(N)、Ser(S)、Thr(T)、Tyr(Y)。

8.如权利要求5所述的方法，其中被取代的氨基酸残基和所述替换氨基酸残基都是同一氨基酸组的成员，其中所述组包括：

-(1)疏水性的：Met(M)、Ala(A)、VaI(V)、Leu(L)、Ile(I)；

-(2)中性亲水性的：Cys(C)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gin(Q)；

-(3)酸性的：Asp(D)、GIu(E)；

-(4)碱性的：His(H)、Lys(K)、Arg R)；

-(5)影响链方向的残基：GIy(G)、Pro(P)；以及

-(6)芳香的：Trp(W)、Tyr(Y)、Phe(F)。

9.如权利要求3所述的方法，其中保守取代包括用衍生自所述靶标种的一种或多种免疫球蛋白的框架区的氨基酸序列的对应位置上存在的共有氨基酸残基取代所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区的氨基酸序列中存在的氨基酸残基。

10.如前述任一项权利要求所述的方法，还包括用衍生自源于所述靶标种的免疫球蛋白的重链/轻链恒定结构域替换所述供体免疫球蛋白的重链和/轻链的至少一个恒定结构域的步骤。

11.如权利要求10所述的方法，其中衍生自所述靶标种的恒定结构域是抗体亚型免疫球蛋白G(IgG)。

12.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述靶标种是哺乳动物靶标种。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物物种是选自狗、猫和马的伴侣动物。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物物种是人。

15.如前述任一项权利要求所述的方法，其中没有取代存在于所述供体免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域框架区的氨基酸序列中且也存在于衍生自所述靶标种的一种或多种免疫球蛋白的至少一种的框架区的氨基酸序列的对应位置上的任何氨基酸残基。

16.组合物，其含有权利要求1-15中任一项所产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段。

17.药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项所产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段，以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。

18.权利要求1-15中任一项所产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段，在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途。

19.权利要求1-15中任一项所产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段，用于治疗或预防疾病。

20.治疗有需要的个体的疾病的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-15中任一项产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段施用于所述个体的步骤。

21.用于施用于靶标种的免疫球蛋白，包含：

-衍生自所述靶标种的免疫球蛋白的轻链恒定结构域和重链恒定结构域，

-衍生自供体免疫球蛋白的互补性决定区(CDR)，其中所述供体免疫球蛋白特异性结合存在于所述供体物种和靶标种的配体，以及

-衍生自所述供体免疫球蛋白的框架区，其中在所述靶标种的任意免疫球蛋白中对应位置上不存在的任何氨基酸被在所述靶标种的对应位置发现的氨基酸取代。

22.如权利要求21所述的免疫球蛋白，其中不对所述抗体的CDR区进行氨基酸取代。

23.如权利要求21或22所述的免疫球蛋白，其中衍生自所述供体免疫球蛋白框架区的不多于7个连续氨基酸残基被来自所述靶标种的残基取代。

24.如权利要求21或22所述的免疫球蛋白，其中衍生自所述供体免疫球蛋白框架区的不多于5个连续氨基酸残基被来自所述靶标种的残基取代。

25.如权利要求21或22所述的免疫球蛋白，其中衍生自所述供体免疫球蛋白框架区的不多于3个连续氨基酸残基被来自所述靶标种的残基取代。

26.如权利要求21-23中任一项所述的免疫球蛋白，其中所述靶标种是哺乳动物物种。

27.如权利要求26所述的免疫球蛋白，其中所述哺乳动物物种选自人、犬、猫和马。

28.药物组合物，其包含权利要求21-27中任一项所述的免疫球蛋白或其抗原结合片段，以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。

29.如权利要求21-27中任一项所述的免疫球蛋白或其抗原结合片段，在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途。

30.如权利要求21-27中任一项所述的免疫球蛋白或其抗原结合片段，用于治疗或预防疾病。

31.治疗有需要的个体的疾病的方法，包括将治疗有效量的权利要求21-27中任一项产生的免疫球蛋白或其抗原结合片段施用于所述个体的步骤。

32.中和抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合人神经生长因子(NGF)，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:14，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

33.如权利要求32所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

34.如权利要求32或33所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

35.药物组合物，其包含权利要求32-34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。

36.分离的核酸，其编码权利要求32-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

37.分离的核酸，其编码能够特异性结合人神经生长因子(NGF)的中和抗体的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:13，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

38.分离的核酸，其编码能够特异性结合人神经生长因子(NGF)的中和抗体的轻链，其中所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

39.分离的核酸，其编码能够特异性结合人神经生长因子(NGF)的中和抗体的重链可变区，其中所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:14，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

40.分离的核酸，其编码能够特异性结合人神经生长因子(NGF)的中和抗体的重链，其中所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

41.如权利要求36-40中任一项所述的分离的核酸，其可操作地连接于一个或多个调控序列。

42.表达载体，其包含权利要求36-40中任一项所述的核酸。

43.如权利要求42所述的表达载体，其还包含一个或多个调控序列。

44.如权利要求42或43所述的表达载体，其中所述表达载体是质粒或逆转录病毒载体。

45.宿主细胞，其并入了权利要求42-44中任一项所述的表达载体。

46.产生人源化NGF中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：培养权利要求45所述的宿主细胞，以使所述细胞表达人源化抗NGF中和抗体或其抗原结合片段。

47.治疗、减轻或抑制有需要的人的疼痛的方法，所述方法包括以下步骤：将治疗有效量的权利要求32-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35所述的药物组合物、权利要求36-41中任一项所述的核酸或权利要求42-44中任一项所述的表达载体施用于所述人。

48.权利要求32-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35所述的药物组合物、权利要求36-41中任一项所述的核酸或权利要求42-44中任一项所述的表达载体，用于治疗或预防人的疼痛。

49.如权利要求48所述的抗体、抗原结合片段、药物组合物、核酸或表达载体，其中所述疼痛选自：急性疼痛、慢性疼痛、围术期疼痛、术后疼痛、炎性疼痛、瘙痒疼痛、矫形外科手术引起的疼痛、与软组织外科手术相关的疼痛、与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛以及与类风湿性关节炎、免疫介导的多发性关节炎或骨关节炎相关或由其引起的疼痛。

50.权利要求32-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35所述的药物组合物、权利要求36-41中任一项所述的核酸或权利要求42-44中任一项所述的表达载体，用于治疗人的关节炎。

51.如权利要求50所述的抗体、抗原结合片段、药物组合物、核酸或表达载体，其中所述关节炎选自：骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎或类风湿性关节炎。

52.权利要求32-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35所述的药物组合物、权利要求36-41中任一项所述的核酸或权利要求42-44中任一项所述的表达载体，在制备用于治疗或预防人的疼痛的药物中的用途。

53.权利要求32-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35所述的药物组合物、权利要求36-41中任一项所述的核酸或权利要求42-44中任一项所述的表达载体，在制备用于治疗或预防人的关节炎的药物中的用途。

54.治疗或预防人的关节炎的方法，所述方法包括以下步骤：将治疗有效量的权利要求32-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求35所述的药物组合物、权利要求36-41中任一项所述的核酸或权利要求42-44中任一项所述的表达载体施用于所述人。

55.细胞系或其衍生细胞或后代细胞，其产生权利要求32-34中任一项所述的抗人NGF中和单克隆抗体或其片段。

56.中和抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合犬神经生长因子(NGF)，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列，所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:69，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

57.如权利要求56所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

58.如权利要求56或57所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:70，或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

59.药物组合物，其包含权利要求56-58中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。

60.分离的核酸，其编码权利要求56-58中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

61.分离的核酸，其编码能够特异性结合犬神经生长因子(NGF)的中和抗体的重链可变区，其中所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ IDNO:69，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

62.分离的核酸，其编码能够特异性结合犬神经生长因子(NGF)的中和抗体的重链，其中所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:70，或与其具有至少85％同一性的氨基酸序列。

63.如权利要求60-62中任一项所述的分离的核酸，其可操作地连接于一个或多个调控序列。

64.表达载体，其包含权利要求60-62中任一项所述的核酸。

65.如权利要求64所述的表达载体，还包含一个或多个调控序列。

66.如权利要求64或65所述的表达载体，其中所述表达载体是质粒或逆转录病毒载体。

67.宿主细胞，其并入了权利要求64-66中任一项所述的表达载体。

68.产生犬源化NGF中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：培养权利要求67所述的宿主细胞，以使所述细胞表达犬源化抗NGF中和抗体或其抗原结合片段。

69.治疗、减轻或抑制有需要的犬的疼痛的方法，所述方法包括以下步骤：将治疗有效量的权利要求56-58中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求59所述的药物组合物、权利要求60-63中任一项所述的核酸或权利要求64-66中任一项所述的表达载体施用于所述犬。

70.权利要求56-58中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求59所述的药物组合物、权利要求60-63中任一项所述的核酸或权利要求64-66中任一项所述的表达载体，用于治疗或预防犬的疼痛。

71.如权利要求70所述的抗体、抗原结合片段、药物组合物、核酸或表达载体，其中所述疼痛选自：急性疼痛、慢性疼痛、围术期疼痛、术后疼痛、炎性疼痛、瘙痒疼痛、矫形外科手术引起的疼痛、与软组织外科手术相关的疼痛、与癌症或癌性病症相关的慢性疼痛以及与类风湿性关节炎、免疫介导的多发性关节炎或骨关节炎相关或由其引起的疼痛。

72.权利要求56-58中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求59所述的药物组合物、权利要求60-63中任一项所述的核酸或权利要求64-66中任一项所述的表达载体，用于治疗犬的关节炎。

73.如权利要求72所述的抗体、抗原结合片段、药物组合物、核酸或表达载体，其中所述关节炎选自：骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎和类风湿性关节炎。

74.权利要求56-58中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求59所述的药物组合物、权利要求60-63中任一项所述的核酸或权利要求64-66中任一项所述的表达载体，在制备用于治疗或预防犬的疼痛的药物中的用途。

75.权利要求56-58中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求59所述的药物组合物、权利要求60-63中任一项所述的核酸或权利要求64-66中任一项所述的表达载体，在制备用于治疗或预防犬的关节炎的药物中的用途。

76.治疗或抑制犬的关节炎的方法，所述方法包括以下步骤：将治疗有效量的权利要求56-58中任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求59所述的药物组合物、权利要求60-63中任一项所述的核酸或权利要求64-66中任一项所述的表达载体施用于所述犬。

77.细胞系或其衍生细胞或后代细胞，其产生权利要求56-58中任一项所述的抗犬NGF中和单克隆抗体或其片段。