JP2022088355A - 結合タンパク質及びその使用方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】ヒトGFRALタンパク質を含むGDNFファミリー受容体アルファ様(GFRAL)タンパク質に結合する結合タンパク質、例えば、抗体、及び、その使用方法を提供する。【解決手段】GDNFファミリー受容体アルファ様(GFRAL)タンパク質に結合する抗体又はその断片であって、該抗体又はその断片が、重鎖可変(VH)領域及び軽鎖可変(VL)領域を含み、(i)該VH領域が、特定のアミノ酸配列を含む相補性決定領域(CDR)1、CDR2、及びCDR3を含み；かつ、(ii)該VL領域が、特定のアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2、及びCDR3を含む、前記抗体又はその断片である。【選択図】なし

Description

(分野)
本出願は、その内容全体が引用により組み込まれる、2016年3月31日に出願された米国
仮出願第62/316,516号の恩典を主張する。
本開示は、全体として、ヒトGFRALタンパク質を含むGDNFファミリー受容体アルファ様(
GFRAL)タンパク質に結合する結合タンパク質、例えば、抗体及びその使用方法に関する。
(背景)
成長分化因子15(GDF15)は、形質転換成長因子ベータ(TGF-β)スーパーファミリーに属
するタンパク質である。GDF15は、TGF-PL、MIC-1、PDF、PLAB、NAG-1、及びPTGFBとして
も知られている。GDF15 mRNAは、肝臓に最も多く存在すると報告されており、より少ない
レベルがいくつかの他の組織に見られる。肝臓でのその発現は、肝臓、腎臓、心臓、及び
肺などの臓器の損傷時に顕著に上方調節されることがある。
GDF15は、損傷組織における及び疾患過程における炎症及びアポトーシス経路の調節に
おいて役割を果たすと報告されている。GDF15は、様々な疾患における悪液質のメディエ
ーターであると報告されている。しかしながら、悪液質は、複雑でかつ完全には理解され
ていない症候群である。さらに、少なくとも一部の腫瘍はGDF15を過剰発現及び分泌し、
血清GDF15レベルの上昇は様々な癌と関連付けられている。GDF-15は、TNF-α、IL-1、IL-
2、及びMCS-Fの放出を抑制し、それにより、TGF-βの効果と同様の局所的炎症シグナル伝
達の正のフィードバックを阻害することによるマクロファージ活性化の負の調節因子と記
載されている。GDF15に対するモノクローナル抗体は、悪液質及び癌の治療のための潜在
的治療剤として開示されている。GDF15の受容体は不明である。
悪液質又はサルコペニアなどの消耗性疾患及び全身性炎症又は急性炎症応答などの炎症
状態を含む、いくつかの疾患及び状態と関連する体重減少の治療に有効な治療剤に対する
満たされていない重大なニーズがある。癌、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核
症、慢性炎症性疾患、全身性炎症、並びに不随意の体重減少及び/又は筋肉量減少が関与
するものを含む筋消耗性疾患を含む、慢性疾患の治療に有効な治療剤に対する満たされて
いない重大なニーズもある。
(概要)
本開示は、GFRALタンパク質に結合する抗体などの結合タンパク質を含む、GDNFファミ
リー受容体アルファ様(GFRAL)タンパク質に結合するタンパク質を提供する。抗体を含む
、そのような結合タンパク質は、GFRALポリペプチド、GFRAL断片、及び/又はGFRALエピト
ープに結合することができる。抗体を含む、そのような結合タンパク質は、アンタゴニス
トである(例えば、GFRALタンパク質に対するGDF15タンパク質の結合を阻害し、GFRALタン
パク質に対するRETタンパク質の結合を阻害し、GDF15タンパク質誘導性シグナル伝達を阻
害し、かつ/又はGDF15/GFRALもしくはGDF15/GFRAL/RET受容体複合体の形成を阻害する)こ
とができる。
本開示は、(i)GFRALタンパク質に結合し、(ii)GFRALタンパク質に対するGDF15タンパク
質の結合を阻害し、かつ/又は(iii)GFRALタンパク質に対するRETタンパク質の結合を阻害
する、抗体(例えば、モノクローナル抗体)又はその断片を含む、結合タンパク質も提供す
る。
いくつかの実施態様において、抗GFRAL抗体は、GFRALポリペプチド、GFRAL断片、又はG
FRALエピトープに結合するヒト化抗体である。ある実施態様において、抗GFRAL抗体は、
本明細書に記載される1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2
I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8、もしく
はP8G4と表記されたモノクローナル抗体又はそのヒト化変異体のVH CDR1、VH CDR2、VH C
DR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3を含む。ある実施態様において、抗GFRAL抗体
は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列又はその変異体のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4
、VL FR1、VL FR2、VL FR3、及び/又はVL FR4をさらに含むことができる。
いくつかの実施態様において、結合タンパク質(例えば、抗GFRAL抗体)は、6つのCDR又
は6つ未満のCDRを含む。いくつかの実施態様において、結合タンパク質(例えば、抗GFRAL
抗体)は、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3から選択さ
れる1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDRを含む。いくつかの実施態様において、結
合タンパク質(例えば、抗GFRAL抗体)は、本明細書に記載される1C1、3P10、12A3、5F12、
5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2
、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8、もしくはP8G4と表記されたモノクローナル抗体又はその
ヒト化変異体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3から
選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDRを含む。いくつかの実施態様におい
て、結合タンパク質(例えば、抗GFRAL抗体)は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列又はそ
の変異体のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3、及び/又はVL FR
4を含む、スキャフォールド領域又はフレームワーク領域をさらに含む。
いくつかの実施態様において、抗体は、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体
、抗原結合断片、又はこれらの任意の組合せである。いくつかの実施態様において、抗体
は、GFRALポリペプチド(例えば、細胞表面発現もしくは可溶性GFRAL)、GFRAL断片、又はG
FRALエピトープに結合するヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。
本開示は、(i)本明細書に提供される抗GFRAL抗体がGFRALポリペプチド(例えば、細胞表
面発現もしくは可溶性GFRAL)、GFRAL断片、又はGFRALエピトープに結合するのを(例えば
、用量依存的に)競合的に遮断し、及び/或いは(ii)本明細書に提供される抗GFRAL抗体に
よって結合されるGFRALエピトープに結合する、結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体も
提供する。他の実施態様において、結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体は、本明細書
に記載されるモノクローナル抗体25M22、3P10、8D8、もしくは5F12、又はそのヒト化変異
体がGFRALポリペプチド(例えば、細胞表面発現もしくは可溶性GFRALタンパク質)、GFRAL
断片、又はGFRALエピトープに結合するのを(例えば、用量依存的に)競合的に遮断する。
他の実施態様において、結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体は、本明細書に記載され
るモノクローナル抗体25M22、3P10、8D8、もしくは5F12、又はそのヒト化変異体によって
結合される(例えば、認識される)GFRALエピトープに結合する。
本開示は、(i)それぞれ、配列番号3、7、11、もしくは15のアミノ酸配列を有する重鎖
可変領域及び配列番号4、8、12、もしくは16のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む
抗体によって認識されるGFRALタンパク質のエピトープに結合するか;又は(ii)GFRALタン
パク質に対する結合を、それぞれ、配列番号3、7、11、もしくは15のアミノ酸配列を有す
る重鎖可変領域及び配列番号4、8、12、もしくは16のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む抗体と競合する、抗体又はその断片を含む、結合タンパク質も提供する。いくつか
の実施態様において、GFRALタンパク質(例えば、ヒトGFRALタンパク質)の1以上のアミノ
酸の、エピトープを含む、領域に結合する、抗体又はその断片を含む、結合タンパク質が
本明細書に提供される。いくつかの実施態様において、抗体又はその断片を含む、結合タ
ンパク質は、GFRALタンパク質(例えば、細胞外ドメインの1以上のアミノ酸残基)の領域に
結合し、これには、例えば:(i)GFRALタンパク質のドメイン1(例えば、配列番号1797のア
ミノ酸残基Q20～S130);(ii)GFRALタンパク質のドメイン2(例えば、配列番号1797のアミノ
酸残基C131～C210);(iii)GFRALタンパク質のドメイン3(例えば、配列番号1797のアミノ酸
残基C220～C316);又は(iv)GFRALタンパク質の細胞外ドメイン(例えば、配列番号1797のア
ミノ酸残基Q20～E351)に結合するものが含まれる。
いくつかの実施態様において、GFRALタンパク質の特異的エピトープ(例えば、1以上の
アミノ酸残基)に結合する、抗体又はその断片を含む、結合タンパク質が本明細書に提供
され、これには、例えば:(i)GFRALタンパク質(配列番号1797)のアミノ酸残基SER156、GLN
147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR
175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN
145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO
197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER
207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134、もしくはALA135のうちの少なくとも1つ
(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;(ii)配列番号1797のア
ミノ酸残基LEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140
、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150
、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177
、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187
、PHE188、もしくはCYS189のうちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRA
Lタンパク質のエピトープ;(iii)配列番号1797のアミノ酸残基LEU164、LYS208、VAL212、A
SN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、T
RP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、TH
R295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LY
S305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SE
R315、CYS316、もしくはPHE317のうちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含む
GFRALタンパク質のエピトープ;(iv)配列番号1797のアミノ酸残基CYS233、ARG234、ARG235
、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245
、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255
、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266
、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303
、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315、もしくはCYS316のうちの少なくとも1つ(例
えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;(v)配列番号1797のアミノ
酸残基GLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LE
U152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、もしくはGLN200のう
ちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;(vi)
配列番号1797のアミノ酸残基GLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143
、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182
、もしくはMET185のうちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパ
ク質のエピトープ;(vii)配列番号1797のアミノ酸残基GLN298もしくはGLU301のうちの少な
くとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;又は(viii)配
列番号1797のアミノ酸残基ARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、
THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261、
又はLEU262のうちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質の
エピトープに結合するものが含まれる。上で提供されているそのような抗体は、いくつか
の実施態様において、例えば、GFRALタンパク質を発現する細胞におけるGDF15誘導性シグ
ナル伝達及び/又はGFRAL/GDF15もしくはRET/GFRAL/GDF15受容体複合体のシグナル伝達も
しくは活性化を阻害することができる。さらに、いくつかの実施態様において、該抗体は
、モノクローナル抗体、例えば、ヒト化、ヒト、又はキメラ抗体である。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される結合タンパク質、例えば、抗GFRA
L抗体は、診断剤、検出可能な薬剤(例えば、放射性同位体、酵素、蛍光化合物、生体発光
化合物、又は化学発光化合物)にコンジュゲートされているか又は組換えにより連結され
ている。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される結合タンパク質、例えば、
抗GFRAL抗体は、治療剤とともに使用される(例えば、投与される)。いくつかの態様にお
いて、治療剤は、アクチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤、もしくはIL-
6Rの阻害剤、グレリン、グレリン模倣物、もしくはGHS-RIaアゴニスト、SARM、TNFα阻害
剤、IL-Ia阻害剤、ミオスタチン阻害剤、ベータ-遮断薬、メラノコルチンペプチド阻害剤
、メラノコルチン受容体阻害剤、又は抗癌剤などの1以上の薬物を含む、薬物である。
ある実施態様において、本明細書に記載される結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体
を含む組成物が提供される。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される結合
タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体を含む医薬組成物である。
本開示は、GFRALポリペプチド、GFRALポリペプチド断片、又はGFRALエピトープ(例えば
、GFRALタンパク質の細胞外ドメインを含む、GFRALタンパク質の1以上のアミノ酸)に結合
する結合タンパク質(例えば、抗GFRAL抗体)の免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖
、VH領域、VL領域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3
をコードする単離された核酸分子も提供する。いくつかの実施態様において、該核酸分子
は、本明細書に記載される1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N
5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8、も
しくはP8G4と表記されたモノクローナル抗体又はそのヒト化変異体のVH領域、VL領域、VH
CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3をコードする。いくつ
かの実施態様において、該核酸分子は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列又はその変異体
のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3、及び/又はVL FR4を含む
、スキャフォールド領域又はフレームワーク領域をさらにコードする。また本明細書に提
供されるのは、結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体をコードする核酸分子を含むベク
ター及び宿主細胞、並びに本明細書に提供される宿主細胞を、結合タンパク質、例えば、
抗GFRAL抗体の産生を促進する条件下で培養することにより、結合タンパク質、例えば、
抗GFRAL抗体を産生する方法である。
本開示は、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病(例えば、1以上の症状)を含む、GFRAL媒
介性疾患、障害、又は疾病を治療、予防、又は緩和する方法であって、それを必要として
いる対象を含む、対象に、本明細書に提供される結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体
の治療有効量を投与し、それにより、該疾患、障害、又は疾病を治療、予防、又は緩和す
ることを含む、方法も提供する。いくつかの実施態様において、該疾患、障害、又は疾病
は、GDF15タンパク質(例えば、ヒトGDF15タンパク質)及び/もしくはGFRALタンパク質(例
えば、ヒトGFRALタンパク質)によって引き起こされるか、又は該タンパク質と別の形で関
連し、これには、例えば、対象におけるGDF15誘導性シグナル伝達に関連するものがある
。ある実施態様において、該疾患、障害、又は疾病は、悪液質、サルコペニア、もしくは
筋消耗、骨消耗、又は不随意の体重減少の発生、頻度、又は重症度を低下させることによ
り治療可能である。ある実施態様において、該疾患、障害、又は疾病は、悪液質である。
ある実施態様において、該疾患、障害、又は疾病は、癌である。ある実施態様において、
該疾患、障害、又は疾病は、心血管疾患である。ある実施態様において、該疾患、障害、
又は疾病は、慢性炎症性疾患(例えば、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患)である。ある実施
態様において、該疾患、障害、又は疾病は、GDF15タンパク質によって誘導されるか、又
はGDF15のレベルの上昇を含め、GDF15タンパク質に関連する、化学療法剤(例えば、抗腫
瘍抗体、例えば、トラスツズマブ)に対する感受性(例えば、抵抗性)が減少している癌で
ある。
いくつかの実施態様において、該疾患、障害、又は疾病は、悪液質、サルコペニア、筋
消耗又は筋肉量減少、骨消耗、不随意の体重減少(例えば、疾患、障害、もしくは疾病と
関連する又はこれらに起因する体重減少)であるか、或いはこれらと関連する。いくつか
の実施態様において、該疾患、障害、又は疾病は、限定されないが、癌、慢性腎疾患、慢
性閉塞性肺疾患、AIDS、結核症、慢性炎症性疾患、敗血症及び他の形態の全身性炎症、筋
消耗、例えば、筋ジストロフィー、並びに神経性無食欲として知られる摂食障害を含む、
悪液質と関連する基礎疾患群から選択される。
いくつかの実施態様において、該治療、予防、又は改善する方法は、体重増加を改善し
もしくは体重減少を低下させるか、又は筋肉量増加を改善しもしくは筋肉量減少を低下さ
せる方法を含む。いくつかの実施態様において、該治療、予防、又は改善する方法は、悪
液質、サルコペニアもしくは筋消耗、骨消耗、又は不随意の体重減少の発生、頻度、又は
重症度を予防し、最小化し、又は低下させることにより、癌を治療する方法を改善する。
本開示は、試料中のGFRALを検出する方法であって、該試料を、検出可能な薬剤を含む
、本明細書に記載される結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体と接触させることを含む
、方法も提供する。ある実施態様において、試料は、その表面にGFRALを発現する細胞を
含む。
本開示は、本明細書に記載されるGFRALポリペプチド、GFRAL断片、又はGFRALエピトー
プに結合する結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体を含むキットも提供する。
(図面の簡単な説明)
図1は、様々なGFRALタンパク質間の配列アラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図2は、様々なGDF15タンパク質間の配列アラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図3は、例示的な抗GFRAL抗体1C1及び3P10のGFRALタンパク質に対する結合親和性を示す実験の結果を示している。
図4A～4Bは、例示的な抗GFRAL抗体のVH及びVL配列のアラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図5A～5Fは、GFRALのドメイン1(図5A～5B)、ドメイン2(図5C～5D)、又はドメイン3(図5E～5F)に結合する例示的な抗GFRAL抗体のVH及びVL配列のアラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図6A～6Bは、ヒト化1C1抗体のVH及びVL配列のアラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図7A～7Bは、ヒト化25M22抗体のVH及びVL配列のアラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図8A～8Bは、ヒト化17J16抗体のVH及びVL配列のアラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図9A～9Bは、ヒト化5F12抗体のVH及びVL配列のアラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図10A～10Bは、ヒト化3P10抗体のVH及びVL配列のアラインメントを示している。配列番号は、括弧内に太字のテキストで記載されている。
図11は、ヒト化GFRAL抗体を用いた受容体アンタゴニストアッセイの結果を示している。
図12は、ヒト化抗体を示すElk1レポーターアッセイの結果を示している。
図13A～13Cは、例示的なヒト化抗GFRAL抗体の特異性を示す実験の結果を示している。
図14A～14Bは、DIOマウスにおけるGDF15誘導性の体重減少の抗GFRAL抗体阻害を示す実験の結果を示している。図14Aについて、図の左から右に、施された処置は、それぞれ、PBS、3P10、1C1、17J16、5A20、25M22、5F12、及び1MO3(それぞれ、d1、d2、及びd3について)であった。図14Bについて、図の左から右に、施された処置は、それぞれ、PBS、8D8、及び12A3(それぞれ、d1、d2、及びd3について)であった。
図15は、GDF15誘導性の体重減少のモデルにおける抗GFRAL抗体を示す実験の結果を示している。
図16は、食餌摂取に対する抗GFRAL抗体の効果を示す実験の結果を示している。
図17は、DIOマウスにおける体重に対する抗GFRAL抗体の効果を示す実験の結果を示している。
図18は、DIOマウスにおける食餌摂取に対する抗GFRAL抗体の効果を示す実験の結果を示している。
図19は、脂肪量に対する抗GFRAL抗体の効果を示す実験の結果を示している。
図20は、DIOマウスにおけるGDF15誘導性の体重減少並びに脂肪量及び除脂肪量減少に対する抗GFRAL抗体の効果を示す実験の結果を示している。
図21は、DIOマウスにおけるGDF15誘導性のエネルギー消費量増加及びGDF15誘導性の食餌摂取低下に対する抗GFRAL抗体の効果を示す実験の結果を示している。
図22は、痩せたマウスにおけるGDF15誘導性の体重減少並びに脂肪量及び除脂肪量減少に対する抗GFRAL抗体の効果を示す実験の結果を示している。
図23は、痩せたマウスにおけるGDF15誘導性のRER変化及びGDF15誘導性の食餌摂取低下に対する抗GFRAL抗体の効果を示す実験の結果を示している。
図24は、痩せたマウスにおける体重に対する抗GFRAL抗体(3P10)の効果を示す実験の結果を示している。
図25は、痩せたマウスにおける食餌摂取に対する抗GFRAL抗体の投与の効果を示す実験の結果を示している。
図26A～26Cは、食餌性アデニンの効果を示す実験の結果を示している。
図27Aは、食餌性アデニンの効果を示す実験の結果を示している。
図27Bは、慢性腎傷害を有するマウスに対する例示的な抗GFRAL抗体(3P10)の効果を示す
実験の結果を示している。
図28は、慢性腎傷害を有するマウスに対する例示的な抗GFRAL抗体(3P10)の効果を示す実験の結果を示している。
図29は、GDF15誘導性の体重減少の例示的なヒト化抗GFRAL抗体(h3P10)の効果を示す実験の結果を示している。
図30は、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質の複合体の例示的な結晶を示している。
図31は、例示的なGFRAL電子密度図を示している。
図32は、非対称のGFRAL/GDF15結晶単位中に形成されたGFRAL/GDF15複合体の例示的なリボンダイアグラムを示している。GFRALタンパク質ドメインD2及びD3は、GFRAL D2及びGFRAL D3として示されている。
図33は、2つのGFRAL/GDF15複合体の二量体の例示的なリボンダイアグラムを示している。GFRALタンパク質ドメインD2及びD3は、GFRAL D2及びGFRAL D3として示されている。
図34A～34Bは、2つのGFRAL/GDF15複合体の二量体の異なる表面表示を示している。
図35は、GDF15アミノ残基と相互作用しているGFRALアミノ残基を示している。
図36A～36Dは、GFRAL/GDF15界面を示している。GFRALタンパク質ドメインD2及びD3は、GFRAL D2及びGFRAL D3として示されている。
図37A～37Bは、リボンダイアグラムとして示されたGFRALタンパク質とGFRα1の重合せの異なる側面を示している。
図38A～38Dは、RET/GFRAL/GDF15モデルにおけるGFRALタンパク質とRETタンパク質との相互作用の異なる側面を示している。
図39A～39Bは、GFRALタンパク質のRETタンパク質界面のアミノ酸残基を示している。
図40は、結晶化条件B11、D11、及びH8の下で生成されるGFRALタンパク質、3P10 Fab、及び25M22 Fabを有する複合体の例示的な結晶を示している。
図41は、結晶化条件C6、E11、及びC2の下で生成されるGFRALタンパク質、8D8 Fab、及び5F12 Fabを有する複合体の例示的な結晶を示している。
図42は、GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体の結晶構造における3P10 Fab及び25M22 Fab CDR領域の例示的な電子密度図を示している。
図43は、GFRAL/8D8/5F12 Fab複合体の例示的な電子密度を示している。
図44は、非対称のGFRAL/3P10/25M22 Fab複合体結晶単位中に形成されたGFRAL/3P10/25M22 Fab複合体の例示的なリボンダイアグラムを示している。
図45は、3P10 Fab及び25M22 Fab CDR配列(上の列)と、3P10 Fab及び25M22 Fab結合に関与するGFRALアミノ酸残基(下の列)とのアラインメントを示している。GFRAL-Fab相互作用に関与する残基は、枠で囲まれている。3P10 Fabの場合、配列番号1824のアミノ酸残基Q1～S120がHcについて示されており、配列番号1825のアミノ酸残基D1～F120がLcについて示されている。25M22 Fabの場合、配列番号1826のアミノ酸残基Q1～S120がHcについて示されている。
図46は、GFRAL 3P10 Fabエピトープと3P10 Fab重鎖CDR領域の相互作用を示すリボンダイアグラムを示している。
図47は、GFRAL 3P10 Fabエピトープと3P10 軽鎖CDR領域の相互作用を示すリボンダイアグラムを示している。
図48は、GFRAL 25M22エピトープと25M22 Fab重鎖CDR領域の相互作用を示すリボンダイアグラムを示している。
図49は、GFRALタンパク質(配列番号1797の残基S130～N318)並びに配列番号1826の25M22 Fab重鎖(HC)残基Q1～P138及びG146～P225並びに配列番号1827の軽鎖(LC)残基D1～E218のアミノ酸配列を示している。灰色の背景及び白のテキストを有する残基は、GFRALタンパク質と25M22 Fabの両方のコア相互作用界面アミノ酸を示している。灰色の背景を黒又は白のレタリングとともに有するFab HC又はLC上の残基は、25M22 Fabの例示的なCDR配列を示している。
図50A～50Bは、GFRAL/25M22 Fab相互作用に関与するGFRALタンパク質上及び25M22 Fab上のコア相互作用界面アミノ酸残基を示している。
図51は、GFRAL/25M22 Fab相互作用に関与するGFRALタンパク質上の境界相互作用界面アミノ酸残基を示している。
図52は、GFRALタンパク質上の重複する25M22 Fab及びGDF15エピトープ(コア相互作用界面アミノ酸)を示すリボンダイアグラムの例示的な側面図を空間充填表面モデルとして示している。
図53は、GFRALタンパク質上の重複する25M22 Fab及びGDF15エピトープ(コア相互作用界面アミノ酸)を示すリボンダイアグラムの上面図を空間充填表面モデルとして示している。
図54は、GFRALタンパク質(配列番号1797の残基S130～N318)並びに配列番号1824の3P10 Fab重鎖(HC)残基Q1～A130及びG138～C221並びに配列番号1825の軽鎖(LC)残基D1～C218のアミノ酸配列を示している。灰色の背景及び白のテキストを有する残基は、GFRALタンパク質と3P10 Fabの両方のコア相互作用界面アミノ酸を示している。灰色の背景を黒又は白のレタリングとともに有するFab HC又はLC上の残基は、3P10 Fabの例示的なCDR配列を示している。
図55A～55Bは、GFRAL/3P10 Fab複合体の結晶構造を示すリボンダイアグラムを示している。相互作用界面残基は、棒モデル(図55A)又は空間充填表面モデル(図55B)として示されている。
図56A～56Bは、GFRAL 3P10 Fabエピトープの界面残基をGFRALのリボンダイアグラムでの空間充填表面モデルとして示している。図56Aは、コア相互作用界面残基を示し、図56Bは、境界相互作用界面残基を示している。
図57は、重複する3P10 Fabに結合するGFRALタンパク質の残基及びRETタンパク質に結合するGFRALタンパク質の残基をGFRALタンパク質のリボンダイアグラムでの空間充填表面モデルとして示している。
図58は、3P10 Fab及び25M22 Fabに結合するGFRALタンパク質の境界相互作用界面残基の統合された範囲を示している。
図59は、非対称のGFRAL/8D8/5F12 Fab複合体結晶単位中に形成されたGFRAL/8D8/5F12 Fab複合体の例示的なリボンダイアグラムを示している。
図60は、GFRALタンパク質上の8D8 Fab及び5F12 Fab結合部位の例示的なリボンダイアグラムを示している。Fab結合に重要なGFRALタンパク質上の残基が棒モデルとして示されている。
図61は、GFRALタンパク質(配列番号1797の残基S130～N318)及び配列番号1828の8D8 Fab重鎖(HC)残基Q1～K217及び配列番号1829の軽鎖(LC)残基D1～R211のアミノ酸配列を示している。灰色の背景及び白のテキストを有する残基は、GFRALタンパク質と8D8 Fabの両方のコア相互作用界面アミノ酸を示している。灰色の背景を黒又は白のレタリングとともに有するFab HC又はLC上の残基は、8D8 Fabの例示的なCDR配列を示している。
図62A、62B、62C、及び62Dは、GFRAL/8D8 Fab相互作用界面におけるコア及び境界アミノ酸残基を示している。
図63A、63B、63C、及び63Dは、GFRAL/5F12 Fab相互作用界面におけるコア及び境界アミノ酸残基を示している。
図64は、GFRAL(配列番号1797の残基S130～N318)及び配列番号1830の5F12 Fab重鎖(HC)残基Q1～K223及び配列番号1831の軽鎖(LC)残基N1～E217のアミノ酸配列を示している。灰色の背景及び白のテキストを有する残基は、GFRALタンパク質と5F12 Fabの両方のコア相互作用界面アミノ酸を示している。灰色の背景を黒又は白のレタリングとともに有するFab HC又はLC上の残基は、5F12 Fabの例示的なCDR配列を示している。
(詳細な説明)
ヒトGFRALタンパク質を含む、GFRALタンパク質に結合する、結合タンパク質、例えば、
抗体が本明細書に提供される。本明細書に開示される抗体を含む、そのような結合タンパ
ク質の独特な性質は、その拮抗的な性質であり、これには、GDF15タンパク質の効果を阻
害する能力及び/又はGFRALタンパク質に対するGDF15タンパク質の結合を阻害する能力も
しくはGFRALタンパク質に対するRETタンパク質の結合を阻害する能力が含まれ、これには
、結合の阻害がGDF15シグナル伝達を低下させる(例えば、遮断する)場合が含まれる。顕
著かつ具体的には、本明細書に開示されるGFRALタンパク質に対する結合タンパク質、例
えば、抗体は、(i)GFRALタンパク質に結合し、(ii)GFRALタンパク質に対するGDF15タンパ
ク質の結合を阻害し、かつ/又は(iii)GFRALタンパク質に対するRETタンパク質の結合を阻
害し、これには、例えば、いくつかのインビトロの細胞ベースのアッセイによって測定さ
れるものを含む、GDF15/GFRALタンパク質複合体もしくはGDF15/GFRAL/RETタンパク質複合
体の形成又はGDF15シグナル伝達を遮断することが含まれる。そのようなアッセイとして
は、(1)ELK1-ルシフェラーゼレポーターアッセイ(例えば、実施例3参照);及び/又は(2)U2
OS細胞におけるERK-リン酸化アッセイ(例えば、実施例4参照)を挙げることができる。し
たがって、本明細書に記載される結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体は、インビボの(
例えば、GDF15のシグナル伝達機能と関連する)GDF15活性を阻害すると考えられる。この
性質のために、抗GFRAL抗体を含む、開示された結合タンパク質は、GDF15タンパク質(例
えば、ヒトGDF15タンパク質)及び/又はGFRALタンパク質(例えば、ヒトGFRALタンパク質)
によって引き起こされるか、又は該タンパク質と別の形で関連する疾患、障害、又は疾病
、例えば、対象におけるGDF15誘導性シグナル伝達と関連するものの治療のための実現可
能な治療剤となる。
本明細書に提供される結合タンパク質、例えば、GFRALタンパク質に結合する抗体は、(
i)GFRALタンパク質に対するGDF15タンパク質の結合及び/又は(ii)GFRALタンパク質に対す
るRETタンパク質の結合に拮抗するという共通の特徴を共有する。本明細書に提供される
抗GFRAL抗体には、表1～24もしくは図4～10に記載されるCDR配列を有する、1C1、3P10、1
2A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N16、1B3、19K19、2B3、8C10
、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8、及び/もしくはP8G4に由来し又はこれらに基
づくヒト化抗GFRAL抗体を含む、ヒト化抗GFRAL抗体が含まれる。ヒト化抗GFRAL抗体を含
む、そのような抗GFRAL抗体は、GFRALタンパク質の特定のドメインに結合し、これには、
例えば:(i)GFRALタンパク質のドメイン1(例えば、配列番号1797のアミノ酸残基Q20～S130
);(ii)GFRALタンパク質のドメイン2(例えば、配列番号1797のアミノ酸残基C131～C210);(
iii)GFRALタンパク質のドメイン3(例えば、配列番号1797のアミノ酸残基C220～C316);又
は(iv)GFRALタンパク質の細胞外ドメイン(例えば、配列番号1797のアミノ酸残基Q20～E35
1)に結合するものが含まれる。
本開示のいくつかの実施態様において、結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体は、表1
～24に記載される1以上の相補性決定領域(CDR)を含む免疫グロブリン可変領域を含むこと
ができる。そのような結合タンパク質(例えば、抗GFRAL抗体)において、CDRは、1以上の
スキャフォールド領域又はフレームワーク領域と接続されていてもよく、該領域は、CDR
の適切な抗原結合特性が達成されるようにCDRを配向させる。本明細書に記載される抗GFR
AL抗体を含む、そのような結合タンパク質は、(i)GDF15タンパク質とGFRALタンパク質の
相互作用及び/又は(ii)RETタンパク質とGFRALタンパク質の相互作用を阻害する(例えば、
遮断する)ことができる。本明細書に記載される抗GFRAL抗体を含む、そのような結合タン
パク質は、GDF15シグナル伝達を阻害する(例えば、遮断する)ことができる。
本開示のいくつかの実施態様において、結合タンパク質、例えば、抗GFRAL抗体は:(i)G
FRALタンパク質(配列番号1797)のアミノ酸残基SER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150
、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138
、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189
、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200
、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132
、GLU133、VAL134、もしくはALA135のうちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を
含むGFRALタンパク質のエピトープ;(ii)配列番号1797のアミノ酸残基LEU132、GLU133、VA
L134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CY
S144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、AL
A169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、AS
N181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188、もしくはCYS189のう
ちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;(iii
)配列番号1797のアミノ酸残基LEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO21
6、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28
、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298
、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308
、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316、もしくはPHE317
のうちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;
(iv)配列番号1797のアミノ酸残基CYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、TH
R239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、TH
R249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、IL
E259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、AS
P274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、ME
T310、SER315、もしくはCYS316のうちの少なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含む
GFRALタンパク質のエピトープ;(v)配列番号1797のアミノ酸残基GLY140、LEU148、ALA149
、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204
、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、もしくはGLN200のうちの少なくとも1つ(例えば、1
つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;(vi)配列番号1797のアミノ酸残基G
LU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、G
LN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182、もしくはMET185のうちの少
なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;(vii)配列
番号1797のアミノ酸残基GLN298もしくはGLU301のうちの少なくとも1つ(例えば、1つもし
くは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープ;又は(viii)配列番号1797のアミノ酸残基A
RG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、C
YS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261、もしくはLEU262のうちの少
なくとも1つ(例えば、1つもしくは複数)を含むGFRALタンパク質のエピトープに結合する
。上で提供されているそのような抗体は、いくつかの実施態様において、例えば、GFRAL
タンパク質を発現する細胞におけるGDF15誘導性シグナル伝達及び/又はGFRAL/GDF15もし
くはRET/GFRAL/GDF15受容体複合体のシグナル伝達もしくは活性化を阻害することができ
る。さらに、本開示のいくつかの実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体、例
えば、ヒト化抗体である。
(一般的な技法)
本明細書に記載又は言及される技法及び手順は、当業者によって一般に十分に理解され
ており、かつ/又は従来の方法論、例えば、Sambrookらの文献、分子クローニング:実験マ
ニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第3版(2001) Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;分子生物学の最新プロトコル(Current P
rotocols in Molecular Biology)(F. M. Ausubelら編(2003));治療用モノクローナル抗体
:ベンチから臨床まで(Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic)、Z.
An編、Wiley, Hoboken N.J.(2009);モノクローナル抗体:方法及びプロトコル(Monoclona
l Antibodies: Methods and Protocols)、M. Albitar編、Humana Press, Totawa, N.J.(2
010);及び抗体エンジニアリング(Antibody Engineering)、第2版、第1巻及び第2巻、Kont
ermann及びDubel編、Springer-Verlag, Heidelberg, 2010に記載されている広く利用され
ている方法論などを用いて一般に利用されるものを含む。
(専門用語)
別途記載されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は全て、当業者に
よって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書を解釈するために、以下の用
語の説明が適用され、適切な場合はいつでも、単数で使用される用語は複数も含み、逆も
また同様である。特許、出願、公開出願、及び他の刊行物は全て、引用により完全に組み
込まれる。記載された用語の任意の説明が引用により本明細書中に組み込まれる任意の文
書と相容れない場合、下記の用語の説明が優先されるものとする。
「GDNFファミリー受容体アルファ様」、「成長分化因子15受容体」、「GFRAL」、又は
「GFRALタンパク質」という用語及び類似の用語は、別途示されない限り、ポリペプチド(
「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用される)又は哺乳動物
、例えば、霊長類(例えば、ヒト、カニクイザル(cyno))、イヌ、並びに齧歯類(例えば、
マウス及びラット)を含む、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブなGFRALを指し、あ
る実施態様において、これには、そのSNP変異体を含む、関連するGFRALポリペプチドが含
まれる。GFRALは、「C6orf144」、「第6番染色体オープンリーディングフレーム144」、
「BA360D14.1」、「IVFI9356」、及び「UNQ9356」としても当技術分野で公知である。
全長前駆体ヒトGFRALのアミノ酸配列が以下に提供されており、これには、シグナルペ
プチド配列(下線が付された小文字の残基)が含まれる:
Figure 2022088355000001
成熟ヒトGFRALポリペプチドのアミノ酸配列が以下に提供されている:
Figure 2022088355000002
いくつかの実施態様において、GFRALは、成熟ヒトGFRAL(配列番号1798)のアミノ酸配列
と少なくとも55％同一であるタンパク質を指す。結合タンパク質、例えば、本明細書に開
示される抗GFRAL抗体は、本明細書に記載されるように、GFRALに結合し、かつ/又はシグ
ナル伝達を調節することができる。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体は
、ヒトGFRALに結合する。
ヒトGFRALは、細胞外ドメイン(例えば、配列番号1797の残基20～351)、膜貫通ドメイン
(例えば、配列番号1797の残基352～371)、及び細胞質ドメイン(例えば、配列番号1797の
残基372～394)を有する。
前駆体GFRALポリペプチドをコードする核酸配列が以下に提供されている:
Figure 2022088355000003
Figure 2022088355000004
。
本明細書で使用される「GFRAL」は、ヒトGFRAL及び限定されないが、例えば、マウスGF
RAL、ラットGFRAL、カニクイザルGFRALなどの、そのオルソログを含む、その変異体を包
含する。GFRALは、TGFβRII(NCBI参照配列: NM_001024847.2(GI:133908632); NM_003242.
5(GI:133908633))でも、そのオルソログでもない。GFRALは、TGFβRI(NCBI参照配列: NP_
001124388.1(GI:195963412); NP_004603.1(GI:4759226))又はそのオルソログと異なる。
ある実施態様において、GFRALは、配列番号1797と少なくとも55％、60％、65％、70％、7
5％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又はそれを上回って同一であ
るアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。そのような例示的なGFRALタンパク質に
は、図1に示されるように、チンパンジー(99％)、カニクイザル(92％)、ジャイアントパ
ンダ(82％)、イヌ(81％)、ネコ(80％)、ブタ(77％)、ウシ(75％)、マウス(70％)、ラット
(70％)、チャイニーズハムスター(65％)、及びカモノハシ(59％)が含まれる。
カニクイザル(cyno)、学名マカカ・ファスシクラリス(Macaca fascicularis)由来のGFR
ALタンパク質のアミノ酸配列が以下に提供されており、これには、シグナルペプチド配列
(下線が付された残基)が含まれる:
Figure 2022088355000005
 。
カニクイザルGFRALタンパク質のコード核酸配列が以下に提供されている:
Figure 2022088355000006
マウス、学名ムス・ムスクルス(Mus musculus)由来のGFRALタンパク質のアミノ酸配列
が以下に提供されており、これには、シグナルペプチド配列(下線が付された残基)が含ま
れる:
Figure 2022088355000007
マウスGFRALタンパク質のコード核酸配列が以下に提供されている:
Figure 2022088355000008
Figure 2022088355000009
Figure 2022088355000010
ラット、学名ラトゥス・ノルベギクス(Rattus norvegicus)由来のGFRALタンパク質のア
ミノ酸配列が以下に提供されており、これには、シグナルペプチド配列(下線が付された
残基)が含まれる:
Figure 2022088355000011
ラットGFRALタンパク質のコード核酸配列が以下に提供されている:
Figure 2022088355000012
GFRALタンパク質又はGFRALは、1以上のアミノ酸残基の(例えば、変異体及び/又は種を
超えて保存されていない位置での)改変を有するが、保存されたドメインを保持し、かつ
天然に存在するGFRALと同様の生物学的活性を有するタンパク質も指す。GFRALは、天然に
存在するDNA配列と1以上の塩基が異なるが、それでも、遺伝暗号の縮重のために天然に存
在するタンパク質に対応するアミノ酸配列に翻訳される核酸配列によってコードされても
よい。GFRALタンパク質は、GFRALの天然に存在する配列と1以上の保存的置換及び/又はタ
グ及び/又はコンジュゲートの分だけ異なるタンパク質も指す。
「GFRAL」又は「GFRALタンパク質」という用語は、「全長」のプロセシングされていな
いGFRAL、及び細胞内でのプロセシングによって生じるGFRALの任意の形態を包含する。GF
RAL又は「GFRALタンパク質」という用語には:アレル変異体(例えば、SNP変異体);スプラ
イス変異体;アイソフォーム;断片;誘導体;置換、欠失、及び挿入変異体;融合ポリペプチ
ド;並びに種間ホモログ、好ましくは、GFRAL活性を保持し、及び/又は抗GFRAL免疫応答を
発生させるのに十分であるものも含まれる。当業者が理解しているように、本明細書に提
供される抗GFRAL抗体は、GFRALポリペプチド断片、GFRAL抗原、及び/又はGFRALエピトー
プを含む、GFRALタンパク質に結合することができる。エピトープは、より大きいGFRAL抗
原の一部であってもよく、該GFRAL抗原は、より大きいGFRALポリペプチド断片の一部であ
ってもよく、そして、該GFRALポリペプチド断片は、より大きいGFRALタンパク質の一部で
あってもよい。GFRALタンパク質は、ネイティブな形態又は変性した形態で存在すること
ができる。本明細書に記載されるGFRALタンパク質は、様々な源から、例えば、ヒト組織
型からもしくは別の源から単離するか、又は組換え法もしくは合成法により調製すること
ができる。GFRALタンパク質は、自然から得られる対応するGFRALポリペプチドと同じアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。GFRALタンパク質は、切断又は分泌
された形態のGFRALポリペプチド(例えば、細胞外ドメイン配列)、該ポリペプチドの変異
体形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びアレル変異体を包含する。本明
細書に記載されるGFRALポリペプチド(例えば、ヒトGFRAL)は、様々な源から、例えば、ヒ
ト組織型からもしくは別の源から単離するか、又は組換え法もしくは合成法により調製す
ることができる。
GFRALタンパク質は、天然に存在する全長GFRALポリペプチドと比べて、少なくとも5個
、少なくとも10個、最大少なくとも50個、又はそれより多くのアミノ酸を欠如することが
できる。例えば、GFRALタンパク質は、天然に存在するGFRALポリペプチドのアミノ酸配列
に基づくシグナル配列を含有しなくてもよい。GFRALタンパク質はまた、天然に存在するG
FRALポリペプチドと同じもしくは同様の翻訳後修飾を含有してもよく、又は翻訳後修飾を
含有しなくてもよい。例えば、該タンパク質は、天然に存在するGFRALポリペプチドと同
じもしくは同様のグリコシル化パターンを有してもよく、又はグリコシル化を全く含有し
なくてもよい。他の実施態様において、GFRLタンパク質は、天然に存在するGFRALタンパ
ク質の配列と比べて、天然に存在するGFRALタンパク質中に存在しない位置にグリコシル
化部位を導入する突然変異を含む。
ある実施態様において、GFRALタンパク質は、GFRALタンパク質をその細胞表面に発現す
るように遺伝子修飾された組換え細胞によって発現され得る。該細胞は、単離されたGDF1
5タンパク質を含む組成物中に存在し得る。ある場合、該細胞は、RETタンパク質をさらに
発現し得る、例えば、該細胞は、RETタンパク質をコードする外因性配列を含むように遺
伝子修飾されることなく、RETタンパク質を内在性に発現し得る。他の実施態様において
、該細胞は、検出可能なレベルのRETタンパク質を発現しなくてもよく、かつ外因性配列
由来のRETタンパク質を発現するように遺伝子修飾されていてもよい。
また本明細書に開示されるのは、GFRALタンパク質の断片、例えば、ネイティブのGFRAL
タンパク質中に存在する細胞内ドメイン、又はネイティブのGFRALタンパク質、例えば、
図1に示されるネイティブのGFRAL中に存在する細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインを欠く
GFRAL断片である。上記のように、GFRALタンパク質の断片はまた、ネイティブのGFRAL中
に存在するシグナル配列を欠いてもよく、かつ異種シグナル配列を含んでも含まなくても
よい。該断片は、ネイティブのGFRALタンパク質中に存在する細胞内ドメインを欠いても
よいが、膜貫通ドメインを含む。
「GFRAL-細胞外ドメイン」(「GFRAL-ECD」)という用語には、全長GFRAL ECD、GFRAL EC
D断片、及びGFRAL ECD変異体が含まれる。本明細書で使用される場合、「GFRAL ECD」と
いう用語は、細胞内及び/又は膜貫通ドメインを欠く、シグナルペプチドを有する又は有
さないGFRALポリペプチドを指す。いくつかの実施態様において、GFRAL ECDは、以下のア
ミノ酸配列を有するヒト全長GFRAL ECDのアミノ酸配列と少なくとも70％同一であるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質を指す:
Figure 2022088355000013
本明細書で使用される「全長GFRAL ECD」という用語は、細胞外ドメインの最後のアミ
ノ酸にまで及び、かつN-末端シグナルペプチドを含んでも含まなくてもよい、GFRAL ECD
を指す。しかしながら、「全長GFRAL ECD」は、膜貫通ドメインのアミノ酸残基を含むよ
うにC-末端で1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸だけ延長されているGFRAL-ECD
も包含する(ただし、該ポリペプチドは可溶性である)ことに留意されたい。言い換えると
、そのようなGFRAL ECDは、それが細胞膜にアンカリングされないように、十分な長さの
膜貫通ドメインを欠いている。「全長GFRAL ECD」という語句は、シグナルペプチドのア
ミノ酸残基を含むようにN-末端で1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸だけ延長
されているGFRAL-ECDも包含する。ある実施態様において、GFRAL ECDは、図1に示される
連続するアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％、又はそれを上回って同一であり、かつ図1に示されるGFRAL配列のC-末端で少
なくとも30、33、35、40、45、50、もしくは55個のアミノ酸、又はそれより多くを欠く、
連続するアミノ酸配列を指す。
GFRAL ECDは、TGFβRII(アクセッション番号: NM_001024847.2; NM_003242.5)のECDで
も、そのオルソログでもない。GFRAL ECDは、TGFβRI(アクセッション番号: NP_00112438
8.1; NP_004603.1)又はそのオルソログのECDと異なる。ある実施態様において、GFRAL EC
Dは、配列番号1806と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98
％、99％、又はそれを上回って同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
本明細書で使用される場合、「GFRAL ECD断片」という用語は、1以上の残基が全長ECD
のN及び/又はC末端から欠失しており、かつGDF15に結合する能力を保持しているGFRAL EC
Dを指す。いくつかの例において、GFRAL ECD断片は、N-末端シグナルペプチドを含んでも
含まなくてもよい。いくつかの例において、GFRAL ECD断片は、以下の配列のN-末端に存
在する1、5、10、15、16、17、18、又は19個の残基を欠くヒトGFRAL ECD断片である:
Figure 2022088355000014
別の例示的なGFRAL ECD断片は、全長ヒト前駆体GFRALタンパク質のQ20～C316に対応す
る以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2022088355000015
さらに別の例示的なGFRAL ECD断片は、全長ヒト前駆体GFRALタンパク質のW115～E351に
対応する以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2022088355000016
 上記の例示的なGFRAL ECD断片を、GFRALタンパク質及びGDF15タンパク質又はGFRALタンパ
ク質及び例示的な抗GFRAL抗体を含む複合体の結晶を産生するためのものを含む、実施例
に記載されている様々な方法で使用した。
GFRALタンパク質又はGFRAL ECDの内部に、3つのドメイン－ドメイン1(D1)、ドメイン2(
D2)、及びドメイン3(D3)がある。いくつかの実施態様において、例示的なD1ドメインのア
ミノ酸配列は、配列番号1797の残基Q20～S130である。いくつかの実施態様において、例
示的なD2ドメインのアミノ酸配列は、配列番号1797の残基C131～C210である。いくつかの
実施態様において、例示的なD3ドメインのアミノ酸配列は、配列番号1797の残基C220～C3
16である。GFRALタンパク質のある性質は、ECD内のものを含む、これらのドメインの活性
及び/又は結合に帰することができる。例えば、本明細書に記載されているように、D2内
のアミノ酸残基は、GDF15タンパク質に対するGFRALタンパク質結合のためのコア相互作用
界面アミノ酸及び/又は境界相互作用界面アミノ酸であると特定されている。同様に、本
明細書に記載されているように、D3内のアミノ酸残基は、RETタンパク質に対するGFRALタ
ンパク質結合のためのコア相互作用界面アミノ酸及び/又は境界相互作用界面アミノ酸で
あると特定されている。
「コア相互作用界面アミノ酸」という用語又はその文法的等価物は、少なくとも1つの
原子が、相互作用するタンパク質から4.5Å以下の範囲内にある所与のタンパク質のアミ
ノ酸残基(例えば、GDF15タンパク質又はRETタンパク質と相互作用するGFRALタンパク質の
アミノ酸)を指す。4.5Åという距離は、ファンデルワールス半径＋起こり得る水を介した
水素結合以内の原子が、相互作用するタンパク質との結合を形成するのを可能にする。
「境界相互作用界面アミノ酸」という用語又はその文法的等価物は、少なくとも1つの
原子が、所与のタンパク質上のコア界面アミノ酸から5Å以下の範囲内にある所与のタン
パク質のアミノ酸残基(例えば、GDF15タンパク質又はRETタンパク質と相互作用するGFRAL
タンパク質のコア相互作用界面アミノ酸の5Å以内にあるGFRALタンパク質のアミノ酸)を
指す。5Å以下という距離は、所与のタンパク質上のコア相互作用界面アミノ酸から5Å未
満離れている残基に対するタンパク質結合が、相互作用するタンパク質のファンデルワー
ルス半径以内となることを可能にする。
本明細書で使用される場合、「GFRAL ECD変異体」という用語は、アミノ酸の付加、欠
失、又は置換を含み、かつGDF15に対する結合が依然として可能であるGFRAL ECDを指す。
そのような変異体は、親GFRAL ECDと少なくとも80％、85％、90％、92％、95％、97％、9
8％、又は99％同一であり得る。
当技術分野において、MIC-1(マクロファージ抑制サイトカイン-1)、PDF(前立腺分化因
子)、PLAB(胎盤骨形成タンパク質)、NAG-1(非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)活性化遺伝
子)、TGF-PL、及びPTGFBとしても知られる「成長分化因子15」又は「GDF15」は、形質転
換成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーのメンバーである。GDF15は、フーリン様プロ
テアーゼによって後に切断される62kDaの細胞内前駆体タンパク質として合成され、25kDa
のジスルフィド結合タンパク質として分泌される(例えば、Fairlieらの文献、J. Leukoc.
Biol 65:2-5(1999)を参照)。GDF15 mRNAは、肝臓、腎臓、膵臓、結腸、及び胎盤を含む
、いくつかの組織で見られ、肝臓でのGDF15発現は、肝臓、腎臓、心臓、及び肺などの臓
器の損傷時に顕著に上方調節され得る。
GDF15前駆体は、29アミノ酸のシグナルペプチド、167アミノ酸のプロ-ドメイン、及び
フーリン様プロテアーゼによってプロ-ドメインから切除される112アミノ酸の成熟ドメイ
ンを含有する、308アミノ酸のポリペプチド(NCBI参照配列NP_004855.2; GI:153792495)で
ある。
前駆体ヒトGDF15ポリペプチドのアミノ酸配列が以下に提供されている:
Figure 2022088355000017
 そのような308-アミノ酸のGDF15ポリペプチドは、「全長」GDF15ポリペプチドと呼ばれ;
112-アミノ酸のGDF15ポリペプチド(「全長」GDF15のアミノ酸197～308)は、「成熟」GDF1
5ポリペプチドである。
本明細書で使用される「GDF15」には、成熟ヒトGDF15ポリペプチドのアミノ酸配列と少
なくとも65％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。成熟ヒトGDF15ポ
リペプチドのアミノ酸配列が以下に提供されている:
Figure 2022088355000018
上記の例示的な成熟ヒトGDF15を、GFRALタンパク質及びGDF15タンパク質又はGFRALタン
パク質を含む複合体の結晶を産生するためのものを含む、実施例に記載されている様々な
方法で使用した。
別途示されない限り、「GDF15」という用語は、112アミノ酸の成熟ヒト配列(例えば、
配列番号1811)を指す。さらに、特定のGDF15残基に対する数値参照は、112アミノ酸の成
熟配列を指す(例えば、残基1はAla(A)であり、残基112は配列番号1811のIle(I)である)。
例えば、GDF15前駆体アミノ酸配列から、「成熟」ヒトGDF15の3つの推定上の形態(例えば
、110、112、及び115アミノ酸)を生じる3つの切除部位が予測されるが、112アミノ酸の成
熟配列が正しいものであると受け入れられている。
本開示との関連において、「GDF15」又は「GDF15タンパク質」には、マウス(NP_035949
; GI:170784848)、チンパンジー(XP_009433302.1; GI:694973734)、オランウータン(XP_
009251261.1 GI:686757768)、アカゲザル(EHH29815; GI:355703324)、ジャイアントパン
ダ(XP_002912774; GI:301753921)、テナガザル(XP_004089328.1; GI:441627981)、モルモ
ット(XP_003465238; GI:348558868)、フェレット(AER98997; GI:355689945)、ウシ(NP_00
1193227; GI:329664989)、ブタ(NP_001167527; GI:291291599)、イヌ(XP_541938; GI:571
01740)、及びカモノハシ(オルニトリンクス・アナティヌス(Ornithorhynchus anatinus);
AFV61279; GI:410111209)を含む、他の哺乳動物種由来のGDF15オルソログ及びその修飾
形態、並びにこれらの使用が含まれる。そのような例示的なGDF15タンパク質は図2に示さ
れており、これには、様々な例示的なGDF15タンパク質のアラインメントが含まれる。ヒ
トGDF15の成熟形態は、マウスオルソログとの約67％のアミノ酸同一性を有する。
当技術分野において、Ret癌原遺伝子、カドヘリン関連ファミリーメンバー16、トラン
スフェクション時の再配列(Rearranged During Transfection)、RET受容体チロシンキナ
ーゼ、カドヘリンファミリーメンバー12、癌原遺伝子C-Ret、EC 2.7.10.1、CDHF12、CDHR
16、RET51、PTC、ヒドロキシアリール-タンパク質キナーゼ、RET形質転換配列、及び受容
体チロシンキナーゼとしても知られる「RET」は、細胞成長及び分化のシグナルを変換す
る細胞表面分子である受容体チロシンキナーゼの1つである。RETは共受容体として作用し
、GDNF受容体アルファ(GFRα)共受容体のメンバーに結合したときのグリア細胞株由来神
経栄養因子(GDNF)リガンド(ヒトでは、GDNF、アルテミン、ニュールツリン、及びパーセ
フィン)の一次シグナル伝達受容体として知られている。RETタンパク質(例えば、RET-ECD
)は、4つの連続するカドヘリン様ドメイン(CLD1～CLD4)と、それに続く、膜近傍システイ
ンリッチドメイン(CRD)を含む。本明細書に開示されているように、RETタンパク質は、GF
RALタンパク質及びGDF15タンパク質との共受容体である(例えば、RETタンパク質との共受
容体として作用する)。本明細書に記載される受容体複合体には、GFRALタンパク質、例え
ば、RET/GFRAL複合体、GFRAL/GDF15複合体、及びRET/GFRAL/GDF15複合体が含まれる。
本明細書で使用される場合、「Ret」又は「RET」は、配列番号1813のアミノ酸配列と少
なくとも75％同一であり、例えば、77％、79％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％、又はそれを上回って同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。RE
Tは、TGFβRI及びTGFβRIIと異なる。配列番号1812は、シグナルペプチドを欠く成熟ヒト
RET9の配列である:
Figure 2022088355000019
全長前駆体ヒトRETタンパク質のアミノ酸配列が以下に提供されており、これには、シ
グナルペプチド配列(下線が付された小文字の残基)が含まれる:
Figure 2022088355000020
したがって、本明細書で使用される「RET」又は「RETタンパク質」は、ヒトRET及びそ
の変異体を包含し、これには、そのオルソログ、例えば、マウスRET、カニクイザルRETな
どが含まれるが、これらに限定されない。ある実施態様において、RETは、配列番号1813
と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又はそれを上回
って同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
ある実施態様において、単離されたRET-細胞外ドメイン(RET-ECD)ポリペプチドが提供
される。RET-ECDは、本開示の単離されたタンパク質複合体中に存在するとき、GFRALタン
パク質などのリガンドに結合していてもよい。「RET-細胞外ドメイン」(「RET-ECD」)と
いう用語には、全長RET ECD、RET ECD断片、及びRET ECD変異体が含まれる。本明細書で
使用される場合、「RET ECD」という用語は、細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインを欠く
、シグナルペプチドを有する又は有さないRETポリペプチドを指す。いくつかの実施態様
において、RET ECDは、以下のアミノ酸配列を有するヒト全長RET ECDのアミノ酸配列と少
なくとも75％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す:
Figure 2022088355000021
別の例示的な実施態様において、RET ECDは、以下のアミノ酸配列を有するヒト全長RET
ECDのアミノ酸配列と少なくとも75％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す
:
Figure 2022088355000022
本明細書で使用される「全長RET ECD」という用語は、細胞外ドメインの最後のアミノ
酸にまで及び、かつN-末端シグナルペプチドを含んでも含まなくてもよい、RET ECDを指
す。しかしながら、「全長RET ECD」は、膜貫通ドメインのアミノ酸残基を含むようにC-
末端で1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸だけ延長されているRET-ECDも包含す
る(ただし、該ポリペプチドは可溶性である)ことに留意されたい。言い換えると、RET EC
Dは、それが細胞膜にアンカリングされないように、十分な長さの膜貫通ドメインを欠い
ている。「全長RET ECD」という語句は、シグナルペプチドのアミノ酸残基を含むようにN
-末端で1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸だけ延長されているRET-ECDも包含
する。ある実施態様において、RET断片は、本明細書に記載されるRETの連続するアミノ酸
配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は
それを上回って同一であり、かつ本明細書に記載されるRET配列のC-末端で少なくとも30
、33、35、40、45、50、もしくは55個のアミノ酸、又はそれより多くを欠く、連続するア
ミノ酸配列を指す。
本明細書で使用される場合、「RET ECD断片」という用語は、1以上の残基が全長ECDのN
及び/又はC末端から欠失しており、かつGFRALタンパク質に結合する能力を保持しているR
ET ECDを指す。いくつかの例において、RET ECD断片は、N-末端シグナルペプチドを含ん
でも含まなくてもよい。いくつかの例において、RET ECD断片は、以下の配列のN-末端に
存在する1、5、10、15、16、17、18、又は19個の残基を欠くヒトRET ECD断片である:
Figure 2022088355000023
上記の例示的なRET ECD断片を、RETタンパク質、GFRALタンパク質、及びGDF15タンパク
質を含む複合体のモデルを作成するためのものを含む、実施例に記載されている様々な方
法で使用した。
RET ECDの代わりの実施態様において、RET-ECDは、配列番号1814のヒト全長RET ECDのR
ET ECD配列中に、C64R、N75Q、N166Q、又はC183S突然変異を含む。
「活性及び/又はシグナル伝達を調節する」という語句は、結合タンパク質、例えば、
本開示のGFRALに結合する抗体に適用される場合、該結合タンパク質(例えば、抗体)が:(i
)GFRALタンパク質;(ii)GDF15タンパク質及びGFRALタンパク質;又は(iii)GDF15タンパク質
、GFRALタンパク質、及びRETタンパク質の結合によって誘導されるインビトロ又はインビ
ボの生物学的作用を模倣又は調節することを意味する。抗GFRAL抗体の結合及び特異性を
評価する際、例えば、GFRALタンパク質(例えば、ヒトGFRALタンパク質)に結合する抗体又
はその断片は、生物学的応答が、野生型GFRAL標準(例えば、ヒトGFRALタンパク質の成熟
形態)の活性の95％以下、好ましくは、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45
％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％以下であるとき
、該応答を誘導するとみなされる。GFRAL(例えば、ヒトGFRAL)に結合する抗体又はその断
片はまた、以下の性質のうちの1つ又は複数を有するとき、生物学的応答を誘導するとみ
なされる:(1)ELK1-ルシフェラーゼレポーターアッセイ(例えば、実施例3を参照);又は(2)
U2OS細胞でのERK-リン酸化アッセイ(例えば、実施例4を参照)において、100nM以下、例え
ば、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nMのIC
50で、GFRAL標準の95％以下の効力レベルを示す。
「結合タンパク質」という用語は、ヒトGFRALタンパク質を含む、GFRALタンパク質に結
合する部分(例えば、1以上の結合領域、例えば、CDR)、並びに任意に、該結合部分が、結
合タンパク質のGFRALポリペプチド、断片、又はエピトープに対する結合を促進する立体
構造を取るのを可能にするスキャフォールド又はフレームワーク部分(例えば、1以上のス
キャフォールド又はフレームワーク領域)を含むタンパク質を指す。そのような結合タン
パク質の例としては、抗体、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体;キメラ抗体;組換え抗体;単
鎖抗体;ダイアボディ;トリアボディ;テトラボディ; Fab断片; F(ab')2断片; IgD抗体; Ig
E抗体; IgM抗体; IgG1抗体; IgG2抗体; IgG3抗体;又はIgG4抗体、及びこれらの断片が挙
げられる。結合タンパク質は、例えば、CDR又はCDR誘導体が移植された代替的なタンパク
質スキャフォールド又は人工スキャフォールドを含むことができる。そのようなスキャフ
ォールドには、例えば、該結合タンパク質の3次元構造を安定化するために導入される突
然変異を含む抗体由来スキャフォールド及び例えば、生体適合性ポリマーを含む完全合成
スキャフォールドが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Korndorferらの文献、
2003、タンパク質:構造、機能、及びバイオインフォマティクス(Proteins: Structure, F
unction, and Bioinformatics)、53(1):121-129(2003); Roqueらの文献、Biotechnol. Pr
og. 20:639-654(2004)を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣物(「PAM」)、及びフ
ィブロネクチン構成要素をスキャフォールドとして利用した抗体模倣物に基づくスキャフ
ォールドを使用することができる。本開示との関連において、結合タンパク質は、例えば
、解離定数(KD)が≦10-8Mであるとき、GFRALに特異的に結合する又は選択的に結合すると
言われる。結合タンパク質(例えば、抗体)は、KDが≦10-9Mであるか又はKDが≦10-10Mで
あるとき、高い親和性でGFRALに特異的に結合することができる。いくつかの実施態様に
おいて、結合タンパク質(例えば、抗体)は、GFRALに、例えば、約10-7M～約10-12MのKDで
結合することができ、他の実施態様において、結合タンパク質(例えば、抗体)は、1～2×
10-9MのKDで結合することができる。
「抗体」及び「免疫グロブリン」又は「Ig」という用語は、本明細書で互換的に使用さ
れ、かつ最も広い意味で使用されており、具体的には、例えば、下記のような、個々の抗
GFRALモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長又は無傷のモノ
クローナル抗体を含む)、多エピトープ又は単一エピトープ特異性を有する抗GFRAL抗体組
成物、ポリクローナル又は一価抗体、多価抗体、少なくとも2つの無傷抗体から形成され
た多重特異性抗体(例えば、それらが所望の生物活性を示す限り、二重特異性抗体)、単鎖
抗GFRAL抗体、及び抗GFRAL抗体の断片を含む。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗
体、及び/又は親和性成熟抗体、並びに他の種、例えば、マウス、ウサギなどに由来する
抗体であることができる。「抗体」という用語は、特定の分子抗原に結合することができ
、かつ2つの同一のポリペプチド鎖対から構成される免疫グロブリンクラスのポリペプチ
ドの範囲内のB細胞のポリペプチド産物を含むことが意図され、ここで、各々の対は、1つ
の重鎖(約50～70kDa)と1つの軽鎖(約25kDa)を有し、各々の鎖の各々のアミノ末端部分は
、約100～約130又はそれより多くのアミノ酸の可変領域を含み、各々の鎖の各々のカルボ
キシ末端部分は、定常領域を含む(Borrebaeck(編)(1995)、抗体エンジニアリング(Antibo
dy Engineering)、第2版、Oxford University Press.; Kubyの文献(1997)、免疫学(Immun
ology)、第3版、W.H. Freeman and Company, New Yorkを参照)。具体的な実施態様におい
て、本明細書に提供される抗体によって結合されることができる特定の分子抗原には、GF
RALポリペプチド、GFRAL断片、又はGFRALエピトープが含まれる。抗体には、合成抗体、
モノクローナル抗体、組換え産生抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗
体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、抗イディオタイプ(抗Id)
抗体、及び上記のもののいずれかの機能性断片(例えば、抗原結合断片、例えば、GFRAL結
合断片)(これは、該断片が由来した抗体の結合活性の一部又は全てを保持する抗体重鎖又
は軽鎖ポリペプチドの部分を指す)も含まれるが、これらに限定されない。機能性断片(例
えば、抗原結合断片、例えば、GFRAL結合断片)の非限定的な例としては、単鎖Fv(scFv)(
例えば、単一特異性、二重特異性などを含む)、Fab断片、F(ab')断片、F(ab)2断片、F(ab
')2断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、Fd断片、Fv断片、ダイアボディ、トリアボディ、
テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書に提供される抗体には、免
疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、例えば、抗原結合ドメイ
ン、又はGFRAL抗原に結合する抗原結合部位(例えば、抗GFRAL抗体の1以上の相補性決定領
域(CDR))を含有する分子が含まれる。そのような抗体断片は、例えば、Harlow及びLaneの
文献、抗体:実験マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor L
aboratory, New York(1989); Myers(編)、分子生物学及び生命工学:包括的卓上参考書(Mo
lec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference)、New York: VCH P
ublisher社; Hustonらの文献、Cell Biophysics, 22:189-224(1993); Pluckthun及びSker
raの文献、Meth. Enzymol., 178:497-515(1989)、及びDay, E.D.の文献、先端免疫化学(A
dvanced Immunochemistry)、第2版、Wiley-Liss社、New York, NY(1990)に記載されてい
るのを見出すことができる。本明細書に提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意の
タイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、任意のクラス(例えば、IgG1、IgG
2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又は任意のサブクラス(例えば、IgG2a及びIgG2b)のも
のであることができる。抗GFRAL抗体は、作動性抗体又は拮抗性抗体であることができる
。本明細書に提供される抗体には、GFRALに対する拮抗性抗体、例えば、GFRALシグナル伝
達を阻害する抗体が含まれる。例示的な抗GFRAL抗体には、表1～24に示されるCDRを有す
る抗体が含まれる。
「約(about)」又は「約(approximately)」という用語は、所与の値又は範囲の20％以内
、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％
以内、2％以内、もしくは1％以内、又はそれ未満を意味する。
「抗原」は、抗体が選択的に結合することができる所定の抗原である。標的抗原は、ポ
リペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然もしくは合成の化合物であ
ってもよい。いくつかの実施態様において、標的抗原はポリペプチドである。
「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」という用語及び類似の用
語は、抗原と相互作用し、かつ該抗原に対するその特異性及び親和性を結合物質に対して
付与するアミノ酸残基を含む抗体の部分(例えば、相補性決定領域(CDR))を指す。
「結合する(binds)」又は「結合する(binding)」という用語は、例えば、複合体を形成
することを含む、分子間の(例えば、共有結合的又は非共有結合的)相互作用を指す。複合
体は、共有結合的又は非共有結合的な結合、相互作用、又は力によって結び付けられた2
以上の分子の結合を含むこともできる。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎
水性相互作用、及び/又はファンデルワールス相互作用を含む、非共有結合的相互作用で
あることができる。抗体上の単一の抗原結合部位と標的分子、例えば、GFRALの単一のエ
ピトープの間の全体的な非共有結合的相互作用の強度が、そのエピトープに対する抗体又
は機能性断片の親和性である。一価抗原に対する抗体の会合(k1)と解離(k-1)の比(k1/k-1
)が、親和性の尺度である会合定数Kである。Kの値は、抗体と抗原の複合体の違いによっ
て異なり、k1とk-1の両方に依存する。本明細書に提供される抗体の会合定数Kは、本明細
書に提供される任意の方法又は当業者に周知の任意の他の方法を用いて決定することがで
きる。1つの結合部位での親和性が、抗体と抗原の間の相互作用の真の強度を常に反映す
るとは限らない。複数の反復する抗原性決定基を含有する複合抗原、例えば、多価GFRAL
が、複数の結合部位を含有する抗体と接するとき、1つの部位での抗体と抗原との相互作
用は、第2の部位での反応の可能性を増加させることになる。多価抗体と抗原の間のその
ような複数の相互作用の強度は、結合力と呼ばれる。抗体の結合力は、その個々の結合部
位の親和性よりも優れたその結合能の尺度であることができる。例えば、高い結合力は、
5量体IgM抗体で時に見られる低い親和性を相殺することができ、この5量体IgM抗体は、Ig
Gよりも低い親和性を有することがあるが、その多価状態(multivalence)によって生じるI
gMの高い結合力のために、IgMが効果的に抗原に結合することができる。
「GFRALに特異的に結合する抗体」、「GFRALエピトープに特異的に結合する抗体」とい
う用語及び類似の用語も本明細書で互換的に使用され、GFRALポリペプチド、例えば、GFR
AL抗原、又は断片、又はエピトープ(例えば、ヒトGFRAL、例えば、ヒトGFRALポリペプチ
ド、抗原、又はエピトープ)に特異的に結合する抗体を指す。GFRAL(例えば、ヒトGFRAL)
に特異的に結合する抗体は、GFRALの細胞外ドメイン又は該細胞外ドメインに由来するペ
プチドに結合することができる。GFRAL抗原(例えば、ヒトGFRAL)に特異的に結合する抗体
は、関連抗原(例えば、カニクイザルGFRAL)と交差反応することができる。ある実施態様
において、GFRAL抗原に特異的に結合する抗体は、他の抗原と交差反応しない。GFRAL抗原
に特異的に結合する抗体は、例えば、免疫アッセイ、Biacore、又は当業者に公知の他の
技法によって同定することができる。抗体は、それが、放射免疫アッセイ(RIA)及び酵素
結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの実験技法を用いて決定したとき、任意の交差反応性
抗原に対するよりも高い親和性でGFRAL抗原に結合する場合、GFRAL抗原に特異的に結合す
る。通常、特異的又は選択性反応は、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも
2倍であり、バックグラウンドの10倍を上回る場合もある。例えば、抗体特異性に関する
考察については、Paul編(1989)、基礎免疫学(Fundamental Immunology)、第2版、Raven P
ress, New Yorkの332～336ページを参照されたい。対象となる抗原(例えば、標的抗原、
例えば、GFRAL)に「結合する」抗体は、該抗体が、抗原を発現する細胞又は組織を標的と
する際に治療剤として有用であり、かつ他のタンパク質と顕著には交差反応しないような
十分な親和性で抗原に結合する抗体である。そのような実施態様において、「非標的」タ
ンパク質に対する抗体の結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)解析又は放射
免疫沈降(RIA)によって決定したとき、その特定の標的タンパク質に対する抗体の結合の
約10％未満である。標的分子に対する抗体の結合に関して、「特異的結合」又は特定のポ
リペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」又は
特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的」である
という用語は、非特異的相互作用と測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合
は、例えば、対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって測定すること
ができ、この対照分子は、通常、結合活性を有しない類似構造の分子である。例えば、特
異的結合は、標的と類似している対照分子、例えば、過剰の非標識標的との競合によって
決定することができる。この例では、標識された標的のプローブに対する結合が過剰の未
標識標的によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。本明細書で使用され
る「特異的結合」又は特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトー
プ「に特異的に結合する」又は特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上の
エピトープ「に特異的」であるという用語は、分子が、標的に対する、例えば、少なくと
も約10-4M、或いは少なくとも約10-5M、或いは少なくとも約10-6M、或いは少なくとも約1
0-7M、或いは少なくとも約10-8M、或いは少なくとも約10-9M、或いは少なくとも約10-10M
、或いは少なくとも約10-11M、或いは少なくとも約10-12M、又はそれを上回るKdを有する
ことにより示されることができる。一実施態様において、「特異的結合」という用語は、
分子が、任意の他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合することな
く、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
ある実施態様において、GFRALに結合する抗体は、10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9n
M、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、又は0.1nM以下の解離定数(Kd)
を有する。KDが低ければ低いほど、抗GFRAL抗体の親和性は高い。ある実施態様において
、抗GFRAL抗体は、異なる種由来のGFRAL間で(例えば、ヒトGFRALとカニクイザルGFRALの
間で)保存されているGFRALのエピトープに結合する。
「競合する」という用語は、標的上の同じエピトープもしくは結合部位に結合するか又
はこれらをめぐって競合する抗GFRAL抗体(例えば、GFRALに結合する拮抗性抗体及び結合
タンパク質)との関連において使用されるとき、検討されているその抗体(又は結合断片)
が、共通の抗原(例えば、GFRAL又はその断片)に対する参照分子(例えば、参照リガンド又
は参照抗原結合タンパク質、例えば、参照抗体)の特異的結合を妨害又は阻害するアッセ
イによって決定される競合を意味する。数多くの種類の競合結合アッセイを用いて、試験
抗体がGFRAL(例えば、ヒトGFRAL)に対する結合を参照抗体と競合するかどうかを決定する
ことができる。利用し得るアッセイの例としては、固相直接又は間接放射免疫アッセイ(R
IA)、固相直接又は間接酵素免疫アッセイ(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(例えば、Sta
hliらの文献(1983) Methods in Enzymology 9:242-253を参照);固相直接ビオチン-アビジ
ンEIA(例えば、Kirklandらの文献(1986) J. Immunol. 137:3614-3619)、固相直接標識ア
ッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(例えば、Harlow及びLaneの文献(1988)、抗
体:実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Pressを参
照); 1-125標識を用いる固相直接標識RIA(例えば、Morelらの文献(1988) Molec. Immunol
. 25:7-15を参照);固相直接ビオチン-アビジンEIA(例えば、Cheungらの文献(1990) Virol
ogy 176:546-552を参照);及び直接標識RIA(Moldenhauerらの文献(1990) Scand. J. Immun
ol. 32:77-82)が挙げられる。通常、そのようなアッセイは、未標識の試験抗原結合タン
パク質(例えば、試験抗GFRAL抗体)又は標識された参照抗原結合タンパク質(例えば、参照
抗GFRAL抗体)のいずれかを担持する固体表面又はセルに結合した精製抗原(例えば、GFRAL
、例えば、ヒトGFRAL)の使用を伴う。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で
該固体表面又はセルに結合した標識の量を決定することにより測定することができる。通
常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗体(
競合抗体)には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体及び/又は参照によって結合さ
れるエピトープに抗体の立体障害が生じるほど十分近接した隣接エピトープに結合する抗
体が含まれる。競合的結合及び/又は同じエピトープに対する結合を決定する方法に関す
るさらなる詳細が本明細書に記載されている。通常、競合抗体タンパク質が過剰に存在す
るとき、それは、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を、少なくとも23％、例えば
、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、又は75％阻害する。場合により、結合は
、少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、もしくは97％、98％、99％、又はそれより
大きく阻害される。
「抗GFRAL抗体」又は「GFRALに結合する抗体」という用語は、抗体が、GFRALを標的と
する際に診断剤及び/又は治療剤として有用であるような十分な親和性でGFRALに結合する
ことができる抗体を含む。いくつかの実施態様において、関連のない非GFRALタンパク質
に対する抗GFRAL抗体の結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)解析又は免疫
アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ(RIA)によって測定したとき、GFRALに対する抗体の
結合の約10％未満である。GFRAL「に特異的に結合する」又はGFRAL「に特異的」である抗
体は、本明細書に例示されている。ある実施態様において、本明細書に記載される、GFRA
Lに結合する抗体は、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6n
M、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、もしくは0.1nM以下、及び/又は0.1nM以上の解離定数(K
d)を有する。ある実施態様において、抗GFRAL抗体は、異なる種由来のGFRAL間で(例えば
、ヒトGFRALとカニクイザルGFRALの間で)保存されているGFRALのエピトープに結合する。
本明細書で使用される「結晶」及び「結晶化した」という用語は、結晶の形態で存在す
る1以上のタンパク質又はその断片を指す。結晶は、物質の固体状態の一形態であり、こ
れは、非晶質固体状態又は液晶状態などの他の形態と異なる。結晶は、原子、イオン、分
子(例えば、タンパク質、例えば、抗体)、又は分子集合体(例えば、リガンド/受容体もし
くは抗原/抗体複合体)の規則的な反復する3次元配列から構成される。これらの3次元配列
は、当技術分野で十分に理解されている特定の数学的関係に従って配置される。結晶中で
反復される基本単位、又はビルディングブロックは、非対称単位と呼ばれる。所与の明確
に規定された結晶学的対称性に一致する配置での非対称単位の反復により、結晶の「単位
胞」がもたらされる。3つ全ての次元における規則的変換による単位胞の反復により、結
晶がもたらされる。Giege, R.及びDucruix, A. Barrettの文献、核酸及びタンパク質の結
晶化、実践的アプローチ(Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practica
l Approach)、第2版、pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, N.Y.,(1999)
を参照されたい。
「単離された」抗体は、細胞物質又は細胞もしくは組織源由来の他の夾雑タンパク質及
び/又は抗体が由来する他の夾雑成分を実質的に含まないか、或いは化学合成される場合
、化学前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」
という言葉は、抗体が、それが単離されるか又は組換えにより産生される細胞の細胞成分
から分離されている抗体の調製物を含む。したがって、細胞物質を実質的に含まない抗体
には、(乾燥重量で)約30％、25％、20％、15％、10％、5％、又は1％未満の異種タンパク
質(「夾雑タンパク質」とも呼ばれる)を有する抗体の調製物が含まれる。ある実施態様に
おいて、抗体が組換えにより産生される場合、それは、培養培地を実質的に含まず、例え
ば、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約20％、15％、10％、5％、又は1％未満に相
当する。ある実施態様において、抗体が化学合成によって産生される場合、それは、化学
前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まず、例えば、それは、タンパク質の合成に関与
する化学前駆物質又は他の化学物質から分離されている。したがって、そのような抗体の
調製物は、(乾燥重量で)約30％、25％、20％、15％、10％、5％、又は1％未満の化学前駆
物質又は対象となる抗体以外の化合物を有する。夾雑成分としては、限定されないが、抗
体の治療的使用を妨害する物質を挙げることもでき、また、酵素、ホルモン、及び他のタ
ンパク質性又は非タンパク質性溶質を挙げることができる。ある実施態様において、抗体
は、(1)Lowry法(Lowryらの文献、J. Bio. Chem. 193: 265-275, 1951)によって決定した
とき、抗体の95重量％超、例えば、96重量％、97重量％、98重量％、もしくは99重量％ま
で、(2)スピニングカップシーケネーターの使用によって、N末端もしくは内部アミノ酸配
列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、又は(3)クマシーブルー染色もしくは
好ましくは銀染色を用いた還元もしくは非還元条件下でのSDS-PAGEによって均一になるま
で精製される。抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、単離された抗
体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離され
た抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。具体的な実施態様において、
本明細書に提供される抗体は、単離されている。
4鎖抗体ユニットは、2つの同一の軽(L)鎖と2つの同一の重(H)鎖から構成されたヘテロ4
量体糖タンパク質である。IgGの場合、4鎖ユニットは、通常、約150,000ダルトンである
。各々のL鎖は、1つの共有結合的ジスルフィド結合によってH鎖に結合しているが、2つの
H鎖は、H鎖アイソタイプに応じた1以上のジスルフィド結合によって互いに結合している
。各々のH鎖及びL鎖は、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各々のH鎖は、N
末端に可変ドメイン(VH)を有し、次いで、α及びγ鎖の各々については3つの定常ドメイ
ン(CH)、μ及びεアイソタイプについては4つのCHドメインを有する。各々のL鎖は、N末
端に可変ドメイン(VL)を有し、次いで、そのもう一方の末端に定常ドメイン(CL)を有する
。VLはVHと整列し、CLは、重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)と整列する。特定のアミノ酸残
基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの接触面を形成すると考えられている。VHと
VLが対形成して一体化すると、単一の抗原結合部位が形成される。異なるクラスの抗体の
構造及び性質については、例えば、基礎及び臨床免疫学(Basic and Clinical Immunology
)、第8版、Daniel P. Stites、Abba I. Terr、及びTristram G. Parslow(編)、Appleton
& Lange, Norwalk, CT, 1994の71ページ及び第6章を参照されたい。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、通常、軽鎖又は重鎖のアミノ末端に
位置し、重鎖では約120～130アミノ酸の長さ、軽鎖では約100～110アミノ酸の長さを有し
、各々の特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に関して使用される抗体の
軽鎖又は重鎖の部分を指す。重鎖の可変領域は、「VH」と呼ぶことができる。軽鎖の可変
領域は、「VL」と呼ぶことができる。「可変」という用語は、可変領域の特定のセグメン
トが、配列に関して抗体間で大きく異なるという事実を指す。V領域は抗原結合を媒介し
、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可
変領域の110アミノ酸のスパンにわたって均一に分布しているわけではない。それどころ
か、V領域は、各々約9～12アミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる可変性がより大きい(
例えば、極端に可変性がある)より短い領域によって隔てられた約15～30アミノ酸のフレ
ームワーク領域(FR)と呼ばれる可変性がより小さい(例えば、比較的変化しない)ストレッ
チからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々、3つの超可変領域によって接続された、主
にβシート形状を取る4つのFRを含み、該超可変領域は、該βシート構造を接続し、場合
によっては、その一部を形成する、ループを形成する。各鎖中の超可変領域は、FRによっ
て互いに近接して保持され、他の鎖由来の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形
成に寄与する(例えば、Kabatらの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences
of Proteins of Immunological Interest)、第5版、Public Health Service, National
Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991を参照)。定常領域は、抗体を抗原に結合さ
せるのに直接は関与しないが、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)及び補体依存性細胞傷害性(C
DC)への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。可変領域は、異なる抗体間で
配列が大きく異なる。配列のばらつきはCDRに集中しており、一方、可変領域内のばらつ
きの小さい部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。軽鎖及び重鎖のCDRは、主に、抗
体と抗原との相互作用に関与する。具体的な実施態様において、可変領域は、ヒト可変領
域である。
「Kabatと同様の可変領域残基付番」又は「Kabatと同様のアミノ酸位置付番」という用
語及びこれらの変化形は、Kabatらの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequen
ces of Proteins of Immunological Interest)、第5版、Public Health Service, Nation
al Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)における抗体の編集物の重鎖可変領域又
は軽鎖可変領域に対して使用されている付番体系を指す。この付番体系を用いると、実際
の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのFRもしくはCDRの短縮又は可変ドメインのFRもし
くはCDRへの挿入に対応するより少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含有し得る。例え
ば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後ろの単一のアミノ酸挿入(Kabatによれば、残基
52a)及び重鎖FR残基82の後ろの挿入された残基(例えば、Kabatによれば、残基82a、82b、
及び82cなど)を含み得る。残基のKabat付番は、抗体の配列と「標準的な」Kabat付番配列
とが相同な領域におけるアラインメントにより、所与の抗体について決定することができ
る。Kabat付番体系は、通常、可変ドメイン(およそ軽鎖の残基1～107及び重鎖の残基1～1
13)中の残基を指すときに使用される(例えば、Kabatらの文献、免疫学的に興味深い配列(
Sequences of Immunological Interest)、第5版、Public Health Service, National Ins
titutes of Health, Bethesda, Md.(1991))。「EU付番体系」又は「EUインデックス」は
、通常、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を指すときに使用される(例えば、Kabatら
の文献(上記)に報告されているEUインデックス)。「Kabatと同様のEUインデックス」は、
ヒトIgG1 EU抗体の残基付番を指す。例えば、AbM、Chothia、接触、IMGT、及びAHonを含
む、他の付番体系が記載されている。様々な付番体系が表1～24に例示されている。
「無傷」抗体は、抗原結合部位並びに軽鎖定常領域CL並びに少なくとも重鎖定常領域CH
1、CH2、及びCH3を含む抗体である。定常領域には、ヒト定常領域又はそのアミノ酸配列
変異体が含まれ得る。好ましくは、無傷抗体は、1以上のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合又は可変領域を含
む。抗体断片の例としては、限定するものではないが、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片
;ダイアボディ及びジ-ダイアボディ(例えば、Holliger, P.らの文献(1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. 90:6444-8; Lu, D.らの文献(2005) J. Biol. Chem. 280:19665-72; Hudsonら
の文献、Nat. Med. 9:129-134(2003); WO 93/11161号;及び米国特許第5,837,242号及び第
6,492,123号を参照);単鎖抗体分子(例えば、米国特許第4,946,778号;第5,260,203号;第5,
482,858号、及び第5,476,786号を参照);二重可変ドメイン抗体(例えば、米国特許第7,612
,181号を参照);単一可変ドメイン抗体(SdAb)(例えば、Woolvenらの文献、Immunogenetics
50: 98-101, 1999; Streltsovらの文献、Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-12449, 2
004を参照);並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
治療的抗体の「機能性断片」又は「結合断片」又は「抗原結合断片」は、無傷抗体に起
因する生物学的機能の、いくつか又は全てではないにしても、少なくとも1つを示し、該
機能は、少なくとも標的抗原(例えば、GFRAL結合断片又はGFRALに結合する断片)に対する
結合を含む。
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、抗体のアミノ酸配列及び異種
ポリペプチド又はタンパク質(例えば、通常は抗体の一部ではないポリペプチド又はタン
パク質(例えば、非抗GFRAL抗原結合抗体))のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「
融合」という用語は、GFRAL又は抗GFRAL抗体との関連において使用されるとき、ペプチド
もしくはポリペプチド、又はその断片、変異体、及び/もしくは誘導体と異種ペプチド又
はポリペプチドとの結合を指す。ある実施態様において、融合タンパク質は、GFRAL又は
抗GFRAL抗体の生物活性を保持する。ある実施態様において、融合タンパク質は、GFRAL抗
体のVH領域、VL領域、VH CDR(1つ、2つ、もしくは3つのVH CDR)、及び/又はVL CDR(1つ、
2つ、もしくは3つのVL CDR)を含み、その場合、該融合タンパク質は、GFRALエピトープ、
GFRAL断片、及び/又はGFRALポリペプチドに結合する。
「重鎖」という用語は、抗体との関連において使用されるとき、アミノ末端部分が約12
0～130個又はそれより多くのアミノ酸の可変領域を含み、かつカルボキシ末端部分が定常
領域(例えば、CH1、CH2、CH3、CH4)を含む、約50～70kDaのポリペプチド鎖を指す。定常
領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づくアルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(
ε)、ガンマ(γ)、及びミュー(μ)と呼ばれる5つの異なるタイプ(例えば、アイソタイプ)
のうちの1つであることができる。異なる重鎖はサイズが異なり:α、δ、及びγは、約45
0個のアミノ酸を含有し、一方、μ及びεは、約550個のアミノ酸を含有する。軽鎖と組み
合わされると、これらの異なるタイプの重鎖は、IgGの4つのサブクラス、すなわち、IgG1
、IgG2、IgG3、及びIgG4を含め、それぞれ、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMという、抗体
の5つの周知のクラス(例えば、アイソタイプ)を生じる。重鎖は、ヒト重鎖であることが
できる。
「軽鎖」という用語は、抗体との関連において使用されるとき、アミノ末端部分が約10
0～約110個又はそれより多くのアミノ酸の可変領域を含み、かつカルボキシ末端部分が定
常領域を含む、約25kDaのポリペプチド鎖を指す。軽鎖のおおよその長さは、211～217ア
ミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づくカッパ(κ)又はラムダ(λ)と呼ばれ
る2つの異なるタイプがある。軽鎖アミノ酸配列は当技術分野で周知である。軽鎖は、ヒ
ト軽鎖であることができる。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、症状の重症度及び/もしくは頻度を低
下させ、症状及び/又は根本原因を除去し、症状及び/もしくはその根本原因の発生を予防
し、並びに/又は例えば、不随意の体重減少、グルコース代謝障害、もしくは体重障害を
含む、GDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病に起因もしくは関連する被害を改善もしく
は修正するのに十分である療法(例えば、本明細書に提供される抗GFRAL抗体又は医薬組成
物;例えば、表1～24に示されるCDR、VH、及び/又はVL配列を含む抗体を参照)の量を指す
。この用語は、所与のGDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病の進展もしくは進行、GDF15
媒介性疾患、障害、もしくは疾病の再発、発症、もしくは発生の低下もしくは改善、及び
/又は別の療法(例えば、本明細書に提供される抗GFRAL抗体以外の療法)の予防的もしくは
治療的効果の改善もしくは増強に必要な量も包含する。いくつかの実施態様において、有
効量は、間欠用量を含む1以上の用量で投与され、この場合、1以上の用量が治療期間に投
与された後に、抗体が投与されない休止期間が続く(例えば、1サイクルの治療期間及び休
止期間の後に、追加のサイクルが続くことができ、1以上の治療期間の後に、1以上の休止
期間が続く)。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体の有効量は、約0
.1mg/kg(対象の体重1kg当たりの抗体のmg)～約100mg/kgである。ある実施態様において、
本明細書に提供される抗体の有効量は、約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、3mg/kg、5m
g/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/k
g、約45mg/kg、約50mg/kg、約60mg/kg、約70mg/kg、約80mg/kg、約90mg/kg、もしくは約1
00mg/kg(又はこれらの中の範囲)である。いくつかの実施態様において、本明細書で使用
される有効量はまた、特定の結果を達成する(例えば、(i) GFRAL;(ii)GDF15及びGFRAL;又
は(iii)GDF15、GFRAL、及びRET:の結合によって誘導されるインビトロ又はインビボの生
物学的効果を模倣又は調節する)ための本明細書に提供される抗体の量を指す。例えば、
有効量には:(i)体重を増加させ;(ii)体重を維持し;(iii)体重減少を低下させ;(iv)ボディ
マス(例えば、除脂肪量もしくは脂肪量)を増加させ;(v)ボディマス(例えば、除脂肪量も
しくは脂肪量)を維持し;又は(vi)ボディマス(例えば、除脂肪量もしくは脂肪量)の減少を
低下させるのに有効な本明細書に記載される抗GFRAL抗体の(例えば、1以上の用量におけ
る)量が含まれる。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子でトランスフェクトされ得
る特定の対象細胞及びそのような細胞の子孫又は潜在的な子孫を指す。そのような細胞の
子孫は、後続の世代で生じ得る突然変異もしくは環境的影響又は宿主細胞ゲノムへの核酸
分子の組込みのために、核酸分子でトランスフェクトされた親細胞と同一でなくてもよい
。
本明細書で使用される「免疫調節剤(immunomodulatory agent)」という用語及び限定さ
れないが、免疫調節剤(immunomodulatory agents)を含む、そのバリエーションは、宿主
の免疫系を調節する薬剤を指す。ある実施態様において、本明細書に提供される組合せ療
法で使用される免疫調節剤には、抗GFRAL抗体も、抗原結合断片も含まれない。免疫調節
剤としては、低分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、無
機分子、模倣剤、及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。「低分子」とい
う用語及び類似の用語には、ペプチド、ペプチドミメティックス、アミノ酸、アミノ酸類
似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体
、1モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物(すなわち、ヘテ
ロ有機及び/又は有機金属化合物を含む)、1モル当たり約5,000グラム未満の分子量を有す
る有機又は無機化合物、1モル当たり約1,000グラム未満の分子量を有する有機又は無機化
合物、1モル当たり約500グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、並びにそのよ
うな化合物の塩、エステル、及び他の医薬として許容し得る形態が含まれるが、これらに
限定されない。いくつかの実施態様において、免疫調節剤は免疫刺激剤である。いくつか
の実施態様において、免疫調節剤は免疫抑制剤である。いくつかの実施態様において、免
疫調節剤は、免疫チェックポイント分子(例えば、共抑制性又は共刺激性)として知られる
タンパク質、例えば、C10orf54、CD86、CD80、PDL-1、PDL-2、CTLA-4、PD1、LAG3、BTNL2
、B7-H3、B7-H4、ブチロフィリン、CD48、CD244、TIM-3、CD200R、CD200、CD160、BTLA、
HVEM、LAIR1、TIM1、ガレクチン9、TIM3、CD48、2B4、CD155、CD112、CD113、及びTIGIT(
例えば、共抑制性)、並びに/又はCD154、TNFRSF25、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、
ICOS、CD28、CD40、TL1A、GITRL、41BBL、OX40L、CD70、HHLA2、ICOSL、サイトカイン、L
IGHT、HVEM、CD30、CD30L、B7-H2、CD80、CD86、CD40L、TIM4、TIM1、SLAM、CD48、CD58
、CD155、CD112、DR3、GITR、CD2、及びCD226(例えば、共刺激性)を調節する(例えば、阻
害又は刺激する)薬剤(例えば、抗体)である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集
団から得られる抗体を指し、例えば、該集団を構成する個々の抗体は、微かな量で存在し
得る天然のあり得る突然変異を除いて同一であり、各々のモノクローナル抗体は、通常、
抗原上の単一のエピトープを認識する。具体的な実施態様において、本明細書で使用され
る「モノクローナル抗体」は、単一のハイブリドーマ又は他の細胞によって産生される抗
体であり、ここで、該抗体は、例えば、ELISA又は当技術分野で公知の他の抗原結合もし
くは競合結合アッセイによって決定したとき、GFRALエピトープのみに結合する。「モノ
クローナル」という用語は、任意の特定の抗体作製方法に限定されない。例えば、本開示
において有用なモノクローナル抗体は、Kohlerら(Nature, 256:495(1975))によって最初
に記載されたハイブリドーマ法によって調製されてもよく、又は細菌、真核動物、もしく
は植物細胞で組換えDNA法を用いて作製されてもよい(例えば、米国特許第4,816,567号を
参照)。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clacksonらの文献、Nature, 352:624-6
28(1991)及びMarksらの文献、J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)に記載されている技法
を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。クローン細胞株及びそれに
より発現されるモノクローナル抗体の他の調製方法が当技術分野で周知である(例えば、
分子生物学のショートプロトコル(Short Protocols in Molecular Biology)(2002)、第5
版、Ausubelら編、John Wiley and Sons, New York:の第11章を参照)。例示的なモノクロ
ーナル抗体産生方法が本明細書中の実施例に提供されている。
「ネイティブ」という用語は、生体物質、例えば、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞
などとの関連において使用されるとき、天然に見出され、かつ人間によって操作、修飾、
及び/又は改変(例えば、単離、精製、選択)されていないものを指す。
本明細書に提供される抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定の種に由来し又は特
定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である
一方、鎖の残りが、別の種に由来し又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体
中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びに所望の生物活性を示す限
り、そのような抗体の断片を含むことができる(例えば、米国特許第4,816,567号;及びMor
risonらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)を参照)。
「ヒト化」形態の非ヒト(例えば、マウス)抗体は、ネイティブなCDR残基が、所望の特
異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非
ヒト種の対応するCDR(例えば、ドナー抗体)に由来する残基に置き換えられているヒト免
疫グロブリン(例えば、レシピエント抗体)を含むキメラ抗体である。場合によっては、ヒ
ト免疫グロブリンの1以上のFR領域残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに
、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含むことができ
る。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化するために行われる。ヒト化抗体の重鎖又
は軽鎖は、少なくとも1つ又は複数の可変領域の実質的に全てを含むことができ、該可変
領域では、CDRの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのCDRに対応し、FRの全て
又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFRである。ある実施態様において、ヒト化
抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンの定
常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jonesらの文献、Nature, 321
:522-525(1986); Riechmannらの文献、Nature, 332:323-329(1988);及びPrestaの文献、C
urr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992); Carterらの文献、Proc. Natl. Acd. Sci. U
SA 89:4285-4289(1992);及び米国特許第6,800,738号(2004年10月5日発行)、第6,719,971
号(2005年9月27日発行)、第6,639,055号(2003年10月28日発行)、第6,407,213号(2002年6
月18日発行)、及び第6,054,297号(2000年4月25日発行)を参照されたい。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列
を保有し及び/又は本明細書に開示されるヒト抗体作製技法のいずれかを用いて作製され
た抗体である。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗
体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom及びWinter
の文献、J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marksらの文献、J. Mol. Biol., 222:581(1991
))及び酵母ディスプレイライブラリー(Chaoらの文献、Nature Protocols 1:755-768(2006
))を含む、当技術分野で公知の様々な技法を用いて産生することができる。Coleらの文献
、モノクローナル抗体及び癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、Alan R
. Liss, p.77(1985); Boernerらの文献、J. Immunol., 147(1):86-95(1991)に記載されて
いる方法もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。van Dijk及びvan de Winke
lの文献、Curr. Opin. Pharmacol., 5:368-74(2001)も参照されたい。ヒト抗体は、抗原
刺激に応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座
が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスに抗原を投与することによ
り調製することができる(例えば、Jakobovits, A.の文献、Curr. Opin. Biotechnol. 199
5, 6(5):561-6; Bruggemann及びTaussingの文献、Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8(4):
455-8;並びにXENOMOUSE(商標)技術に関する米国特許第6,075,181号及び第6,150,584号を
参照)。例えば、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術によって作製されるヒト抗体に関するLiら
の文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562(2006)も参照されたい。
「CDR」は、免疫グロブリン(Igもしくは抗体)VH β-シートフレームワークの非フレー
ムワーク領域内の3つの超可変領域(H1、H2、もしくはH3)のうちの1つ、又は抗体VL β-シ
ートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(L1、L2、もしくはL3)
のうちの1つを指す。したがって、CDRは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域
配列である。CDR領域は当業者に周知であり、例えば、抗体可変(V)ドメイン内の最も超可
変性の領域として、Kabatによって定義されている(Kabatらの文献、J. Biol. Chem. 252:
6609-6616(1977); Kabatの文献、Adv. Prot. Chem. 32:1-75(1978))。CDR領域配列は、保
存されたβ-シートフレームワークの一部ではなく、そのため、様々な立体構造を取るこ
とができる残基として、Chothiaによって構造的に定義されている(Chothia及びLeskの文
献、J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。両方の用語法が当技術分野で十分に認識されて
いる。CDR領域配列は、AbM、接触、及びIMGTによっても定義されている。CDR領域配列は
、表1～24に例示されている。標準的な抗体可変領域内のCDRの位置は、数多くの構造の比
較によって決定されている(Al-Lazikaniらの文献、J. Mol. Biol. 273:927-948(1997); M
oreaらの文献、Methods 20:267-279(2000))。超可変領域内の残基の数は異なる抗体で様
々に異なるので、標準的な可変領域付番方式では、標準的な位置に対する追加の残基に、
従来、残基番号の次にa、b、cなどの番号が付けられている(Al-Lazikaniらの文献、上記(
1997))。そのような術語体系も同様に当業者に周知である。
「超可変領域」、「HVR」、又は「HV」という用語は、本明細書で使用されるとき、配
列が超可変であり及び/又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変領域の領域を
指す。通常、抗体は、6つの超可変領域; VHに3つ(H1、H2、H3)及びVLに3つ(L1、L2、L3)
を含む。いくつかの超可変領域の描写が使用され、本明細書に包含されている。Kabat相
補性決定領域(CDR)は配列の可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている(例
えば、Kabatらの文献、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of
Immunological Interest)、第5版、Public Health Service, National Institutes of H
ealth, Bethesda, MD.(1991)を参照)。Chothiaは、代わりに、構造的ループの位置に言及
している(例えば、Chothia及びLeskの文献、J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)を参照)。
Kabat付番慣例を用いて付番したときのChothia CDR-H1ループの末端は、ループの長さに
応じてH32とH34の間で異なる(これは、Kabat付番方式ではH35AとH35Bに挿入を置くからで
あり; 35Aも35Bも存在しない場合、ループは32で終わり; 35Aしか存在しない場合、ルー
プは33で終わり; 35Aと35Bの両方が存在する場合、ループは34で終わる)。AbM超可変領域
は、Kabat CDRとChothia構造ループの折衷物に相当し、Oxford MolecularのAbM抗体モデ
リングソフトウェアによって使用される(例えば、Martinの文献、抗体エンジニアリング(
Antibody Engineering)、第2巻、第3章、Springer Verlagを参照)。「接触」超可変領域
は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づくものである。これらの超可変領域又はCDR
の各々に由来する残基が以下に記載されている。
最近、ImMunoGeneTics(IMGT) Information System(登録商標)という普遍的な付番体系
が開発され、広く採用されている(Lafrancらの文献、Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77(
2003))。IMGTは、ヒト及び他の脊椎動物の免疫グロブリン(IG)、T細胞受容体(TR)、及び
主要組織適合性複合体(MHC)に特化した総合情報システムである。ここでは、CDRがアミノ
酸配列と軽鎖又は重鎖内の位置の両方に関して言及されている。免疫グロブリン可変ドメ
インの構造内のCDRの「位置」は種間で保存されており、かつループと呼ばれる構造に存
在するので、構造的特徴に従って可変ドメイン配列を整列させる付番体系を用いることに
より、CDR及びフレームワーク残基が容易に特定される。この情報は、ある種の免疫グロ
ブリン由来のCDR残基を、典型的には、ヒト抗体由来のアクセプターフレームワークに移
植して、置き換える際に使用することができる。さらなる付番体系(AHon)がHonegger及び
Pluckthunによって開発されている(J. Mol. Biol. 309: 657-670(2001))。例えば、Kabat
の付番体系及びIMGTの独特な付番体系を含む、付番体系間の対応は当業者に周知であり(
例えば、Kabatの文献(上記); Chothia及びLeskの文献(上記); Martinの文献(上記); Lefr
ancらの文献(上記)を参照)、表1～24にも例示されている。本明細書に示される例示的な
体系は、KabatとChothiaを組み合わせている。
Figure 2022088355000024
超可変領域は、以下のような「拡張された超可変領域」: VLの24～36又は24～34(L1)、
46～56又は50～56(L2)、及び89～97又は89～96(L3)並びにVHの26～35又は26～35A(H1)、5
0～65又は49～65(H2)、及び93～102、94～102、又は95～102(H3)を含み得る。本明細書で
使用されるように、「HVR」及び「CDR」という用語は、互換的に使用されている。
「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、抗体の抗原に対する結合に直接は関
与しないが、Fc受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示す、軽鎖及び重鎖
のカルボキシ末端部分を指す。これらの用語は、抗原結合部位を含有する、免疫グロブリ
ンのもう一方の部分である可変領域と比べて、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫
グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のCH1、CH2、及びCH3領域、及び軽鎖のC
L領域を含有し得る。
「フレームワーク」又は「FR」残基という用語は、CDRに隣接する可変領域残基である
。FR残基は、例えば、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、
及び二重特異性抗体中に存在する。FR残基は、超可変領域残基又はCDR残基以外の可変ド
メイン残基である。
「親和性成熟」抗体は、1以上の変化(例えば、改変、付加、及び/又は欠失を含む、ア
ミノ酸配列のバリエーション)を保有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和
性の向上をもたらすこれらの変化をその1以上のHVR中に有する抗体である。好ましい親和
性成熟抗体は、標的抗原に対するナノモル濃度又はさらにはピコモル濃度の親和性を有す
る。親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順によって産生される。総説については、
Hudson及びSouriauの文献、Nature Medicine 9 :129-134(2003); Hoogenboomの文献、Nat
ure Biotechnol. 23 : 1105-1116(2005); Quiroz及びSinclairの文献、Revista Ingeneri
a Biomedia 4 : 39-51(2010)を参照されたい。
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原(例えば、
本明細書に記載されるGFRAL)の生物活性を阻害し又は低下させる抗体である。例えば、ブ
ロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原(例えば、本明細書に記載されるGFRAL)
の生物活性を実質的に又は完全に阻害することができる。
「アゴニスト抗体」は、応答を誘発する抗体、例えば、対象となるポリペプチドの機能
活性のうちの少なくとも1つを模倣する抗体である。アゴニスト抗体には、リガンド模倣
物となる抗体が含まれ、例えば、この場合、リガンドは、細胞表面受容体に結合し、該結
合は、細胞内細胞シグナル伝達経路を介して細胞シグナル伝達又は活性を誘導し、該抗体
は、同様の細胞シグナル伝達又は活性化を誘導する。
GFRALの「アンタゴニスト」は、例えば、GFRALを発現する細胞で、GFRALの生物活性の
うちの1つ又は複数を検出可能に阻害し又は別の形で減少させることができる分子(例えば
、抗体)を指す。いくつかの実施態様において、GFRALのアンタゴニスト(例えば、本明細
書に記載される作動性抗体)は、例えば、GFRALを発現する細胞の活性化及び/又は細胞シ
グナル伝達経路を検出可能に阻害し又は別の形で減少させることにより作用し、それによ
り、アンタゴニストの非存在下でのGFRAL媒介生物活性と比べて該細胞のGFRAL媒介生物活
性を検出可能に減少させることができる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供
される抗体は、GFRAL、GDF15、及び/又はRETを含む複合体のシグナル伝達を阻害する抗体
を含む、拮抗性抗GFRAL抗体である。GFRALアンタゴニストによって引き起こされる阻害又
は減少は、アッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。例えば、下記
の実施例に記載される細胞ベースのアッセイを用いて、GFRALの生物活性を解析すること
ができる。
「結合親和性」は、通常、分子(例えば、結合タンパク質、例えば、抗体)の単一の結合
部位とその結合パートナー(例えば、抗原)の間の非共有結合的相互作用の合計の強度を指
す。別途示されない限り、本明細書で使用されるように、「結合親和性」は、結合対のメ
ンバー(例えば、抗体及び抗原)間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。結
合分子Xのその結合パートナーYに対する親和性は、通常、解離定数(KD)によって表すこと
ができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的な方
法によって測定することができる。低親和性抗体は、通常、抗原にゆっくりと結合し、速
やかに解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は、通常、抗原により速く結合し、よ
り長く結合した状態に留まる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野
で公知であり、これらのいずれかを本開示の目的のために使用することができる。具体的
で例示的な実施態様には、以下のものが含まれる。一実施態様において、「KD」又は「KD
値」は、当技術分野で公知のアッセイによって、例えば、結合アッセイによって測定する
ことができる。KDは、例えば、対象となるFab型の抗体及びその抗原を用いて実施される
、放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)で測定することができる(Chenらの文献(1999) J. Mo
l Biol 293:865-881)。KD又はKD値は、例えば、BIAcoreTM-2000もしくはBIAcoreTM-3000
BIAcore社, Piscataway, NJ)を用いたBiacoreによる表面プラズモン共鳴アッセイを使用
することによるか、又は例えば、OctetQK384システム(ForteBio, Menlo Park, CA)を用い
たバイオレイヤー干渉法によって測定することができる。「結合速度(on-rate)」又は「
会合の速度」又は「会合速度」又は「kon」も、例えば、BIAcoreTM-2000もしくはBIAcore
TM-3000(BIAcore社, Piscataway, NJ)、又はOctetQK384システム(ForteBio, Menlo Park,
CA)を用いた上記の同じ表面プラズモン共鳴又はバイオレイヤー干渉法を用いて決定する
ことができる。
「実質的に類似する」又は「実質的に同じ」という語句は、当業者であれば、2つの値
の違いを、該値(例えば、KD値)によって測定される生物学的特徴との関連において、生物
学的及び/又は統計学的にほとんど又は全く有意ではないと考えるほど十分に高い2つの数
値(例えば、本開示の抗体と関連する一方の数値と参照抗体と関連するもう一方の数値)間
の類似度を意味する。例えば、該2つの値の違いは、参照抗体についての値の関数として
、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約20％未満、約10％未満、約5％未満であり得
る。
本明細書で使用される「実質的に低下した」又は「実質的に異なる」という語句は、当
業者であれば、2つの値の違いを、該値によって測定される生物学的特徴との関連におい
て、統計学的に有意であると考えるほど十分に高い2つの数値(例えば、本開示の抗体と関
連する一方の数値と参照抗体と関連するもう一方の数値)間の相違度を意味する。例えば
、該2つの値の違いは、参照抗体についての値の関数として、好ましくは、約10％超、約2
0％超、約30％超、約40％超、約50％超であり得る。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のFc領域(例えば、ネイティブ配列Fc領域又はアミ
ノ酸配列変異体Fc領域)に起因する生物活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。
抗体エフェクター機能の例としては: C1q結合及び補体依存性細胞傷害性; Fc受容体結合;
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)
の下方調節;並びにB細胞活性化が挙げられる。
本明細書における「Fc領域」という用語は、例えば、ネイティブ配列Fc領域、組換えFc
領域、及び変異体Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用
される。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は様々であり得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は
、多くの場合、位置Cys226のアミノ酸残基から又はPro230から、そのカルボキシル末端に
まで及ぶと定義される。Fc領域のC末端リジン(EU付番体系によれば、残基447)は、例えば
、抗体の産生もしくは精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え技術で操作す
ることにより除去することができる。したがって、無傷抗体の組成物は、全てのK447残基
が除去された抗体集団、K447残基が除去されていない抗体集団、及びK447残基がある抗体
とK447残基がない抗体の混合物を有する抗体集団を含むことができる。
「機能的Fc領域」は、ネイティブ配列Fc領域の「エフェクター機能」を保有する。例示
的な「エフェクター機能」としては、C1q結合;補体依存性細胞傷害性(CDC); Fc受容体結
合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えば、B細胞受容
体; BCR)の下方調節などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、通常、Fc領域が
結合領域又は結合ドメイン(例えば、抗体可変領域又はドメイン)と組み合わされることを
必要とし、本明細書に開示される及び/又は当技術分野で公知の様々なアッセイの使用を
含めて評価することができる。
「ネイティブ配列Fc領域」は、天然に見られ、かつヒトによって操作、修飾、及び/又
は改変されていない(例えば、単離、精製、選択されていない、可変領域配列などの他の
配列を含まない、又は該配列と組み合わせていない)、Fc領域のアミノ酸配列と同一のア
ミノ酸配列を含む。ネイティブ配列ヒトFc領域には、ネイティブ配列ヒトIgG1 Fc領域(非
A及びAアロタイプ);ネイティブ配列ヒトIgG2 Fc領域;ネイティブ配列ヒトIgG3 Fc領域;並
びにネイティブ配列ヒトIgG4 Fc領域、並びにこれらの天然の変異体が含まれる。
「変異体Fc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾(例えば、置換、付加、又は欠失)
、好ましくは、1以上のアミノ酸置換によって、ネイティブ配列Fc領域のアミノ酸配列と
異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Fc領域は、ネイティブ配列Fc領域又は親
ポリペプチドのFc領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、約1～約10個
のアミノ酸置換、好ましくは、約1～約5個のアミノ酸置換をネイティブ配列Fc領域中又は
親ポリペプチドのFc領域中に有する。本明細書における変異体Fc領域は、好ましくは、ネ
イティブ配列Fc領域及び/又は親ポリペプチドのFc領域との少なくとも約80％の相同性、
より好ましくは、それらとの少なくとも約90％の相同性、例えば、それらとの少なくとも
約95％の相同性を保有する。例えば、ヒトIgG1 Fc配列中の2つの位置でアラニンへの2ア
ミノ酸変化を有する変異体が、以下に提供されるアミノ酸配列中で太字にして示されてい
る:
Figure 2022088355000025
例えば、C-末端リジン残基が存在しない切断型ヒトIgG1 Fc配列(IgG1ΔK Fc)中の2つの
位置でアラニンへの2アミノ酸変化を有する変異体が、以下に提供されるアミノ酸配列中
で太字にして示されている:
Figure 2022088355000026
例えば、C-末端リジン残基が存在しないヒトIgG1 Fc配列の切断型変異体(IgG1ΔK Fc)
が、以下に提供されるアミノ酸配列中で示されている:
Figure 2022088355000027
例えば、ヒトIgG4 Fc配列中の位置でプロリンへのアミノ酸変化を有する変異体が、以
下に提供されるアミノ酸配列中で太字にして示されている:
Figure 2022088355000028
例えば、C-末端リジンが存在しないヒトIgG4 Fc配列(IgG4ΔK Fc)中の位置でプロリン
へのアミノ酸変化を有する変異体が、以下に提供されるアミノ酸配列中で太字にして示さ
れている：
Figure 2022088355000029
例えば、ヒトIgG1 Fc配列中の位置でグルタミンへのアミノ酸変化を有する変異体が、
以下に提供されるアミノ酸配列中で太字にして示されている:
Figure 2022088355000030
表1～24並びに図4A、5A、5C、5E、6A、7A、8A、9A、及び10AのVHドメインのいずれかを
本明細書に記載される変異体Fc領域と組み合わせることができる。変異体Fc領域を含む例
示的な重鎖コンストラクトとしては、以下に示されるように表記された以下のコンストラ
クトを挙げることができ;可変領域配列は、太字になっており、CDR配列には、下線が付さ
れている:
3P10 Fab Hc:
Figure 2022088355000031
25M22 Fab Hc:
Figure 2022088355000032
8D8 Fab Hc:
Figure 2022088355000033
5F12 Fab Hc:
Figure 2022088355000034
「軽鎖定常領域」には、カッパ及びラムダ定常領域が含まれる。表1～24並びに図4B、5
B、5D、5F、6B、7B、8B、9B、及び10BのVLドメインのいずれかを本明細書に記載されるカ
ッパ又はラムダ定常領域と組み合わせることができる。
例示的なカッパ定常領域が以下に提供されている:
Figure 2022088355000035
例示的なラムダ定常領域が以下に提供されている:
Figure 2022088355000036
定常領域を含む例示的な軽鎖コンストラクトとしては、以下に示されるように表記され
た以下のコンストラクトを挙げることができ;可変領域配列は、太字になっており、CDR配
列には、下線が付されている:
3P10 Fab Lc:
Figure 2022088355000037
25M22 Fab Lc:
Figure 2022088355000038
8D8 Fab Lc:
Figure 2022088355000039
5F12 Fab Lc:
Figure 2022088355000040
「変異体」という用語は、GFRAL又は抗GFRAL抗体との関連において使用されるとき、ネ
イティブな又は未修飾のGFRAL配列と比較して、1以上(例えば、約1～約25個、約1～約20
個、約1～約15個、約1～約10個、又は約1～約5個など)のアミノ酸配列置換、欠失、及び/
又は付加を含むペプチド又はポリペプチドを指すことができる。例えば、GFRAL変異体は
、ネイティブなGFRALのアミノ酸配列に対する1以上(例えば、約1～約25個、約1～約20個
、約1～約15個、約1～約10個、又は約1～約5個など)の変化によって生じることができる
。また例として、抗GFRAL抗体の変異体は、ネイティブな又は以前に修飾されていない抗G
FRAL抗体のアミノ酸配列に対する1以上(例えば、約1～約25個、約1～約20個、約1～約15
個、約1～約10個、又は約1～約5個など)の変化によって生じることができる。変異体は、
アレル変異体もしくはスプライス変異体などの、天然に存在するものであってもよく、又
は人為的に構築されたものであってもよい。ポリペプチド変異体は、該変異体をコードす
る対応する核酸分子から調製されてもよい。いくつかの実施態様において、GFRAL変異体
又は抗GFRAL抗体変異体は、それぞれ、GFRAL又は抗GFRAL抗体の機能活性を少なくとも保
持する。いくつかの実施態様において、抗GFRAL抗体変異体は、GFRALに結合し、及び/又
はGFRAL活性に対して拮抗性である。いくつかの実施態様において、抗GFRAL抗体変異体は
、GFRALに結合し、及び/又はGFRAL活性に対して作動性である。いくつかの実施態様にお
いて、該変異体は、GFRAL又は抗GFRAL抗体のVHもしくはVL領域もしくはサブ領域、例えば
、1以上のCDRをコードする核酸分子の単一ヌクレオチド多型(SNP)変異体によってコード
される。
「ベクター」という用語は、例えば、核酸配列を宿主細胞に導入するためを含め、核酸
配列を担持又は包含するために使用される物質を指す。使用のために適用可能なベクター
としては、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、
エピソーム、及び人工染色体が挙げられ、これらは、宿主細胞の染色体への安定な組込み
のために作動可能な選択配列又はマーカーを含むことができる。さらに、ベクターは、1
以上の選択可能マーカー遺伝子及び適切な発現制御配列を含むことができる。含めること
ができる選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質もしくは毒素に対する抵抗性を提
供し、独立栄養欠損を相補し、又は培養培地中にない重要な栄養を供給する。発現制御配
列は、当技術分野で周知である構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写
ターミネーターなどを含むことができる。2以上の核酸分子(例えば、抗体の重鎖と軽鎖の
両方又は抗体のVHとVLの両方)が共発現されることになる場合、両方の核酸分子を、例え
ば、単一の発現ベクター又は別々の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクター
発現のために、コード核酸を、1つの共通の発現制御配列に機能的に連結するか、又は異
なる発現制御配列、例えば、1つの誘導性プロモーター及び1つの構成的プロモーターに連
結することができる。核酸分子の宿主細胞への導入は、当技術分野で周知の方法を用いて
確認することができる。そのような方法としては、例えば、核酸解析、例えば、mRNAのノ
ーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、又は遺伝子産物の発現につい
ての免疫ブロッティング、又は導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発
現を試験する他の好適な解析方法が挙げられる。核酸分子は、所望の産物(例えば、本明
細書に記載される抗GFRAL抗体)を産生するのに十分な量で発現されることが当業者によっ
て理解され、また、発現レベルを当技術分野で周知の方法を用いて最適化して、十分な発
現を得ることができることがさらに理解される。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ADCC」は、特定の細胞傷害性細胞(例えば
、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するFc受容体(FcR)
に結合した分泌型Igによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞
に特異的に結合し、その後、該標的細胞を細胞毒素で死滅させることが可能になる細胞傷
害性の形態を指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装し」、そのような死滅化に完全に必
要とされる。ADCCを媒介する主な細胞であるNK細胞がFcγRIIIのみを発現するのに対し、
単球は、FcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcR発現が知られて
いる(例えば、Ravetch及びKinetの文献、Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991)の464ペー
ジの表3を参照)。対象となる分子のADCC活性を評価するために、インビトロADCCアッセイ
(例えば、米国特許第5,500,362号又は第5,821,337号を参照)を実施してもよい。そのよう
なアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュ
ラルキラー(NK)細胞が挙げられる。代わりに、又はさらに、対象となる分子のADCC活性を
、インビボで、例えば、動物モデルでアッセイしてもよい(例えば、Clynesらの文献(USA)
95:652-656(1998)を参照)。ADCC活性がほとんど又は全くない抗体を使用のために選択し
てもよい。
「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を言い表したものである
。好ましいFcRは、ネイティブ配列ヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体に結
合するもの(例えば、ガンマ受容体)であり、FcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIサブクラス
の受容体を、これらの受容体のアレル変異体及び選択的スプライシング形態を含めて含む
。FcγRII受容体には、FcγRIIA(「活性化受容体」)及びFcγRIIB(「抑制受容体」)が含
まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する(例えば
、Daeronの総説、Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)を参照)。FcRは公知である(例
えば、Ravetch及びKinetの文献、Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991); Capelらの文献
、Immunomethods 4:25-34(1994);及びde Haasらの文献、J. Lab. Clin. Med. 126:330-41
(1995)を参照)。他のFcRは、将来同定されることになるものを含め、本明細書における「
FcR」という用語によって包含される。この用語は、母親IgGの胎児への移動に関与する新
生児受容体であるFcRnも含む(例えば、Guyerらの文献、J. Immunol. 117:587(1976)及びK
imらの文献、J. Immunol. 24:249(1994)を参照)。FcRに対する結合が向上又は減少した抗
体変異体が記載されている(例えば、WO 2000/42072号;米国特許第7,183,387号、第7,332,
581号、及び第7.335,742号; Shieldsらの文献、J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604(2001)を
参照)。
「補体依存性細胞傷害性」又は「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。
古典的補体経路の活性化は、補体系の第1の成分(C1q)がそのコグネートな抗原に結合して
いる(適当なサブクラスの)抗体に結合することによって開始される。補体活性化を評価す
るために、CDCアッセイ(例えば、Gazzano-Santoroらの文献、J. Immunol. Methods 202:1
63(1996)を参照)を実施してもよい。改変されたFc領域アミノ酸配列を有するポリペプチ
ド変異体(変異体Fc領域を有するポリペプチド)及び増加又は減少したC1q結合能を有する
ポリペプチド変異体が記載されている(例えば、米国特許第6,194,551号、WO 1999/51642
号、Idusogieらの文献、J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)を参照)。CDC活性がほとんど
又は全くない抗体を使用のために選択してもよい。
パーセント同一性を計算する際、比較されている配列を、配列間で最大のマッチを与え
るように整列させることができる。パーセント同一性を決定するために使用し得るコンピ
ュータプログラムは、GAPを含むGCGプログラムパッケージである(Devereuxらの文献(1984
) Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madi
son, Wis.)。コンピュータアルゴリズムGAPを用いて、パーセント配列同一性を決定すべ
き2つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを整列させる。配列は、そのそれぞれのアミ
ノ酸又はヌクレオチドの最適なマッチング(アルゴリズムによって決定される「マッチし
たスパン(matched span))を求めて整列させることができる。ギャップ開始ペナルティ(こ
れは、平均対角の3倍として計算され、ここで、「平均対角」は、使用されている比較マ
トリックスの対角の平均であり;「対角」は、特定の比較マトリックスによって各々の完
全なアミノ酸マッチに割り当てられるスコア又は数字である)及びギャップ伸長ペナルテ
ィ(これは、通常、ギャップ開始ペナルティの1/10倍である)、並びにPAM 250又はBLOSUM
62などの比較マトリックスが、該アルゴリズムとともに使用される。ある実施態様におい
て、標準的な比較マトリックス(PAM 250比較マトリックスについては、Dayhoffらの文献(
1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352; BLOSUM 62比較マトリック
スについては、Henikoffらの文献(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-1091
9を参照)も、該アルゴリズムによって使用される。
GAPプログラムを用いてポリペプチド又はヌクレオチド配列についてのパーセント同一
性を決定するための例示的なパラメータは、以下のものである:(i)アルゴリズム: Needle
manらの文献、1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;(ii)比較マトリックス: Henikoffらの文
献、1992(上記)からのBLOSUM 62;(iii)ギャップペナルティ:12(ただし、末端のギャップ
については、ペナルティなし)(iv)ギャップ長ペナルティ:4;及び(v)類似性の閾値:0。
2つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアラインメント方式では、結果として2つ
の配列の短い領域しかマッチングされない可能性があり、この整列された小さい領域は、
2つの全長配列間に有意な関係がない場合でも、非常に高い配列同一性を有することがあ
る。したがって、選択されたアラインメント法(例えば、GAPプログラム)は、そのように
所望される場合、標的ポリペプチドのいくつかのアミノ酸、例えば、少なくとも50個の連
続するアミノ酸にわたるアラインメントが結果として得られるように調整することができ
る。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列
させ、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した
後、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮に入れずに、参照ポリペプチド配
列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義
される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、公
的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegal
ign(DNASTAR)ソフトウェアを用いて、当技術分野の技術の範囲内にある様々な方法で達成
することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメン
トを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適
当なパラメータを決定することができる。
アミノ酸残基/位置の「修飾」は、出発アミノ酸配列と比較したときの一次アミノ酸配
列の変化を指し、ここで、該変化は、該アミノ酸残基/位置を含む配列の改変によって生
じる。例えば、典型的な修飾には、別のアミノ酸との残基の置換(例えば、保存的もしく
は非保存的置換)、該残基/位置に近接した1以上(例えば、通常、5、4、もしくは3個未満)
のアミノ酸の挿入、及び/又は該残基/位置の欠失が含まれる。
「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位、例えば、抗体
の1以上の抗原結合領域に結合することができる、及び動物、例えば、哺乳動物(例えば、
ヒト)で抗原性又は免疫原性活性を有する、すなわち、免疫応答を誘発することができる
、抗原、例えば、GFRALポリペプチド、GFRALポリペプチド断片、又はGFRALエピトープの
表面上の限局された領域である。免疫原性活性を有するエピトープは、動物で抗体応答を
誘発するポリペプチドの部分である。抗原性活性を有するエピトープは、例えば、免疫ア
ッセイによるものを含め、当技術分野で周知の任意に方法によって決定される、抗体が結
合するポリペプチドの部分である。抗原性エピトープが必ずしも免疫原性である必要はな
い。エピトープは、多くの場合、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性のある表面分子
団からなり、特異的な3次元構造特性及び特異的な電荷特性を有する。「エピトープ」と
いう用語は、具体的には、線状エピトープ及び立体構造エピトープを含む。エピトープに
寄与するポリペプチドの領域は、ポリペプチドの連続的なアミノ酸であってもよく、又は
エピトープは、ポリペプチドの2以上の非連続的な領域から一体となったものであっても
よい。エピトープは、抗原の3次元表面特徴であっても、そうでなくてもよい。ある実施
態様において、GFRALエピトープは、GFRALポリペプチドの3次元表面特徴である。他の実
施態様において、GFRALエピトープは、GFRALポリペプチドの線形特徴である。通常、抗原
は、いくつかの又は多くの異なるエピトープを有しており、多くの異なる抗体と反応する
ことができる。
2つの抗体が3次元空間で同一の、重複する、又は隣接するエピトープを認識する場合、
抗体は、「エピトープ」又は参照抗体と「本質的に同じエピトープ」又は「同じエピトー
プ」に結合する。2つの抗体が3次元空間で同一の、重複する、又は隣接するエピトープに
結合するかどうかを決定するための最も広く使用されかつ迅速な方法は、競合アッセイで
あり、これは、例えば、標識抗原又は標識抗体のどちらかを用いる、いくつかの異なるフ
ォーマットで構成することができる。いくつかのアッセイでは、抗原を、96ウェルプレー
トに固定化するか、又は細胞表面上に発現させ、未標識抗体が標識抗体の結合を遮断する
能力を、放射性標識、蛍光標識、又は酵素標識を用いて測定する。
「エピトープマッピング」は、抗体の結合部位、又は、エピトープをその標的抗原上で
同定するプロセスである。抗体エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープで
あり得る。線状エピトープは、タンパク質中の連続するアミノ酸配列によって形成される
。立体構造エピトープは、タンパク質配列中では不連続であるが、タンパク質がその3次
元構造へとフォールディングするときに寄せ集められるアミノ酸から形成される。誘導さ
れるエピトープは、例えば、別のタンパク質又はリガンドの活性化又は結合の後、タンパ
ク質の3次元構造が変化した立体構造を取るときに、形成される。
「エピトープビニング」は、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体を分類するプロ
セスである。より具体的には、エピトープビニングは、様々な抗体のエピトープ認識特性
を識別し、そのエピトープ認識特性に基づいて抗体をクラスタリングするための計算プロ
セスと組み合わせた競合アッセイを使用し、かつ異なる結合特異性を有する抗体を同定す
るための方法及びシステムを含む。
「GFRAL媒介性疾患」、「GFRAL媒介性障害」、及び「GFRAL媒介性疾病」は互換的に使
用されており、GFRALもしくはGFRALとGDF15との相互作用によって完全にもしくは部分的
に引き起こされるか、又はGFRALもしくはGFRALとGDF15との相互作用の結果である、任意
の疾患、障害、又は疾病、及び/或いはその代わりに、GDF15のインビボ効果を阻害するこ
とが望ましい任意の疾患、障害、又は疾病を指す。GFRAL媒介性疾患、障害、又は疾病に
は、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病が含まれる。
「GDF15媒介性疾患」、「GDF15媒介性障害」、及び「GDF15媒介性疾病」は互換的に使
用されており:(i)GDF15タンパク質(例えば、GDF15タンパク質の活性、例えば、GDF15シグ
ナル伝達、もしくはGDF15タンパク質のレベルの上昇)又はGFRALタンパク質とGDF15タンパ
ク質及び/もしくはRETタンパク質との相互作用によって完全にもしくは部分的に引き起こ
され;或いは(ii)GDF15タンパク質(例えば、GDF15タンパク質の活性、例えば、GDF15シグ
ナル伝達、もしくはGDF15タンパク質のレベルの上昇)又はGFRALタンパク質とGDF15タンパ
ク質及び/もしくはRETタンパク質との相互作用の結果である任意の疾患、障害、又は疾病
、その代わりに、GDF15のインビボ効果を阻害することが望ましい任意の疾患、障害、又
は疾病を指す。GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病としては、不随意の体重減少、悪液質
、サルコペニア、筋消耗、骨消耗、心血管疾患、慢性炎症性疾患(例えば、慢性腎疾患、
慢性閉塞性肺疾患)、及びGDF15タンパク質によって誘導されるか又はGDF15タンパク質に
関連する化学療法剤(例えば、抗腫瘍抗体、例えば、トラスツズマブ)に対する感受性(例
えば、抵抗性)が減少している癌を含む、癌が挙げられる。
本明細書で使用される「治療的有効量」という用語は、所与の疾患、障害、もしくは疾
病、及び/又はこれらに関連する症状の重症度及び/又は持続期間を低下させ及び/又は改
善するのに十分である薬剤(例えば、本明細書に記載される抗体又は本明細書に記載され
る任意の他の薬剤)の量を指す。治療剤を含む、薬剤の治療的有効量は、(i)所与の疾患、
障害、もしくは疾病の進展もしくは進行の低下もしくは改善、(ii)所与の疾患、障害、も
しくは疾病の再発、発症、もしくは発生の低下もしくは改善、及び/又は(iii)別の療法(
例えば、本明細書に提供される抗体の投与以外の療法)の予防もしくは治療効果の向上も
しくは増強に必要な量であることができる。本開示の物質/分子/薬剤(例えば、抗GFRAL抗
体)の「治療的有効量」は、個体の病状、年齢、性別、及び重量、並びに該物質/分子/薬
剤が個体において所望の応答を誘発する能力などの因子によって異なり得る。治療的有効
量は、該物質/分子/薬剤の任意の毒性又は有害効果を治療的に有益な効果が上回る量を包
含する。ある実施態様において、「治療的有効量」という用語は、対象又は哺乳動物の疾
患、障害、又は疾病を「治療する」のに有効な抗体又は他の薬剤(例えば、又は薬物)の量
を指す。
「予防的有効量」は、所望の予防結果を達成するために必要な投薬量で及び所望の予防
結果を達成するために必要な期間にわたって有効な量を指す。一般に、予防用量は、疾患
、障害、もしくは疾病の前に、又はその初期段階において、対象で使用されるので、予防
的有効量は、治療的有効量よりも少ない可能性があるが、必ずしもそうであるとは限らな
い。
「慢性的」投与は、長期間にわたって初回治療効果(活性)を維持するために、急性の様
式ではなく、連続的な様式で(例えば、数日、数週間、数カ月、又は数年などの期間)、薬
剤を投与することを指す。「間欠的」投与は、中断なしで連続的に行われるのではなく、
むしろ本来は周期的な処置である。
1以上のさらなる薬剤「と組み合わせた」投与には、同時(例えば、並行)投与と任意の
順序での連続投与とが含まれる。他の療法(例えば、他の薬剤)の投与との関連における「
と組み合わせた」という用語は、複数の療法(例えば、1つの薬剤)の使用を含む。「と組
み合わせた」という用語の使用は、療法が対象に投与される順序を制限するものではない
。第1の療法(例えば、薬剤)を、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病を有していたか、該疾
患を有しているか、又は該疾患に罹患しやすいか、又は該疾患のリスクを有する対象への
第2の療法(例えば、薬剤)の投与の前に(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間
、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時
間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、8週間、9週間、10週間、11週
間、もしくは12週間前に)、該投与と並行して、又は該投与の後に(例えば、1分、15分、3
0分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、12時間、24時
間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週
間、9週間、10週間、11週間、もしくは12週間後に)投与することができる。
任意の追加の療法(例えば、薬剤)を、任意の順序で、他の追加の療法(例えば、薬剤)と
ともに投与することができる。ある実施態様において、抗体を、1以上の療法、例えば、
薬剤(例えば、現在投与されている抗体ではない、薬剤を含む、療法)と組み合わせて投与
して、GDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病、又はこれらの症状を予防、治療、管理、
及び/又は改善することができる。抗体と組み合わせて投与することができる療法(例えば
、薬剤)の非限定的な例としては、例えば、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、もしくは免疫調
節剤、又は米国薬局方(U.S. Pharmacopoeia)及び/もしくは医師の卓上参考書(Physician'
s Desk Reference)に記載されている任意の他の薬剤が挙げられる。併用療法で有用な薬
剤の例としては、以下のもの:非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、例えば、アスピリン、イ
ブプロフェン、並びに他のプロピオン酸誘導体(アルミノプロフェン、ベノキサプロフェ
ン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェ
ン、フルルビプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロ
キセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロ
フェン酸、及びチオキサプロフェン)、酢酸誘導体(インドメタシン、アセメタシン、アル
クロフェナク、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロジン酸、
フェンチアザク、フイロフェナク(fuirofenac)、イブフェナク、イソキセパク、オキシピ
ナク、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、及びゾメピラク)、フェナ
ム酸誘導体(フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸、及びトル
フェナム酸)、ビフェニルカルボン酸誘導体(ジフルニサル及びフルフェニサル)、オキシ
カム(イソオキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、及びテノキシカン(tenoxican))、
サリチレート(アセチルサリチル酸、スルファサラジン)、並びにピラゾロン(アパゾン、
ベズピペリロン(bezpiperylon)、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン
、フェニルブタゾン)が挙げられるが、これらに限定されない。他の組合せとしては、シ
クロオキシゲナーゼ-2(COX-2)阻害剤が挙げられる。組合せ用の他の薬剤としては、プレ
ドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、又
はヒドロコルチゾンなどのステロイドが挙げられる。そのような組合せは、特に好都合で
あり得るが、それは、本抗体と組み合わせて対象を治療するときに必要とされるステロイ
ド用量を漸減することにより、ステロイドの1以上の副作用を軽減し又は消失させること
すらできるからである。組合せ用の薬剤のさらなる例としては、サイトカイン抑制性抗炎
症薬(CSAID);他のヒトサイトカインもしくは成長因子、例えば、TNF、LT、IL-1β、IL-2
、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、もしくはPDGFに対
する抗体、又はこれらのアンタゴニストが挙げられる。薬剤の組合せとしては、キメラ、
ヒト化、又はヒトTNF抗体、REMICADE、抗TNF抗体断片(例えば、CDP870)、及び可溶性p55
又はp75 TNF受容体、これらの誘導体、p75TNFRIgG(ENBREL(登録商標))又はp55TNFR1gG(LE
NERCEPT(登録商標))、可溶性IL-13受容体(sIL-13)、さらには、TNFα変換酵素(TACE)阻害
剤のようなTNFアンタゴニストを挙げることができ;同様に、IL-1阻害剤(例えば、インタ
ーロイキン-1-変換酵素阻害剤)も有効であり得る。他の組合せとしては、インターロイキ
ン11、抗P7、及びp-セレクチン糖タンパク質リガンド(PSGL)が挙げられる。併用療法で有
用な薬剤の他の例としては、インターフェロン-β1a(AVONEX);インターフェロン-β1b(BE
TASERON(登録商標));コパキソン;高圧酸素;静脈内免疫グロブリン;クラブリビン(clabrib
ine);並びに他のヒトサイトカインもしくは成長因子に対する抗体又はこれら他のヒトサ
イトカインもしくは成長因子のアンタゴニスト(例えば、CD40リガンド及びCD80に対する
抗体)が挙げられる。
本明細書で使用される「担体」には、利用される投薬量及び濃度でそれに曝露されてい
る細胞又は哺乳動物にとって無毒である医薬として許容し得る担体、賦形剤、又は安定化
剤が含まれる。多くの場合、生理的に許容し得る担体は、水性pH緩衝溶液である。生理的
に許容し得る担体の例としては、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機
酸;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(例えば、約10アミノ酸残基未満)のポリペプ
チド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン;親水性
ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、
アスパラギン、アルギニン、もしくはリジン;単糖、二糖、及びグルコース、マンノース
、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート化剤、例えば、EDTA;糖アルコール
、例えば、マンニトールもしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;並
びに/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)
、及びPLURONICS(商標)が挙げられる。「担体」という用語は、それとともに治療薬が投
与される希釈剤、アジュバント(例えば、フロイントのアジュバント(完全もしくは不完全
))、賦形剤、又はビヒクルを指すこともできる。医薬担体を含む、そのような担体は、滅
菌液、例えば、水及び油であることができ、油には、石油、動物、植物、又は合成起源の
もの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。水は、組成物(例
えば、医薬組成物)が静脈内に投与されるときの例示的な担体である。食塩水溶液並びに
水性デキストロース及びグリセロール溶液を、特に、注射用溶液のための液体担体として
利用することもできる。好適な賦形剤(例えば、医薬賦形剤)としては、デンプン、グルコ
ース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、
ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱
脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組
成物は、望ましい場合、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、又はpH緩衝化剤を含有することも
できる。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤
などの形態を取ることができる。経口組成物は、製剤を含め、標準的な担体、例えば、医
薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。好適な医薬担体の
例は、レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(1990) Mack Publishin
g Co., Easton, PAに記載されている。医薬化合物を含む組成物は、予防的又は治療的有
効量の抗GFRAL抗体を、例えば、単離又は精製された形態で、対象(例えば、患者)への適
切な投与のための形状を提供するための好適な量の担体と一緒に含有し得る。製剤は、投
与様式に適するべきである。
本明細書で使用される「医薬として許容し得る」という用語は、動物、より具体的には
ヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局に承認されているか、又は米
国薬局方、欧州薬局方、もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意
味する。
「医薬製剤」という用語は、活性成分(例えば、抗GFRAL抗体)の生物活性が有効である
ことを可能にするような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容し難いほど
毒性がある追加の成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌性であってもよ
い。
「滅菌」製剤は、無菌であるか又は全ての生きた微生物及びその胞子を含まない。
本明細書で使用される「ポリクローナル抗体」は、多くのエピトープを有するタンパク
質に対する免疫原性応答において生成され、そのため、タンパク質内の同じエピトープ及
び異なるエピトープに対する様々な異なる抗体を含む、抗体集団を指す。ポリクローナル
抗体の産生方法は当技術分野で公知である(例えば、第11章:分子生物学のショートプロト
コル(Short Protocols in Molecular Biology)(2002)、第5版、Ausubelら編、John Wiley
and Sons, New Yorkを参照)。
「単離された核酸」は、他のゲノムDNA配列、並びにネイティブ配列に自然に付随する
タンパク質又は複合体、例えば、リボソーム及びポリメラーゼから実質的に分離されてい
る核酸、例えば、RNA、DNA、又は混合ポリマーである。「単離された」核酸分子は、核酸
分子の天然の源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子である。さらに、「
単離された」核酸分子、例えば、cDNA分子は、他の細胞物質、又は組換え技法によって産
生される場合は、培養培地を実質的に含まないものであるか、又は化学合成される場合は
、化学前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないものであることができる。具体
的な実施態様において、本明細書に記載される抗体をコードする1以上の核酸分子は単離
又は精製されている。この用語は、その天然の環境から除去された核酸配列を含み、組換
えDNA単離体又はクローニングされたDNA単離体及び化学合成された類似体又は異種システ
ムによって生合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子には、該分子の単離された形
態が含まれ得る。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌ
クレオチドのポリマーを指し、これには、DNA及びRNAが含まれる。ヌクレオチドは、デオ
キシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び/又は
これらの類似体、或いはDNAもしくはRNAポリメラーゼによるか又は合成反応によってポリ
マーに組み込むことができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、修飾
ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びその類似体を含み得る。本明細書で使
用される「オリゴヌクレオチド」は一般に、短い、通常は一本鎖の、通常は合成されたポ
リヌクレオチドを指し、これは、通常、長さが約200ヌクレオチド未満であるが、必ずし
もそうとは限らない。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、
互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドに
も同等かつ完全に適用可能である。本開示の抗GFRAL抗体を産生する細胞には、親ハイブ
リドーマ細胞、並びに該抗体をコードする核酸が導入されている細菌及び真核生物宿主細
胞が含まれ得る。好適な宿主細胞は、以下に開示されている。
本明細書で使用される場合、「治療する(treat)」、「治療(treatment)」、及び「治療
する(treating)」という用語は、1以上の療法の投与(1以上の予防剤又は治療剤、例えば
、本明細書に提供される抗体の投与を含むが、これらに限定されない)によって生じるGDF
15媒介性疾患、障害、又は疾病の進行、重症度、及び/又は持続期間の低下又は改善を指
す。いくつかの実施態様において、該薬剤は、抗GFRAL抗体である。本明細書で使用され
る治療には、(i)体重を増加させること;(ii)体重を維持すること;(iii)体重減少を低下さ
せること;(iv)ボディマス(例えば、除脂肪量もしくは脂肪量)を増加させること;(v)ボデ
ィマス(例えば、除脂肪量もしくは脂肪量)を維持すること;(vi)ボディマス(例えば、除脂
肪量もしくは脂肪量)の減少を低下させること、又はこれらの任意の組合せが含まれるが
、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「予防剤」という用語は、対象におけるGDF15媒介性疾患
、障害、もしくは疾病、及び/又はこれらに関連する症状の発症、再発、発生、又は拡大
を完全に又は部分的に阻害することができる任意の薬剤を指す。いくつかの実施態様にお
いて、「予防剤」という用語は、本明細書に提供される抗体を指す。いくつかの実施態様
において、「予防剤」という用語は、本明細書に提供される抗体以外の薬剤を指す。いく
つかの実施態様において、予防剤は、GDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病、及び/又は
これらに関連する症状を予防し、或いはGDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病、及び/又
はこれらに関連する症状の発生、発症、進行、及び/又は重症度を妨害するために有用で
あることが知られているか、又はそのために使用されてきたか、又はそのために現在使用
されている薬剤である。いくつかの実施態様において、予防剤は、完全ヒト抗GFRAL抗体
、例えば、完全ヒト抗GFRALモノクローナル抗体である。
「予防剤」という用語は、対象におけるGDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病、又は
これらの症状の発症、再発、発生、又は拡大を完全に又は部分的に阻害することができる
任意の薬剤を指す。ある実施態様において、「予防剤」という用語は、本明細書に記載さ
れる抗GFRAL抗体を指す。ある他の実施態様において、「予防剤」という用語は、本明細
書に記載される抗GFRAL抗体以外の薬剤を指す。ある実施態様において、予防剤は、GDF15
媒介性疾患、障害、もしくは疾病、又はこれらの症状を予防し、或いはGDF15媒介性疾患
、障害、もしくは疾病、又はこれらの症状の発生、発症、進行、及び/又は重症度を妨害
するために有用であることが知られているか、又はそのために使用されてきたか、又はそ
のために現在使用されている薬剤である。具体的な実施態様において、予防剤は、ヒト化
抗GFRAL抗体、例えば、ヒト化抗GFRALモノクローナル抗体である。
「パッケージインサート」という用語は、治療製品のコマーシャルパッケージに通例含
まれ、そのような治療製品の使用に関する適応症、用法、投薬量、投与、禁忌、及び/又
は警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。
「予防する(prevent)」、「予防する(preventing)」、及び「予防(prevention)」とい
う用語は、本明細書に提供される療法又は療法の組合せ(例えば、予防剤又は治療剤、例
えば、本明細書に提供される抗体の組合せ)の投与によってもたらされる、GDF15媒介性疾
患、障害、もしくは疾病、又はこれらの症状の発症、再発、発生、又は拡大の完全な又は
部分的な阻害を指す。
「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作出、又は単離される
抗体を指す。組換え抗体は、宿主細胞内にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを
用いて発現される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、
ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック及び/もしくはトランスクロモソ
ーマルである動物(例えば、マウスもしくはウシ)から単離される抗体(例えば、Taylor, L
. D.らの文献(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照)、又は免疫グロブリン遺伝
子配列の他のDNA配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作
出、もしくは単離される抗体であることができる。そのような組換え抗体は、ヒト生殖系
列免疫グロブリン配列に由来するものを含む、可変及び定常領域を有することができる(K
abat, E. A.らの文献(1991)、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Prote
ins of Immunological Interest)、第5版、U.S. Department of Health and Human Servi
ces, NIH Publication No. 91-3242を参照)。ある実施態様において、しかしながら、そ
のような組換え抗体は、インビトロ突然変異誘発(又はヒトIg配列についてトランスジェ
ニックな動物を使用する場合は、インビボ体細胞突然変異誘発)を受けることがあり、そ
のため、該組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列に由
来し、かつこれに関連するが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリーに天然には存在
しない可能性がある配列である。
「副作用」という用語は、療法(例えば、予防剤又は治療剤)の望ましくない及び有害な
作用を包含する。望ましくない作用が必ずしも有害であるとは限らない。療法(例えば、
予防剤又は治療剤)による有害な作用は、有害又は不快又は危険であり得る。副作用の例
としては、下痢、咳、胃腸炎、喘鳴、吐き気、嘔吐、食欲不振、腹部痙攣、発熱、疼痛、
体重の減少、脱水症、脱毛症、呼吸困難、不眠症、目眩、粘膜炎、神経筋効果、疲労、口
内乾燥症、及び食欲不振、投与部位での発疹又は腫脹、インフルエンザ様症状、例えば、
発熱、悪寒、及び疲労、消化管異常、並びにアレルギー反応が挙げられる。患者が経験す
るさらなる望ましくない作用は数多くあり、当技術分野で公知である。多くは、医師の卓
上参考書(Physician's Desk Reference)(第60版、2006)に記載されている。
「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用されており、本明細書に
開示される方法との関連において、療法又は予防症例のレシピエントとなる動物を指す。
本明細書で使用されるように、ある実施態様において、対象は、哺乳動物、例えば、非霊
長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど)又は霊長類(例えば、サル及
びヒト)である。具体的な実施態様において、対象は、ヒトである。一実施態様において
、対象は、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病を有する哺乳動物(例えば、ヒト)である。
別の実施態様において、対象は、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病を発症するリスクが
ある哺乳動物(例えば、ヒト)である。
「実質的に全て」は、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少な
くとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約
95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又
は約100％を指す。
「治療剤」という用語は、GDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病、又はこれらの症状
のうちの1以上の症状の治療、予防、又は緩和においてを含め、疾患、障害、又は疾病を
治療、予防、又は緩和する際に使用することができる任意の薬剤を指す。ある実施態様に
おいて、治療剤は、本明細書に記載される抗GFRAL抗体を指す。ある他の実施態様におい
て、治療剤は、本明細書に提供される抗体以外の薬剤を指す。ある実施態様において、治
療剤は、GDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病、又はこれらの症状の1以上の症状の治療
、予防、又は緩和に有用であることが知られているか、又はそのために使用されてきたか
、又はそのために現在使用されている薬剤である。
任意の2以上の単剤療法の相加作用よりも効果的である療法の組合せ(例えば、予防剤又
は治療剤の使用)。例えば、予防剤及び/又は治療剤の組合せの相乗作用は、GDF15媒介性
疾患、障害、又は疾病を有する対象に対する、該薬剤のうちの1つもしくは複数のより少
ない投薬量の使用、及び/又は該薬剤のより低頻度の投与を可能にする。より少ない投薬
量の予防的もしくは治療的療法を利用し、及び/又はより低い頻度で該療法を投与する能
力は、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病の予防、管理、治療、又は改善における該療法
の効力を低下させることなく、対象への該療法の投与と関連する毒性を低下させる。さら
に、相乗作用は、GDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病の予防における、又は管理、治
療、もしくは改善における療法の効力の改善をもたらすことができる。最後に、療法(例
えば、予防剤又は治療剤)の組合せの相乗作用は、任意の単剤療法の使用と関連する有害
な又は望ましくない副作用を回避又は軽減することができる。いくつかの実施態様におい
て、組合せ療法は、本明細書に提供される抗体及びインスリン(例えば、インスリン補給)
を含む。いくつかの実施態様において、組合せ療法は、抗GFRAL抗体及びインスリンを含
み、ここで、該組合せ療法は、インスリン単独療法における通常の1日投薬量よりも少な
い1日投薬量のインスリンを含む。いくつかの実施態様において、組合せ療法は、例えば
、インスリン単独療法における通常の1日インスリン投薬量の90％未満、80％未満、70％
未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％
未満、3％未満、又は1％未満を含む。
「療法」という用語は、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病(例えば、1型糖尿病又は2型
糖尿病)の予防、管理、治療、及び/又は改善において使用することができる任意のプロト
コル、方法、及び/又は薬剤を指す。いくつかの実施態様において、「療法(therapies)」
及び「療法(therapy)」という用語は、生物療法、支持療法、並びに/又は当業者、例えば
、医療関係者に公知の、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病の予防、管理、治療、及び/も
しくは改善において有用な他の療法を指す。
「検出可能なプローブ」という用語は、検出可能なシグナルを提供する組成物を指す。
この用語は、限定するものではないが、その活性を介して検出可能なシグナルを提供する
任意の蛍光団、発色団、放射性標識、酵素、抗体、又は抗体断片などを含む。
「診断剤」という用語は、疾患、障害、又は疾病の診断を助ける、対象に投与される物
質を指す。そのような物質を用いて、疾患誘発過程の局在を明らかにし、それを正確に示
し、及び/又はそれを規定することができる。ある実施態様において、診断剤は、対象に
投与するか又は対象由来の試料に接触させたときにGDF15媒介性疾患、障害、又は疾病の
診断を助ける、本明細書に記載される抗GFRAL抗体にコンジュゲートされている物質を含
む。
「検出可能な薬剤」という用語は、試料又は対象中の所望の分子、例えば、本明細書に
記載される抗GFRAL抗体の存在(existence)又は存在(presence)を確認するために使用する
ことができる物質を指す。検出可能な薬剤は、可視化されることができる物質又は別の方
法で(例えば、定量によって)決定及び/もしくは測定される物質であることができる。
「コードする」という用語又はその文法的同等語は、それが核酸分子に関して使用され
るとき、そのネイティブな状態の、又は当業者に周知の方法によって操作される場合、後
にポリペプチド及び/又はその断片に翻訳されるmRNAを産生するように転写されることが
できる、核酸分子を指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸分子の相補体であり、コー
ド配列は、それから推定することができる。
「賦形剤」という用語は、希釈剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、又は安定化剤として一
般に使用される不活性物質を指し、タンパク質(例えば、血清アルブミンなど)、アミノ酸
(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン
など)、脂肪酸及びリン脂質(例えば、アルキルスルホネート、カプリレートなど)、界面
活性剤(例えば、SDS、ポリソルベート、非イオン性界面活性剤など)、糖類(例えば、スク
ロース、マルトース、トレハロースなど)、並びにポリオール(例えば、マンニトール、ソ
ルビトールなど)を含むが、これらに限定されない。その全体が引用により本明細書中に
組み込まれるレミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(1990) Mack Pub
lishing Co., Easton, PAも参照されたい。
ペプチド又はポリペプチドとの関連において、本明細書で使用される「断片」という用
語は、全長に満たないアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを指す。そのような
断片は、例えば、アミノ末端での切断、カルボキシ末端での切断、及び/又はアミノ酸配
列からの残基の内部欠失によって生じ得る。断片は、例えば、選択的RNAスプライシング
によるか又はインビボのプロテアーゼ活性によって生じ得る。ある実施態様において、断
片は、GFRALポリペプチド又はGFRALポリペプチドに結合する抗体のアミノ酸配列の少なく
とも5個の連続するアミノ酸残基、少なくとも10個の連続するアミノ酸残基、少なくとも1
5個の連続するアミノ酸残基、少なくとも20個の連続するアミノ酸残基、少なくとも25個
の連続するアミノ酸残基、少なくとも40個の連続するアミノ酸残基、少なくとも50個の連
続するアミノ酸残基、少なくとも60個の連続するアミノ残基、少なくとも70個の連続する
アミノ酸残基、少なくとも80個の連続するアミノ酸残基、少なくとも90個の連続するアミ
ノ酸残基、少なくとも連続100個のアミノ酸残基、少なくとも125個の連続するアミノ酸残
基、少なくとも150個の連続するアミノ酸残基、少なくとも175個の連続するアミノ酸残基
、少なくとも200個の連続するアミノ酸残基、少なくとも250個、少なくとも300個、少な
くとも350個、少なくとも400個、少なくとも450個、少なくとも500個、少なくとも550個
、少なくとも600個、少なくとも650個、少なくとも700個、少なくとも750個、少なくとも
800個、少なくとも850個、少なくとも900個、又は少なくとも950個の連続するアミノ酸残
基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施態様において、GFRALポリ
ペプチドに結合する抗体の断片は、該抗体の少なくとも1つ、少なくとも2つ、もしくは少
なくとも3つ、又はそれより多くの機能を保持する。
「管理する(manage)」、「管理する(managing)」、及び「管理(management)」という用
語は、対象が療法(例えば、予防剤又は治療剤)から得る有益な効果を指し、該療法は、疾
患の治癒をもたらすものではない。ある実施態様において、疾患の進行又は悪化を予防す
るために、対象に、1以上の療法(例えば、予防剤又は治療剤、例えば、本明細書に提供さ
れる抗体)を投与して、GDF15媒介性疾患、障害、もしくは疾病、又はこれらの症状を「管
理する」。
「投与する」又は「投与」は、体外に存在するがままの物質(例えば、本明細書に記載
される抗GFRAL抗体)を、対象に、例えば、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内送達、及び/又は
本明細書に記載されるもしくは当技術分野で公知の任意の他の物理的送達方法によって注
射するか又は別の方法で物理的に送達する行為を指す。疾患、障害、もしくは疾病、又は
その症状が治療されているとき、該物質の投与は、通常、該疾患、障害、もしくは疾病、
又はその症状の発症の後に行われる。疾患、障害、もしくは疾病、又はその症状が予防さ
れているとき、該物質の投与は、通常、該疾患、障害、もしくは疾病、又はその症状の発
症の前に行われる。
ポリペプチドとの関連において、本明細書で使用される「類似体」という用語は、GFRA
Lポリペプチド、GFRALポリペプチドの断片、もしくは抗GFRAL抗体と同様のもしくは同一
の機能を保有するが、必ずしも、GFRALポリペプチド、GFRALポリペプチドの断片、もしく
は抗GFRAL抗体と同様のもしくは同一のアミノ酸配列を含むものではなく、GFRALポリペプ
チド、GFRALポリペプチドの断片、もしくは抗GFRAL抗体と同様のもしくは同一の構造を保
有するものでもない、ポリペプチドを指す。同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドは
、以下のうちの少なくとも1つを満たすポリペプチドを指す:(a)本明細書に記載されるGFR
ALポリペプチド(例えば、配列番号500)、GFRALポリペプチドの断片、又は抗GFRAL抗体の
アミノ酸配列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少
なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少
なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又
は少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド;(b)少なくとも5アミノ
酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸
残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少なくとも50アミノ酸残
基、少なくとも60アミノ残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なくとも80アミノ酸残基、
少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なくとも125アミノ酸残基、
又は少なくとも150アミノ酸残基の本明細書に記載されるGFRALポリペプチド、GFRALポリ
ペプチドの断片、又は抗GFRAL抗体(又はそのVHもしくはVL領域)をコードするヌクレオチ
ド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコー
ドされるポリペプチド(例えば、Sambrookらの文献(2001)、分子クローニング:実験マニュ
アル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, NY; Maniatisらの文献(1982)、分子クローニング:実験マニュア
ル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Press, Cold Sprin
g Harbor, NYを参照);及び(c)本明細書に記載されるGFRALポリペプチド、GFRALポリペプ
チドの断片、又は抗GFRAL抗体(又はそのVHもしくはVL領域)をコードするヌクレオチド配
列と少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50
％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75
％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくと
も99％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド。本明細書に記載
されるGFRALポリペプチド、GFRALポリペプチドの断片、又は抗GFRAL抗体と同様の構造を
有するポリペプチドは、本明細書に記載されるGFRALポリペプチド、GFRALの断片、又はGF
RAL抗体と同様の2次、3次、又は4次構造を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドの構
造は、限定されないが、X線結晶学、核磁気共鳴、及び結晶学的電子顕微鏡法を含む、当
業者に公知の方法によって決定することができる。
「組成物」という用語は、任意に、指定された量の、指定された成分(例えば、本明細
書に提供される抗体)を含有する製品、及び任意に、指定された量の、指定された成分の
組合せから、直接的又は間接的に得られる任意の製品を包含することが意図される。
ポリペプチドとの関連において、本明細書で使用される「誘導体」という用語は、アミ
ノ酸残基の置換、欠失、又は付加の導入によって改変されている、GFRALポリペプチド、G
FRALポリペプチドの断片、又はGFRALポリペプチドに結合する抗体のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドを指す。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、例えば、ポリペプ
チドに対する任意の種類の分子の共有結合によって化学的に修飾されている、GFRALポリ
ペプチド、GFRALポリペプチドの断片、又はGFRALポリペプチドに結合する抗体も指す。例
えば、限定するものではないが、GFRALポリペプチド、GFRALポリペプチドの断片、又はGF
RAL抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の
保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク
質に対する結合などによって化学的に修飾されていてもよい。誘導体は、結合している分
子の種類又は位置のどちらかが天然に存在するペプチドもしくはポリペプチド又は出発ペ
プチドもしくはポリペプチドと異なるように修飾される。誘導体は、ペプチド又はポリペ
プチド上に天然に存在する1以上の化学基の欠失をさらに含む。GFRALポリペプチド、GFRA
Lポリペプチドの断片、又はGFRAL抗体の誘導体は、限定されないが、特異的な化学的切断
、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、当業者に公知の技法
を用いる化学修飾によって化学的に修飾されていてもよい。さらに、GFRALポリペプチド
、GFRALポリペプチドの断片、又はGFRAL抗体の誘導体は、1以上の非典型的アミノ酸を含
有していてもよい。ポリペプチド誘導体は、本明細書に記載されるGFRALポリペプチド、G
FRALポリペプチドの断片、又はGFRAL抗体と同様の又は同一の機能を保有する。
「不随意の体重減少」という用語は、悪液質、肝硬変、甲状腺機能亢進症、慢性腎疾患
、パーキンソン病、癌、摂食障害、及びサルコペニアなどの多くの疾病で観察される意図
しない体重減少を指す。
「悪液質」という用語は、積極的に減量しようとしていない人における体重減少、筋萎
縮、疲労、衰弱、及び顕著な食欲不振を特徴とする消耗症候群を指す。悪液質は、いくつ
かの慢性疾患(例えば、癌、慢性腎疾患、慢性炎症性疾患、筋消耗、例えば、筋ジストロ
フィー、及び神経性無食欲)に罹患している患者の罹病率に大きく寄与し得る。例えば、
末期癌において、悪液質は、一般的であり(最末期症状の癌患者で生じ)、全ての癌関連死
の約4分の1の原因である。
(組成物及びその作製方法)
結合タンパク質、例えば、GFRAL(例えば、ヒトGFRAL)に結合する抗体が提供される。本
開示の抗体は、例えば、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病の診断又は治療に有用である
。ある実施態様において、本開示の抗体は、限定されないが、悪液質もしくは慢性疾患(
例えば、肝硬変、甲状腺機能亢進症、パーキンソン病、癌、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾
患、AIDS、結核症、慢性炎症性疾患、敗血症、筋消耗、及び神経性無食欲)に罹患してい
る対象における不随意の体重減少を含む、不随意の体重減少などの、疾患、障害、もしく
は疾病、又はGDF15のインビボ作用を阻害することが望ましい、広く任意の疾患、障害、
もしくは疾病の診断又は治療に有用である。
本明細書に提供されるのは、GFRALポリペプチド、GFRALポリペプチド断片、GFRALペプ
チド、又はGFRALエピトープに結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体)である。いく
つかの実施態様において、抗GFRAL抗体は、GFRALの細胞外ドメイン(ECD)に結合する。ま
た提供されるのは、本明細書に提供される抗GFRAL抗体がGFRALポリペプチドに結合するの
を競合的に遮断する抗体である。本明細書に提供される抗GFRAL抗体は、診断剤、検出可
能な薬剤、又は治療剤にコンジュゲートするか又は組換え融合させることもできる。さら
に提供されるのは、抗GFRAL抗体を含む組成物である。
また本明細書に提供されるのは、GFRALポリペプチド、GFRALポリペプチド断片、GFRAL
ペプチド、又はGFRALエピトープに結合する抗GFRAL抗体の免疫グロブリン重鎖、軽鎖、VH
領域、VL領域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又はVL CDR3をコ
ードする単離された核酸分子である。さらに提供されるのは、GFRALポリペプチド、GFRAL
ポリペプチド断片、GFRALペプチド、又はGFRALエピトープに結合する抗GFRAL抗体をコー
ドする核酸分子を含むベクター及び宿主細胞である。また提供されるのは、GFRALポリペ
プチド、GFRALポリペプチド断片、GFRALペプチド、又はGFRALエピトープに結合する抗体
を作製する方法である。
抗GFRAL抗体を使用する方法が本明細書に提供される。本方法は、対象(例えば、患者)
におけるGDF15媒介性疾患、障害、又は疾病の1以上の症状を治療、予防、又は緩和するこ
とを含む、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病を治療、予防、又は緩和することを含む。G
DF15媒介性疾患、障害、又は疾病の非限定的な例としては、不随意の体重減少、消耗性疾
患、悪液質又は慢性疾患(例えば、肝硬変、甲状腺機能亢進症、パーキンソン病、癌、慢
性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核症、慢性炎症性疾患、敗血症、筋消耗、及び神
経性無食欲)に罹患している対象における不随意の体重減少が挙げられる。対象が不随意
の体重減少に苦しみ得る疾患、障害、又は疾病のその他のものとしては、摂食障害、筋ジ
ストロフィー、又は多発性硬化症が挙げられる。
(抗GFRAL抗体)
いくつかの実施態様において、本開示は、本明細書において治療剤としての使用を見出
し得る抗GFRAL抗体を提供する。例示的な抗体としては、ポリクローナル、モノクローナ
ル、ヒト化、ヒト、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体、並びに改善された親和
性又は他の性質を有するこれらの変異体が挙げられる。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、GFRALポリペプチド、GFRAL
ポリペプチド断片、GFRALペプチド、又はGFRALエピトープを含む、GFRALに結合する抗体
である。いくつかの実施態様において、抗GFRAL抗体は、GFRALポリペプチド、GFRALポリ
ペプチド断片、GFRALペプチド、又はGFRALエピトープを含む、GFRALに結合するヒト化抗
体(例えば、ヒト定常領域を含むもの)である。
いくつかの実施態様において、抗GFRAL抗体は、本明細書に記載されるモノクローナル
抗体(例えば、1C1、3P10、12A3、5F12、5A20、8D8、17J16、25M22、2B8、22N5、2I23、6N
16、1B3、19K19、2B3、8C10、2A9、24G2、6G9、2B11、1A3、P1B6、P1H8、又はP8G4)のい
ずれか1つのVH領域、VL領域、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/又
はVL CDR3、例えば、表1～24に示されるアミノ酸配列を含む。したがって、いくつかの実
施態様において、本明細書に提供される単離された抗体又はその機能断片は、表1～24に
示されるような:(a)1C1と表記された抗体;(b)3P10と表記された抗体;(c)12A3と表記され
た抗体;(d)5F12と表記された抗体;(e)5A20と表記された抗体;(f)8D8と表記された抗体;(g
)17J16と表記された抗体;(h)25M22と表記された抗体;(i)2B8と表記された抗体;(j)22N5と
表記された抗体;(k)2I23と表記された抗体;(l)6N16と表記された抗体;(m)1B3と表記され
た抗体;(n)19K19と表記された抗体;(o)2B3と表記された抗体;(p)8C10と表記された抗体;(
q)2A9と表記された抗体;(r)24G2と表記された抗体;(s)6G9と表記された抗体;(t)2B11と表
記された抗体;(u)1A3と表記された抗体;(v)P1B6と表記された抗体;(w)P1H8と表記された
抗体;(x)P8G4と表記された抗体;又は1C1～P8G4と表記された抗体由来の1つ、2つ、及び/
もしくは3つの重鎖CDR並びに/又は1つ、2つ、及び/もしくは3つの軽鎖CDRを含む。
1C1と表記された抗体は、配列番号1であるVH配列及び配列番号2であるVL配列を含む。
3P10と表記された抗体は、配列番号3であるVH配列及び配列番号4であるVL配列を含む。
12A3と表記された抗体は、配列番号5であるVH配列及び配列番号6であるVL配列を含む。
5F12と表記された抗体は、配列番号7であるVH配列及び配列番号8であるVL配列を含む。
5A20と表記された抗体は、配列番号9であるVH配列及び配列番号10であるVL配列を含む
。
8D8と表記された抗体は、配列番号11であるVH配列及び配列番号12であるVL配列を含む
。
17J16と表記された抗体は、配列番号13であるVH配列及び配列番号14であるVL配列を含
む。
25M22と表記された抗体は、配列番号15であるVH配列及び配列番号16であるVL配列を含
む。
2B8と表記された抗体は、配列番号17であるVH配列及び配列番号18であるVL配列を含む
。
22N5と表記された抗体は、配列番号19であるVH配列及び配列番号20であるVL配列を含む
。
2I23と表記された抗体は、配列番号21であるVH配列及び配列番号22であるVL配列を含む
。
6N16と表記された抗体は、配列番号23であるVH配列及び配列番号24であるVL配列を含む
。
1B3と表記された抗体は、配列番号25であるVH配列及び配列番号26であるVL配列を含む
。
19K19と表記された抗体は、配列番号27であるVH配列及び配列番号28であるVL配列を含
む。
2B3と表記された抗体は、配列番号29であるVH配列及び配列番号30であるVL配列を含む
。
8C10と表記された抗体は、配列番号31であるVH配列及び配列番号32であるVL配列を含む
。
2A9と表記された抗体は、配列番号33であるVH配列及び配列番号34であるVL配列を含む
。
24G2と表記された抗体は、配列番号35であるVH配列及び配列番号36であるVL配列を含む
。
6G9と表記された抗体は、配列番号37であるVH配列及び配列番号38であるVL配列を含む
。
2B11と表記された抗体は、配列番号39であるVH配列及び配列番号40であるVL配列を含む
。
1A3と表記された抗体は、配列番号480であるVH配列及び配列番号481であるVL配列を含
む。
P1B6と表記された抗体は、配列番号482であるVH配列及び配列番号483であるVL配列を含
む。
P1H8と表記された抗体は、配列番号484であるVH配列及び配列番号485であるVL配列を含
む。
P8G4と表記された抗体は、配列番号486であるVH配列及び配列番号487であるVL配列を含
む。
表1:抗体1CのCDR配列
Figure 2022088355000041
 表2:抗体3P10のCDR配列
Figure 2022088355000042
 表3:抗体12A3のCDR配列
Figure 2022088355000043
 表4:抗体5F12のCDR配列
Figure 2022088355000044
 表5:抗体5A20のCDR配列
Figure 2022088355000045
 表6:抗体8D8のCDR配列
Figure 2022088355000046
 表7:抗体17J16のCDR配列
Figure 2022088355000047
 表8:抗体25M22のCDR配列
Figure 2022088355000048
 表9:抗体2B8のCDR配列
Figure 2022088355000049
 表10:抗体22N5のCDR配列
Figure 2022088355000050
 表11:抗体2I23のCDR配列
Figure 2022088355000051
 表12:抗体6N16のCDR配列
Figure 2022088355000052
 表13:抗体1B3のCDR配列
Figure 2022088355000053
 表14:抗体19K19のCDR配列
Figure 2022088355000054
 表15:抗体2B3のCDR配列
Figure 2022088355000055
 表16:抗体8C10のCDR配列
Figure 2022088355000056
 表17:抗体2A9のCDR配列
Figure 2022088355000057
 表18:抗体24G2のCDR配列
Figure 2022088355000058
 表19:抗体6G9のCDR配列
Figure 2022088355000059
 表20:抗体2B11のCDR配列
Figure 2022088355000060
 表21:抗体1A3のCDR配列
Figure 2022088355000061
 表22:抗体P1B6のCDR配列
Figure 2022088355000062
 表23:抗体P1H8のCDR配列
Figure 2022088355000063
 表24:抗体P8G4のCDR配列
Figure 2022088355000064
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体は、VH領域又はVHドメインを
含む。他の実施態様において、本明細書に提供される抗体は、VL領域又はVL鎖を含む。い
くつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体は、(i)VHドメインもしくはVH領
域;及び/又は(ii)VLドメインもしくはVL領域の組合せを有する。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体は、表1～24で特定される6つ
のCDR、例えば、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/もしくはVL CDR3
を含む又は該CDRからなる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体は
、6つ未満のCDRを含むことができる。いくつかの実施態様において、該抗体は、表1～24
で特定されるVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及び/もしくはVL CDR3か
らなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのCDRを含む又は該CDRからな
る。いくつかの実施態様において、該抗体は、本明細書に記載される:(a)1C1と表記され
た抗体;(b)3P10と表記された抗体;(c)12A3と表記された抗体;(d)5F12と表記された抗体;(
e)5A20と表記された抗体;(f)8D8と表記された抗体;(g)17J16と表記された抗体;(h) t25M2
2と表記された抗体;(i)2B8と表記された抗体;(j)22N5と表記された抗体;(k)2I23と表記さ
れた抗体;(l)6N16と表記された抗体;(m)1B3と表記された抗体;(n)19K19と表記された抗体
;(o)2B3と表記された抗体;(p)8C10と表記された抗体;(q)2A9と表記された抗体;(r)24G2と
表記された抗体;(s)6G9と表記された抗体;(t)2B11と表記された抗体;(u)1A3と表記された
抗体;(v)P1B6と表記された抗体;(w)P1H8と表記された抗体;もしくは(x)P8G4と表記された
抗体からなる群から選択されるマウスモノクローナル抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3
、VL CDR1、VL CDR2、及び/もしくはVL CDR3からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4
つ、もしくは5つのCDRを含む又は該CDRからなる。したがって、いくつかの実施態様にお
いて、該抗体は、表1～24で特定されるVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、
及び/もしくはVL CDR3のうちのいずれか1つの1つ、2つ、3つ、4つ、もしくは5つのCDRを
含む又は該CDRからなる。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体は、表1～24に記載される1以
上の(例えば、1つ、2つ、もしくは3つの)VH CDRを含む又は該CDRからなる。他の実施態様
において、本明細書に提供される抗体は、表1～24に記載される1以上の(例えば、1つ、2
つ、又は3つの)VL CDRを含む。さらに他の実施態様において、本明細書に提供される抗体
は、表1～24に記載される1以上の(例えば、1つ、2つ、又は3つの)VH CDR及び表1～24に記
載される1以上のVL CDRを含む。したがって、ある実施態様において、該抗体は、57、49
、57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796、488～493、1795、1796のうちの
いずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDR1を含む。別の実施態様において、該抗体は、
配列番号132～220、497～514のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDR2を含む
。別の実施態様において、該抗体は、配列番号57、49、57、49、221～296、515～530、48
8～493、1795、1796、488～493、1795、1796のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有す
るVH CDR3を含む。ある実施態様において、該抗体は、表1～24に示されるアミノ酸配列の
いずれか1つに示されるVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3から独立に選択されるVH CDR1及び/又
はVH CDR2及び/又はVH CDR3を含む。ある実施態様において、該抗体は、配列番号297～37
2、531～546のいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDR1を含む。別の実施態様におい
て、該抗体は、配列番号373～422のいずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDR2を含む。
別の実施態様において、該抗体は、配列番号423～479、558～569のいずれか1つのアミノ
酸配列を有するVL CDR3を含む。ある実施態様において、該抗体は、表1～24に示されるア
ミノ酸配列のいずれか1つに示されるVL CDR1、VL CDR2、VL CDR3から独立に選択されるVL
CDR1及び/又はVL CDR2及び/又はVL CDR3を含む。
また本明細書に提供されるのは、表1～24に記載される1以上の(例えば、1つ、2つ、又
は3つの)VH CDR及び1以上の(例えば、1つ、2つ、又は3つの)VL CDRを含む抗体である。特
に、本明細書に提供されるのは: VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～530、488～4
93、1795、1796)及びVL CDR1(配列番号297～372、531～546); VH CDR1(配列番号57、49、
221～296、515～530、488～493、1795、1796)及びVL CDR2(配列番号373～422); VH CDR1(
配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)及びVL CDR3(配列番号423
～479、558～569); VH CDR2(配列番号132～220、497～514)及びVL CDR1(配列番号297～37
2、531～546); VH CDR2(配列番号132～220、497～514)及びVL CDR2(配列番号373～422);
VH CDR2(配列番号132～220、497～514)及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH C
DR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)及びVL CDR1(配列番
号297～372、531～546); VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、179
5、1796)及びVL CDR2(配列番号373～422); VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～53
0、488～493、1795、1796)及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番
号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、4
97～514)、及びVL CDR1(配列番号297～372、531～546); VH CDR1(配列番号57、49、221～
296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、及びV
L CDR2(配列番号373～422); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、
1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、及びVL CDR3(配列番号423～479、
558～569); VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296
、515～530、488～493、1795、1796)、及びVL CDR1(配列番号297～372、531～546)、VH C
DR2(配列番号132～220、497～514)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488
～493、1795、1796)、及びVL CDR2(配列番号373～422); VH CDR2(配列番号132～220、497
～514)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、及びV
L CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～530、
488～493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR2(配列番号
373～422); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL
CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH C
DR1(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR2(配列番号3
73～422)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR2(配列番号132～220、497
～514)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR2(配列番号373～422); VH C
DR2(配列番号132～220、497～514)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR
3(配列番号423～479、558～569); VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VL CDR2(配列
番号373～422)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR3(配列番号57、49、
221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、
及びVL CDR2(配列番号373～422); VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～
493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR3(配列番号423～
479、558～569); VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796
)、VL CDR2(配列番号373～422)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR1(
配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～
220、497～514)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796
)、及びVL CDR1(配列番号297～372、531～546); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、51
5～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VH CDR3(配列
番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、及びVL CDR2(配列番号373～
422); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2
(配列番号132～220、497～514)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～4
93、1795、1796)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番号57、49
、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、497～514)
、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR2(配列番号373～422); VH CDR1(配
列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～22
0、497～514)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR3(配列番号423～479
、558～569); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、
VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VL CDR2(配列番号373～422)、及びVL CDR3(配列
番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1
795、1796)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、V
L CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR2(配列番号373～422); VH CDR1(配列
番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR3(配列番号57、49、2
21～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、
及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～
530、488～493、1795、1796)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493
、1795、1796)、VL CDR2(配列番号373～422)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569
); VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～5
30、488～493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、及びVL CDR2(配列
番号373～422); VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VH CDR3(配列番号57、49、221
～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、及
びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VH C
DR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR2(配列番号3
73～422)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番号57、49、221～
296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VH CD
R3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号29
7～372、531～546)、及びVL CDR2(配列番号373～422); VH CDR1(配列番号57、49、221～2
96、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VH CDR
3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号297
～372、531～546)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番号57、4
9、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、497～514
)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR2(配
列番号373～422)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番号57、49
、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VH CDR2(配列番号132～220、497～514)
、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、VL CDR2(配列番号373～422)、及びVL CDR3(配
列番号423～479、558～569); VH CDR1(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493
、1795、1796)、VH CDR3(配列番号57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)
、VL CDR1(配列番号297～372、531～546)、VL CDR2(配列番号373～422)、及びVL CDR3(配
列番号423～479、558～569); VH CDR2(配列番号132～220、497～514)、VH CDR3(配列番号
57、49、221～296、515～530、488～493、1795、1796)、VL CDR1(配列番号297～372、531
～546)、VL CDR2(配列番号373～422)、及びVL CDR3(配列番号423～479、558～569);又は
表1～24に記載されるVH CDR(配列番号41～296)とVL CDR(配列番号297～477)のその任意の
組合せを含む抗体である。
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体又はその断片は、ヒト化フレームワ
ーク領域(FR)配列を含む。ある実施態様において、本明細書に記載される抗体又はその断
片は、表25に示されるVH FR1、VH FR2、VH FR3、及びVH FR4アミノ酸配列を含むVH領域;
並びに/又は(b)表25に示されるVL FR1、VL FR2、VL FR3、及びVL FR4アミノ酸配列を含む
VL領域を含む。
表25:ヒト化抗GFRAL抗体の例示的なフレームワーク配列
Figure 2022088355000065
Figure 2022088355000066
Figure 2022088355000067
Figure 2022088355000068
Figure 2022088355000069
Figure 2022088355000070
Figure 2022088355000071
Figure 2022088355000072
Figure 2022088355000073
Figure 2022088355000074
Figure 2022088355000075
Figure 2022088355000076
Figure 2022088355000077
Figure 2022088355000078
Figure 2022088355000079
Figure 2022088355000080
Figure 2022088355000081
Figure 2022088355000082
Figure 2022088355000083
Figure 2022088355000084
Figure 2022088355000085
Figure 2022088355000086
Figure 2022088355000087
Figure 2022088355000088
Figure 2022088355000089
Figure 2022088355000090
Figure 2022088355000091
Figure 2022088355000092
Figure 2022088355000093
Figure 2022088355000094
Figure 2022088355000095
Figure 2022088355000096
Figure 2022088355000097
Figure 2022088355000098
Figure 2022088355000099
Figure 2022088355000100
Figure 2022088355000101
Figure 2022088355000102
Figure 2022088355000103
Figure 2022088355000104
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体又はその断片は:(1)配列番号570～5
78から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR1;(2)配列番号579～602から選択されるアミ
ノ酸配列を有するVH FR2;(3)配列番号603～1726から選択されるアミノ酸配列を有するVH
FR3;及び/又は(4)配列番号1727～1728から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR4を含む
VH領域を含む。したがって、いくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号570～578
から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR1を含むVH領域を含む。いくつかの態様におい
て、ヒト化抗体は、配列番号579～602から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR2を含む
VH領域を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号603～1726から選択さ
れるアミノ酸配列を有するVH FR3を含むVH領域を含む。いくつかの態様において、ヒト化
抗体は、配列番号1727～1728から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR4を含むVH領域を
含む。
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体又はその断片は:(1)配列番号1729～
1750から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR1;(2)配列番号1751～1777から選択される
アミノ酸配列を有するVL FR2;(3)配列番号1778～1792から選択されるアミノ酸配列を有す
るVL FR3;及び/又は(4)配列番号1793～1794から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR4
を含むVL領域を含む。したがって、いくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号17
29～1750から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR1を含むVL領域を含む。いくつかの態
様において、ヒト化抗体は、配列番号1751～1777から選択されるアミノ酸配列を有するVL
FR2を含むVL領域を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号1778～1792
から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR3を含むVL領域を含む。いくつかの態様におい
て、ヒト化抗体は、配列番号1793～1794から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR4を含
むVL領域を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載される抗体又はその断片は、VH領域及びVL領域
を含み、ここで、該VH領域は:(1)配列番号570～578から選択されるアミノ酸配列を有する
VH FR1;(2)配列番号579～602から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR2;(3)配列番号60
3～1726から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR3;及び/又は(4)配列番号1727～1728の
アミノ酸配列を有するVH FR4をさらに含み;かつ該VL領域は:(1)配列番号1729～1750から
選択されるアミノ酸配列を有するVL FR1;(2)配列番号1751～1777から選択されるアミノ酸
配列を有するVL FR2;(3)配列番号1778～1792から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR3
;及び/又は(4)配列番号1793～1794から選択されるアミノ酸を有するVL FR4をさらに含む
。
また本明細書に提供されるのは、表25に記載される1以上(例えば、1つ、2つ、3つ、又
は4つ)のVH FR及び1以上(例えば、1つ、2つ、3つ、又は4つ)のVL FRを含む抗体である。
特に、本明細書に提供されるのは: VH FR1(配列番号570～578)及びVL FR1(配列番号1729
～1750); VH FR1(配列番号570～578)及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配列番号
570～578)及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)及びVL FR4(配列
番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)及びVL FR1(配列番号1729～1750); VH FR2(
配列番号579～602)及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR2(配列番号579～602)及びVL
FR3(配列番号1778～1792); VH FR2(配列番号579～602)及びVL FR4(配列番号1793～1794);
VH FR3(配列番号603～1726)及びVL FR1(配列番号1729～1750); VH FR3(配列番号603～17
26)及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR3(配列番号603～1726)及びVL FR3(配列番号1
778～1792); VH FR3(配列番号603～1726)及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR4(配列
番号1727～1728)及びVL FR1(配列番号1729～1750); VH FR4(配列番号1727～1728)及びVL
FR2(配列番号1751～1777); VH FR4(配列番号1727～1728)及びVL FR3(配列番号1778～1792
); VH FR4(配列番号1727～1728)及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570
～578)、VH FR2(配列番号579～602)、及びVL FR1(配列番号1729～1750); VH FR1(配列番
号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配
列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR
1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); V
H FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、及びVL FR1(配列番号1729～175
0); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、及びVL FR2(配列番号1751
～1777); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、及びVL FR3(配列番
号1778～1792); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、及びVL FR4(
配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びV
L FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配列番号570～578)、VL FR1(配列番号1729～1750)
、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VL FR1(配列番号1729
～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VL FR2(配列番
号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VL FR2(
配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、V
L FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR2(配列番号579～6
02)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR2(配列番号
579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配
列番号579～602)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH
FR2(配列番号579～602)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794
); VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号175
1～1777); VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列
番号1778～1792); VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL F
R4(配列番号1793～1794); VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～1777)、
及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～
1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番
号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR
1(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR4(配列番号1727～1728
)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR4(配列番号17
27～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR4(配
列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); V
H FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、及
びVL FR1(配列番号1729～1750); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)
、VH FR3(配列番号603～1726)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配列番号570
～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、及びVL FR3(配列番号
1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号
603～1726)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配
列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR1(配列番号1729～1750); VH
FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及
びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)
、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570
～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR4(配列番
号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列
番号1727～1728)、及びVL FR1(配列番号1729～1750); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR
3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR2(配列番号1751～1777)
; VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728
)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603
～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列
番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR1
(配列番号1729～1750); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR
4(配列番号1727～1728)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR2(配列番号579～602)
、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR3(配列番号1778
～1792); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号172
7～1728)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列
番号579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR
1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びV
L FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、V
L FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～5
78)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1
751～1777); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号
1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配
列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH
FR1(配列番号570～578)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、
及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR4(配列番号1727～1
728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番
号570～578)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(
配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1
(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR2(配列番号579～602)、
VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～
1792); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729
～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番
号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR
2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及
びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～172
8)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR3(配列番号6
03～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配
列番号1751～1777); VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1
(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR3(配列番号603～1726)
、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号179
3～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VL FR2(配列番号175
1～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列
番号579～602)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR
1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及び
VL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)
、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570
～578)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列
番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配
列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH
FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～179
2); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～17
77)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号17
27～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR2(配
列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL
FR4(配列番号1793～1794); VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、
VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR3(配列番号603～
1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番
号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VL FR3(配列番
号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(
配列番号603～1726)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794);
VH FR1(配列番号570～578)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR3(配列番号1778～1792)
、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～
1726)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番
号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(
配列番号1793～1794); VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL F
R3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)
、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号177
8～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1
751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VL FR1(配
列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); V
H FR1(配列番号570～578)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)
、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VL FR1(配列番号1729
～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR2(配列
番号579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR
4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL
FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602
)、VL FR2(配列番号1751～1777)
、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR3(配列番号603
～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列
番号1778～1792); VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(
配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR3(配列番号603～1726)、
VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793
～1794); VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1
778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(
配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792);
VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～17
77)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号
1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR4(
配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及
びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)
、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR1(配列番号1729
～1750); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603
～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配列
番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列
番号1727～1728)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR
2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、及び
VL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、
VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～
1777); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1
726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番
号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番
号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(
配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL
FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH
FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～17
94); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～172
6)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号5
70～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1
729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配
列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL
FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH
FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～17
94); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～17
28)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号
570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号
1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配
列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL
FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH
FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～1
777); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～
1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR2(配列番
号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列
番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR
3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及
びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726
)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号17
93～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1
727～1728)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(
配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(
配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、V
H FR2(配列番号579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)
、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～
602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番
号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VL FR2(配列番
号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR
1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL F
R2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)
、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～17
77)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号60
3～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配
列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(
配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794);
VH FR1(配列番号570～578)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750
)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号57
0～578)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号
1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR4(配
列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びV
L FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR4(配列番号1727～1728)
、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号179
3～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号17
29～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR2(配
列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(
配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、V
H FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)
、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～
1726)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番
号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列
番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH
FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、V
L FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～6
02)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778
～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番
号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR
4(配列番号1793～1794); VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL
FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1
792); VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729
～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR3(配列
番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(
配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR3(配列番号603～1726)、
VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～179
2)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VL FR1(配列番号172
9～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配
列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(
配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794);
VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～177
7)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR4(配列番号1
727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列
番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR
2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL F
R1(配列番号1729～1750)、及びVL FR2(配列番号1751～1777); VH FR1(配列番号570～578)
、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728
)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号57
0～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号172
7～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配
列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配
列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); V
H FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH
FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1
794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～17
26)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号
1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号
603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(
配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(
配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及び
VL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、
VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792
)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579
～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号17
78～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列
番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配
列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～578)、VH
FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、V
L FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～5
78)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～
1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番
号570～578)、VH FR2(配列番
号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列
番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR
3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL
FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～57
8)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～
1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番
号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列
番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH
FR1(配列番号570～578)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL
FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1
794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～
1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番
号1778～1792); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列
番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL
FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH
FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR3(配列番号1778～1792)
、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～
1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号17
78～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列
番号579～602)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配
列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH
FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、
VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～
578)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号175
1～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR2(配
列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(
配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794);
VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750
)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号17
93～1794); VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番
号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR
4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR
3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL
FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR3(配列番号1778～1792); VH FR1(配列番号570～57
8)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～17
28)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、及びVL FR4(配列番号
1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号
603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列
番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR
2(配列番号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL F
R2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～179
4); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番号579～602)、VH FR4(配列番号1727～172
8)、VL FR1(配列番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778
～1792)、及びVL FR4(配列番号1793～1794); VH FR1(配列番号570～578)、VH FR2(配列番
号579～602)、VH FR3(配列番号603～1726)、VH FR4(配列番号1727～1728)、VL FR1(配列
番号1729～1750)、VL FR2(配列番号1751～1777)、VL FR3(配列番号1778～1792)、及びVL
FR4(配列番号1793～1794);又は表25に記載されるVH FR(配列番号478～1636)とVL FR(配列
番号1637～1702)のその任意の組合せを含む抗体である
さらに別の態様において、GFRALに対する結合を例示された抗体又は機能性断片のうち
の1つと競合する抗体が提供される。そのような抗体は、本明細書に例示された抗体のう
ちの1つと同じエピトープ、又は重複エピトープに結合することもできる。例示された抗
体と同じエピトープと競合し又は該エピトープに結合する抗体及び断片は、類似の機能特
性を示すと考えられる。例示された抗原結合タンパク質及び断片には、表1～24のものを
含む、本明細書に提供されるVH及びVL領域、並びにCDRを有するものが含まれる。したが
って、具体的な例として、提供される抗体には:(a)表1～24に記載された抗体について記
載されたCDRのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、もしくは6つ全て;(b)表1～24に記載され
た抗体について記載されたVH及びVL領域から選択されるVH及びVL;又は(c)表1～24に記載
された抗体について指定されたVH及びVLを含む2つの軽鎖及び2つの重鎖を含む抗体と競合
するものが含まれる。
ある実施態様において、該組成物の抗体及び本明細書に提供される抗体を使用する方法
は、例えば、実施例の節の、本明細書に記載される抗GFRALモノクローナル抗体を含む。
任意の抗GFRAL抗体を本明細書に提供される方法のいずれかにおいて使用することができ
る。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番
号1のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される
様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号3のアミノ酸配列を含むV
H領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実
施態様において、該抗体は、配列番号5のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変
異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は
、配列番号7のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提
供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号9のアミノ酸配
列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいく
つかの実施態様において、該抗体は、配列番号11のアミノ酸配列を含むVH領域、又はその
ヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、
該抗体は、配列番号13のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明
細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号15のア
ミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方
法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号17のアミノ酸配列を含むVH領域、
又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様に
おいて、該抗体は、配列番号17のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含
む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番
号19のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される
様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号21のアミノ酸配列を含む
VH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実
施態様において、該抗体は、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変
異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は
、配列番号25のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提
供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号27のアミノ酸配
列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいく
つかの実施態様において、該抗体は、配列番号29のアミノ酸配列を含むVH領域、又はその
ヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、
該抗体は、配列番号31のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明
細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号33のア
ミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方
法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を含むVH領域、
又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様に
おいて、該抗体は、配列番号37のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含
む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番
号39のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される
様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号480のアミノ酸配列を含
むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。 本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号482のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒ
ト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該
抗体は、配列番号484のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明
細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号486の
アミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号
2のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様
々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号4のアミノ酸配列を含むVL
領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施
態様において、該抗体は、配列番号6のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異
体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、
配列番号8のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供
される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号10のアミノ酸配列
を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつ
かの実施態様において、該抗体は、配列番号12のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒ
ト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該
抗体は、配列番号14のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細
書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号16のアミ
ノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法
のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号18のアミノ酸配列を含むVL領域、又
はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様にお
いて、該抗体は、配列番号20のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む
。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号
22のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様
々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号24のアミノ酸配列を含むVL
領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施
態様において、該抗体は、配列番号26のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異
体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、
配列番号28のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供
される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号30のアミノ酸配列
を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつ
かの実施態様において、該抗体は、配列番号32のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒ
ト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該
抗体は、配列番号34のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細
書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号36のアミ
ノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法
のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号38のアミノ酸配列を含むVL領域、又
はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様にお
いて、該抗体は、配列番号40のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む
。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号
481のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される
様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号483のアミノ酸配列を含
むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの
実施態様において、該抗体は、配列番号485のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト
化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗
体は、配列番号487のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号
1のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号2のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号3のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号4のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号5
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号6のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号7のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号8のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号9
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号10のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号11のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号12のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号13
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号14のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号15のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号16のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号17
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号18のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号19のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号21
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号22のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号23のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号24のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号25
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号26のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号27のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号28のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号29
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号30のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号31のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号33
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号34のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号37
のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号38のアミノ酸配列を
含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト
化変異体、及び配列番号40のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号48
0のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号481のアミノ酸配列
を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつ
かの実施態様において、該抗体は、配列番号482のアミノ酸配列を含むVH領域、又はその
ヒト化変異体、及び配列番号483のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を
含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列
番号484のアミノ酸配列を含むVH領域、又はそのヒト化変異体、及び配列番号485のアミノ
酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変異体を含む。本明細書に提供される様々な方法の
いくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号486のアミノ酸配列を含むVH領域、又
はそのヒト化変異体、及び配列番号487のアミノ酸配列を含むVL領域、又はそのヒト化変
異体を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号
1のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号
2のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供
される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号3のアミノ酸配列
を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号4のアミノ酸配列
を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方
法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号5のアミノ酸配列を有するVHドメ
インのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号6のアミノ酸配列を含むVL領域の
VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの
実施態様において、該抗体は、配列番号7のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、
VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号8のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR
2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において
、該抗体は、配列番号9のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH
CDR3、並びに配列番号10のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3
を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配
列番号11のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに
配列番号12のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明
細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号13のア
ミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号14の
アミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供さ
れる様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号15のアミノ酸配列を
有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号16のアミノ酸配列
を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方
法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号17のアミノ酸配列を有するVHドメ
インのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号18のアミノ酸配列を含むVL領域
のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつか
の実施態様において、該抗体は、配列番号19のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR
1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号20のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL
CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様にお
いて、該抗体は、配列番号21のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及
びVH CDR3、並びに配列番号22のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL
CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は
、配列番号23のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並
びに配列番号24のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。
本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号25
のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号2
6のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供
される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号27のアミノ酸配列
を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号28のアミノ酸配
列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な
方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号29のアミノ酸配列を有するVHド
メインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号30のアミノ酸配列を含むVL領
域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつ
かの実施態様において、該抗体は、配列番号31のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH C
DR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号32のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、
VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様に
おいて、該抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、
及びVH CDR3、並びに配列番号34のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びV
L CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体
は、配列番号35のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、
並びに配列番号36のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む
。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号
37のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番
号38のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に
提供される様々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号39のアミノ酸
配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号40のアミノ
酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様
々な方法のいくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号480のアミノ酸配列を有す
るVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号481のアミノ酸配列を含
むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法の
いくつかの実施態様において、該抗体は、配列番号482のアミノ酸配列を有するVHドメイ
ンのVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号483のアミノ酸配列を含むVL領域の
VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの
実施態様において、該抗体は、配列番号484のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1
、VH CDR2、及びVH CDR3、並びに配列番号485のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL
CDR2、及びVL CDR3を含む。本明細書に提供される様々な方法のいくつかの実施態様にお
いて、該抗体は、配列番号486のアミノ酸配列を有するVHドメインのVH CDR1、VH CDR2、
及びVH CDR3、並びに配列番号487のアミノ酸配列を含むVL領域のVL CDR1、VL CDR2、及び
VL CDR3を含む。本明細書に記載される他のVHドメイン、VLドメイン、VH CDR1、VH CDR2
、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3配列も、本明細書に提供される様々な方法に
おける使用のために想定されている。
(1.ポリクローナル抗体)
本開示の抗体は、ポリクローナル抗体を含み得る。ポリクローナル抗体を調製する方法
は当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤及び望ましい場合、アジ
ュバントの1回以上の注射によって哺乳動物で惹起することができる。通常、免疫剤及び/
又はアジュバントは、複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物に注射される。免疫
剤には、GFRALポリペプチド又はその融合タンパク質が含まれ得る。免疫剤を、免疫され
ている哺乳動物で免疫原性があることが知られているタンパク質にコンジュゲートするか
、又は該タンパク質及び1以上のアジュバントで哺乳動物を免疫することが有用である場
合がある。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシア
ニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターが挙げら
れるが、これらに限定されない。利用し得るアジュバントの例としては、Ribi、CpG、ポ
リ1C、フロイントの完全アジュバント、及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A
、合成トレハロースジコリノミコレート)が挙げられる。免疫プロトコルは、過度の実験
を行うことなく、当業者によって選択され得る。その後、哺乳動物から採血し、血清をGF
RAL抗体力価についてアッセイすることができる。望ましい場合、抗体力価が上昇するか
又はプラトーに達するまで、哺乳動物に追加免疫することができる。さらに又は代わりに
、リンパ球を、融合及び下記のようなハイブリドーマからのモノクローナル抗体の調製の
ために免疫動物から得てもよい。
(2.モノクローナル抗体)
本開示の抗体は、代わりに、モノクローナル抗体を含み得る。モノクローナル抗体は、
Kohlerら(Nature, 256:495(1975))によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて
作製されてもよく、又は組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)によって作
製されてもよい。
ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物、例えば、ハムスターを上記の
ように免疫して、免疫に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する又は産
生することができるリンパ球を誘発する。或いは、リンパ球をインビトロで免疫してもよ
い。免疫後、リンパ球を単離し、その後、好適な融合剤、例えば、ポリエチレングリコー
ルを用いて骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Godingの文献
、モノクローナル抗体:原理及び実践(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice
)、59～103ページ(Academic Press, 1986))。
このように調製されたハイブリドーマ細胞を好適な培養培地中に播種し、その中で成長
させ、この培地は、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞(融合パートナーとも呼ば
れる)の成長又は生存を阻害する1以上の物質を含有する。例えば、親骨髄腫細胞が、ヒポ
キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)という酵素を欠
く場合、ハイブリドーマ用の選択的培養培地は、通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン
、及びチミジンを含み(HAT培地)、これらの物質は、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる。
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によ
る安定した高レベルの抗体産生を支持し、かつ融合していない親細胞に不利な選択をする
選択培地に感受性がある細胞である。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えば
、SP-2及び派生物、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American
Type Culture Collection), Manassas, Virginia, USAから入手可能なX63-Ag8-653細胞、
並びにソーク研究所細胞配布センター(Salk Institute Cell Distribution Center), San
Diego, California USAから入手可能なMOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍から派生したもの
である。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫
細胞株も記載されている(Kozbor, J.の文献、Immunol., 133:3001(1984);及びBrodeurら
の文献、モノクローナル抗体産生技法及び応用(Monoclonal Antibody Production Techni
ques and Applications)、51～63ページ(Marcel Dekker社, New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が成長している培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産
生についてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体
の結合特異性は、免疫沈降によるか、又はインビトロ結合アッセイ、例えば、放射免疫ア
ッセイ(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定される。モノクロー
ナル抗体の結合親和性は、例えば、Munsonらの文献、Anal. Biochem., 107:220(1980)に
記載されているスキャッチャード解析によって決定することができる。
ひとたび所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
が同定されれば、クローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によ
って成長させることができる(Godingの文献、モノクローナル抗体:原理及び実践(Monoclo
nal Antibodies: Principles and Practice)、59～103ページ(Academic Press, 1986))。
この目的のための好適な培養培地としては、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地が挙げられ
る。さらに、ハイブリドーマ細胞は、例えば、該細胞をマウスに腹腔内注射することによ
り、動物内の腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、親和性クロマトグラ
フィー(例えば、プロテインAもしくはプロテインG-セファロースを使用するもの)又はイ
オン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気
泳動、透析などの従来の抗体精製手順によって、培養培地、腹水液、又は血清から好適に
分離される。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、マウス抗体の重
鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用することにより)、容易に単離され、シークエンシングされる。ハイブリドー
マ細胞は、そのようなDNAの好ましい源としての役割を果たす。ひとたび単離されれば、D
NAを発現ベクター中に入れることができ、これをその後、トランスフェクトされなければ
抗体タンパク質を産生することはない、大腸菌(E. coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニー
ズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、
組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするDNAの細菌内
での組換え発現に関する総説としては、Skerraらの文献、Curr. Opinion in Immunol., 5
:256-262(1993)及びPluckthunの文献、Immunol. Revs. 130:151-188(1992)が挙げられる
。
いくつかの実施態様において、GFRALエピトープに結合する抗体は、(1)ストリンジェン
トな条件下(例えば、フィルターに結合したDNAへの、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリ
ウム(SSC)中、約45℃でのハイブリダイゼーションと、その後の、0.2×SSC/0.1％SDS中、
約50～65℃での1回以上の洗浄)、極めてストリンジェントな条件下(例えば、フィルター
に結合した核酸への、6×SSC中、約45℃でのハイブリダイゼーションと、その後の、0.1
×SSC/0.2％SDS中、約68℃での1回以上の洗浄)、又は当業者に公知である他のストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されるVH及び/又はVLドメイ
ンのうちのいずれか1つをコードするヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌ
クレオチド配列によってコードされるVHドメインのアミノ酸配列及び/又はVLドメインの
アミノ酸配列を含む(例えば、Ausubel, F.M.ら編、1989、分子生物学の最新プロトコル(C
urrent Protocols in Molecular Biology)、第I巻、Green Publishing Associates社及び
John Wiley & Sons社, New York、6.3.1～6.3.6及び2.10.3ページを参照)。
いくつかの実施態様において、GFRALエピトープに結合する抗体は、ストリンジェント
な条件下(例えば、フィルターに結合したDNAへの、6×SSC中、約45℃でのハイブリダイゼ
ーションと、その後の、0.2×SSC/0.1％SDS中、約50～65℃での1回以上の洗浄)、極めて
ストリンジェントな条件下(例えば、フィルターに結合した核酸への、6×SSC中、約45℃
でのハイブリダイゼーションと、その後の、0.1×SSC/0.2％SDS中、約68℃での1回以上の
洗浄)、又は当業者に公知である他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
で、表1～24に示されたVH CDR及び/又はVL CDRのうちのいずれか1つをコードするヌクレ
オチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるVH CDR
のアミノ酸配列又はVL CDRのアミノ酸配列を含む(例えば、Ausubel, F.M.ら編、1989、分
子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、第I巻、Green P
ublishing Associates社及びJohn Wiley & Sons社, New York、6.3.1～6.3.6及び2.10.3
ページを参照)。
さらなる実施態様において、モノクローナル抗体又は抗体断片を、例えば、抗体ファー
ジディスプレイ:方法及びプロトコル(Antibody Phage Display: Methods and Protocols)
、P.M. O'Brien及びR. Aitken編、Humana Press, Totawa N.J., 2002に記載されている技
法を用いて作製される抗体ファージライブラリーから単離することができる。原理的には
、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域(Fv)の様々な
断片を提示するファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることにより選
択する。そのようなファージライブラリーを所望の抗原に対してスクリーニングする。所
望の抗原に結合することができるFv断片を発現するクローンを抗原に吸着させ、それによ
り、ライブラリー中の非結合クローンから分離する。その後、結合クローンを抗原から溶
出させ、さらなる抗原吸着/溶出サイクルによってさらに濃縮することができる。
可変ドメインを、例えば、Winterらの文献、Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)
に記載されているように、VH及びVLが、短い柔軟性のあるペプチドを介して共有結合して
いる単鎖Fv(scFv)断片としてか、又はVH及びVLが各々、定常ドメインに融合し、非共有結
合的に相互作用しているFab断片としてかのいずれかで、ファージ上に機能的に提示させ
ることができる。
VH及びVL遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって別々にクローニ
ングし、ファージライブラリー中でランダムに組み換えることができ、これをその後、Wi
nterらの文献(上記)に記載されているように、抗原結合クローンについて探索することが
できる。免疫された源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免
疫原に対する高親和性抗体を提供する。或いは、ナイーブレパートリーをクローニングし
て、Griffithsら(EMBO J, 12: 725-734(1993))によって記載されているように、いかなる
免疫も行わずに、幅広い非自己抗原及びまた自己抗原に対するヒト抗体の単一の供給源を
提供することができる。最後に、ナイーブレパートリーは、例えば、Hoogenboom及びWint
er(J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992))によって記載されているように、幹細胞由来の
再配列されていないV-遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含むPCRプ
ライマーを用いて可変性の高いCDR3領域をコードさせ、インビトロでの再配列を達成する
ことにより合成的に作製することもできる。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の様々な技法によって達成するこ
とができる。例えば、GFRAL(例えば、GFRALポリペプチド、断片、又はエピトープ)を、吸
着プレートのウェルをコーティングするために使用し、吸着プレートに固定されるかもし
くは細胞選別で使用される宿主細胞上で発現させ、又はストレプトアビジンコーティング
されたビーズによる捕捉のためにビオチンにコンジュゲートし、又はディスプレイライブ
ラリーをパニングするための任意の他の方法で使用することができる。遅い解離反応速度
(例えば、良好な結合親和性)を有する抗体の選択は、Bassらの文献、Proteins, 8: 309-3
14(1990)及びWO 92/09690号に記載されているような長い洗浄及び一価ファージディスプ
レイの使用、並びにMarksらの文献、Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されている
ような抗原の低コーティング密度によって促進することができる。
抗GFRAL抗体は、対象となるファージクローンについて選択するための好適な抗原スク
リーニング手順を設計し、その後、対象となるファージクローン由来の、VH及び/もしく
はVL配列(例えば、Fv配列)、又はVH及びVL配列由来の様々なCDR配列、及びKabatらの文献
、免疫学的に興味深いタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Inte
rest)、第5版、NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991)、第1巻～第3巻に記載され
ている好適な定常領域(例えば、Fc)配列を用いて、全長抗GFRAL抗体クローンを構築する
ことにより得ることができる。
(3.抗体断片)
本開示は、GFRALに結合する抗体及び抗体断片を提供する。ある状況においては、全抗
体よりもむしろ抗体断片を使用する利点がある。該断片のサイズがより小さいことにより
、迅速なクリアランスが可能になり、細胞、組織、又は器官への接近の改善がもたらされ
得る。特定の抗体断片の総説については、Hudsonらの文献(2003) Nat. Med. 9:129-134を
参照されたい。
抗体断片の産生のための様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗
体のタンパク質分解的消化によって得られた(例えば、Morimotoらの文献、Journal of Bi
ochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992);及びBrennanらの文献、Science,
229:81(1985)を参照)。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって
直接産生させることができる。Fab、Fv、及びScFv抗体断片を全て、大腸菌又は酵母細胞
で発現させ、そこから分泌させ、それにより、大量のこれらの断片の簡易産生を可能にす
ることができる。抗体断片は、上で論じられた抗体ファージライブラリーから単離するこ
とができる。或いは、Fab'-SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせ
て、F(ab')2断片を形成させることができる(Carterらの文献、Bio/Technology 10:163-16
7(1992))。別の手法に従って、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離するこ
とができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が延長されたFa
b及びF(ab')2断片が、例えば、米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体断片の産
生のための他の技法が当業者に明白であろう。ある実施態様において、抗体は、単鎖Fv断
片(scFv)である(例えば、WO 93/16185号;米国特許第5,571,894号;及び第5,587,458号を参
照)。Fv及びscFvは、定常領域を欠く無傷の結合部位を有し;そのため、これらは、インビ
ボ使用時の非特異的結合の低下のために好適である可能性がある。scFv融合タンパク質は
、scFvのアミノ末端又はカルボキシ末端のどちらかでのエフェクタータンパク質の融合を
生じるように構築してもよい(例えば、抗体エンジニアリング(Antibody Engineering)、B
orrebaeck編(上記)を参照)。抗体断片はまた、例えば、上で引用されている参考文献に記
載されているような、例えば、「直鎖抗体」であってもよい。そのような直鎖抗体は、単
一特異性又は多重特異性、例えば、二重特異性であり得る。
より小さい抗体由来結合構造は、単一可変ドメイン抗体(SdAb)とも呼ばれる個別の可変
ドメイン(Vドメイン)である。ラクダ科動物及び軟骨魚類といった特定の種類の生物は、
それらの免疫系の一部として、Fc相当ドメイン構造の上に取り付けられた高親和性単一V
様ドメインを保有する(Woolvenらの文献、Immunogenetics 50: 98-101, 1999; Streltsov
らの文献、Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-12449, 2004)。V様ドメイン(ラクダ科動
物ではVhH、サメではV-NARと呼ばれる)は、通常、長い表面ループを提示し、これにより
、標的抗原の空洞の貫通が可能になる。これらはまた、疎水性表面パッチをマスクするこ
とにより、孤立したVHドメインを安定化する。
これらのVhH及びV-NARドメインは、sdAbを人為的に作製するために使用されている。ヒ
トVドメイン変異体は、ファージライブラリーからの選択並びに安定な高結合性のVL及びV
H由来ドメインを結果として生じさせている他の手法を用いて設計されている。
本明細書に提供されるGFRALに結合する抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体
、組換え産生抗体、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含む)、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラ
クダ化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、及び上記のも
ののいずれかの機能性断片(例えば、GFRAL結合断片)が挙げられるが、これらに限定され
ない。機能性断片(例えば、GFRALに結合する断片)の非限定的な例としては、単鎖Fv(scFv
)(例えば、単一特異性、二重特異性などを含む)、Fab断片、F(ab')断片、F(ab)2断片、F(
ab')2断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、Fd断片、Fv断片、ダイアボディ、トリアボディ
、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。
本明細書に提供される抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学
的活性部分、例えば、GFRALエピトープに結合する抗原結合部位を含む分子が含まれるが
、これらに限定されない。本明細書に提供される免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン
分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG
1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又はサブクラスのものであることができる。
抗体の変異体及び誘導体には、GFRALエピトープに結合する能力を保持する抗体機能性
断片が含まれる。例示的な機能性断片としては、Fab断片(例えば、抗原結合ドメインを含
有し、かつジスルフィド結合によって架橋された軽鎖と重鎖の一部とを含む抗体断片); F
ab'(例えば、ヒンジ領域を介してFabと重鎖のさらなる部分とを含む単一の抗原結合ドメ
インを含有する抗体断片); F(ab')2(例えば、重鎖のヒンジ領域で鎖間ジスルフィド結合
によって接続された2つのFab'分子;該Fab'分子は、同じ又は異なるエピトープに対するも
のであり得る);二重特異性Fab(例えば、その各々が異なるエピトープに対するものであり
得る2つの抗原結合ドメインを有するFab分子);可変領域を含む単鎖Fab鎖、別名、sFv(例
えば、10～25個のアミノ酸の鎖によって連結された抗体の単一の軽鎖及び重鎖の可変の抗
原結合決定領域);ジスルフィド結合Fv、又はdsFv(例えば、ジスルフィド結合によって連
結された抗体単一の軽鎖及び重鎖の可変の抗原結合決定領域);ラクダ化VH(例えば、VH接
触面のいくつかのアミノ酸が天然のラクダ抗体の重鎖に見出されるものである抗体の単一
の重鎖の可変の抗原結合決定領域);二重特異性sFv(例えば、その各々が異なるエピトープ
に対するものであり得る2つの抗原結合ドメインを有するsFv又はdsFv分子);ダイアボディ
(例えば、第1のsFvのVHドメインが第2のsFvのVLドメインと会合し、第1のsFvのVLドメイ
ンが第2のsFvのVHドメインと会合したときに形成される2量体化sFv;ダイアボディの2つの
抗原結合領域は、同じ又は異なるエピトープに対するものであり得る);並びにトリアボデ
ィ(例えば、ダイアボディと同様の様式で形成されるが、単一の複合体中に3つの抗原結合
ドメインが作り出される3量体化sFv; 3つの抗原結合ドメインは、同じ又は異なるエピト
ープに対するものであり得る)が挙げられる。抗体の誘導体には、抗体結合部位の1以上の
CDR配列も含まれる。該CDR配列は、2以上のCDR配列が存在するとき、スキャフォールド上
で連結され得る。ある実施態様において、抗体は、単鎖Fv(「scFv」)を含む。scFvは、抗
体のVH及びVLドメインを含む抗体断片であり、ここで、これらのドメインは、単一のポリ
ペプチド鎖中に存在する。scFv ポリペプチドは、scFvが抗原結合のための所望の構造を
形成するのを可能にするVHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含
み得る。scFvの総説については、Pluckthunの文献、モノクローナル抗体の薬理学(The Ph
armacology of Monoclonal Antibodies)、第113巻、Rosenburg及びMoore編、Springer-Ve
rlag, New York, 269～315ページ(1994)を参照されたい。
(4.ヒト化抗体)
本開示は、ヒトGFRALを含む、GFRALに結合するヒト化抗体を提供する。本開示のヒト化
抗体は、表1～24に示される1以上のCDRを含み得る。非ヒト抗体をヒト化するための様々
な方法が当技術分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである源からそれに導
入された1以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、
しばしば「移入」残基と呼ばれ、これは、典型的には、「移入」可変ドメインから取得さ
れる。ヒト化は、例えば、Winter及び共同研究者らの方法(Jonesらの文献(1986) Nature
321:522-525; Riechmannらの文献(1988) Nature 332:323-327; Verhoeyenらの文献(1988)
Science 239:1534-1536)に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列の代わり
に用いることにより実施することができる。
場合によっては、ヒト化抗体は、親非ヒト抗体(例えば、齧歯類)の6つの相補性決定領
域(CDR)のアミノ酸配列がヒト抗体フレームワーク上に移植されるCDR移植によって構築さ
れる。例えば、Padlanら(FASEB J. 9:133-139, 1995)は、CDR中の残基の約3分の1しか実
際に抗原と接触していないことを明らかにし、これらを「特異性決定残基」、又はSDRと
命名した。SDR移植の技法では、SDR残基のみをヒト抗体フレームワーク上に移植する(例
えば、Kashmiriらの文献、Methods 36: 25-34, 2005を参照)。
ヒト化抗体を作製する際に使用されることになる、軽鎖と重鎖の両方のヒト可変ドメイ
ンの選択は、抗原性を低下させるのに重要であり得る。例えば、いわゆる「最良適合」法
に従って、非ヒト(例えば、齧歯類)抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン
配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯類の配列に最も近いヒト配列
をヒト化抗体用のヒトフレームワークとして選択することができる(Simsらの文献(1993)
J. Immunol. 151:2296; Chothiaらの文献(1987) J. Mol. Biol. 196:901)。別の方法では
、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特
定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使
用することができる(Carterらの文献(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Pre
staらの文献(1993) J. Immunol., 151:2623)。場合によっては、フレームワークは、最も
大量に存在するヒトサブクラスであるVL6サブグループI(VL6I)及びVHサブグループIII(VH
III)のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖系列遺伝子をフレームワー
ク領域の供給源として使用する。
超ヒト化と呼ばれる、CDRの比較に基づく代替的なパラダイムでは、FRの相同性は重要
ではない。この方法は、非ヒト配列と機能的ヒト生殖系列遺伝子レパートリーとの比較か
らなる。その後、マウス配列と同じ又は密接に関連する標準構造をコードする遺伝子を選
択する。次に、非ヒト抗体と標準構造を共有する遺伝子の中で、CDR内での相同性が最も
高いものをFRドナーとして選ぶ。最後に、非ヒトCDRをこれらのFR上に移植する(例えば、
Tanらの文献、J. Immunol. 169: 1119-1125, 2002を参照)。
一般に、抗体は、抗原に対するその親和性及び他の有利な生物学的特性を保持したまま
でヒト化されることがさらに望ましい。この目標を達成するために、1つの方法に従って
、親配列及びヒト化配列の3次元モデルを用いた親配列及び様々な概念上のヒト化産物の
解析のプロセスによってヒト化抗体を調製する。3次元の免疫グロブリンモデルは一般に
利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可
能性のある3次元立体構造を図示及び提示するコンピュータプログラムが利用可能である
。これらには、例えば、WAM(Whitelegg及びReesの文献、Protein Eng. 13: 819-824, 200
0)、Modeller(Sali及びBlundellの文献、J. Mol. Biol. 234: 779-815, 1993)、並びにSw
iss PDB Viewer(Guex及びPeitschの文献、Electrophoresis 18: 2714-2713, 1997)が含ま
れる。これらの提示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えら
れる役割の解析、例えば、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす
残基の解析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大などの、所望
の抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント配列及び移入配列から選択し、組
み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直
接的にかつ最も実質的に関与している。
抗体のヒト化のための別の方法は、ヒトストリング含有量(HSC)と呼ばれる抗体のヒト
性(humanness)の尺度に基づくものである。この方法は、マウス配列をヒト生殖系列遺伝
子のレパートリーと比較し、その差異をHSCとしてスコア化する。その後、標的配列を、
全体的な同一性尺度を用いるのではなく、そのHSCを最大化することによりヒト化して、
複数の多様なヒト化変異体を作製する(Lazarらの文献、Mol. Immunol. 44: 1986-1998, 2
007)。
上記の方法に加えて、実験的な方法を用いて、ヒト化抗体を作製し、選択することがで
きる。これらの方法には、ヒト化変異体の大規模ライブラリーの作製及び濃縮技術又はハ
イスループットスクリーニング法を用いた最良クローンの選択に基づくものが含まれる。
抗体変異体は、ファージ、リボソーム、及び酵母ディスプレイライブラリーから並びに細
菌コロニースクリーニングによって単離することができる(例えば、Hoogenboomの文献、N
at. Biotechnol. 23: 1105-1116, 2005; Dufnerらの文献、Trends Biotechnol. 24: 523-
529, 2006; Feldhausらの文献、Nat. Biotechnol. 21: 163-70, 2003; Schlapschyらの文
献、Protein Eng. Des. Sel. 17: 847-60, 2004を参照)。
FRライブラリー法では、一群の残基変異体をFR中の特定の位置に導入し、その後、移植
されたCDRを最も良好に支持するFRを選択するためのライブラリーの選択を行う。置換さ
れることになる残基には、CDR構造に寄与する可能性があるものとして特定された「バー
ニア(Vernier)」残基の一部もしくは全て(例えば、Foote及びWinterの文献、J. Mol. Bio
l. 224: 487-499, 1992を参照)、又はBacaら(J. Biol. Chem. 272: 10678-10684, 1997)
によって特定されたより限定された標的残基のセット由来の一部もしくは全てが含まれ得
る。
FRシャッフリングでは、選択された残基変異体のコンビナトリアルライブラリーを作製
する代わりに、FR全体を非ヒトCDRと組み合わせる(例えば、Dall'Acquaらの文献、Method
s 36: 43-60, 2005を参照)。このライブラリーを、最初にVLをヒト化し、その後、VHをヒ
ト化する2段階選択プロセスにおいて、結合についてスクリーニングすることができる。
或いは、1段階FRシャッフリングプロセスを使用することができる。そのようなプロセス
は、結果として得られる抗体が、発現の増強、親和性及び熱安定性の増大を含む、生化学
的及び物理化学的な特性の改善を示すので、2段階スクリーニングよりも効率的であるこ
とが示されている(例えば、Damschroderらの文献、Mol. Immunol. 44: 3049-60, 2007を
参照)。
「ヒューマニアリング(humaneering)」法は、必須の最小特異性決定基(MSD)の実験的同
定に基づくものであり、かつ非ヒト断片のヒトFRのライブラリーへの逐次的置き換え及び
結合の評価に基づくものである。これは、非ヒトVH鎖及びVL鎖のCDR3の領域から開始され
、非ヒト抗体の他の領域を、VHとVLの両方のCDR1及びCDR2を含む、ヒトFRへと徐々に置き
換える。この方法は、通常、エピトープ保持及び異なるヒトVセグメントCDRを有する複数
のサブクラスからの抗体の同定をもたらす。ヒューマニアリングは、ヒト生殖系列遺伝子
抗体と91～96％相同である抗体の単離を可能にする(例えば、Alfenitoの文献、ケンブリ
ッジ健康技術研究所主催第3回PEGS、タンパク質工学サミット2007(Cambridge Healthtech
Institute's Third Annual PEGS, The Protein Engineering Summit, 2007)を参照)。
「ヒトエンジニアリング」法は、ヒトでの低下した免疫原性を有し、それにもかかわら
ず、もとの非ヒト抗体の望ましい結合特性を保持する修飾抗体を産生するように抗体のア
ミノ酸配列を特異的に変化させることにより、非ヒト抗体又は抗体断片、例えば、マウス
又はキメラ抗体又は抗体断片を改変することを含む。一般に、この技法は、非ヒト(例え
ば、マウス)抗体のアミノ酸残基を、「低リスク」、「中リスク」、又は「高リスク」残
基として分類することを含む。この分類は、(例えば、ヒトでの免疫原性のために)特定の
置換を行うことの予測される利益を、該置換が結果として得られる抗体のフォールディン
グに影響を及ぼす及び/又はヒト残基と置換されるリスクとの対比で評価する全体的なリ
スク/報酬計算を用いて行われる。非ヒト(例えば、マウス)抗体配列の所与の位置(例えば
、低又は中リスク)で置換されることになる特定のヒトアミノ酸残基は、非ヒト抗体の可
変領域由来のアミノ酸配列を特異的又はコンセンサスヒト抗体配列の対応する領域と整列
させることにより選択することができる。非ヒト配列中の低又は中リスク位置のアミノ酸
残基を、アラインメントに従って、ヒト抗体配列中の対応する残基の代わりに用いること
ができる。ヒト人工タンパク質を作製する技法は、Studnickaらの文献、Protein Enginee
ring, 7: 805-814(1994)、米国特許第5,766,886号、第5,770,196号、第5,821,123号、及
び第5,869,619号、PCT出願公開WO 93/11794号により詳細に記載されている。
(5.ヒト抗体)
ヒト抗GFRAL抗体を、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvク
ローン可変ドメイン配列を既知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることにより構築す
ることができる。或いは、本開示のヒトモノクローナル抗GFRAL抗体をハイブリドーマ法
によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及び
マウス-ヒト異種骨髄腫細胞株は、例えば、Kozborの文献、J. Immunol., 133: 3001(1984
); Brodeurらの文献、モノクローナル抗体産生技法及び応用(Monoclonal Antibody Produ
ction Techniques and Applications)、51～63ページ(Marcel Dekker社, New York, 1987
);及びBoernerらの文献、J. Immunol., 147: 86(1991)によって記載されている。
免疫したときに、内在性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパート
リーを産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することも
可能である。ヒト抗体レパートリーを発現するトランスジェニックマウスは、多種多様な
薬物標的候補に対する高親和性ヒト配列モノクローナル抗体を作製するために使用されて
いる(例えば、Jakobovits, A.の文献、Curr. Opin. Biotechnol. 1995, 6(5):561-6; Bru
ggemann及びTaussingの文献、Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8(4):455-8;米国特許第6,
075,181号及び第6,150,584号;並びにLonbergらの文献、Nature Biotechnol. 23: 1117-11
25, 2005を参照)。
或いは、ヒト抗体を、標的抗原に対する抗体を産生するヒトBリンパ球の不死化によっ
て調製することができる(例えば、そのようなB細胞は、個体から回収されるものであって
もよく、又はインビトロで免疫されたものであってもよい)(例えば、Coleらの文献、モノ
クローナル抗体及び癌療法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、Alan R. Liss
, 77ページ(1985); Boernerらの文献、J. Immunol., 147(1):86-95(1991);及び米国特許
第5,750,373号を参照)。
遺伝子シャッフリングを用いて、非ヒト、例えば、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るこ
ともでき、その場合、該ヒト抗体は、出発非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する
。「エピトープインプリンティング」又は「ガイド選択(guided selection)」とも呼ばれ
るこの方法に従って、本明細書に記載されるファージディスプレイ法によって得られる非
ヒト抗体断片の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のいずれかをヒトVドメイン遺伝子のレパ
ートリーと置き換えて、非ヒト鎖/ヒト鎖のscFv又はFabキメラの集団を生成させる。抗原
による選択によって、非ヒト鎖/ヒト鎖のキメラscFv又はFabの単離がもたらされ、その場
合、該ヒト鎖は、1次ファージディスプレイクローン中の対応する非ヒト鎖を除去すると
きに破壊された抗原結合部位を回復する(例えば、エピトープが、ヒト鎖パートナーの選
択をガイドする(刷り込む))。残りの非ヒト鎖を置き換えるために、このプロセスを反復
すると、ヒト抗体が得られる(例えば、PCT WO 93/06213号;及びOsbournらの文献、Method
s., 36, 61-68, 2005を参照)。CDR移植による非ヒト抗体の従来のヒト化とは異なり、こ
の技法では、非ヒト起源のFR残基もCDR残基も有しない、完全ヒト抗体が得られる。細胞
表面抗原に対するマウス抗体をヒト化するためのガイド選択の例としては、卵巣癌細胞上
に存在する葉酸結合タンパク質(例えば、Figiniらの文献、Cancer Res., 58, 991-996, 1
998を参照)及び肝細胞癌上で高度に発現されるCD147(例えば、Baoらの文献、Cancer Biol
. Ther., 4, 1374-1380, 2005を参照)が挙げられる。
ガイド選択アプローチの潜在的な欠点は、一方の抗体鎖を、もう一方を不変に保持しな
がらシャッフリングすると、エピトープドリフトが生じる可能性があることである。非ヒ
ト抗体によって認識されるエピトープを維持するために、CDR保持を適用することができ
る(例えば、Klimkaらの文献、Br. J. Cancer., 83, 252-260, 2000; VH CDR2 Beiboerら
の文献、J. Mol. Biol., 296, 833-49, 2000を参照)。この方法では、非ヒトVH CDR3が一
般に保持されるが、それは、このCDRが抗原結合部位の中心にあり得、かつ抗原認識のた
めの最も重要な抗体領域であり得るからである。しかしながら、場合によっては、非ヒト
抗体のVH CDR3及びVL CDR3、並びにVH CDR3、VL CDR3、及びVL CFR1が保持され得る。
(6.二重特異性抗体)
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクロ
ーナル抗体である。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ヒト又はヒト化抗体であ
る。ある実施態様において、結合特異性のうちの一方は、GFRALに対するものであり、も
う一方は、任意の他の抗原に対するものである。いくつかの実施態様において、二重特異
性抗体は、GFRALの2つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体は、
全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、2つの重鎖
が異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の共発現によるものなどがある
(例えば、Milstein及びCuelloの文献、Nature, 305: 537(1983)を参照)。二重特異性抗体
の作製のさらなる詳細については、例えば、二重特異性抗体(Bispecific Antibodies)、K
ontermann編、Springer-Verlag, Hiedelberg(2011)を参照されたい。
(7.多価抗体)
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く内在化(
及び/又は異化)され得る。本開示の抗体は、3以上の抗原結合部位を有する(IgMクラスの
もの以外である)多価抗体(例えば、四価抗体)であることができ、これは、抗体のポリペ
プチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生することができる。多価抗体
は、二量体化ドメイン及び3以上の抗原結合部位を含むことができる。ある実施態様にお
いて、二量体化ドメインは、Fc領域もしくはヒンジ領域を含む(又はそれらからなる)。こ
の状況では、抗体は、Fc領域及び該Fc領域のアミノ末端にある3以上の抗原結合部位を含
むことになる。ある実施態様において、多価抗体は、3つ～約8つの抗原結合部位を含む(
又はそれらからなる)。1つのそのような実施態様において、多価抗体は、4つの抗原結合
部位を含む(又はそれらからなる)。多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(例えば
、2つのポリペプチド鎖)を含み、ここで、該ポリペプチド鎖は、2以上の可変ドメインを
含む。例えば、該ポリペプチド鎖は、VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを含むことができ、ここで
、VD1は、第1の可変ドメインであり、VD2は、第2の可変ドメインであり、Fcは、Fc領域の
1つのポリペプチド鎖であり、X1及びX2は、アミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1
である。例えば、該ポリペプチド鎖は: VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域の鎖;又は
VH-CH1-VH-CH1-Fc領域の鎖を含むことができる。本明細書における多価抗体は、少なくと
も2つ(例えば、4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含むことができる。本明細
書における多価抗体は、例えば、約2つ～約8つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むこ
とができる。ここで想定される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含
み、任意に、CLドメインをさらに含む。
(8. Fcエンジニアリング)
GFRALに対する抗体を、例えば、該抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)及び/
又は補体依存性細胞傷害性(CDC)を減少させ又は除去するために、エフェクター機能に関
するものを含め、Fcエンジニアリングによって改変することが望ましい場合がある。これ
は、抗体のFc領域に1以上のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。
例えば、位置233～236のIgG2残基並びに位置327、330、及び331のIgG4残基を用いたヒトI
gG1への置換は、ADCC及びCDCを大きく低下させることが示された(例えば、Armourらの文
献、Eur. J. Immunol. 29:(8):2613-24(1999); Shieldsらの文献、J. Biol..Chem. 276(9
): 6591-604(2001)を参照)。
抗体の血清半減期を延長させるために、例えば、米国特許第5,739,277号に記載されて
いるように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体(特に、抗体断片)に組み込むことが
できる。「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、IgG分子のインビボ血清半
減期を延長させるのに関与するIgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)のFc領域
のエピトープを指す。
(9.代替的な結合物質)
本開示は、本明細書に開示される抗GFRAL抗体と同じエピトープに特異的に結合する非
免疫グロブリン結合物質を包含する。いくつかの実施態様において、非免疫グロブリン結
合物質は、競合結合アッセイにおいて本開示の抗GFRAL抗体を置換するか又はそれによっ
て置換される作用物質として同定される。これらの代替的な結合物質には、例えば、当技
術分野で公知の人工タンパク質スキャフォールドのいずれかが含まれ得る。そのようなス
キャフォールドは、表1～24に示される1以上のCDRを含み得る。そのようなスキャフォー
ルドとしては、例えば、リガンド結合部位を形成する4つの超可変ループを支持する強固
なβ-バレルを特徴とするタンパク質構造であるリポカリンスキャフォールドを基にした
、アンチカリンが挙げられる。新規の結合特異性は、機能的提示及びガイド選択と組み合
わせた、ループ領域における標的ランダム突然変異誘発によって改変することができる(
例えば、Skerraの文献(2008) FEBS J. 275: 2677-2683を参照)。他の好適なスキャフォー
ルドとしては、例えば、ヒトフィブロネクチンIIIの10番目の細胞外ドメインを基にした
アドネクチン又はモノボディ(例えば、Koide及びKoideの文献(2007) Methods Mol. Biol.
352: 95-109を参照);ブドウ球菌プロテインAのZドメインを基にしたアフィボディ(例え
ば、Nygrenらの文献(2008) FEBS J. 275: 2668-2676)を参照);アンキリンリピートタンパ
ク質を基にしたDARPin(例えば、Stumppらの文献(2008) Drug. Discov. Today 13: 695-70
1を参照);ヒトFynタンパク質キナーゼのSH3ドメインを基にしたフィノマー(Grabulovski
らの文献(2007) J. Biol. Chem. 282: 3196-3204);スルフォロバス・アシドラリウス(Sul
folobus acidolarius)由来のSac7dを基にしたアフィチン(例えば、Krehenbrinkらの文献(
2008) J. Mol. Biol. 383: 1058-1068を参照);ヒトy-B-クリスタリンを基にしたアフィリ
ン(例えば、Ebersbachらの文献(2007) J. Mol. Biol. 372: 172-185を参照);膜受容体タ
ンパク質のAドメインを基にしたアビマー(例えば、Silvermanらの文献(2005) Biotechnol
. 23: 1556-1561を参照);システインリッチノッチンペプチド(例えば、Kolmar(2008) FEB
S J. 275: 2684-2690を参照);及び人工クニッツ型インヒビター(例えば、Nixon及びWood
の文献(2006) Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9: 261-268を参照)を挙げることができ
る。総説については、例えば、Gebauer及びSkerraの文献(2009) Curr. Opin. Chem. Biol
. 13: 245-255を参照されたい。
(抗体変異体)
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるGFRALに結合する又は本明細書に
記載される抗体のアミノ酸配列修飾が想定される。例えば、結合親和性及び/又は限定さ
れないが、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、低下した
免疫原性、もしくは溶解性を含む、抗体の他の生物学的特性を改善することが望ましい場
合がある。したがって、本明細書に記載される抗GFRAL抗体に加えて、抗GFRAL抗体変異体
を調製することができることが想定される。例えば、抗GFRAL抗体変異体は、コードするD
NAに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、及び/又は所望の抗体もしくはポ
リペプチドの合成によって調製することができる。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシ
ル化部位の数又は位置を変化させたり、又は膜アンカリング特性を改変したりするなどの
、抗GFRAL抗体の翻訳後プロセスを改変し得ることを認識しているであろう。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体を、例えば、任意のタイプの
分子と該抗体との、共有結合的結合を含む、関連によって化学的に修飾する。抗体誘導体
には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基
/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンド又は他のタンパク質に対
する結合などによって化学的に修飾されている抗体が含まれ得る。数多くの化学修飾はい
ずれも、限定されないが、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシ
ンの代謝合成などを含む、既知の技法によって実施することができる。さらに、該抗体は
、1以上の非典型的アミノ酸を含有し得る。
変異は、ネイティブ配列抗体又はポリペプチドと比較したときにアミノ酸配列の変化を
もたらす抗体又はポリペプチドをコードする1以上のコドンの置換、欠失、又は挿入であ
り得る。アミノ酸置換は、ロイシンとセリンとの置換などの、あるアミノ酸を類似の構造
的及び/又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換える結果として生じるもの、例え
ば、保存的アミノ酸置換であることができる。挿入又は欠失は、任意に、約1～5アミノ酸
の範囲のものであってもよい。ある実施態様において、置換、欠失、又は挿入は、もとの
分子に対する25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10
未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置
換、又は2未満のアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様において、置換は、1以上の推定
非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換である。許容される変異は、配列中で
アミノ酸の挿入、欠失、又は置換を系統的に行い、結果として得られる変異体を全長又は
成熟ネイティブ配列によって示される活性について試験することにより決定することがで
きる。
アミノ酸配列挿入物としては、長さが1残基から100以上の残基を含有するポリペプチド
までの範囲に及ぶアミノ及び/又はカルボキシル末端融合体、並びに単一又は複数のアミ
ノ酸残基の配列内挿入物が挙げられる。末端挿入物の例としては、N末端メチオニル残基
を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体のN末端又はC末端
と、抗体の血清半減期を延長させる酵素(例えば、抗体指向性酵素プロドラッグ療法用の
もの)又はポリペプチドとの融合体が挙げられる。
抗体の生物学的特性の実質的な修飾は、(a)置換領域内のポリペプチド骨格の、例えば
、シート状もしくはらせん状立体構造としての構造、(b)標的部位での分子の電荷もしく
は疎水性、又は(c)側鎖のかさの維持に対するその効果が顕著に異なる置換を選択するこ
とにより達成される。或いは、保存的な(例えば、類似の特性及び/又は側鎖を有するアミ
ノ酸グループ内での)置換は、該特性を維持し、又はそれを著しくは変化させないように
行うことができる。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ分けすること
ができる(例えば、A. L. Lehningerの文献、Biochemistry、第2版、73～75ページ、Worth
Publishers, New York(1975)を参照):(1)非極性: Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pr
o(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)非荷電極性: Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(
Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性: Asp(D)、Glu(E);及び(4)塩基性: Lys(K)、Arg(R)、His(H)
。
或いは、天然に存在する残基を、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることもで
きる:(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性: Cys、Ser、Th
r、Asn、Gln;(3)酸性: Asp、Glu;(4)塩基性: His、Lys、Arg;(5)鎖の配向に影響を及ぼす
残基: Gly、Pro;及び(6)芳香族: Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換すること
を伴う。そのような置換された残基を、保存的置換部位に、又は残りの(非保存的)部位に
導入することもできる。したがって、一実施態様において、GFRALエピトープに結合する
抗体又はその断片は、本明細書に記載されるマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列と
少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、
少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、
少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも99％同一であるアミ
ノ酸配列を含む。一実施態様において、GFRALエピトープに結合する抗体又はその断片は
、表1～24に示されるアミノ酸配列と少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％
、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％
、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％
、又は少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様において、GF
RALエピトープに結合する抗体又はその断片は、表1～24に示されるVH CDRアミノ酸配列及
び/又は表1～24に示されるVL CDRアミノ酸配列と少なくとも35％、少なくとも40％、少な
くとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少な
くとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少な
くとも95％、又は少なくとも99％同一であるVH CDR及び/又はVL CDRアミノ酸配列を含む
。変異は、当技術分野で公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然
変異誘発、アラニンスキャニング、及びPCR突然変異誘発を用いて起こすことができる。
部位特異的突然変異誘発(例えば、Carterらの文献、Nucl. Acids Res., 13:4331(1986);
Zollerらの文献、Nucl. Acids Res., 10:6487(1987)を参照)、カセット突然変異誘発(例
えば、Wellsらの文献、Gene, 34:315(1985)を参照)、制限選択突然変異誘発(例えば、Wel
lsらの文献、Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415(1986)を参照)、又は他の公
知の技法をクローニングされたDNAに対して実施して、抗GFRAL抗体変異体DNAを産生する
ことができる。
抗GFRAL抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基を、例え
ば、別のアミノ酸、例えば、アラニン又はセリンと置換して、分子の酸化安定性を向上さ
せ、異常な架橋を妨げることもできる。逆に、システイン結合を抗GFRAL抗体に付加して
、その安定性を向上させることができる(例えば、抗体が、Fv断片などの抗体断片である
場合)。
いくつかの実施態様において、本開示の抗GFRAL抗体分子は、「脱免疫(de-immunized)
」抗体である。「脱免疫」抗GFRAL抗体は、それぞれのもとの非脱免疫抗体と比較して、
そのアミノ酸配列中に抗体の免疫原性の低下をもたらす1以上の改変を有する、ヒト化又
はキメラ抗GFRAL抗体に由来する抗体である。そのような抗体突然変異体を作製するため
の手順の1つは、抗体分子のT細胞エピトープの同定及び除去を含む。最初の段階では、抗
体分子の免疫原性を、いくつかの方法によって、例えば、当技術分野で公知であるような
、インビトロでのT細胞エピトープの決定又はそのようなエピトープのインシリコ予測に
よって決定することができる。ひとたびT細胞エピトープ機能のための決定的に重要な残
基が同定されてしまえば、免疫原性を除去し、かつ抗体活性を保持するように突然変異を
起こすことができる。総説については、例えば、Jonesらの文献、Methods in Molecular
Biology 525: 405-423, 2009を参照されたい。
(1.インビトロ親和性成熟)
いくつかの実施態様において、親抗体と比較して、親和性、安定性、又は発現レベルな
どの特性が改善された抗体変異体をインビトロ親和性成熟によって調製することができる
。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、突然変異及び選択の原理に基
づく。抗体のライブラリーは、Fab、scFv、又はVドメイン断片として、生物(例えば、フ
ァージ、細菌、酵母、もしくは哺乳動物細胞)の表面上に、又はそれらがコードするmRNA
もしくはDNAと(例えば、共有結合的もしくは非共有結合的に)関連した状態で提示される
。提示された抗体の親和性選択により、抗体をコードする遺伝情報を保有する生物又は複
合体の単離が可能になる。ファージディスプレイなどのディスプレイ法を用いた2回又は3
回の突然変異及び選択により、通常、低ナノモル濃度の範囲の親和性を有する抗体断片が
得られる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度又はさらにはピコ
モル濃度の親和性を有する。
ファージディスプレイは、抗体の提示及び選択のための広く普及している方法である。
抗体を、バクテリオファージコートタンパク質との融合体として、Fd又はM13バクテリオ
ファージの表面に提示させる。選択は、ファージに提示された抗体をその標的に結合させ
るための抗原への曝露を伴い、このプロセスは「パニング」と呼ばれる。抗原に結合した
ファージを回収し、細菌に感染させて、さらなる回数の選択のためのファージを産生させ
る。総説については、例えば、Hoogenboomの文献、Methods. Mol. Biol. 178: 1-37, 200
2; Bradbury及びMarksの文献、J. Immuno. Methods 290: 29-49, 2004を参照されたい。
酵母ディスプレイ系(例えば、Boderらの文献、Nat. Biotech. 15: 553-57, 1997; Chao
らの文献、Nat. Protocols 1:755-768, 2006を参照)では、抗体を、重鎖及び軽鎖が柔軟
なリンカーによって接続されている単鎖可変融合体(scFv)として提示させることができる
。scFvを、Aga1pとのジスルフィド結合によって酵母細胞壁に付着している酵母凝集素タ
ンパク質Aga2pの接着サブユニットに融合させる。Aga2pを介したタンパク質の提示により
、該タンパク質が細胞表面から離れて突き出され、酵母細胞壁上の他の分子と相互作用す
る可能性が最小限に抑えられる。磁気分離及びフローサイトメトリーを用いて、ライブラ
リーをスクリーニングし、親和性又は安定性が向上した抗体について選択する。対象とな
る可溶性抗原に対する結合は、ビオチン化された抗原と蛍光団にコンジュゲートされたス
トレプトアビジンなどの2次試薬とによる酵母の標識によって決定される。抗体の表面発
現の変動は、scFvに隣接する赤血球凝集素又はc-Mycエピトープタグのいずれかの免疫蛍
光標識によって測定することができる。発現は、提示されたタンパク質の安定性と相関す
ることが示されており、したがって、抗体を安定性及び親和性の向上について選択するこ
とができる(例えば、Shustaらの文献、J. Mol. Biol. 292: 949-956, 1999を参照)。酵母
ディスプレイのさらなる利点は、提示されたタンパク質が真核酵母細胞の小胞体でフォー
ルディングされ、小胞体シャペロン及び品質管理機構を利用することである。ひとたび成
熟が終了すると、抗体親和性を、酵母の表面に提示されたままで好都合に「漸増させ」、
各々のクローンの発現及び精製の必要性をなくすことができる。酵母表面ディスプレイの
理論的限界は、他のディスプレイ法よりも機能的なライブラリーのサイズが小さくなる可
能性があることであるが;最近のアプローチは、酵母細胞の接合システムを用いて、1014
のサイズであると推定される組み合わせ多様性を生み出している(例えば、米国特許公開
第2003/0186,374号; Blaiseらの文献、Gene 342: 211-218, 2004を参照)。
リボソームディスプレイでは、抗体-リボソーム-mRNA(ARM)複合体が無細胞系での選択
のために作製される。抗体の特定のライブラリーをコードするDNAライブラリーを、終止
コドンを欠くスペーサー配列と遺伝的に融合させる。このスペーサー配列は、翻訳された
とき、ペプチジルtRNAと付着したままで、リボソームトンネルを占有し、そのため、対象
となるタンパク質がリボソームから突き出てフォールディングすることが可能になる。結
果として生じるmRNA、リボソーム、及びタンパク質の複合体は、表面に結合したリガンド
に結合することができ、該リガンドによる親和性捕捉によって、抗体とそれをコードする
mRNAの同時単離が可能になる。その後、リボソームに結合したmRNAを逆転写させてcDNAに
戻し、これをその後、突然変異誘発に供して、次回の選択で使用することができる(例え
ば、Fukudaらの文献、Nucleic Acids Res. 34, e127, 2006を参照)。mRNAディスプレイで
は、ピューロマイシンをアダプター分子として用いて、抗体とmRNAの共有結合が確立され
る(Wilsonらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755, 2001)。
これらの方法は全てインビトロで行われるので、それらは他の選択技術に優る2つの主
な利点を提供する。第1に、ライブラリーの多様性は、細菌細胞の形質転換効率によって
ではなく、試験管内に存在するリボソーム及び様々なmRNA分子の数のみによって限定され
る。第2に、どの多様化段階の後にもライブラリーを形質転換する必要がないので、ラン
ダムな突然変異を、各々の選択回の後に、例えば、非プルーフリーディングポリメラーゼ
によって容易に導入することができる。
多様性は、抗体ライブラリーのCDR又はV遺伝子全体に、狙った形で又はランダム導入に
よって導入することができる。前者のアプローチは、高レベル又は低レベルの突然変異誘
発によって抗体のCDRの全てを逐次標的とするか、或いは体細胞超突然変異の孤立したホ
ットスポット(例えば、Hoらの文献、J. Biol. Chem. 280: 607-617, 2005を参照)又は実
験的根拠もしくは構造的理由から親和性に影響を及ぼすことが疑われる残基を標的とする
ことを含む。ランダム突然変異は、大腸菌突然変異誘発株、DNAポリメラーゼによるエラ
ーを起こしやすい複製(例えば、Hawkinsらの文献、J. Mol. Biol. 226: 889-896, 1992を
参照)、又はRNAレプリカーゼを用いて、V遺伝子全体にわたって導入することができる。
多様性は、DNAシャッフリング又は類似の技法による、天然に多様性のある領域の置換に
よって導入することもできる(例えば、Luらの文献、J. Biol. Chem. 278: 43496-43507,
2003;米国特許第5,565,332号;米国特許第6,989,250号を参照)。代替的な技法は、フレー
ムワーク領域残基に伸長している超可変ループを標的とするか(例えば、Bondらの文献、J
. Mol. Biol. 348: 699-709, 2005を参照)、CDRにおけるループの欠失及び挿入を利用す
るか、又はハイブリダイゼーションに基づく多様化を使用する(例えば、米国特許公開第2
004/0005709号を参照)。CDRにおける多様性を生じさせるさらなる方法は、米国特許第7,9
85,840号に開示されている。
ライブラリーのスクリーニングは、当技術分野で公知の様々な技法によって達成するこ
とができる。例えば、GFRALを、固体支持体、カラム、ピン、もしくはセルロース/ポリ(
フッ化ビニリデン)膜/他のフィルター上に固定化し、吸着プレートに固定されるかもしく
は細胞選別で使用される宿主細胞上で発現させ、又はストレプトアビジンコーティングさ
れたビーズによる捕捉のためにビオチンにコンジュゲートし、又はディスプレイライブラ
リーをパニングするための任意の他の方法で使用することができる。
インビトロ親和性成熟法の総説については、例えば、Hoogenboomの文献、Nature Biote
chnology 23: 1105-1116, 2005、並びにQuiroz及びSinclairの文献、Revista Ingeneria
Biomedia 4: 39-51, 2010、並びにそれらの中の参考文献を参照されたい。
(2.抗GFRAL抗体の修飾)
抗GFRAL抗体の共有結合的修飾は本開示の範囲内に含まれる。共有結合的修飾は、抗GFR
AL抗体の標的アミノ酸残基を、抗GFRAL抗体の選択された側鎖又はN末端もしくはC末端残
基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることを含む。他の修飾には、グル
タミニル残基及びアスパラギニル残基の、それぞれ、対応するグルタミル残基及びアスパ
ルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル残基又はトレ
オニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα
-アミノ基のメチル化(例えば、T.E. Creightonの文献、タンパク質:構造及び分子特性(Pr
oteins: Structure and Molecular Properties)、W.H. Freeman & Co., San Francisco,
79～86ページ(1983)を参照)、N末端アミンのアセチル化、並びに任意のC末端カルボキシ
ル基のアミド化が含まれる。
本開示の範囲内に含まれる抗GFRAL抗体の他のタイプの共有結合的修飾には、抗体又は
ポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンを改変すること(例えば、Beckらの文
献、Curr. Pharm. Biotechnol. 9: 482-501, 2008; Walshの文献、Drug Discov. Today 1
5: 773-780, 2010を参照)、及び抗体を、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリ
エチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのう
ちの1つに、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,7
91,192号、又は第4,179,337号に記載されている様式で連結することが含まれる。
本開示の抗GFRAL抗体を、抗GFRAL抗体が、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列、例
えば、エピトープタグ(例えば、Terpeの文献、Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 523-5
33, 2003を参照)又はIgG分子のFc領域(例えば、抗体融合タンパク質(Antibody Fusion Pr
oteins)、S.M. Chamow及びA. Ashkenazi編、Wiley-Liss, New York, 1999、221～242ペー
ジのAruffoの文献、「免疫グロブリン融合タンパク質(Immunoglobulin fusion proteins)
」を参照)と融合したものを含むキメラ分子を形成するように修飾することもできる。
また本明細書に提供されるのは、GFRAL抗原に結合する本明細書に提供される抗体と異
種ポリペプチドとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、抗体を融
合させる異種ポリペプチドは、該抗体を、細胞表面に発現したGFRALを有する細胞に標的
化するのに有用である。
また本明細書に提供されるのは、GFRAL抗原に結合する抗体のパネルである。具体的な
実施態様において、抗体のパネルは、異なる会合速度定数、異なる解離速度定数、GFRAL
抗原に対する異なる親和性、及び/又はGFRAL抗原に対する異なる特異性を有する。いくつ
かの実施態様において、該パネルは、約10、約25、約50、約75、約100、約125、約150、
約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約7
00、約750、約800、約850、約900、約950、もしくは約1000個の抗体、又はそれより多く
の抗体を含む、或いは該抗体からなる。抗体のパネルは、例えば、ELISAなどのアッセイ
のための、例えば、96ウェル又は384ウェルプレートで使用することができる。
(抗GFRAL抗体の調製)
抗GFRAL抗体は、抗GFRAL抗体をコードする核酸を含むベクターで形質転換又はトランス
フェクトされた細胞を培養することにより産生することができる。本開示の抗体のポリペ
プチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を用いて得ること
ができる。所望のポリヌクレオチド配列をハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単
離し、シークエンシングすることができる。或いは、ポリヌクレオチドを、ヌクレオチド
合成装置又はPCR法を用いて合成することができる。ひとたび得られれば、ポリペプチド
をコードする配列を、宿主細胞内で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができ
る組換えベクター中に挿入する。当技術分野で入手可能でありかつ公知である多くのベク
ターを本開示の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベ
クター中に挿入される核酸のサイズ及びベクターで形質転換される具体的な宿主細胞に依
存する。本開示の抗体を発現させるのに好適な宿主細胞としては、原核生物、例えば、グ
ラム陰性又はグラム陽性生物を含む、古細菌(Archaebacteria)及び真正細菌(Eubacteria)
、真核微生物、例えば、糸状菌又は酵母、無脊椎動物細胞、例えば、昆虫細胞又は植物細
胞、並びに脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞株が挙げられる。宿主細胞を上記の
発現ベクターで形質転換させて、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、
又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜修飾された従来の栄養培地中で
培養する。宿主細胞によって産生された抗体は、当技術分野で公知の標準的なタンパク質
精製法を用いて精製される。
ベクターの構築、発現、及び精製を含む、抗体生産方法は、Pluckthunらの文献(1996)
、抗体エンジニアリング:大腸菌における抗体産生: PCRから発酵まで(Antibody Engineer
ing: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation)(McCaffe
rty, J.、Hoogenboom, H. R.、及びChiswell, D. J.編)、初版、203～252ページ、IRL Pr
ess, Oxford; Kwong, K.及びRader, C.の文献、Fab抗体断片の大腸菌発現及び精製(E. co
li expression and purification of Fab antibody fragments)、タンパク質科学の最新
プロトコル編集委員会(Current protocols in protein science editorial board)、John
E Coliganら、第6章、ユニット6.10(2009); Tachibana及びTakekoshiの文献、「大腸菌
における抗体Fab断片の産生(Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia c
oli)」、抗体発現及び産生(Antibody Expression and Production)、M. Al-Rubeai編、Sp
ringer, New York, 2011;治療用モノクローナル抗体:ベンチから臨床まで(Therapeutic M
onoclonal Antibodies: From Bench to Clinic)(Z. An編), John Wiley & Sons, Inc., H
oboken, NJ, USAにさらに記載されている。
当然ながら、当技術分野で周知である代替的な方法を利用して、抗GFRAL抗体を調製し
得ることが想定される。例えば、適切なアミノ酸配列又はその部分を、固相法を用いた直
接ペプチド合成によって産生することができる(例えば、Stewartらの文献、固相ペプチド
合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)、W.H. Freeman Co., San Francisco, CA(1969);
Merrifieldの文献、J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154(1963)を参照)。インビトロのタン
パク質合成は、手作業の技法を用いて又は自動化によって行うことができる。抗GFRAL抗
体の様々な部分を別々に化学合成し、化学的又は酵素的な方法を用いて組み合わせて、所
望の抗GFRAL抗体を産生することができる。或いは、抗体を、例えば、米国特許第5,545,8
07号及び米国特許第5,827,690号に開示されているように、抗体を発現するよう改変され
たトランスジェニック動物の細胞又は体液、例えば、乳から精製することができる。
(免疫コンジュゲート)
本開示はまた、合成リンカーによるものを含め、1以上の非抗体物質に共有結合された
本開示の抗GFRAL抗体のいずれか1つを含むコンジュゲートを提供する。
様々な放射性同位体が、放射性コンジュゲートされた抗体の産生のために利用可能であ
る。例としては、At211、I4、I4、Y4、Re4、Re4、Sm4、Bi4、P4、Pb4、及びLuの放射性同
位体が挙げられる。コンジュゲートを検出用に使用する場合、それは、シンチグラフィー
試験用の放射性原子、例えば、tc4もしくはI4、又は核磁気共鳴(NMR)画像法(別名、磁気
共鳴画像法、MRI)用のスピン標識、例えば、この場合もヨウ素-123、ヨウ素-131、インジ
ウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、もしくは
鉄を含み得る。放射性同位体は、例えば、Reillyの文献、「モノクローナル抗体及びペプ
チドの放射化学(The radiochemistry of monoclonal antibodies and peptides)」、モノ
クローナル抗体及び癌のペプチド標的放射線療法(Monoclonal Antibody and Peptide-Tar
geted Radiotherapy of Cancer)、R.M. Reilly編、Wiley, Hoboken N.J., 2010に記載さ
れているような公知の方法でコンジュゲート中に組み入れることができる。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される抗体を、診断剤、検出可能な薬剤
、もしくは治療剤、又は任意の他の分子にコンジュゲートするか又は組換えにより融合さ
せる。コンジュゲートされているか又は組換えにより融合させられている抗体は、例えば
、臨床試験手順の一部として、β細胞欠損疾患、障害、又は疾病の発生、発症、進行、及
び/又は重症度をモニタリング又は予後予測する、例えば、特定の療法の効力を決定する
のに有用であり得る。
そのような診断及び検出は、例えば、抗体を検出可能な物質にカップリングさせること
により達成することができ、該検出可能な物質には、様々な酵素、例えば、限定されない
が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、又
はアセチルコリンエステラーゼ;補欠分子族、例えば、限定されないが、ストレプトアビ
ジン/ビオチン及びアビジン/ビオチン;蛍光物質、例えば、限定されないが、ウンベリフ
ェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロト
リアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリスリン;発光物質
、例えば、限定されないが、ルミノール;生体発光物質、例えば、限定されないが、ルシ
フェラーゼ、ルシフェリン、及びイクオリン;化学発光物質、例えば、限定されないが、
アクリジニウム系化合物又はHALOTAG;放射性物質、例えば、限定されないが、ヨウ素(131
I、125I、123I、及び121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In
、113In、112In、及び111In)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、
67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm
、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105R
h、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、並
びに117Sn;並びに様々な陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放射金属、並びに非放射性
常磁性金属イオンが含まれるが、これらに限定されない。
また本明細書に提供されるのは、治療的部分(又は1以上の治療的部分)にコンジュゲー
トされているか又は組換えにより融合させられている抗体、及びその使用である。該抗体
を治療的部分にコンジュゲートするか又は組換えにより融合させることができ、該治療的
部分には、細胞毒素、例えば、静細胞剤もしくは殺細胞剤、治療剤、又は放射性金属イオ
ン、例えば、α-放射体が含まれる。細胞毒素又は細胞毒性剤には、細胞に有害である任
意の薬剤が含まれる。
さらに、本明細書に提供される抗体を、所与の生物学的応答を修飾する治療的部分又は
薬物部分にコンジュゲートするか又は組換えにより融合させることができる。治療的部分
又は薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されるものと解釈されるべきではない。例
えば、薬物部分は、所望の生物活性を保有するタンパク質、ペプチド、又はポリペプチド
であり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンA、緑膿菌外毒
素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、γ-インターフェロ
ン、α-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン
活性化因子、アポトーシス物質、例えば、TNF-γ、TNF-γ、AIM I(例えば、国際公開WO 9
7/33899号を参照)、AIM II(例えば、国際公開WO 97/34911号を参照)、Fasリガンド(例え
ば、Takahashiらの文献、1994, J. Immunol., 6:1567-1574を参照)、及びVEGF(例えば、
国際公開WO 99/23105号を参照)などのタンパク質、例えば、アンギオスタチン、エンドス
タチン、もしくは凝固経路の成分(例えば、組織因子)を含む、抗血管形成物質;又は例え
ば、リンホカイン(例えば、インターフェロンγ、インターロイキン-1(「IL-1」)、イン
ターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-5(「IL-5」)、インターロイキン-6(「IL-
6」)、インターロイキン-7(「IL-7」)、インターロイキン9(「IL-9」)、インターロイキ
ン-10(「IL-10」)、インターロイキン-12(「IL-12」)、インターロイキン-15(「IL-15」)
、インターロイキン-23(「IL-23」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF
」)、及び顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」))などの生物応答修飾物質、もしくは成長
因子(例えば、成長ホルモン(「GH」))、もしくは凝固物質(例えば、カルシウム、ビタミ
ンK、組織因子、例えば、限定されないが、ハーゲマン因子(第XII因子)、高分子量キニノ
ーゲン(HMWK)、プレカリクレイン(PK)、凝固タンパク質－第II因子(プロトロンビン)、第
V因子、第XIIa因子、第VIII因子、第XIIIa因子、第XI因子、第XIa因子、第IX因子、第IXa
因子、第X因子、リン脂質、及びフィブリンモノマー)を挙げることができる。
また本明細書に提供されるのは、融合タンパク質を作製するために、異種タンパク質も
しくはポリペプチド(又はこれらの断片、例えば、約10、約20、約30、約40、約50、約60
、約70、約80、約90、又は約100アミノ酸のポリペプチド)に組換えにより融合させられて
いるか又は化学的にコンジュゲートされている(共有結合的もしくは非共有結合的コンジ
ュゲーション)抗体、及びその使用である。特に、本明細書に提供されるのは、本明細書
に提供される抗体の抗原結合断片(例えば、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、VHド
メイン、VH CDR、VLドメイン、又はVL CDR)と異種タンパク質、ポリペプチド、又はペプ
チドとを含む融合タンパク質である。一実施態様において、抗体を融合させる異種タンパ
ク質、ポリペプチド、又はペプチドは、該抗体を、特定の細胞型、例えば、GFRALを発現
する細胞に標的化するのに有用である。例えば、特定の細胞型(例えば、免疫細胞)によっ
て発現される細胞表面受容体に結合する抗体を、本明細書に提供される修飾抗体に融合さ
せるか又はコンジュゲートすることができる。
さらに、本明細書に提供される抗体は、治療的部分、例えば、放射性金属イオン、例え
ば、α-放射体、例えば、213Bi又は限定されないが、131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm
を含む、放射性金属イオンをポリペプチドにコンジュゲートするのに有用な大環状キレー
ト剤にコンジュゲートすることができる。ある実施態様において、該大環状キレート剤は
、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸(DOTA)であり、これは、リ
ンカー分子を介して抗体に結合させることができる。そのようなリンカー分子は当技術分
野で一般に公知であり、例えば、Denardoらの文献、1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483
-90; Petersonらの文献、1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7;及びZimmermanらの文献
、1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている。
さらに、本明細書に提供される抗体を、マーカー又は「タグ」配列、例えば、精製を容
易にするペプチドに融合させることができる。具体的な実施態様において、マーカー又は
タグアミノ酸配列は、その多くが市販されている、ヘキサ-ヒスチジンペプチド、例えば
、特に、pQEベクター(例えば、QIAGEN社を参照)中に提供されているタグである。例えば
、Gentzらの文献、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載されているよう
に、ヘキサ-ヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製をもたらす。精製に有用な他
のペプチドタグとしては、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープ
に相当する赤血球凝集素(「HA」)タグ(Wilsonらの文献、1984, Cell 37:767)、及び「FLA
G」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
治療的部分(ポリペプチドを含む)を抗体に融合させ又はコンジュゲートする方法は、周
知である(例えば、Arnonらの文献、「癌療法における薬物の免疫標的化用のモノクローナ
ル抗体(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)」、
モノクローナル抗体及び癌療法(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)、Reisfeld
ら(編)、243～56ページ(Alan R. Liss社、1985); Hellstromらの文献、「薬物送達用の抗
体(Antibodies For Drug Delivery)」、制御薬物送達(Controlled Drug Delivery)(第2版
)、Robinsonら(編)、623～53ページ(Marcel Dekker社、1987); Thorpeの文献、「癌療法
における細胞毒性剤の抗体担体:総説(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cance
r Therapy: A Review)」、モノクローナル抗体84:生物学的及び臨床的用途(Monoclonal
Antibodies 84: Biological And Clinical Applications)、Pincheraら(編)、475～506ペ
ージ(1985);「癌療法における放射性標識抗体の治療的使用の解析、結果、及び将来的展
望(Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabe
led Antibody In Cancer Therapy)」、癌の検出及び治療用のモノクローナル抗体(Monocl
onal Antibodies For Cancer Detection And Therapy)、Baldwinら(編)、303～16ページ(
Academic Press 1985)、Thorpeらの文献、1982, Immunol. Rev. 62:119-58;米国特許第5,
336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、第5,723,1
25号、第5,783,181号、第5,908,626号、第5,844,095号、及び第5,112,946号; EP 307,434
号; EP 367,166号; EP 394,827号; PCT公開WO 91/06570号、WO 96/04388号、WO 96/22024
号、WO 97/34631号、及びWO 99/04813号; Ashkenaziらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88: 10535-10539, 1991; Trauneckerらの文献、Nature, 331:84-86, 1988; Zhengら
の文献、J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vilらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 89:11337-11341, 1992を参照)。
融合タンパク質は、例えば、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソ
ンシャッフリング、及び/又はコドンシャッフリング(「DNAシャッフリング」と総称され
る)の技法によって作製することができる。DNAシャッフリングを利用して、例えば、より
高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体を含む、本明細書に提供される抗GFRAL抗
体の活性を変化させることができる(例えば、米国特許第5,605,793号、第5,811,238号、
第5,830,721号、第5,834,252号、及び第5,837,458号; Pattenらの文献、1997, Curr. Opi
nion Biotechnol. 8:724-33; Harayamaの文献、1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82;
Hanssonらの文献、1999, J. Mol. Biol. 287:265-76;並びにLorenzo及びBlascoの文献、
1998, Biotechniques 24(2):308-313を参照)。抗体、又はコードされた抗体を、組換え前
に、エラーを起こしやすいPCR、ランダムなヌクレオチド挿入、又は他の方法によるラン
ダムな突然変異誘発に供することにより改変することができる。本明細書に提供される抗
体をコードするポリヌクレオチドを、1以上の異種分子の1以上の成分、モチーフ、セクシ
ョン、部分、ドメイン、断片などと組み換えることができる。
本明細書に提供される抗体を第2の抗体にコンジュゲートして、例えば、米国特許第4,6
76,980号に記載されているような抗体ヘテロコンジュゲートを形成させることもできる。
GFRAL(例えば、GFRALポリペプチド、断片、エピトープ)に結合する本明細書に提供され
る抗体にコンジュゲートされているか又は組換えにより融合させられている治療的部分又
は薬物は、所望の予防又は治療効果を達成するように選択されるべきである。ある実施態
様において、該抗体は修飾抗体である。臨床医又は他の医療関係者は、例えば、どの治療
的部分又は薬物を本明細書に提供される抗体にコンジュゲートし又は組換えにより融合さ
せるべきかに関して決定するとき、以下のこと:疾患の性質、疾患の重症度、及び対象の
状態を考慮することができる。
本明細書に提供されるGFRALに結合する抗体は、免疫アッセイ又は標的抗原の精製に特
に有用である固体支持体に付着させることもできる。そのような固体支持体としては、ガ
ラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又
はポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
リンカーは、細胞内でのコンジュゲートされた薬剤の放出を容易にする「切断可能なリ
ンカー」であってもよいが、非切断性リンカーも本明細書において想定される。本開示の
コンジュゲートで使用するためのリンカーとしては、限定するものではないが、酸不安定
性リンカー(例えば、ヒドラゾンリンカー)、ジスルフィド含有リンカー、ペプチダーゼ感
受性リンカー(例えば、アミノ酸、例えば、バリン及び/又はシトルリンを含むペプチドリ
ンカー、例えば、シトルリン-バリン又はフェニルアラニン-リジン)、光不安定性リンカ
ー、ジメチルリンカー(例えば、Chariらの文献、Cancer Research 52:127-131(1992); 米
国特許第5,208,020号を参照)、チオエーテルリンカー、又は多剤輸送体を介した耐性を回
避するように設計された親水性リンカー(例えば、Kovtunらの文献、Cancer Res. 70: 252
8-2537, 2010を参照)が挙げられる。
抗体と薬剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、
BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、
スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及
びスルホ-SMPB、並びにSVSB(スクシニミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート)を用いて
作製することができる。本開示は、抗体と薬剤のコンジュゲートを、当技術分野で開示さ
れている任意の好適な方法(例えば、バイオコンジュゲート技法(Bioconjugate Technique
s)、第2版、G.T. Hermanson編、Elsevier, San Francisco, 2008中のものを参照)を用い
て調製し得ることをさらに想定している。
抗体及び薬剤の従来のコンジュゲーション戦略は、Lys残基のε-アミノ基又はCys残基
のチオール基が関与するランダムコンジュゲーション化学に基づいており、これは、不均
一なコンジュゲートを結果として生じる。最近開発された技法は、抗体への部位特異的コ
ンジュゲーションを可能にし、結果として、均一な装填が得られ、抗原結合又は薬物動態
が改変されたコンジュゲート亜集団が回避される。これらには、反応性チオール基を提供
し、かつ免疫グロブリンのフォールディング及びアセンブリを妨害することも抗原結合を
改変することもない重鎖及び軽鎖上の位置でのシステイン置換を含む「チオマブ(thiomab
)」の人為的作製が含まれる(例えば、Junutulaらの文献、J. Immunol. Meth. 332: 41-52
(2008); Junutulaらの文献、Nat. Biotechnol. 26: 925-932, 2008を参照)。別の方法で
は、終止コドンUGAを終結からセレノシステイン挿入へとコードし直すことによって、セ
レノシステインが抗体配列中に共翻訳的に挿入され、他の天然アミノ酸の存在下でのセレ
ノシステインの求核性セレノール基における部位特異的な共有結合的コンジュゲーション
が可能になる(例えば、Hoferらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 12451-12456(
2008); Hoferらの文献、Biochemistry 48(50): 12047-12057, 2009を参照)。
(医薬製剤)
本開示の抗GFRAL抗体は、治療されることになる疾患、障害、又は疾病に適した任意の
経路によって投与することができる。該抗体は、通常、非経口的に、例えば、注入、皮下
、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内、及び硬膜外に投与される。抗体用量は、例えば、疾患
又は障害の性質及び/又は重症度並びに対象の状態によって異なり、これには、1mg～100m
gの用量が含まれ得る。用量には、1mg/kg～15mg/kgの用量も含まれ得る。いくつかの実施
態様において、用量は、約5mg/kg～約7.5mg/kgである。いくつかの実施態様において、用
量は、約5mg/kgである。いくつかの実施態様において、用量は、約7.5mg/kgである。フラ
ット用量(Flat doses)は:(a) 2週間毎に375～400mg及び(b)3週間毎に550～600mgからなる
群から選択される。いくつかの実施態様において、フラット用量は、2週間毎に375～400m
gである。いくつかの実施態様において、フラット用量は、3週間毎に550～600mgである。
いくつかの実施態様において、フラット用量は、2週間毎に400mgである。いくつかの実施
態様において、フラット用量は、3週間毎に600mgである。逐次投与のいくつかの実施態様
において、第1の用量及び第2の用量は、各々、1mg/kg～15mg/kgであり、第2の用量は、第
1の用量から1～4週間後である。いくつかの実施態様において、第1の用量及び第2の用量
は、各々、5mg/kg～7.5mg/kgであり、第2の用量は、第1の用量から2～3週間後である。い
くつかの実施態様において、第1の用量及び第2の用量は、各々、5mg/kgであり、第2の用
量は、第1の用量から2週間後である。いくつかの実施態様において、第1の用量及び第2の
用量は、各々、7.5mg/kgであり、第2の用量は、第1の用量から3週間後である。
疾患、障害、又は疾病を治療するために、抗体は、いくつかの実施態様において、静脈
内注入を介して投与される。注入を介して投与される投薬量は、1回の投与当たり約1μg/
m2～約10,000μg/m2の範囲にあり、通常、週1回の投与で、合計1回、2回、3回、又は4回
の投与である。或いは、投薬量の範囲は、約1μg/m2～約1000μg/m2、約1μg/m2～約800
μg/m2、約1μg/m2～約600μg/m2、約1μg/m2～約400μg/m2;或いは、約10μg/m2～約500
μg/m2、約10μg/m2～約300μg/m2、約10μg/m2～約200μg/m2、及び約1μg/m2～約200μ
g/m2である。投与は、疾患、障害、又は疾病の症状を緩和する(relieve)又は緩和する(al
leviate)ために、1日1回、週1回、週に複数回であるが1日1回未満、月に複数回であるが1
日1回未満、月に複数回であるが週1回未満、月1回、又は間欠的に施し得る。投与は、治
療されている疾患、障害、もしくは疾病の改善、又は該疾患、障害、もしくは疾病の症状
の改善まで、開示された間隔のいずれかで継続し得る。投与は、そのような寛解又は緩和
がそのような継続投与によって延長される場合、症状の寛解又は緩和が達成された後に継
続し得る。
一態様において、本開示は、本開示の少なくとも1つの抗GFRAL抗体を含む医薬製剤をさ
らに提供する。いくつかの実施態様において、医薬製剤は、(1)抗GFRAL抗体、及び(2)医
薬として許容し得る担体を含む。いくつかの実施態様において、医薬製剤は、(1)抗GFRAL
抗体及び/又はその免疫コンジュゲート、並びに任意に、(2)少なくとも1つの追加の治療
剤を含む。
抗体を含む医薬製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意の生理的に許容し得る担体、
賦形剤、又は安定化剤(例えば、レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Science
s)、第16版、Osol, A.編(1980)を参照)と混合することにより、水性溶液又は凍結乾燥製
剤もしくは他の乾燥製剤の形態で保存用に調製される。本明細書における製剤は、治療さ
れている特定の疾患、障害、又は疾病(例えば、特定の適応症)に必要なものとしての複数
の活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼさない補完的な活性を有するものも
含有し得る。例えば、抗GFRAL抗体の他に、1つの製剤中に、追加の抗体、例えば、GFRAL
ポリペプチド上の異なるエピトープに結合する第2の抗GFRAL抗体、又はいくつかの他の標
的に対する抗体を含めることが望ましい場合がある。代わりに、又はさらに、組成物は、
例えば、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び/又
は心臓保護剤を含む、別の薬剤をさらに含み得る。いくつかの実施態様において、製剤は
、アルキル化剤(例えば、クロラムブシル、ベンダムスチン塩酸塩、又はシクロホスファ
ミド)、ヌクレオシド類似体(例えば、フルヅラビン(fludurabine)、ペントスタチン、ク
ラドリビン、又はシタラビン)、コルチコステロイド(例えば、プレドニゾン、プレドニゾ
ロン、又はメチルプレドニゾロン)、免疫調節剤(例えば、レナリドミド)、抗生物質(例え
ば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、又はミトキセントロン(mitoxentr
one))、合成フラボン(例えば、フラボピリドール)、Bcl2アンタゴニスト(例えば、オブリ
メルセン又はABT-263)、低メチル化剤(例えば、アザシチジン又はデシタビン)、FLT3阻害
剤(例えば、ミドスタウリン、ソラフェニブ、及びAC220)を含む。そのような分子は、意
図される目的に有効である量で好適に併存する。
本開示の抗体は、標的細胞/組織への送達のための任意の好適な形態で、例えば、マイ
クロカプセルもしくはマクロエマルジョンとして(レミントンの薬学(Remington's Pharma
ceutical Sciences)、第16版、Osol, A.編(1980); Parkらの文献、Molecules 10: 146-16
1(2005); Malikらの文献、Curr. Drug. Deliv. 4: 141-151(2007));持続放出製剤として(
Putney及びBurkeの文献、Nature Biotechnol. 16: 153-157(1998))、又はリポソーム中に
(Macleanらの文献、Int. J. Oncol. 11: 235-332(1997); Kontermannの文献、Curr. Opin
. Mol. Ther. 8: 39-45(2006))、製剤化することができる。
本明細書に提供される抗体は、例えば、コアセルベーション法によるか又は界面重合に
よって調製されたマイクロカプセル、例えば、ぞれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又
はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中、コ
ロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマ
ルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)中、又はマクロエマルジョン中に封入すること
もできる。そのような技法は、例えば、レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical
Sciences)(1990) Mack Publishing Co., Easton, PAに開示されている。
様々な送達系が公知であり、かつ予防剤又は治療剤(例えば、本明細書に記載されるGFR
ALに結合する抗体)を投与するために使用することができ、該送達系には、リポソーム、
微粒子、マイクロカプセルへの封入、抗体を発現することができる組換え細胞、受容体媒
介性エンドサイトーシス(例えば、Wu及びWuの文献、J. Biol. Chem. 262:4429-4432(1987
)を参照)、レトロウイルスもしくは他のベクターの部分としての核酸の構築などが含まれ
るが、これらに限定されない。別の実施態様において、予防剤もしくは治療剤又は本明細
書に提供される組成物を制御放出又は持続放出系で送達することができる。一実施態様に
おいて、ポンプを用いて、制御又は持続放出を達成することができる(例えば、Langerの
文献(上記); Seftonの文献、1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwaldらの
文献、1980, Surgery 88:507; Saudekらの文献、1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照
)。別の実施態様において、ポリマー材料を用いて、予防剤もしくは治療剤(例えば、本明
細書に記載されるGFRALに結合する抗体)又は本発明の組成物の制御又は持続放出を達成す
ることができる(例えば、制御放出の医学的応用(Medical Applications of Controlled R
elease)、Langer及びWise(編)、CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974);薬物バイオアベ
イラビリティーの制御、医薬品設計、及び性能(Controlled Drug Bioavailability, Drug
Product Design and Performance)、Smolen及びBall(編)、Wiley, New York(1984); Ran
ger及びPeppasの文献、1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照さ
れたく; Levyらの文献、1985, Science 228:190; Duringらの文献、1989, Ann. Neurol.
25:351; Howardらの文献、1989, J. Neurosurg. 7 1:105); 米国特許第5,679,377号;米国
特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,32
6号; PCT公開WO 99/15154号;及びPCT公開WO 99/20253号を参照)。持続放出製剤で使用さ
れるポリマーの例としては、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メタクリ
ル酸メチル)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)
、ポリグリコリド(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコー
ル)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラク
チド-コ-グリコリド)(PLGA)、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定さ
れない。一実施態様において、持続放出製剤で使用されるポリマーは、不活性で、浸出性
不純物を含まず、保存時に安定で、滅菌性で、かつ生体分解性である。
さらに別の実施態様において、制御又は持続放出系を、治療標的、例えば、鼻孔又は肺
の近くに配置することができ、したがって、全身用量のごく一部しか必要としない(例え
ば、Goodsonの文献、制御放出の医学的応用(Medical Applications of Controlled Relea
se)、上記、第2巻、115～138ページ(1984)を参照)。制御放出系は、例えば、Langer(1990
, Science 249:1527-1533)によって論じられている。当業者に公知の任意の技法を用いて
、本明細書に記載されるGFRALに結合する1以上の抗体を含む持続放出製剤を産生すること
ができる(例えば、米国特許第4,526,938号、PCT公開WO 91/05548号、PCT公開WO 96/20698
号、Ningらの文献、1996、「持続放出ゲルを用いたヒト結腸癌異種移植片の腫瘍内放射免
疫療法(Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a
Sustained-Release Gel)」、Radiotherapy & Oncology 39:179- 189、Songらの文献、19
95、「長期循環エマルジョンの抗体媒介性肺標的化(Antibody Mediated Lung Targeting
of Long-Circulating Emulsions)」、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Techno
logy 50:372-397、Cleekらの文献、1997、「心血管用途のためのbFGF抗体用の生体分解性
ポリマー担体(Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovasc
ular Application)」、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854、
及びLamらの文献、1997、「局所送達のための組換えヒト化モノクローナル抗体のマイク
ロカプセル化(Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for
Local Delivery)」、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を
参照)。
限定されないが、注射可能な薬物送達装置を含む、別の送達系を用いて、予防剤又は治
療剤(例えば、本明細書に記載されるGFRALに結合する抗体)を投与することができる。抗G
FRAL抗体用の注射可能な薬物送達装置としては、例えば、携帯型装置又は装着可能な装置
が挙げられる。抗GFRAL抗体に有用な携帯型装置としては、FLEXIQ-DV(Elcam Medical)又
はPRO-JECT(Aptar Pharma)オートインジェクターなどのオートインジェクターが挙げられ
る。抗GFRAL抗体に有用な装着可能な装置としては、例えば、NEULASTA薬物送達キット(Am
gen)などの持ち運び式薬物送達系が挙げられる。抗GFRAL抗体用の注射可能な薬物送達装
置は、例えば、プレフィルドシリンジ、カートリッジ、又はバイアル中に、予防剤又は治
療剤としての抗体を含有することができる。抗GFRAL抗体用の注射可能な薬物送達装置(例
えば、オートインジェクター)及び/又はその容器(例えば、シリンジ、カートリッジ、又
はバイアル)は使い捨てであることができる。抗GFRAL抗体に有用な例示的な注射用装置は
、WO2014/081780号に記載されている。
いくつかの実施態様において、限定されないが、浸透圧ポンプを含む、さらなる薬物送
達系を用いて、予防剤又は治療剤(例えば、本明細書に記載されるGFRALに結合する抗体)
を投与することができる。例えば、単一コンパートメントシステム、二重コンパートメン
トシステム、及び多重コンパートメントシステムを含む、抗GFRAL抗体用の様々なタイプ
の浸透圧ポンプシステムを使用することができる。抗GFRAL抗体に有用な例示的な浸透圧
ポンプシステムは、例えば、Herrlichらの文献(2012) Advanced Drug Delivery Reviews
64, 1617-1627に記載されている。いくつかの実施態様において、抗GFRAL抗体用の浸透圧
ポンプとしては、DUROSポンプなどの移植可能な薬物分配浸透圧ポンプを挙げることがで
きる。
(治療方法)
本開示の抗GFRAL抗体は、例えば、治療方法において使用することができる。
いくつかの実施態様において、本開示は、GDF15媒介性疾患、障害、又は疾病を治療又
は予防する方法であって、本明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその断片をGDF15媒介性
疾患、障害、又は疾病に罹患している対象に投与することを含む、方法を提供する。さら
に、該対象に、本明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその断片を含む医薬組成物を投与
することができる。
いくつかの実施態様において、本開示は、不随意の体重減少に苦しむ対象を治療する方
法を提供する。好適な対象の例は、消耗性疾患又は悪液質と診断される対象であり得る。
好適な患者としては、肝硬変、甲状腺機能亢進症、慢性腎疾患、パーキンソン病、癌、摂
食障害(例えば、神経性無食欲)、慢性炎症性疾患(例えば、関節リウマチ)、敗血症もしく
は他の形態の全身性炎症、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核症、及び筋消耗、例えば、筋ジ
ストロフィーもしくは多発性硬化症)、又はサルコペニアに罹患している患者が挙げられ
る。
いくつかの実施態様において、本開示は、慢性疾患、例えば、肝硬変、甲状腺機能亢進
症、慢性腎疾患、パーキンソン病、癌、摂食障害(例えば、神経性無食欲)、慢性炎症性疾
患(例えば、関節リウマチ)、敗血症もしくは他の形態の全身性炎症、慢性閉塞性肺疾患、
AIDS、結核症、及び筋消耗、例えば、筋ジストロフィーもしくは多発性硬化症)、又はサ
ルコペニアによる不随意の体重減少のリスクがあり得る対象における不随意の体重減少を
予防する方法も提供する。そのような対象としては、上昇したGDF15レベルを有する対象
、癌の治療を受けている対象などを挙げることができる。
いくつかの実施態様において、本開示は、悪液質に罹患している対象を治療する方法を
提供する。好適な対象の例は、悪液質と診断される対象である。本開示は、悪液質の発生
による不随意の体重減少のリスクがあり得る対象における不随意の体重減少を予防する方
法も提供する。そのような対象としては、上昇したGDF15レベルを有する対象、癌を有す
る対象、癌の治療を受けている対象、摂食障害を有する対象などを挙げることができる。
また開示されるのは、上昇したGDF15活性を有する患者におけるGDF15活性を調節する方
法である。本明細書で使用される場合、「上昇したGDF15活性」は、正常対象と比較した
ときの対象の生体液中のGDF15の活性又は量の増加を指す。いくつかの疾病はGDF15血清レ
ベルの増加と関連しており、ここで、GDF15の増加は、例えば、食欲の喪失、体重減少な
どの、いくつかの症状をもたらす。GDF15血清レベルの増加と関連する疾病の例としては
、癌、例えば、黒色腫、胃癌、膵癌、前立腺癌;自己免疫疾患、例えば、関節炎及び炎症;
アテローム性動脈硬化症、心不全、高血圧、心筋梗塞、胸痛、及び心血管事象のような心
血管疾患;貧血、悪液質、食欲不振、腎疾患、及びサラセミアのような代謝性疾患などが
挙げられる。
上記の疾患、障害、又は疾病のいずれかを有する対象は、本明細書に記載される抗GFRA
L抗体もしくはその断片、又は治療剤と抗GFRAL抗体もしくはその断片の組合せを受容する
のに好適な候補である。
対象に、そのような対象への抗GFRAL抗体又はその断片を投与すると、GDF15媒介性疾患
、障害、又は疾病と関連する症状のうちの1つ又は複数を減少させ又は予防することがで
きる。例えば、本開示の抗GFRAL抗体又はその断片を投与すると、対象の体重及び/又は食
欲を増大させることができる。別の例として、本開示の抗GFRAL抗体又はその断片を投与
すると、対象の体重を維持するか又は対象の体重減少を低下させることができる。
一態様において、疾患、障害、又は疾病を治療する方法であって、抗GFRAL抗体又はそ
の断片の有効量を個体に投与することを含む、方法が提供される。ある実施態様において
、疾患、障害、又は疾病を治療する方法は、抗GFRAL抗体及び任意に、少なくとも1つの追
加の治療剤、例えば、本明細書に提供されるものを含む医薬製剤の有効量を個体に投与す
ることを含む。
抗GFRAL抗体又はその断片を治療目的でヒトに投与することができる。さらに、抗GFRAL
抗体又はその断片を、獣医学的な目的で又はヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反
応するGFRALを発現する非ヒト哺乳動物(例えば、霊長類、ブタ、ラット、又はマウス)に
投与することができる。後者に関して、そのような動物モデルは、本開示の抗体の治療効
力の評価(例えば、投薬量及び投与の経時変化の試験)に有用である場合がある。
本開示の抗体は、治療法において単独で又は他の組成物と組み合わせて使用することが
できる。例えば、本開示の抗GFRAL抗体は、少なくとも1つの追加の治療剤及び/又はアジ
ュバントと共投与することができる。いくつかの実施態様において、追加の化合物は、抗
GFRAL抗体以外の治療用抗体である。
上述のそのような併用療法は、併用投与(この場合、2以上の治療剤が同じ又は別々の製
剤に含まれる)、及び個別投与を包含し、この場合、本開示の抗GFRAL抗体又はその断片の
投与は、追加の治療剤及び/又はアジュバントの投与の前、それと同時、及び/又はその後
に行うことができる。本開示の抗体を、限定するものではないが、本明細書に記載されて
いるものを含む、追加の治療レジメンと組み合わせて使用することもできる。
本開示の抗GFRAL抗体(及び任意の追加の治療剤又はアジュバント)は、非経口、皮下、
腹腔内、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療にとって望ましい場合、病変内投与を含む、
任意の好適な手段によって投与することができる。非経口的注入には、筋肉内、静脈内、
動脈内、腹腔内、又は皮下への投与が含まれる。さらに、抗体又はコンジュゲートは、特
に漸減用量の抗体又はその断片を用いる、パルス注入によって好適に投与される。投与は
、任意の好適な経路によるもの、例えば、注射、例えば、一つには、投与が短期間である
か又は持続的であるかによって、静脈内注射又は皮下注射によるものであってもよい。
本開示の抗体は、医療実施基準(good medical practice)と一致する様式で製剤化され
、投薬され、投与される。これに関連して考慮される因子としては、治療されている具体
的な障害、治療されている具体的な哺乳動物、個々の対象の臨床状態、障害の原因、薬剤
の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に公知の他の因子が挙げられる
。抗GFRAL抗体は、必ずしもその必要はないが、任意に、当該の障害を予防又は治療する
ために現在使用されている1以上の薬剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有
効量は、製剤中に存在する抗体又は免疫コンジュゲートの量、障害又は治療の種類、及び
上で考察した他の因子によって決まる。これらは、通常、本明細書に記載されているのと
同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投薬量の約1～99％で、又は適切
であることが実験的/臨床的に明らかにされている任意の投薬量及び任意の経路で使用さ
れる。
疾患、障害、又は疾病の予防又は治療のために、本開示の抗GFRAL抗体又はその断片の
適切な投薬量は(単独で又は1以上の他の追加の治療剤、例えば、本明細書に記載される薬
剤と組み合わせて使用される場合)、治療されることになる疾患、障害、又は疾病の種類
、抗体の種類、疾患、障害、又は疾病の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるの
か、それとも治療目的で投与されるのかということ、薬歴、対象の既往歴及び抗体に対す
る応答、並びに担当医の裁量によって決まる。抗GFRAL抗体又はその断片は、対象に対し
て、1回で又は一連の治療にわたって好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて
、約1μg/kg～100mg/kg(例えば、0.1mg/kg～20mg/kg、1mg/kg～15mg/kgなど)の抗体又は
その断片を、例えば、1回以上の個別投与によるものであれ、連続注入によるものであれ
、対象への投与のための初回候補投薬量とすることができる。1つの典型的な1日投薬量は
、上述の因子に応じて、約1μg/kg～100mg/kg又はそれを上回る範囲であり得る。数日間
又はそれより長い期間にわたる反復投与については、状態に応じて、治療は、通常、疾患
症状の所望の抑制が起こるまで持続される。抗体又はその断片の例示的な投薬量は、約0.
05mg/kg～約10.0mg/kgの範囲であり得る。したがって、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、
3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg、又は10.0mg
/kgのうちの1つ又は複数の用量(又はこれらの任意の組合せ)の抗体を対象に投与すること
ができる。そのような用量は、間欠的に、例えば、週に1回又は3週に1回(例えば、対象が
、約2～約20回、又は例えば、約6回の抗体の投与を受けるように)投与することができる
。初回にはより高い負荷用量を、その後は1回以上のより低い用量を投与することができ
る。例示的な投与レジメンは、初回負荷用量の抗体を投与し、その後、維持用量(週1回)
の抗体又はその断片を投与することを含む。初回負荷用量は、維持用量より大きくてもよ
い。しかしながら、他の投与レジメンが有用である場合がある。この療法の進捗は、従来
の技法及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、対象に、不随意の体重減
少を有するか又は不随意の体重減少を発症するリスクのある患者への抗GFRAL抗体又はそ
の断片を投与することを含む。対象方法は、GDF15の上昇した血清レベルを有する対象に
、本明細書に開示される抗GFRAL抗体又はその断片を投与することを含む。ある実施態様
において、該抗体又はその断片は、GFRALの細胞外ドメインに対する結合をGDF15と競合す
る抗GFRAL抗体である。ある実施態様において、該抗体又はその断片は、GFRALタンパク質
の細胞外ドメインに結合するが、RETを活性化しない。例えば、該抗体又はその断片は、G
FRALの細胞外ドメインに対する結合をGDF15と競合するが、GFRALに結合したときにRETを
活性化しない、抗GFRAL抗体である。そのような抗体は、本明細書に記載されている。
本開示の方法において、本明細書に記載される抗GFRAL抗体もしくはその断片又は該抗
体もしくはその断片を含む医薬組成物を対象(例えば、ヒト患者)に投与して、例えば、目
標体重を達成し及び/又は体重を維持すること;目標ボディマスインデックス(BMI)を達成
し及び/又はBMIを維持すること;食欲を増進すること;などができる。正常な成人は、18.5
～24.9Kg/m2の範囲のBMIを有する。対象治療方法は、患者の体重、BMI、筋重量、及び/又
は食餌摂取を、少なくとも約5％、例えば、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％
、45％、50％、又はそれを上回って増大させることができる。
本明細書に記載されるGDF15媒介性疾患、障害、又は疾病(例えば、不随意の体重減少)
の治療又は予防に関する方法は、例えば、単独での又は他のタイプの療法と組み合わせた
療法/予防のための本明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその断片の使用を含む。本方法
は、対象に、抗GFRAL抗体又はその断片及び別の薬剤を投与することを含む。
いくつかの実施態様において、該薬剤は、筋肉量減少、例えば、基礎疾患と関連する筋
肉量減少を経験している患者に投与される。悪液質と関連する基礎疾患としては、癌、慢
性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核症、慢性炎症性疾患、敗血症及び他の形態の全
身性炎症、筋消耗、例えば、筋ジストロフィー、並びに神経性無食欲として知られる摂食
障害が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、該薬剤は、
除脂肪量(例えば、筋肉量)及び又は脂肪量の減少を、少なくとも40％、50％、60％、70％
、80％、90％、95％、98％、99％、又は100％阻害する。
いくつかの実施態様において、除脂肪量(例えば、筋肉量)の減少は、脂肪量の減少によ
って達成される。いくつかの実施態様において、該薬剤は、脂肪量の減少を、少なくとも
40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、又は100％阻害することがで
きる。
いくつかの実施態様において、該薬剤は、体重減少(例えば、不随意の体重減少)と診断
された患者に投与される。いくつかの実施態様において、該薬剤は、体重減少(例えば、
不随意の体重減少)を、少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、又は35％
戻すことができる。
いくつかの実施態様において、該薬剤は、臓器質量の減少、例えば、基礎疾患と関連す
る臓器質量の減少と診断された患者に投与される。悪液質と関連する基礎疾患としては、
癌、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核症、慢性炎症性疾患、敗血症及び他の形
態の全身性炎症、筋消耗、例えば、筋ジストロフィー、並びに神経性無食欲として知られ
る摂食障害が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、該薬
剤は、臓器質量の減少を、少なくとも40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％
、99％、又は100％阻害することができる。いくつかの実施態様において、臓器質量の減
少は、心臓、肝臓、腎臓、及び/又は脾臓で観察される。いくつかの実施態様において、
臓器質量の減少は、筋肉量減少、脂肪量減少、及び/又は不随意の体重減少を伴う。
サルコペニア、筋消耗障害、及び顕著な筋重量減少は、悪液質、食欲減退、又は体重減
少の非存在下で生じ得る。いくつかの実施態様において、該薬剤を用いて、サルコペニア
、筋消耗障害、及び/又は重大な顕著な筋重量減少と診断された対象を治療することがで
き、該対象が悪液質もしくは食欲減退を有するかどうか、又は悪液質もしくは食欲減退と
診断されたことがあるかどうかを問わない。そのような方法は、1以上の薬剤の治療有効
量を、それを必要としている対象に投与することを含む。
悪液質の治療又は予防に対する多種多様な療法のいずれかを、組成物又は治療法におい
て、対象タンパク質と組み合わせることができる。
GFRAL-ECDタンパク質を1以上の他の療法と組み合わせて投与する場合、該組合せは、対
象タンパク質の投与と同時から該投与の最大5時間もしくはそれ以前、例えば、10時間、1
5時間、20時間、もしくはそれ以前、又は対象タンパク質の投与と同時から該投与の最大5
時間もしくはそれ以降、例えば、10時間、15時間、20時間、もしくはそれ以降のどこかで
投与することができる。ある実施態様において、対象タンパク質及び他の治療的介入は順
次投与又は適用され、例えば、この場合、対象タンパク質は、別の治療的治療の前又は後
に投与される。さらに他の実施態様において、対象タンパク質及び他の療法は同時に投与
され、例えば、この場合、対象タンパク質及び第二の療法は同時に投与され、例えば、第
二の療法が薬物であるとき、それを、対象タンパク質と一緒に2つの別々の製剤として投
与するか、又は組み合わせて、対象に投与される単一の組成物にすることができる。上で
説明したように、順次投与されるか、それとも同時に投与されるかを問わず、治療は、本
開示の目的のために、一緒に又は組み合わせて投与されると考えられる。
悪液質に関係があるとされるサイトカインとしては、アクチビンA及びIL-6が挙げられ
る。アクチビンレベルの増大は、癌関連悪液質及び性腺腫瘍と関連付けられている。例え
ば、Marinoらの文献(2013) CYTOKINE & GROWTH FACTOR REV. 24:477-484を参照されたい
。アクチビンAは、TGF-βファミリーのメンバーであり、アクチビン2型受容体であるActR
IIBのリガンドである。例えば、Zhouらの文献(2010) CELL 142:531-543を参照されたい。
IL-6の循環レベルは、癌患者における体重減少、並びに生存の低下と相関することが示さ
れている。例えば、Fearonらの文献(2012) CELL METABOLISM 16: 153-166を参照されたい
。
したがって、いくつかの実施態様において、アクチビン-A又はアクチビン-A受容体、Ac
tRIIB、IL-6又はIL-6受容体(IL-6R)の1以上の阻害剤を本明細書に記載される抗GFRAL抗体
又はその断片と組み合わせて投与する(例えば、それと同時に投与する、その前に投与す
る、又はその後に投与する)ことができる。アクチビンA又はActRIIBの例示的な阻害剤と
しては、例えば、抗アクチビン-A抗体又はその抗原結合断片、抗ActRIIB抗体又はその抗
原結合断片、アクチビン-Aの低分子阻害剤、ActRIIBの低分子阻害剤、並びにActRIIBの「
デコイ」受容体、例えば、可溶性ActRIIB受容体及び可溶性ActRIIB受容体とFc分子との融
合体(ActRIIB-Fc)が挙げられる。例えば、Zhouらの文献(2010)、上記を参照されたい。IL
-6又はIL-6Rの好適な阻害剤としては、抗IL-6抗体又はその抗原結合断片、抗IL-6R抗体又
はその抗原結合断片、IL-6の低分子阻害剤、IL-6Rの低分子阻害剤、並びにIL-6Rの「デコ
イ」受容体、例えば、可溶性IL-6受容体及び可溶性IL-6受容体とFc分子との融合体(IL6R-
Fc)が挙げられる。例えば、Enomotoらの文献(2004) BlOCHEM. AND BIOPHYS. RES. COMM.
323: 1096-1 102; Argilesらの文献(2011) EUR. J. PHARMACOL. 668:S81-S86; Tucaらの
文献(2013) ONCOLOGY/HEMATOLOGY 88:625-636を参照されたい。IL-6又はIL-6Rの好適な阻
害剤としては、例えば、トシリズマブ(Actemra(登録商標)、Hoffmann-LaRoche)、関節リ
ウマチの治療に認可されているヒト化抗IL-6Rモノクローナル抗体、及び関節リウマチの
治療のための臨床開発中のヒト化抗IL6R抗体であるサリルマブ/REGN88(Regeneron);及びI
L-6産生を阻害することが示されているMEKのアロステリック阻害剤であるセルメチニブ/A
ZD6244(AstraZeneca)を挙げることができる。Pradoらの文献(2012) BRITISH J. CANCER 1
06: 1583-1586。
TNFα及びIL-1は、炎症促進性応答の媒介に関与することが知られているサイトカイン
であり、これらは、筋肉減少、食欲不振、及び悪液質にも関係があるとされる。TNFαの
循環レベルの増大は、筋形成を阻害するように見える。「カケクチン」としても知られる
TNFαは、インターロイキン-1分泌を刺激し、悪液質の誘導に関係があるとされる。IL-1
は、急性期炎症応答の強力な誘因であり、IL-1の注入が著しい体重減少及び食欲の喪失を
もたらし得ることが示されている。IL-1は、マウス結腸-26腺癌を担持するマウスにおけ
る癌悪液質のイニシエーションに寄与することが示されている(Strassmannらの文献(1993
) J. IMMUNOL. 150:2341)。Mathys及びBilliauの文献(1997) NUTRITION 13 :763-770; Fo
ngらの文献(1989) AM. J. PHYSIOL. - REGULATORY, INTEGRATIVE AND COMPARATIVE PHYSI
OL., 256:R659-R665も参照されたい。したがって、関節リウマチの治療において使用され
るTNFα阻害剤及びIL-1阻害剤は、悪液質の治療においても有用であり得る。
したがって、いくつかの実施態様において、TNFα又はIL-1の1以上の阻害剤を本明細書
に記載される抗GFRAL抗体又はその断片と組み合わせて投与する(例えば、それと同時に投
与する、その前に投与する、又はその後に投与する)ことができる。TNFα又はIL-1の好適
な阻害剤としては、抗TNFα抗体又はその抗原結合断片、抗IL-1抗体又はその抗原結合断
片、TNFα又はIL-1の低分子阻害剤、並びにTNFα又はIL-1の「デコイ」受容体、例えば、
可溶性TNFα又はIL-1受容体及び可溶型のTNFα又はIL-1とFc分子との融合体が挙げられる
。TNFαの好適な阻害剤としては、例えば、エタネルセプト(Enbrel(登録商標)、Pfizer/A
mgen)、インフリキシマブ(Remicade(登録商標)、Janssen Biotech)、アダリムマブ(Humir
a(登録商標)、Abbvie)、ゴリムマブ(Simponi(登録商標)、Johnson and Johnson/Merck)、
及びセルトリズマブペゴール(Cimzia(登録商標)、UCB)が挙げられる。好適なIL-1阻害剤
としては、例えば、IL-Iaを標的とするXilonix(登録商標)抗体(XBiotech)、アニキンラ(a
nikinra)(Kinaret(登録商標)、Amgen)、カナキヌマブ(Ilaris(登録商標)、Novartis)、及
びリロナセプト(Arcalyst(登録商標)、Regeneron)が挙げられる。ある実施態様において
、通常、関節リウマチの治療のために全身投与されるTNFα阻害剤又はIL-1阻害剤を腫瘍
部位に局所的にかつ直接投与することができる。
GDF-8としても知られるミオスタチンは、TGF-βファミリーのペプチドのメンバーであ
り、ミオスタチン欠損哺乳動物における筋肉量の増加によって示されるように、筋肉量の
負の調節因子である。ミオスタチンは、アクチビン2型受容体であるActRIIBのリガンドで
ある。
したがって、いくつかの実施態様において、ミオスタチン又はその受容体の1以上の阻
害剤を本明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその断片と組み合わせて投与する(例えば、
それと同時に投与する、その前に投与する、又はその後に投与する)ことができる。ミオ
スタチン又はActRIIBの好適な阻害剤としては、抗ミオスタチン抗体又はその抗原結合断
片、抗ActRIIB抗体又はその抗原結合断片、ミオスタチンの低分子阻害剤、ActRIIBの低分
子阻害剤、並びにGDF-8の「デコイ」受容体、例えば、可溶性ActRIIB及び可溶型のActRII
BとFc分子との融合体が挙げられる。例えば、Lokireddyらの文献(2012) BlOCHEM. J. 446
(l):23-26を参照されたい。本方法に好適であり得るミオスタチン阻害剤としては、REGN1
033(Regeneron); Bauerleinらの文献(2013) J. CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE: 2013年12
月9日～11日、日本の神戸/大阪での第7回悪液質会議の要旨、要旨4-06を参照; Eli Lilly
による臨床開発中のヒト化抗ミオスタチン抗体であるLY2495655(Lilly);ワールドワイド
ウェブ上のclinicaltrials.gov/ct2/NCT01505530で入手可能な「膵癌を有する参加者にお
けるLY2495655の第2相試験(A PHASE 2 STUDY OF LY2495655 IN PARTICIPANTS WITH PANCR
EATIC CANCER)」も参照; NML識別子: NCT01505530; ACE-031(Acceleron Pharma);及びス
タムルマブ(Pfizer)が挙げられる。
グレリンもしくはグレリン模倣物、又はグレリン受容体としても知られるGHS受容体(GH
S-RIa)を活性化することができる他の成長ホルモン分泌促進物質(GHS)などの薬剤は、ヒ
トにおける食餌摂取及び体重を増大させるのに有用であり得る。Guilloryらの文献(2013)
、ビタミン及びホルモン(VITAMINS AND HORMONES)、第92巻、第3章所収;及びSteinman及
びDeBoerの文献(2013)、ビタミン及びホルモン(VITAMINS AND HORMONES)、第92巻、第8章
を参照されたい。したがって、いくつかの実施態様において、1以上のグレリンもしくは
グレリン模倣物、又は他の成長ホルモン分泌促進物質(GHS)を本明細書に記載される抗GFR
AL抗体又はその断片と組み合わせて投与する(例えば、それと同時に投与する、その前に
投与する、又はその後に投与する)ことができる。好適なグレリン模倣物としては、アナ
モレリン(Helsinn, Lugano, CH)が挙げられ; Temelらの文献(2013) J. CACHEXIA SARCOPE
NIA MUSCLE: 2013年12月9日～11日、日本の神戸/大阪での第7回悪液質会議の要旨、要旨5
-01を参照されたい。例えば、PCT公開WO2011/117254号及びWO2012/113103号に記載されて
いる成長ホルモン分泌促進物質受容体グレリン競合アッセイを用いて、他の好適なGHS分
子を同定することができる。
低分子及び他の選択的アンドロゲン受容体モジュレーター(SARM)を含むアンドロゲン受
容体のアゴニストは、悪液質及び/又はサルコペニアを治療するのに有用であり得る。例
えば、Mohlerらの文献(2009) J. MED. CHEM. 52:3597-3617; Nagataらの文献(2011) BIOO
RGANIC AND MED. CHEM. LETTERS 21 : 1744-1747;及びChenらの文献(2005) MOL. INTERV.
5: 173-188を参照されたい。理想的には、SARMは、筋肉及び骨などの同化作用のある標
的組織において、テストステロンのような完全アゴニストとして作用するはずであるが、
前立腺組織に対しては部分的な又は純粋なアンドロゲン受容体拮抗活性しか示さないはず
である。例えば、Boveeらの文献(2010) J. STEROID BlOCHEM. & MOL. BIOL. 118:85-92を
参照されたい。好適なSARMは、例えば、Zhangらの文献(2006) BIOORG. MED. CHEM. LETT.
16:5763-5766;及びZhangらの文献(2007) BIOORG. MED. CHEM. LETT. 17:439-443に記載
されている方法及びアッセイを用いて同定することができる。
したがって、いくつかの実施態様において、1以上のアンドロゲン受容体アゴニストを
本明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその断片と組み合わせて投与する(例えば、それと
同時に投与する、その前に投与する、又はその後に投与する)ことができる。好適なSARM
としては、例えば、GTx-024(エノボサルム、Ostarine(登録商標)、GTx社)、GTx社による
第2相臨床開発中のSARMが挙げられる。Daltonらの文献(2011) J. CACHEXIA SARCOPENIA M
USCLE 2: 153-161も参照されたい。他の好適なSARMとしては、2-(2,2,2)-トリフルオロエ
チル-ベンゾイミダゾール(Ngらの文献(2007) BIOORG. MED. CHEM. LETT. 17: 1784-1787)
及びJNJ-26146900(Allanらの文献(2007) J. STEROID BlOCHEM. & MOL. BIOL. 103:76-83)
が挙げられる。
β-アドレナリン作動性受容体遮断薬、又はベータ-遮断薬は、悪液質の対象の体重に対
するその効果について研究されており、鬱血性心不全を有する患者における悪液質の部分
的な回復と関連付けられている。例えば、Hryniewiczらの文献(2003) J. CARDIAC FAILUR
E 9:464-468を参照されたい。ベータ-遮断薬のMT-102(PsiOxus Therapeutics, Ltd.)は、
癌悪液質を有する対象についての第2相臨床試験で評価されている。Coatsらの文献(2011)
J. CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2:201-207を参照されたい。したがって、いくつかの実
施態様において、1以上のβ-アドレナリン作動性受容体遮断薬、又はベータ-遮断薬を本
明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその断片と組み合わせて投与する(例えば、それと同
時に投与する、その前に投与する、又はその後に投与する)ことができる。
メラノコルチンシグナル伝達に遺伝子異常を有するメラノコルチン受容体ノックアウト
マウスは、悪液質の表現型とは反対の表現型:食欲の増加、除脂肪ボディマスの増加、及
び代謝の減少を示す。そのため、メラノコルチン拮抗作用は、慢性疾患と関連する悪液質
の潜在的治療として浮上してきた(DeBoer及びMarksの文献(2006) TRENDS IN ENDOCRINOLO
GY AND METABOLISM 17: 199-204)。
したがって、いくつかの実施態様において、メラノコルチンペプチド又はメラノコルチ
ン受容体の1以上の阻害剤を本明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその断片と組み合わせ
て投与する(例えば、それと同時に投与する、その前に投与する、又はその後に投与する)
ことができる。メラノコルチン又はメラノコルチン受容体の好適な阻害剤としては、抗メ
ラノコルチンペプチド抗体又はその抗原結合断片、抗メラノコルチン受容体抗体又はその
抗原結合断片、メラノコルチンペプチドの低分子阻害剤、メラノコルチン受容体の低分子
阻害剤、並びにメラノコルチン受容体の「デコイ」受容体、例えば、可溶性メラノコルチ
ン受容体及び可溶性メラノコルチン受容体とFc分子との融合体が挙げられる。好適なメラ
コルチン(melacortin)受容体阻害剤としては、例えば、癌関連悪液質のマウスモデルにお
いて悪液質関連症状を予防することが示されているメラノコルチン受容体アンタゴニスト
アグーリ(agouri)関連ペプチド(AgRP(83-132))が挙げられる(Joppaらの文献(2007) PEPTI
DES 28:636-642)。
抗癌剤、特に、悪液質を引き起こし、GDF15レベルを上昇させることができる抗癌剤、
例えば、シスプラチンを、本開示の方法において、本明細書に記載される抗GFRAL抗体又
はその断片と組み合わせて使用する(例えば、それと同時に投与する、その前に投与する
、又はその後に投与する)ことができる。多くの癌患者は、そのような療法を忍容する能
力を限定し、それゆえ、投薬レジメンを制限し得る、一連の過酷な放射線療法及び/又は
化学療法によって衰弱する。フルオロウラシル、アドリアマイシン、メトトレキセート、
及びシスプラチンなどの、特定の癌作用物質はそれ自体、例えば、重度の胃腸合併症を誘
導することにより、悪液質の一因となり得る。例えば、Inuiの文献(2002) CANCER J. FOR
CLINICIANS 52:72-91を参照されたい。抗癌剤が本開示の抗GFRAL抗体と組み合わせて投
与される本開示の方法によって、悪液質の発生率及び/又は重症度を減少させ、最終的に
、そのような抗癌剤の最大忍容用量を増加させることが可能である。したがって、悪液質
を引き起こし得る抗癌剤による治療の効力は、用量を制限する有害作用としての悪液質の
発生率を低下させることにより、及びより高用量の所与の抗癌剤の投与を可能にすること
により改善することができる。
したがって、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその
断片を、アクチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤又はIL-6Rの阻害剤、グ
レリン、グレリン模倣物又はGHS-RIaアゴニスト、SARM、TNFα阻害剤、IL-Iα阻害剤、ミ
オスタチン阻害剤、ベータ-遮断薬、メラノコルチンペプチド阻害剤、メラノコルチン受
容体阻害剤、及び抗癌剤からなる群から選択される薬剤との組合せで含む医薬組成物であ
る。本開示は、哺乳動物の悪液質及び/又はサルコペニアを治療、予防、又は最小化する
方法であって、それを必要としている哺乳動物に、本開示の抗GFRAL抗体の有効量を、ア
クチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤もしくはIL-6Rの阻害剤、グレリン
、グレリン模倣物もしくはGHS-RIaアゴニスト、SARM、TNFα阻害剤、IL-Iα阻害剤、ミオ
スタチン阻害剤、ベータ-遮断薬、メラノコルチンペプチド阻害剤、又はメラノコルチン
受容体阻害剤の有効量との組合せで含む医薬組成物(1つ又は複数)を投与することを含む
、方法も含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、基礎疾患と関連する筋肉量減少を阻害
する方法であって、それを必要としている哺乳動物に、本明細書に記載される抗GFRAL抗
体又はその断片の有効量を、アクチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤も
しくはIL-6Rの阻害剤、グレリン、グレリン模倣物もしくはGHS-RIaアゴニスト、SARM、TN
Fα阻害剤、IL-Iα阻害剤、ミオスタチン阻害剤、ベータ-遮断薬、メラノコルチンペプチ
ド阻害剤、又はメラノコルチン受容体阻害剤の有効量との組合せで含む医薬組成物(1つ又
は複数)を投与して、筋肉量減少を予防又は軽減することを含む、方法である。基礎疾患
は、癌、慢性心不全、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、多発性硬化症、関節リウマ
チ、敗血症、及び結核症からなる群から選択することができる。さらに、いくつかの実施
態様において、筋肉量減少は、脂肪量減少を伴う。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、哺乳動物における不随意の体重減少を
阻害し又は低下させる方法であって、それを必要としている哺乳動物に、本開示の抗GFRA
L抗体の有効量を、アクチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤もしくはIL-6
Rの阻害剤、グレリン、グレリン模倣物もしくはGHS-RIaアゴニスト、SARM、TNFα阻害剤
、IL-Iα阻害剤、ミオスタチン阻害剤、ベータ-遮断薬、メラノコルチンペプチド阻害剤
、又はメラノコルチン受容体阻害剤の有効量との組合せで含む医薬組成物(1つ又は複数)
を投与することを含む、方法である。
特定の抗癌剤、例えば、シスプラチンは、悪液質、サルコペニア、筋消耗、骨消耗、又
は不随意の体重減少などの1以上の症状を引き起こし又は増大させることを伴う1以上の望
ましくない有害作用を有する。したがって、別の態様において、本明細書に提供されるの
は、哺乳動物における悪液質、サルコペニアもしくは筋消耗、骨消耗、又は不随意の体重
減少の発生、頻度、又は重症度を予防し、最小化し、又は低下させると同時に、癌を治療
する方法であって、それを必要としている哺乳動物に、本明細書に記載される抗GFRAL抗
体又はその断片の有効量を、1以上の抗癌剤との組合せで含む医薬組成物を投与すること
を含む、方法である。いくつかの実施態様において、哺乳動物における悪液質、サルコペ
ニアもしくは筋消耗、骨消耗、又は不随意の体重減少の発生、頻度、又は重症度を予防し
、最小化し、又は低下させると同時に、癌を治療する方法は、それを必要としている哺乳
動物に、本明細書に記載される抗GFRAL抗体又はその断片の有効量を、哺乳動物における
悪液質、サルコペニア、もしくは筋消耗、骨消耗、又は不随意の体重減少の発生、頻度、
又は重症度を引き起こし又は増大させることが知られている1以上の抗癌剤との組合せで
含む医薬組成物を投与することを含む。
(診断方法及び検出方法)
一態様において、本開示の抗GFRAL抗体及びその断片は、生体試料中のGFRALの存在を検
出するのに有用である。そのような抗GFRAL抗体には、ヒトGFRALに結合するものが含まれ
得る。本明細書で使用される「検出する」という用語は、定量的又は定性的検出を包含す
る。ある実施態様において、生体試料は、細胞又は組織を含む。
一態様において、本開示は、生体試料中のGFRALの存在を検出する方法を提供する。あ
る実施態様において、本方法は、生体試料を、抗GFRAL抗体と、GFRALに対する抗GFRAL抗
体の結合が可能な条件下で接触させること、及び複合体が抗GFRAL抗体とGFRALの間で形成
されるかどうかを検出することを含む。
一態様において、本開示は、GFRALの発現と関連する障害を診断する方法を提供する。
ある実施態様において、本方法は、試験細胞を抗GFRAL抗体と接触させること;GFRALに対
する抗GFRAL抗体の結合を検出することにより、試験細胞によるGFRALの発現のレベルを(
定量的又は定性的に)決定すること;及び試験細胞によるGFRALの発現のレベルを対照細胞(
例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞又はそのような正常細胞と同程度のレベルで
GFRALを発現する細胞)によるGFRALの発現のレベルと比較することを含み、ここで、対照
細胞と比較したときの試験細胞によるGFRALの発現のより高いレベルは、GFRALの発現の増
加と関連する障害の存在を示す。ある実施態様において、試験細胞は、GDF15の発現と関
連する疾患、障害、もしくは疾病、又はGDF15のインビボ作用を阻害することが望ましい
疾患、障害、もしくは疾病を有する疑いのある個体から得られる。ある実施態様において
、該疾患、障害、又は疾病は、例えば、不随意の体重減少である。そのような例示的な疾
患、障害、又は疾病は、本開示の抗GFRAL抗体を用いて診断することができる。
ある実施態様において、診断又は検出の方法、例えば、上記の方法は、細胞の表面に発
現された又はGFRALをその表面に発現する細胞から得られた膜調製物中のGFRALに対する抗
GFRAL抗体の結合を検出することを含む。ある実施態様において、本方法は、細胞を、抗G
FRAL抗体と、GFRALに対する抗GFRAL抗体の結合が可能な条件下で接触させること、及び複
合体が細胞表面で抗GFRAL抗体とGFRALの間で形成されるどうかを検出することを含む。細
胞の表面に発現されたGFRALに対する抗GFRAL抗体の結合を検出するための例示的なアッセ
イは、「FACS」アッセイである。
特定の他の方法を用いて、GFRALに対する抗GFRAL抗体の結合を検出することができる。
そのような方法としては、当技術分野で周知である抗原結合アッセイ、例えば、ウェスタ
ンブロット、放射免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」
免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイ、及び
免疫組織化学(IHC)が挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施態様において、抗GFRAL抗体を標識する。標識には、直接的に検出される標識
又は部分(例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性
標識)、並びに間接的に、例えば、酵素反応又は分子相互作用を介して検出される、酵素
又はリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、
放射性同位体32P、14C、125I、3H、及び131I、蛍光団、例えば、希土類キレート又はフル
オレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、
ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(例えば、米国
特許第4,737,456号を参照)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラ
ーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラク
トースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて
色素前駆体を酸化する酵素、例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキ
シダーゼと共役した複素環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダー
ゼ、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル
などが挙げられるが、これらに限定されない。
ある実施態様において、抗GFRAL抗体を不溶性マトリックス上に固定化する。固定化は
、抗GFRAL抗体を、溶液中に遊離したまま残るGFRALから分離することを必要とする。これ
は、従来通り、水不溶性のマトリックスもしくは表面への吸着によるもの(例えば、Benni
chらの文献、U.S. 3,720,760号を参照)、又は(例えば、グルタルアルデヒド架橋を用いた
)共有結合によるもののように、アッセイ手順の前に抗GFRAL抗体を不溶化するか、或いは
抗GFRAL抗体とGFRALの複合体の形成後に、例えば、免疫沈降によって、抗GFRAL抗体を不
溶化するかのいずれかによって達成される。
診断又は検出の上記の実施態様はいずれも、抗GFRAL抗体の代わりに又はそれに加えて
、本開示の免疫コンジュゲートを用いて実施することができる。
(アッセイ)
本開示の抗GFRAL抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、その物理的/化
学的特性及び/又は生物活性について特徴付けることができる。
(1.活性アッセイ)
一態様において、生物活性を有するその抗GFRAL抗体を同定するためのアッセイが提供
される。生物活性には、例えば、グルコース及び/又は脂質代謝に対する効果を測定する
アッセイが含まれ得る。例えば、血液グルコースアッセイを使用することができる。血液
グルコース(例えば、マウス尻尾小片中又はヒト血液試料中)を、製造元の指示に従って、
ACCU-CHEK Activeメーター(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)によって読み取られ
るACCU-CHEK Active試験ストリップを用いて測定することができる。さらに、例えば、脂
質プロファイルアッセイを使用することができる。全血(例えば、マウス尻尾小片由来又
はヒト血液試料由来)を無地キャピラリーチューブ(BD Clay Adams SurePrep, Becton Dic
kenson and Co. Sparks, MD)に回収することができる。このチューブをAutocrit Ultra 3
(Becton Dickinson and Co. Sparks, MD)中でスピンすることによって、血清及び血液細
胞を分離することができる。血清試料を、製造元の指示に従ってIntegra 400 Clinical A
nalyzer(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を用いて、脂質プロファイル(トリグリ
セリド、総コレステロール、HDL、及び非HDL)についてアッセイすることができる。
(2.結合アッセイ及び他のアッセイ)
一態様において、抗GFRAL抗体を、その抗原結合活性について試験する。例えば、ある
実施態様において、抗GFRAL抗体を、細胞の表面に発現される外因性又は内在性GFRALに結
合するその能力について試験する。FACSアッセイをそのような試験に使用することができ
る。
GFRALに対して惹起されたモノクローナル抗体のパネルを、それらが認識するエピトー
プに基づいてグループ分けすることができ、この過程は、エピトープビニングとして知ら
れる。エピトープビニングは、通常、抗体が別の抗体の存在下で抗原と結合する能力を評
価する競合アッセイを用いて実施される。例示的な競合アッセイでは、固定化されたGFRA
Lを、GFRALに結合する第1の標識抗体と、GFRALに対する結合を該第1の抗体と競合するそ
の能力について試験されている第2の非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートする。
第2の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化されたGFRAL
を、第1の標識抗体を含むが、第2の未標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。
GFRALに対する第1の抗体の結合が可能な条件下でのインキュベーションの後に、過剰の未
結合抗体を除去し、固定化されたGFRALと関連する標識の量を測定する。固定化されたGFR
ALと関連する標識の量が対照試料と比べて試験試料中で実質的に低下している場合、その
ことは、第2の抗体がGFRALに対する結合を第1の抗体と競合していることを示す。ある実
施態様において、固定化されたGFRALは、細胞の表面に存在するか又はGFRALをその表面に
発現する細胞から得られた膜調製物中に存在する。
ハイスループットなエピトープビニングの方法も当技術分野で公知である(例えば、モ
ノクローナル抗体の特徴付けのための多重化競合抗体ビニングの方法を記載している、Ji
aらの文献、J. Immunol. Methods 2004, 288(1-2):91-98;及び多重化対形成アッセイによ
るマウスモノクローナル抗体のエピトープビニングを記載している、Millerらの文献、J.
Immunol. Methods 2011, 365(1-2):118-25を参照)。
(3.エピトープマッピング)
エピトープマッピングは、その標的タンパク質抗原上の抗体の結合部位、すなわち、エ
ピトープ(例えば、GFRAL上の抗GFRAL抗体のエピトープ)を同定するプロセスである。抗体
エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープであり得る。線状エピトープは、
タンパク質中のアミノ酸の連続配列によって形成される。立体構造エピトープは、タンパ
ク質配列中では不連続であるが、タンパク質がその3次元構造へとフォールディングした
ときに寄せ集められるアミノ酸から形成される。
標的タンパク質抗原上の抗体エピトープのマッピングのための様々な方法が当技術分野
で公知である。これらには、突然変異誘発法、ペプチドスキャニング法、ディスプレイ法
、質量分析及び構造決定を伴う方法が含まれる。
部位特異的突然変異誘発法は、タンパク質配列に沿って系統的に置換を導入し、その後
、抗体結合に対する各々の置換の効果を決定することによって決定的に重要なアミノ酸を
同定する、標的化部位特異的突然変異誘発を含む。これは、例えば、Cunningham及びWell
sら(1989) Science 244: 1081-1085によって記載された「アラニンスキャニング突然変異
誘発」、又はヒトGFRAL中のアミノ酸残基の何らかの他の形態の点突然変異誘発によって
行うことができる。しかしながら、突然変異誘発試験では、GFRALの全体的な3次元構造に
は極めて重要であるが、抗体-抗原接触に直接的には関与しないアミノ酸残基が明らかに
なることもあり、したがって、この方法を用いて決定された機能的エピトープを確認する
ために、他の方法が必要となる場合もある。
ショットガン突然変異誘発マッピングでは、標的遺伝子についての包括的プラスミド-
突然変異ライブラリーが利用され、該ライブラリー中の各々のクローンは、特有のアミノ
酸突然変異を有し、ライブラリー全体は、標的タンパク質中のあらゆるアミノ酸を網羅す
る。該突然変異ライブラリーを構成するクローンをマイクロプレートに個々に配置し、生
きた哺乳動物細胞内で発現させて、対象となる抗体との免疫反応性について試験する。抗
体エピトープにとって決定的に重要なアミノ酸を反応性の消失によって同定し、その後、
それをタンパク質構造上にマッピングして、エピトープを視覚化する。この解析を自動化
することにより、数日から数週間以内に新たなエピトープマップを導き出すことができる
。これは、哺乳動物細胞内のタンパク質のネイティブ構造を使用するので、この技法によ
り、線状エピトープ構造と立体構造エピトープ構造の両方を複合タンパク質上にマッピン
グすることが可能になる(例えば、Paesらの文献、J. Am. Chem. Soc. 131(20): 6952-695
4(2009); Banik及びDoranzの文献、Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2):
25-28(2010)を参照)。
抗GFRAL抗体によって結合されるエピトープを、ペプチドスキャニング法を用いて決定
することもできる。ペプチドスキャニングでは、標的タンパク質であるGFRALの重複する
セグメントに由来する短いペプチド配列のライブラリーを、対象となる抗体に結合するそ
の能力について試験する。ペプチドを合成し、「pepscan」法(例えば、WO 84/03564号; W
O 93/09872号を参照)と同様に、複数の固相スクリーニング法のうちのいずれかによって
、例えば、ELISAもしくはBIACOREを用いて、又はチップ上で、結合についてスクリーニン
グする(例えば、Reinekeらの文献、Curr. Opin. Biotechnol. 12: 59-64, 2001を参照)。
そのようなペプチドスクリーニング法は、いくつかの不連続な機能的エピトープ、すなわ
ち、GFRALポリペプチド鎖の1次配列に沿って連続しているのではないアミノ酸残基を含む
機能的エピトープを検出することができない可能性がある。
CLIPS(スキャフォールド上へのペプチドの化学結合)と呼ばれる最近開発された技術を
用いて、立体構造エピトープをマッピングすることができる。ペプチドの遊離末端を、ス
キャフォールド化されたペプチドが無傷タンパク質中の対応する配列と同じ空間構造を取
り得るように、合成スキャフォールド上に取り付ける。抗体結合についてアッセイし得る
立体構造エピトープを生成させるために、CLIPS技術を用いて、線状ペプチドを固定して
環状構造にし(「単一ループ」形式)、タンパク質結合部位の様々な部分を寄せ集める(「
二重ループ」形式、「三重ループ」形式など)(例えば、米国特許第7,972,993号を参照)。
本開示の抗GFRAL抗体によって結合されるエピトープを、例えば、上記のようなファー
ジディスプレイ、微生物ディスプレイ、及びリボソーム/mRNAディスプレイを含むディス
プレイ法を用いてマッピングすることもできる。これらの方法では、ペプチド断片のライ
ブラリーをファージ又は細胞の表面に提示させる。その後、選択的結合アッセイを用いて
これらの断片に対する抗体をスクリーニングすることにより、エピトープをマッピングす
る。ファージディスプレイを用いて得られる線状の親和性選択ペプチドに基づく立体構造
エピトープの予測を可能にするいくつかの計算ツールが開発されている(例えば、Mayrose
らの文献、Bioinformatics 23: 3244-3246, 2007を参照)。ファージディスプレイによる
立体構造エピトープの検出のための方法も利用可能である。立体構造エピトープの同定の
ために、微生物ディスプレイシステムを用いて、適切にフォールディングされた抗原性断
片を細胞表面上に発現させることもできる(例えば、Cochranらの文献、J. Immunol. Meth
. 287: 147-158, 2004; Rockbergらの文献、Nature Methods 5: 1039-1045, 2008を参照)
。
タンパク質分解及び質量分析を伴う方法を用いて、抗体エピトープを決定することもで
きる(例えば、Baerga-Ortizらの文献、Protein Sci. 2002 June; 11(6): 1300-1308を参
照)。限定的なタンパク質分解では、抗原を抗体の存在下及び非存在下で様々なプロテア
ーゼによって切断し、断片を質量分析によって同定する。エピトープは、抗体結合時にタ
ンパク質分解から保護されるようになる抗原の領域である(例えば、Suckauらの文献、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 87:9848-9852, 1990を参照)。タンパク質分解に基づくさらな
る方法としては、例えば、選択的化学修飾(例えば、Fiedlerらの文献、Bioconjugate Che
mistry 1998, 9(2): 236-234, 1998を参照)、エピトープ切除(例えば、Van de Waterらの
文献、Clin. Immunol. Immunopathol. 1997, 85(3): 229-235, 1997を参照)、及び最近開
発された水素-重水素(H/D)交換法(例えば、Flanagan, N.の文献、Genetic Engineering a
nd Biotechnology News 3(2): 25-28, 2010を参照)が挙げられる。
本開示の抗GFRAL抗体によって結合されるエピトープを、X線結晶構造決定(例えば、WO
2005/044853号を参照)、分子モデリング、及び核磁気共鳴(NMR)分光法などの構造的方法
によって決定することもでき、これには、遊離している場合及び対象となる抗体との複合
体中で結合している場合の不安定なアミド水素のH-D交換率のNMRによる決定が含まれる(
例えば、Zinn-Justinらの文献(1992) Biochemistry 31:11335-11347; Zinn-Justinらの文
献(1993) Biochemistry 32:6884-6891を参照)。
本開示の抗GFRAL抗体と同じエピトープに結合するさらなる抗体は、例えば、エピトー
プに対する結合についてGFRALに対して惹起された抗体をスクリーニングすることによる
か、エピトープ配列を含むヒトGFRALの断片を含むペプチドで動物を免疫することによる
か、又はエピトープ配列に対する結合についてファージディスプレイを用いて抗体を選択
することにより得ることができる。同じ機能的エピトープに結合する抗体は、GFRALの生
物活性の遮断などの、類似の生物活性を示すと考えてもよく、そのような活性は抗体の機
能アッセイによって確認することができる。
(4.さらなる活性アッセイ)
一実施態様において、本開示の抗GFRAL抗体は、GFRALの生物活性を阻害する拮抗性抗体
である。本開示の抗GFRAL抗体をアッセイして、それらがGFRALの生物活性を阻害するかど
うかを決定することができる。
一態様において、精製された抗GFRAL抗体を、限定されないが、N末端シークエンシング
、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオ
ン交換クロマトグラフィー、及びパパイン消化を含む、一連のアッセイによってさらに特
徴付けることができる。
一実施態様において、本開示は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を保有す
る改変された抗体を想定しており、該エフェクター機能によって、該抗体は、抗体のイン
ビボでの半減期は重要であるが、特定のエフェクター機能(例えば、補体及びADCC)は不必
要又は有害である多くの用途にとって望ましい候補になる。ある実施態様において、所望
の特性だけが維持されていることを保証するために、抗体のFc活性を測定する。CDC及び/
又はADCC活性の低下/枯渇を確認するために、インビトロ及び/又はインビボの細胞傷害性
アッセイを実施することができる。例えば、抗体がFcγR結合を欠く(それゆえ、ADCC活性
を欠く可能性が高い)が、FcRn結合能を保持することを保証するために、Fc受容体(FcR)結
合アッセイを実施することができる。対象となる分子のADCC活性を評価するためのインビ
トロアッセイは、例えば、米国特許第5,500,362号又は第5,821,337号に記載されている。
そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)及びナ
チュラルキラー(NK)細胞が含まれる。代わりに、又はさらに、対象となる分子のADCC活性
を、インビボで、例えば、動物モデル、例えば、Clynesらの文献、PNAS(USA) 95:652-656
(1998)に開示されている動物モデルで評価することができる。抗体がC1qに結合すること
ができず、それゆえ、CDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイを実施する
こともできる。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoroらの文献、J. Im
munol. Methods 202: 163(1996)に記載されているようなCDCアッセイを実施することがで
きる。FcRn結合及びインビボクリアランス/半減期の決定を、当技術分野で公知の方法を
用いて実施することもできる。
前述の本開示は、理解しやすいように例証及び例によってある程度詳細に説明されてい
るが、この説明及び例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、引用によりその全体が明示的に
組み込まれる。
(実施例)
以下は、本開示の方法及び組成物の実施例である。
(実施例1:抗体の作製)
GFRALタンパク質に対する抗体を、例えば、GFRALタンパク質を発現しているか、RETタ
ンパク質及びGFRALタンパク質を共発現しているか、又はRETタンパク質及びGFRALタンパ
ク質を共発現する細胞上にGDF15タンパク質を架橋している細胞によるマウスの免疫によ
って作製した。マウスを、GFRAL ECD、GDF15:GFRAL ECD複合体、及び/又はGFRAL ECD Fc
融合体:RET ECD Fc融合体によっても免疫した。
例えば、免疫に使用される細胞を次のように調製した。293EXPI(Invitrogen)細胞を、G
FRALタンパク質(配列番号1797)をコードする核酸配列で一過性にトランスフェクトするか
、又はGFRALタンパク質及びRETタンパク質(配列番号1797及び1813)をコードする核酸配列
で共トランスフェクトした。細胞を、GFRAL及びRETの発現について、それぞれの特異的抗
体によってFACSにより解析した。細胞をPBS中で2回洗浄し、遠心分離によりペレット化し
、膜調製物を作製した。129/B6又はNZBW動物をアジュバントとともに膜調製物で免疫した
。好適な力価を誘導するために、動物を追加免疫した。力価をELISA及び/又はFACSにより
決定した。リンパ球の単一細胞懸濁液を動物の脾臓及び流入領域リンパ節から好適な力価
で得た。細胞をSP2/0骨髄腫細胞と1:12の比で電気融合により融合させた。融合した細胞
を、HAT選択の存在下、プレートにプレーティングした。10～14日間培養した後、上清を
回収し、GFRALもしくはGFRAL及びRETを過剰発現する293EXPI細胞を用いたCellnSightによ
る細胞イメージングによるか又はGFRAL-Fcタンパク質もしくはRET及びGFRAL Fc-ヘテロ二
量体を用いたELISAによるスクリーニングに供して、結合を確認した。陽性クローンをさ
らに選択し、サブクローニングに供した。
複数回の免疫及び融合キャンペーンにおいて、10万個を超えるハイブリドーマクローン
をスクリーニングし、2000個を上回るクローンを、GDF15結合、細胞ベースのGDF15誘導性
シグナル伝達、及び細胞ベースのGDF15非依存的シグナル伝達について選択した。数百個
のクローン(例えば、250個)を、結合親和性、ドメインマッピング、及びエピトープ特異
性のアッセイを含む、さらなる試験のために選択した。数千のハイブリドーマ上清を、ア
ンタゴニスト及びアゴニスト活性アッセイを含む、機能アッセイでも試験した。数百個の
クローンをさらなる試験のために純化した。
(実施例2:抗体のスクリーニング及び選択)
培養から2週間後、ハイブリドーマ上清を、GFRALもしくはGFRAL及びRETを過剰発現する
293EXPI細胞を用いたCellnSightによる細胞イメージングによるか又はGFRAL-Fcタンパク
質もしくはRET及びGFRAL Fc-ヘテロ二量体を用いたELISAによって、GFRALタンパク質に対
するモノクローナル抗体の結合についてスクリーニングした。簡潔に説明すると、細胞イ
メージングによるスクリーニングのために、293EXPI細胞を、GFRALをコードする核酸配列
で一過性にトランスフェクトするか、又はGFRAL及びRETをコードする核酸配列で共トラン
スフェクトした。トランスフェクトされた細胞を透明底の384ウェルプレートにプレーテ
ィングした。トランスフェクションから24時間後に培地を交換した。48時間で、培地をプ
レートから吸引除去し、ハイブリドーマ上清をウェルに添加し、室温で30分間インキュベ
ートした。その後、A647抗マウスFcをウェルに添加し、室温でもう30分間インキュベート
した。Dapi陽性細胞をA647チャンネルのシグナルについて解析した。陽性のA647シグナル
はGFRAL結合物質を示す。
簡潔に説明すると、ELISAによるスクリーニングのために、GFRAL-Fcタンパク質又はRET
及びGFRAL Fc-ヘテロ二量体をELISAプレートにコーティングした抗ヒトFc試薬によって捕
捉した。プレートをPBS/1％BSAを用いてブロッキングした。15μLのハイブリドーマ上清
をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、15μLのHRP-抗マ
ウスFc二次抗体をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、15
μLのTMBを用いて、プレートを顕色させた。陽性のシグナルは、GFRAL結合物質を示す。
これらのアッセイから、数千個の抗体をGFRALに対する結合物質として同定した。これ
らの抗体を、結合親和性、ドメインマッピング、エピトープ特異性、並びにアゴニスト及
びアンタゴニスト機能についてのアッセイを含む、さらなる試験に供した。数百個の抗体
をさらなる試験のために純化した。
さらに、ヒト及びマウスGFRALに対する抗体の結合親和性を測定した。例えば、抗体を
、Biacoreによる低分解能KD測定によって、ヒトGFRAL及びマウスGFRALに対するその結合
親和性に基づいて順位を序列化した。簡潔に説明すると、抗マウスFc抗体(Sigma-Aldrich
, St. Louis, MO)を、アミンカップリング試薬(GE Healthcare LifeSciences, Piscatawa
y, NJ)を用いて、CM5チップの4つ全てのフローセル上に固定化した。精製抗体を、フロー
セル1を参照として用いて、フローセル2、3、及び4上で捕捉した(～100RU)。この後、ヒ
ト又はマウスGFRAL(PBS-Pバッファー中、25nM)を70μL/分の流量で注入し、25℃での結合
反応速度をモニタリングした。
結合親和性測定をさらなるBiacoreベースのアッセイでも行った。例えば、平衡解離定
数(KD)測定を精製抗体を用いて実施し、ヒトGFRAL又はマウスGFRALに対するその結合を評
価した。上述の通り、抗マウスFc抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を、アミンカップ
リング試薬(GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ)を用いて、CM5チップの4つ全
てのフローセル上に固定化した。精製抗体を、フローセル1を参照として用いて、フロー
セル2、3、及び4上で捕捉した(～100RU)。この後、PBS-Pバッファー中のヒト又はマウスG
FRALを70μL/分の流量で注入し、結合反応速度を25℃で評価した。
ヒト及びマウスGFRALに対する結合親和性(例えば、KD(nM))の代表的な結果は、下の表2
6に示されている。さらに、例示的な抗体について、結合の解離速度(例えば、Koff(1/s))
の代表的な結果は、下の表26に示されている。
表26.
Figure 2022088355000105
 NA＝適用されない; ND＝結合は検出されない
例示的な抗体1C1及び3P10について、親和性は、極めて遅い解離速度によって主に誘発
される(例えば、図3参照)。上の表26に示されているGFRALに結合する抗体は、GFRALの最
も密接に関連するホモログであるGNFRα1を認識しない(例えば、それに結合しない)。
(実施例3:機能アッセイ)
作製されたGFRALに対する抗体、例えば、実施例1に記載されている抗体などを、その機
能活性について、細胞ベースのレポーターアッセイで試験した。
例えば、ヒトGDF15(hGDF15)誘導性ヒトGFRAL/RETシグナル伝達を測定するELK1-ルシフ
ェラーゼレポーターアッセイを、一過性にトランスフェクトされたHEK293を用いて実施し
た。トランスフェクトするプラスミドは、2つのレポータープラスミドGal4-Elk1及び5×U
AS-Luc(Agilent Technologies PathDetect Elk1トランス-レポーティングシステムCat# 2
19005)、並びにヒトGFRAL(hGFRAL)、カニクイザルGFRAL(cynoGFRAL)、マウスGFRAL(mGFRA
L)、又はラットGFRAL(rGFRAL)、及びヒトRET(hRET)、カニクイザルRET(cynoRET)、マウス
RET(mRET)、又はラットRET(rRET)をコードするプラスミドからなっていた。これらのアッ
セイでは、細胞における組換え発現GFRAL/RET受容体複合体のhGDF15誘導性活性化が細胞
内シグナル伝達を誘発し、それにより、ERK、次いで、Elk1のリン酸化が引き起こされる
。ひとたびGal4-Elk1がリン酸化されると、Gal4-Elk1は、5×UASプロモーター領域に結合
し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子転写をオンにする。その後、ルシフェラーゼの活性
をルシフェラーゼ酵素アッセイで測定する。
ヒトGFRAL/RETシグナル伝達を阻害するGFRALに対する抗体の代表的な結果を下の表27に
示す。
表27
Figure 2022088355000106
 ND＝アッセイで遮断は検出されなかった
NP＝アッセイは実施されなかった
WB＝アッセイで弱い遮断が検出された
いくつかの実験については、上述の4つのプラスミド(例えば、2つのレポータープラス
ミド、GFRAL、RET)を、FuGene6トランスフェクション試薬(Promega)を用いて、新たに採
取された懸濁状態の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション時のGFRALとRET
のDNA比を、表示された種由来の各々の受容体対について最適化し、この比は、12:1～60:
1と様々であった。トランスフェクトされた細胞を通常の成長培地に入れて384ウェルプレ
ートに播種した(7500細胞/25μL/ウェル)。37℃で一晩インキュベートした後、連続希釈
した抗体と一定濃度のhGDF15の混合物を添加した。抗体とともに37℃で6時間インキュベ
ートした後、等量のBright-Glo試薬(Promega)を添加し、Enspireリーダー(Perkin Elmer)
を用いて、発光シグナルを読み取った。
hGDF15作用に拮抗する抗体の同時添加は、hGDF15シグナル伝達を用量依存的に遮断し、
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を妨げた。
(実施例4:さらなる機能アッセイ)
抗hGFRAL抗体を、そのhGDF15拮抗活性について、さらなる細胞ベースのアッセイ、例え
ば、hGFRAL及びhRETを安定発現するU2OSアッセイで試験した。アッセイの1日前に、細胞
を、90μlのDiscoveRxアッセイ完全細胞プレーティング16試薬(DiscoveRx, Cat#93-0563R
16B)中に96ウェルプレートの各々につき20Kでプレーティングした。翌日、細胞を、連続
希釈した抗体と一定濃度のhGDF15の混合物で、37℃で10分間処理した。Cis-bio Cellul'e
rkアッセイキット(Cat# 64ERKPEH)を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ERKリン酸
化レベルについてアッセイした。Hek293T Elk1レポーターアッセイと同様に、hGDF15拮抗
抗体は、hGDF15誘導性リン酸化を用量依存的に妨げることができた。
hGDF15誘導性リン酸化を妨げるGFRALに対する抗体の代表的な結果は、下の表28に示さ
れている。
表28
Figure 2022088355000107
 NP＝アッセイは実施されなかった
(実施例5:リガンド競合、ドメインマッピング、及びエピトープビニング)
GFRALに対する結合について選択された抗体を、リガンド競合結合アッセイ、ドメイン
及びエピトープビニング実験で評価した。
簡潔に説明すると、リガンド競合結合アッセイは、GFRAL-Fcタンパク質又はRET及びGFR
AL Fc-ヘテロ二量体を抗ヒトFcによってELISAプレート上に捕捉することにより実施した
。プレートをPBS/1％BSAを用いてブロッキングした。15μLの用量漸増抗体を10μg/mLか
ら始めて3倍希釈でウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。洗浄することな
く、ビオチン化GDF15(GFRALリガンド)をウェルにもう1時間添加した。3回の洗浄の後、15
μLの二次HRP-ストレプトアビジンをウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。
3回の洗浄の後、15μLのTMBを用いて、プレートを顕色させた。陽性シグナルは、ビオチ
ン化GDF15がプレート上に捕捉されたGFRALに依然として結合し、該抗体がリガンド競合因
子ではないことを示している。陰性シグナルは、ビオチン化GDF15がプレート上に捕捉さ
れたGFRALにもはや結合せず、該抗体がリガンド競合因子であることを示している。
簡潔に説明すると、ドメインマッピングアッセイは、293EXPI細胞を、GFRAL(配列、GFR
ALドメイン1、GFRALドメイン2、GFRALドメイン1＋2、GFRALドメイン1＋3、GFRALドメイン
2＋3、又はGFRALドメイン3)をコードする核酸配列で一過性にトランスフェクトすること
により実施した。
以下の特色をN-末端からC-末端へと連続的に含む、7つのGFRAL欠失コンストラクト(コ
ンストラクト1～7)を試験した: IgKシグナル配列(下記配列において小文字かつ下線付き
の文字によって示されている)、FLAGタグ配列(下記配列において小文字かつイタリック体
の文字によって示されている)、及び様々な細胞外ドメイン組合せを有するGFRALタンパク
質配列(太字の大文字で示されているドメイン1;下線付きの大文字で示されているドメイ
ン2;太字かつ下線付きの文字で示されているドメイン3)。コンストラクト1(IgK-2Flag-GF
RAL;配列番号1817)は、ドメイン1、2、及び3が存在するヒトGDF15ポリペプチド(残基Q20
～L394)を含有していた。コンストラクト2(IgK-2Flag-GFRALドメイン1;配列番号1818)は
、ドメイン2及び3が欠失しているGFRAL-ΔD2、ΔD3(残基Q20～S130及びF317～L394)を含
有していた。コンストラクト3(IgK-2Flag-GFRALドメイン2;配列番号1819)は、ドメイン1
及び3が欠失しているGFRAL-ΔD1、ΔD3(残基S121～C210及びF317～L394)を含有していた
。コンストラクト4(IgK-2Flag-GFRALドメイン1＋2;配列番号1820)は、ドメイン3が欠失し
ているGFRAL-ΔD3(残基Q20～C210及びF317～L394)を含有していた。コンストラクト5(IgK
-2Flag-GFRALドメイン1＋3;配列番号1821)は、ドメイン2が欠失しているGFRAL-ΔD2(残基
Q20～S130及びC220～L394)を含有していた。コンストラクト6(IgK-2Flag-GFRALドメイン2
＋3;配列番号1822)は、ドメイン1が欠失しているGFRAL-ΔD1(残基S121～L394)を含有して
いた。コンストラクト7(IgK-2Flag-GFRALドメイン3;配列番号1823)は、ドメイン2及び3が
欠失しているGFRAL-ΔD1、ΔD2(残基A211～L394)を含有していた。
コンストラクト1(IgK-2Flag-GFRAL;配列番号1817)
Figure 2022088355000108
コンストラクト2(IgK-2Flag-GFRALドメイン1;配列番号1818)
Figure 2022088355000109
コンストラクト3(IgK-2Flag-GFRALドメイン2;配列番号1819)
Figure 2022088355000110
コンストラクト4(IgK-2Flag-GFRALドメイン1＋2;配列番号1820)
Figure 2022088355000111
コンストラクト5(IgK-2Flag-GFRALドメイン1＋3;配列番号1821)
Figure 2022088355000112
コンストラクト6(IgK-2Flag-GFRALドメイン2＋3;配列番号1822)
Figure 2022088355000113
コンストラクト7(IgK-2Flag-GFRALドメイン3;配列番号1823)
Figure 2022088355000114
細胞を1μg/mLの抗体とともに4℃で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞をA488又
はA647のいずれかの蛍光色素で標識された抗マウスFc二次抗体とともに4℃で30分間イン
キュベートした。洗浄後、細胞をFACsにより解析した。陽性シグナルは、該抗体がトラン
スフェクトされた293EXPI細胞によって過剰発現されるドメインに結合することを示して
いる。陰性シグナルは、該抗体がトランスフェクトされた293EXPI細胞によって過剰発現
されるドメインに結合しないことを示している。
簡潔に説明すると、エピトープビニングアッセイは、プレートを2ug/mLの抗体(mAb1)で
直接コーティングすることにより実施した。プレートをPBS/1％BSAを用いてブロッキング
した。2μg/mLの抗体(mAb2)を50ng/mLのGFRAL-Fcタンパク質とともに30分間プレインキュ
ベートした後、ウェルに室温で1時間添加した。3回の洗浄の後、15μLのHRP-抗ヒトFc二
次抗体をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。3回の洗浄の後、15μLのTMB
を用いて、プレートを顕色させた。陽性シグナルは、GFRAL-Fcタンパク質がプレート上に
捕捉された抗体(mAb1)に依然として結合し、抗体(mAb2)が捕捉された抗体(mAb1)と同じエ
ピトープビンに存在しないことを示している。陰性シグナルは、GFRAL-Fcタンパク質がプ
レート上に捕捉された抗体(mAb1)にもはや結合せず、抗体(mAb2)が捕捉された抗体(mAb1)
と同じエピトープビンに属することを示している。
GFRALに対するGDF15結合の阻害、GFRALのドメインマッピング、及びエピトープビニン
グの代表的な結果を下の表29に示す。
表29
Figure 2022088355000115
 NA＝適用されない; ND＝結合は検出されない
上の表29に示されているように、GDF15結合を遮断する抗体(例えば、競合的アンタゴニ
スト)、GDF15結合を遮断しない抗体(例えば、非競合的アンタゴニスト)、及びGDF15結合
の部分的ブロッカーを含む、少なくとも3つのクラスの抗GFRAL抗体を同定した。抗体をGF
RALのドメイン1、ドメイン2、又はドメイン3に対する結合としても同定した。ドメイン2
に結合する抗体は、GFRALに対するGDF15結合を阻害するか、又はこの結合を少なくとも部
分的に阻害することが分かった。ドメイン1又は3に結合する抗体は、GFRALに対するGDF15
結合を阻害しなかった。
実施例2～4でアッセイされた、上記の例示的な抗GFRAL抗体のアラインメントは、図4A
～4Bに示されている。
ドメイン1、ドメイン2、又はドメイン3に結合することが分かった抗体のVH及びVLドメ
インのアラインメントは、それぞれ、図5A～5Fに示されている。
(実施例6:ヒト化)
実施例1～5に記載されている選択された抗体由来のものを含む、ヒト化抗GFRAL抗体を
作製した。例えば、1C1と表記された抗体のCDR(例えば、表1を参照)、25M22と表記された
抗体のCDR(例えば、表8を参照)、17J16と表記された抗体のCDR(例えば、表7を参照)、5F1
2と表記された抗体のCDR(例えば、表4を参照)、及び3P10と表記された抗体のCDR(例えば
、表2を参照)を含む、表1～24からの1以上のCDRを含む、例示的なヒト化抗体を作製する
。例示的なヒト化抗体1C1、25M22、17J16、5F12、及び3P10のVH及びVL領域の配列は、図6
A～6B、7A～7B、8A～8B、9A～9B、及び10A～10Bに示されている。
いくつかの抗GFRAL抗体を、シークエンシング用に、その後、ヒト化用に選択した。NCB
I免疫グロブリン(Ig)配列blastp検索を行って、マウスVH及びVL配列と顕著な類似性を有
するヒト生殖系列配列を同定した。潜在的なヒトフレームワーク配列の例は、表30に示さ
れている。配列類似性、生物物理学的特性、及び潜在的免疫原性を考慮して、IGH及びIGK
の生殖系列配列をヒトフレームワーク配列として選択した。選択された生殖系列配列は、
表30中、太字で強調されている。最も良好に一致するフレームワーク4配列を同定するた
めに、同様のアプローチをJH及びJK生殖系列配列の選択に採用した。これらの選択された
配列も、表30中、太字で強調されている。
表30
Figure 2022088355000116
Figure 2022088355000117
次に、マウス抗体のCDR配列をヒトIGH及びIGKの対応する位置に移転し(例えば、移植し
)、フレームワーク4に対応するJ-領域残基を付加した。得られたタンパク質配列をDNA配
列に翻訳し直し、哺乳動物細胞での発現用にコドンを最適化し、合成した(GeneArt/LifeT
echnologies)。その後、合成されたDNA断片を、In-Fusion技術(Clontech)を用いて、pTT5
ベクター(NRC Biotechnology Research Institute)にクローニングし、Kozak配列、hIgK
シグナルペプチド、続いて、所望の抗体のヒト化可変領域＋該抗体の定常領域(hIgG1/hIg
K)を含む発現可能なコンストラクトを作出した。同時に、結合親和性を保持するために、
フレームワーク領域中の個々の残基を、マウス残基に復帰突然変異するように選択した。
バーニアゾーン残基を特別に考慮した。そのような変異体を部位特異的突然変異誘発(Qui
ckChange, Agilent)又はデノボDNA合成のいずれかによって作出した。その後、そのよう
な発現コンストラクトをExpi293細胞(Thermo Fischer)での一過性タンパク質発現のため
に使用し、選択された抗体を組織培養上清から精製し、結合親和性について試験した。結
合親和性及び必要な復帰突然変異の最小数について最適化するために、通常、2回目のコ
ンストラクト設計を行い、その後、抗体の発現、精製、及び結合親和性の測定を行った。
例示的なヒト化抗GFRAL抗体としては:配列番号1982であるVH(HC-344e)及び配列番号199
7であるVL(LC-344h);配列番号1978であるVH(HC-344a)及び配列番号1992であるVL(LC-344c
);配列番号1978であるVH(HC-344a)及び配列番号1997であるVL(LC-344h);配列番号1985で
あるVH(HC-344h)及び配列番号1997であるVL(LC-344h);配列番号1961であるVH(HC-375d)及
び配列番号1976であるVL(LC-375j);配列番号1962であるVH(HC-375e)及び配列番号1976で
あるVL(LC-375j);配列番号1964であるVH(HC-375g)及び配列番号1967であるVL(LC-375a);
又は配列番号1964であるVH(HC-375g)及び配列番号1976であるVL(LC-375j)を含む抗体が挙
げられる。
(実施例7:ヒト化抗体の選択)
実施例6で同定された例示的なヒト化抗GFRAL抗体をヒトGFRALに対するその結合親和性
についてアッセイした。結合親和性測定をBiacoreベースのアッセイで行った。例えば、
平衡解離定数(KD)測定を精製抗体を用いて実施し、ヒトGFRALに対するその結合を評価し
た。実施例IIに記載されている方法を用いて、抗マウスFc抗体(Sigma-Aldrich, St. Loui
s, MO)を、アミンカップリング試薬(GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ)を用
いて、CM5チップの4つ全てのフローセル上に固定化した。精製ヒト化抗GFRAL抗体を、フ
ローセル1を参照として用いて、フローセル2、3、及び4に捕捉した(～100RU)。この後、P
BS-Pバッファー中のヒトGFRALを70μL分の流速で注入し、結合反応速度を25℃で評価した
。
ヒトGFRALに対する例示的なヒト化抗GFRAL抗体(例えば、ヒト化3P10及びヒト化5F12)の
結合親和性(例えば、KD(nM))の代表的な結果は、下の表31及び32に示されている。
表31
Figure 2022088355000118
 表32
Figure 2022088355000119
(実施例8:ヒト化抗体の機能アッセイ)
実施例6及び7に記載されている例示的なヒト化抗GFRAL抗体を、その機能活性について
、実施例3に記載されているものと同様の細胞ベースのレポーターアッセイで試験した。
例えば、ヒトGDF15(hGDF15)誘導性ヒトGFRAL/RETシグナル伝達を測定するELK1-ルシフ
ェラーゼレポーターアッセイを、トランスフェクトされたU20S及びHEK293Tを用いて実施
した。トランスフェクトするプラスミドは、2つのレポータープラスミドGal4-Elk1及び5
×UAS-Luc(Agilent Technologies PathDetect Elk1 trans-レポーティングシステムCat#
219005)、並びにヒトGFRAL(hGFRAL及びヒトRET(hRET)をコードするプラスミドからなって
いた。これらのアッセイにおいて、細胞内での組換え発現されたGFRAL/RET受容体複合体
のhGDF15誘導性活性化は、細胞内シグナル伝達を誘発し、これにより、ERK、その後、Elk
1のリン酸化がもたらされる。ひとたびGal4-Elk1がリン酸化されると、Gal4-Elk1は、5×
UASプロモーター領域に結合し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子転写をオンにする。そ
の後、ルシフェラーゼの活性をルシフェラーゼ酵素アッセイで測定する。
ヒトGFRAL/RETシグナル伝達を阻害するGFRALに対する例示的なヒト化抗体(例えば、3P1
0及び5F12)の代表的な結果は、下の表33及び34並びに図11に示されている。
表33
Figure 2022088355000120
 表34
Figure 2022088355000121
いくつかの実験については、上述の4つのプラスミド(例えば、2つのレポータープラス
ミド、GFRAL、RET)を、FuGene6トランスフェクション試薬(Promega)を用いて、新たに回
収された懸濁状態の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション時のGFRALとRET
のDNA比を、表示された種由来の各々の受容体対について最適化し、この比は、12:1～60:
1と様々であった。トランスフェクトされた細胞を通常の成長培地に入れて384ウェルプレ
ートに播種した(7500細胞/25μL/ウェル)。37℃で一晩インキュベートした後、連続希釈
した抗体と一定濃度のhGDF15の混合物を添加した。抗体とともに37℃で6時間インキュベ
ートした後、等量のBright-Glo試薬(Promega)を添加し、Enspireリーダー(Perkin Elmer)
を用いて、発光シグナルを読み取った。
hGDF15作用に拮抗するヒト化抗GFRAL抗体の同時添加は、hGDF15シグナル伝達を用量依
存的に遮断し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を妨げた。
(実施例9:ヒト化抗体のさらなる機能アッセイ)
例示的なヒト化抗hGFRAL抗体を、そのhGDF15拮抗活性について、さらなる細胞ベースの
アッセイ、例えば、実施例4に記載されているようなhGFRAL及びhRETを安定発現するU2OS
アッセイで試験した。アッセイの1日前に、細胞を90μlのDiscoveRxアッセイ完全細胞プ
レーティング16試薬(DiscoveRx, Cat#93-0563R16B)中に96ウェルプレートの各々につき20
Kでプレーティングした。翌日、細胞を、連続希釈した抗体と一定濃度のhGDF15の混合物
で、37℃で10分間処理した。Cis-bio Cellul'erkアッセイキット(Cat# 64ERKPEH)を用い
て、製造業者のプロトコルに従って、ERKリン酸化レベルについてアッセイした。
実施例4に記載されているHek293T Elk1レポーターアッセイと同様に、ヒト化抗hGFRAL
抗体(例えば、ヒト化3P10)は、hGDF15誘導性リン酸化を用量依存的に妨げることができた
。
hGDF15誘導性リン酸化を妨げるヒト化抗GFRAL抗体の代表的な結果は、下の表35及び図1
2に示されている。
表35
Figure 2022088355000122
対照実験において、GFRα1(チップ表面に結合している)は、その天然リガンドGDNF(溶
液中、50nM)に対する結合を示した(図13Cを参照)。
例示的なヒト化抗GFRAL抗体(例えば、HC-344e＋LC-344h)は、受容体GFRα1に結合しな
かったが、hGFRALに対する高親和性結合を示し(図13A及び13B)、GFRALに対する特異性を
示した。
(実施例10:動物試験)
抗GFRAL抗体の効果を複数の動物試験で評価した。
(A:抗GFRAL抗体はDIOマウスでGDF15誘導性の体重減少を阻害する(急性))
抗GFRAL抗体が食餌誘導性肥満(DIO)マウスでGDF15誘導性の体重減少効果を中和するこ
とができるかどうかを決定するために、17週齢の雄C57BL/6J DIOマウスを使用した(Jacks
on Labs West, Sacramento, CA)。マウス(41.3g±0.4g)を、例示的な抗GFRAL抗体(例えば
、1C1、3P10、17J16、5A20、25M22、5F12、8D8、及び12A3)又は抗GDF15抗体(例えば、1MO
3)を受容するように無作為に割り当てた。各々の群は、1群当たり6匹のマウスを有してい
た。各々の処置群は、それ自体のPBS対照群を有していた。抗体投薬量は20mg/kgであった
。PBS又は抗体のいずれかを注射してから1日後、マウスは、3日連続のGDF15タンパク質(
例えば、配列番号1811のアミノ酸配列を有する)の注射を0.5mg/kgで受容した。毎日の体
重及び食餌摂取を記録した(1～3日目及び7日目)。Sartorius天秤LE5201を計量に使用した
。自動計量記録プログラム(Sartorius YSW05 Software Wedge, Sartorius Mechatronics
Corporation, 5 Orville Drive, Suite 200 Bohemia, NY 11716)を用いて、重量データを
Microsoft Excelスプレッドシートに自動的に転送した。
データは、未処理の体重、Δ体重変化、及び体重の変化率(すなわち、ベースライン体
重に対するΔ体重変化の％)に関して、平均±semによって提示されている。スチューデン
トのt-検定を使用した(両側、両端)。これらの実験では、P＜0.05を統計的に有意とみな
した。
例示的な抗GFRAL抗体1C1、3P10、17J16、5A20、25M22、5F12、8D8、及び12A3は、GDF15
誘導性の体重減少及び食餌摂取低下を覆すことができる(図14A及び14B)。抗GDF15抗体も
、このモデルでGDF15誘導性の体重減少及び食餌摂取低下を覆した。
非競合的抗GFRAL抗体又は競合的抗GFRAL抗体が外因性のGDF15誘導性の体重減少効果を
用量依存的に遮断するかどうかを決定するために、19週齢の雄C57BL/6J DIOマウスを使用
した。最初に、マウス(43.1g±0.3g)をPBS群(1群当たり8匹のマウス)又はGDF15タンパク
質群(例えば、配列番号1811のアミノ酸配列を有する)(0.1mg/kg、1.0mg/kg、又は10mg/kg
、1群当たり24匹のマウス)に無作為に割り当てた。GDF15タンパク質は、次の日に体重及
び食餌摂取を用量依存的に低下させることが確認された。さらに、GDF15処置群(0.1mg/kg
、1.0mg/kg、又は10mg/kg)を、PBS又は例示的な抗GFRAL抗体(例えば、1C1もしくは3P10)
を受容するように無作為に割り当てた(1群当たり8匹のマウス)。毎日の体重及び食餌摂取
を記録した(1～3日目及び7日目)。
例示的な抗GFRAL抗体は、GDF15によって誘導される体重低下及び食餌摂取低下を覆した
(図15及び16)。
(B:抗GFRAL抗体はDIOマウスで体重増加を促進する(慢性))
例示的な抗GFRAL抗体がDIOモデルで外因性GDF15タンパク質とは無関係に体重を増加さ
せることができるかどうかを決定するために、14週齢の雄C57BL/6J DIOマウスを使用した
(Jackson Labs West, Sacramento, CA)。マウス(34.5g±0.8g)を、PBS又は週に10mg/kgの
例示的な抗GFRAL抗体(例えば、1C1もしくは3P10)のいずれかを受容するように無作為に割
り当てた。各々の群は、1群当たり10匹のマウスを有していた。毎日の体重及び食餌摂取
を28日間記録した。Sartorius天秤LE5201を計量に使用した。自動計量記録プログラム(Sa
rtorius YSW05 Software Wedge, Sartorius Mechatronics Corporation, 5 Orville Driv
e, Suite 200 Bohemia, NY 11716)を用いて、重量データをMicrosoft Excelスプレッドシ
ートに自動的に転送した。身体組成もEchoMRIにより評価した。
例示的な抗GFRAL抗体は、DIOマウスで体重(それぞれ、6％及び7％)及び食餌摂取(それ
ぞれ、3.4％及び3.7％)を増加させた(図17及び18)。例示的な抗GFRAL抗体による体重の増
加は、主に、脂肪量の増加に起因する(図19)。
(C:抗GFRAL抗体はDIOマウスでGDF-15誘導性ボディマス減少を覆す)
例示的な抗GFRAL抗体がDIOマウスでGDF15誘導性の体重減少効果を中和することができ
るかどうかを決定するために、17週齢の雄C57BL/6J DIOマウスを使用し(Jackson Labs We
st, Sacramento, CA)、GDF15を発現する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を構築した。
rAAVの構築を次のように実施した: Phusion(登録商標)高忠実度DNAポリメラーゼを含む
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試薬キットをNew England BioLabs(F-530L, Ipswich, MA)か
ら購入した。PCR反応を製造業者の指示に従って設定した。Igkシグナルペプチド、続いて
、GDF15をコードする配列を含有する増幅されたDNA断片を制限酵素Spe I及びNot Iで消化
し(制限部位は、それぞれ、5'又は3'PCRプライマーに含まれた)、その後、同じ制限酵素
で消化しておいたAAV導入遺伝子ベクターと連結した。発現用に使用されるベクターは、
選択可能マーカーと、クローニングされたコード配列の挿入部位の5'側の強力な真核生物
プロモーター、それに続く、3'非翻訳領域、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化尾部か
ら構成される発現カセットとを含有していた。
DIOマウスに、高脂肪食(Research Diets、カタログ# D12492NI)を与えた。高脂肪食は
、60kcal％の脂肪、20kcal％のタンパク質、及び20kcal％の炭水化物を含有していた。マ
ウスに、上記のrAAV又は緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する対照AAVベクターの1回の尾
静脈注射を投与した。GDF15を1×1010で発現するrAAVを注射してから42日後、マウスに、
例示的な抗GFRAL抗体(3P10)又は対照抗体(抗KLH抗体)を3mg/kgの用量で投与した。1群当
たり20匹のマウスがいた。マウスの体重、除脂肪量及び脂肪量、エネルギー消費量、並び
に食餌摂取を12週間にわたってモニタリングした。
図20に示されているように、例示的な抗GFRAL抗体(3P10)はDIOマウスでGDF15誘導性の
体重減少並びに脂肪量及び除脂肪量減少を覆した。さらに、図21に示されているように、
例示的な抗GFRAL抗体は、GDF15誘導性のエネルギー消費量増加及びGDF15誘導性の食餌摂
取低下を覆した。
(D:抗GFRAL抗体は痩せたマウスでGDF-15誘導性のボディマス減少を覆す(慢性))
例示的な抗GFRAL抗体が痩せたマウスでGDF15誘導性の体重減少効果を中和することがで
きるかどうかを決定するために、15週齢の雄C57BL/6Jマウスを使用した(Jackson Labs We
st, Sacramento, CA)。マウスを普通食で飼育した。実施例11のパートcに記載されている
ように、マウスに、GDF15を1×1010で発現するrAAV又は緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現
する対照AAVベクターの1回の尾静脈注射を投与した。GDF15を発現するrAAVを注射してか
ら28日後、マウスに、例示的な抗GFRAL抗体(3P10)又は対照抗体(抗KLH抗体)を3mg/kgの用
量で投与した。1群当たり20匹のマウスがいた。マウスの体重、除脂肪量及び脂肪量、エ
ネルギー消費量、並びに食餌摂取を12週間にわたってモニタリングした。
図22に示されているように、例示的な抗GFRAL抗体は、GDF15誘導性の体重減少を覆し、
これには、痩せたマウスにおける脂肪量減少と除脂肪量減少の両方の逆戻りが含まれた。
さらに、図23に示されているように、例示的な抗GFRAL抗体は痩せたマウスでGDF15誘導性
の呼吸交換比(RER)の変化及びGDF15誘導性の食餌摂取低下を覆した。
(E:抗GFRAL抗体は痩せたマウスでGDF15誘導性の体重減少とは無関係に体重を増加させな
い)
例示的な抗GFRAL抗体が外因性GDF15タンパク質とは無関係に痩せたマウスで体重を増加
させることができるかどうかを決定するために、15週齢の雄C57BL/6Jマウスを使用した(J
ackson Labs West, Sacramento, CA)。マウス(26.1g±0.3g)を、PBS又は週に10mg/kgの例
示的な抗GFRAL抗体(例えば、1C1もしくは3P10)のいずれかを受容するように無作為に割り
当てた。各々の群は、1群当たり10匹のマウスを有していた。毎日の食餌摂取及び体重を
最初の週に記録し、その後、週に1回、さらに3週間記録した。Sartorius天秤LE5201を計
量に使用した。
反復用量の例示的な抗GFRAL抗体1C1及び3P10は、痩せたマウスで体重及び食餌摂取を顕
著に変化させることはないが、抗体3P10は、体重を増加させる弱い傾向を示した(図24及
び25)。
(F:抗GFRAL抗体は慢性腎傷害を有するマウスで体重減少及びエネルギー消費量増加を覆す
)
例示的な抗GFRAL抗体が慢性腎傷害を有するDIOマウスで体重減少及びエネルギー消費量
の増加を覆すことができるかどうかを決定するために、15週齢の雄C57BL/6Jマウスを使用
した(Jackson Labs West, Sacramento, CA)。HFD＋アデニン食(10日間の誘導段階で0.3％
、その後、さらに3週間の維持段階で0.1％まで低下させる)を摂取してから5週間後、DIO
マウス(26.1g±0.3g)を、対照抗体(抗KLH)又は週に1mg/kgの例示的な抗GFRAL抗体(例えば
、3P10)のいずれかを受容するように無作為に割り当てた。各々の群は、1群当たり12匹の
マウスを有していた。毎日の体重を最初の週に記録し、その後、週に1回、さらに8週間記
録した。Sartorius天秤LE5201を計量に使用した。
図26Aに示されているように、腎機能に対するアデニンの効果を検証するために、10日
間の食餌性アデニン(HFD中、0.25％アデニン)による処置は、マウスで腎傷害を誘導する
ことが示された。食餌性アデニンはまた、血清GDF15レベルを増大させ(図26Bを参照)、体
重減少を促進した(図26Cを参照)。さらに、食餌性アデニンはマウスでエネルギー消費量
を増加させた(図27Aを参照)。
図27Bに示されているように、例示的な抗GFRAL抗体は慢性腎傷害を有するマウスでエネ
ルギー消費量の増加を覆した。さらに、図28に示されているように、例示的な抗GFRAL抗
体は慢性腎傷害を有するマウスで体重減少並びに脂肪量及び除脂肪量減少を覆した。
(G:ヒト化抗GFRAL抗体はGDF15誘導性の体重減少を用量依存的に阻害する)
ヒト化抗GFRAL抗体が食餌誘導性肥満(DIO)マウスでGDF15誘導性の体重減少効果を中和
することができるかどうかを決定するために、17週齢の雄C57BL/6J DIOマウスを使用した
(Jackson Labs West, Sacramento, CA)。最初に、マウス(42g±0.4g)を、PBS(1群当たり8
匹のマウス)又はGDF15タンパク質(1群当たり56匹のマウス)のいずれかに無作為に割り当
てた。GDF15タンパク質は、次の日に体重及び食餌摂取を用量依存的に低下させることが
確認された。さらに、1群当たり8匹のマウスを、ビヒクル(抗KLH)又は1.0mg/kgの投薬量
の例示的なマウス抗GFRAL抗体(例えば、m3P10)又は0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3mg/
kg、もしくは10mg/kgの投薬量の例示的なヒト化抗GFRAL抗体(例えば、h3P10＝HC-344e＋L
C-344h)のいずれかを受容するように無作為に割り当てた。毎日の体重を記録した(1～7日
目)。Sartorius天秤LE5201を計量に使用した。自動計量記録プログラム(Sartorius YSW05
Software Wedge, Sartorius Mechatronics Corporation, 5 Orville Drive, Suite 200
Bohemia, NY 11716)を用いて、重量データをMicrosoft Excelスプレッドシートに自動的
に転送した。
データは、Δ体重変化に関して、平均±semによって提示されている。スチューデント
のt-検定を使用した(両側、両端)。
例示的なヒト化抗GFRAL抗体HC-344e＋LC-344hは、GDF15誘導性の体重減少を用量依存的
に阻害することができる(図29)。
(実施例11: GFRAL/GDF15複合体の結晶構造)
(A:複合体形成及び結晶化)
1.2モル濃度の過剰なGFRAL(W115-E351)タンパク質を1モル濃度のGDF15タンパク質サブ
ユニット(1対のジスルフィド結合によって連結された2つのGDF15サブユニットのホモ二量
体である、0.5モル濃度のGDF15)と混合することにより、GFRALタンパク質とGDF15タンパ
ク質の複合体を作製した。この複合体をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製して、
余分なGFRALを除去した。5mg/mlの1μLのタンパク質を、結晶化液滴中で、0.5μLのリザ
ーバ溶液及び0.5μLのシードと混合することにより、GFRAL/GDF15複合体を結晶化させた
。このリザーバ溶液は、1.0mLの0.1Mビス-Tris pH 6.0、1.5M (NH4)2SO4、及び10％エチ
レングリコールを含有していた。種晶は、0.1Mのビス-Tris pH 6.0及び1.5M (NH4)2SO4の
リザーバ溶液を含む結晶化条件から得られた。結晶化の設定を、Rigaku 24ウェルクロー
バーリーフプレートにて、室温で維持した。インキュベーションから3日後、結晶化液滴
は、小さい針状結晶を示した。
GFRALタンパク質とGDF15タンパク質の複合体の例示的な小さい針状結晶は、図30に示さ
れている。
GFRALについての分子モデルは利用できなかったので、NaBr浸漬法を用いて、結晶位相
を決定した。上記のように得られたGFRAL/GDF15結晶を0.5M NaBr及び0.75M NaBrを含有す
るリザーバ溶液とともに浸漬させた。30分後、0.5M NaBr浸漬結晶が良好な状態であった
のに対し、0.75M NaBr浸漬は亀裂の入った結晶を生じさせた。30％EGを凍結保護物質とし
て用いて、浸漬結晶と非浸漬結晶の両方に由来する結晶を標本化した。
本明細書に記載されるモデルは、GFRALタンパク質と、GFRALタンパク質のGDF15タンパ
ク質に対する結合とについての最初の構造情報を提供するものである。
(B:データ収集及び構造決定)
GFRAL/GDF15複合体結晶を取得し、0.1Mビス-Tris pH 6.0、1.5M (NH4)2SO4、及び10％
エチレングリコールリザーバ条件から、0.5M及び0.7M NaBr浸漬液由来の浸漬結晶及び非
浸漬結晶として回収した。これらの結晶を、20％エチレングリコールが凍結保護物質とし
て添加された母液で処理し、液体窒素中で瞬間凍結した。その後、これらの結晶をx線回
折のためにシンクロトロンビームラインIMCA-CAT, Advanced Photon Source, Argonne Na
tional Lab(ALS)で調べた。結晶は、最大2.28～2.20Åの分解能まで回折した。
例示的なGFRAL/GDF15複合体結晶のX線回折統計は、表36に示されている。
表36
Figure 2022088355000123
 †括弧内は、最外殻(highest resolution shell)に対するものである(単位はÅ)。
GFRAL/GDF15の分子置換は、出発モデルとしての3.2Åの分解能での過去に解明されたGF
RAL/GDF15複合体に関するスケーリングされたデータセットと剛体精密化とを用いて行い(
Vagin, A. A.らの文献(2004)、「REFMAC5辞書:以前の化学的知識の構築及びその使用のた
めのガイドライン(REFMAC5 dictionary: Organization of prior chemical knowledge an
d guidelines for its use.)」 Acta Crystallogr. D 60:2284-2295を参照)、初期位置精
密化をCCP4で実行されるようにREFMAC5で終了した。数回のモデル再構築により、GFRAL/G
DF15複合体の構造が得られた。
GFRALタンパク質とGDF15タンパク質の複合体の例示的な構造は、例えば、図31～39Bに
示されている。
初期電子密度図の検証により、GFRAL及びGDF15の明確な密度が示された。剛体精密化後
、COOTを用いて、数回のモデル構築及び制限精密化を行った(Emsley, P.及びCowtan, K.
の文献(2004)、「COOT:分子グラフィックのためのモデル構築ツール(COOT: model-buildi
ng tools for molecular graphics.)」 Acta Crystallogr. D 60:2126-2132を参照)。溶
媒分子の配置後、最終精密化を終了した。
GFRAL/GDF15複合体のx線回折パターンからの原子座標は、表49に見られる。
例示的な結晶の精密化統計は、表37に示されている。
表37
Figure 2022088355000124
例示的なGFRAL/GDF15複合体結晶中のGFRALのクリアな電子密度は、図31に示されている
。図31は、2.20Åの分解能データを用いて計算され、1σレベルで等高線が付けられたGFR
AL分子の電子密度図(2fo-fc)を示している。GFRAL残基が明瞭に視認できる。
(C: GFRAL/GDF15複合体の結晶構造)
GFRALタンパク質とGDF15タンパク質の複合体の結晶構造を決定した。
コア相互作用界面アミノ酸は、GFRAL相互作用タンパク質(例えば、GDF15)から4.5Å以
内に少なくとも1つの原子を有する(GFRALなどのタンパク質上の)アミノ酸残基であると決
定された。4.5Åは、ファンデルワールス半径＋起こり得る水を介した水素結合以内の原
子を可能にするコア領域カットオフ距離として選ばれた。
境界相互作用界面アミノ酸は、GFRAL相互作用タンパク質(例えば、GDF15)と相互作用す
るGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸から5Å以内に少なくとも1つの原子を有する(GFRA
Lなどのタンパク質上の)アミノ酸残基と決定された。GFRAL上のコア相互作用界面アミノ
酸から5Å未満の残基に対するタンパク質結合は、GFRAL相互作用タンパク質のファンデル
ワールス半径以内であるので、5Å以内が境界領域カットオフ距離として選ばれた。
これらの距離基準を満たすアミノ酸をCCG(Chemical Computing Group)の分子操作環境(
Molecular Operating Environment)(MOE)プログラムで算定した。
図32は、GFRAL/GDF15タンパク質結晶の非対称単位中に見られるような、ヘテロ二量体G
FRAL/GDF15複合体の例示的な図を示している。二量体分子GDF15は、1つの分子間ジスルフ
ィド結合を有しており、これは、放射線損傷のために弱いことが分かった。GDF15分子の
一方は非対称単位中に二量体を形成することができる。図33は、GFRAL/GDF15結晶中のGFR
AL/GDF15ヘテロ二量体の例示的な二量体配列を示している。
図34A～34Bは、GFRAL-GDF15界面でのタンパク質-タンパク質接触の度合いを示している
。GFRAL上の接触領域は、薄い灰色の矢印により示されており; GDF15上の接触領域は、黒
の矢印により示されている。
図35は、GFRALの3つのα-ヘリックスがGFRAL/GDF15界面に関与していることを示してい
る。複数のジスルフィド架橋が、これら3つのGFRAL α-ヘリックスの構造配列を安定する
ように見える。
図36A～36Dは、GFRAL/GDF15界面の異なる側面並びにGFRAL/GDF15界面の形成に関与する
GFRALタンパク質及びGDF15タンパク質のコア及び境界アミノ酸残基を示している。GFRAL
タンパク質及びGDF15タンパク質は、GFRAL/GDF15界面中の残基が空間充填表面表示で示さ
れたリボンダイアグラムとして示されている。図36A～36Cは、GFRALタンパク質及びGDF15
タンパク質のコア相互作用界面アミノ酸を示している。図36Dは、境界相互作用界面アミ
ノ酸を示している。
全長前駆体ヒトGFRALタンパク質のアミノ酸配列が以下に示されている:
Figure 2022088355000125
GFRAL/GDF15複合体の界面のGFRALアミノ酸は、表38に示されている。
表38
Figure 2022088355000126
Figure 2022088355000127
*配列番号1797によるGFRALアミノ酸付番
成熟ヒトGDF15のアミノ酸配列が以下に示されている:
Figure 2022088355000128
GFRAL/GDF15複合体の界面のGDF15残基は、表39に示されている。
表39
Figure 2022088355000129
 *配列番号1811によるGDF15アミノ酸付番
(D: GFRAL/RET/GDF15複合体のモデル)
Goodmanらの文献(2014) CELL REPORTS 8, 1894-1904(PDB 4UX8)によって記載されてい
るRET/GFRα1/GDNF三成分複合体を鋳型として用いて、GFRAL/GDF15/RETの複合体のモデル
を構築した(GFRAL/GDF15構造からは、例えば、実施例11～13を参照されたい)。RET/GFRα
1/GDNF鋳型は、再構築された哺乳動物RET(ECD)-GDNF-GFRα1三成分複合体の電子顕微鏡法
による再構築から得られた(Goodmanらの文献、上記)。
実施例12のGFRAL/GDF15結晶構造とRET/GFRα1/GDNF鋳型中のGFRα1/GDNFの構造の構造
類似性を比較するために、CCGのMOEを用いて、GFRAL/GDF15結晶中のGFRAL構造をGFRα1/G
DNF/RETモデル(PDB 4UX8)のGFRα1と重ね合わせた。質の高い重合せ、その結果として、G
FRAL/GFRα1とGFRAL/GDF15複合体の構造類似性が、2.21ÅのGFRAL/GFRα1骨格残基のRMSD
によって示された。GFRAL/GDF15構造及びRET構造を含む、この三成分複合体モデルを用い
て、GFRALとRETの相互作用を位置付けた。
図37A～37Bは、4XU8におけるGFRALとGFRα1の重合せの例示的な側面を示している。骨
格残基のRMSDは、2.21Åであった。
図38A～38Dは、RET/GFRAL/GDF15モデルにおけるGFRALタンパク質とRETタンパク質との
相互作用の例示的な側面を示している。図38Aにおいて、モデリングされたGFRAL/GDF15界
面で相互作用しているGFRAL残基とGDF15残基が棒モデルによって表示されている。図38B
において、GFRAL上のRET相互作用残基が空間充填表面モデルで示されている。図38Cにお
いて、コア相互作用残基の空間充填表面モデルがGFRAL及びRET上で強調されている。図38
Dにおいて、境界相互作用残基の空間充填表面モデルがGFRAL及びRET上で強調されている
。
図39A～39Bは、モデリングされたRET界面における空間充填表面モデルにおいて同定さ
れたGFRALタンパク質上のコア及び境界アミノ酸残基を示している。図39Aにおいて、モデ
リングされたGFRAL上のコア残基は、空間充填表面モデルにおいて濃い灰色で示されてい
る。図39Bにおいて、モデリングされたGFRAL上の境界残基は、空間充填表面モデルにおい
て薄い灰色で示されている。
このモデリングに基づいて、表40Aに示されているように、RET残基との相互作用に関す
る、いくつかのGFRAL残基を同定した。さらに、表40Bに示されているように、GFRAL残基
との相互作用に関する、いくつかのRET残基を同定した。
表40A
Figure 2022088355000130
Figure 2022088355000131
表40B
Figure 2022088355000132
Figure 2022088355000133
(実施例12: GFRAL/抗体複合体の結晶構造)
(A1: GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体の複合体形成及び結晶化)
GFRAL(W115-E351)を3P10のFab及び25M22のFabと1:1.2:1.2のモル比のGFRAL:3P10 Fab:2
5M22 Fabで混合することにより、GFRALタンパク質と3P10 Fabと25M22 Fabの複合体(GFRAL
/3P10/25M22 Fab複合体)を形成させた。この複合体をサイズ排除クロマトグラフィーカラ
ムで余分なFab分子から精製した。GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体を濃縮し、次のように結
晶化した。
1.5mLの容量の3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab複合体試料を、10,000 MWCO Centricon(登
録商標)濃縮器を用いて、遠心分離により、約6.6mg/mLまで濃縮した。濃縮した試料を、
実験1回当たり1μLのタンパク質＋1μLのリザーバを用いる結晶化スクリーニングにすぐ
に供した。リザーバ含有量について階乗ベースの製剤サンプリングにわたる第1セットの9
6の条件を設定した。結晶化材料一式(crystallization setups)を室温でインキュベート
した。Hampton Index及びPegRx 結晶化スクリーンを初回の結晶化で使用した。Hampton I
ndexスクリーンからはヒット候補が得られなかったのに対し、PegRxスクリーンからは、
以下の3つの結晶化条件B11、D11、及びH8の下で、結晶が得られた:
・B11: 0.1M MES pH 6.0、20％PEGMME 2000
・D11: 0.1MイミダゾールpH 7,0、12％、PEG 20,000
・H8: 0.1M TRIS pH 8.0、16％PEG 10,000、0.2M酢酸アンモニウム。
結晶化条件B11、D11、及びH8の下で得られたGFRAL/3P10/25M22 Fab複合体の例示的な結
晶は、図40に示されている。
結晶をX線回折用にさらに最適化するために、GFRAL/3P10/25M22複合体を5.0mg/mLまで
濃縮し、結晶化及び改善された結晶につながるさらなる最適化の準備をした。一部の改善
された結晶は台形の形状を有していた。これらの改善された結晶の一部を採取し、適合す
る凍結保護物質で処理し、液体窒素中で瞬間凍結した。適合する凍結保護物質の特定及び
使用は、試料の結晶度を維持し、かつ質の高いX線回折データセットを収集するために重
要であった。0.1MイミダゾールpH 7.0、12％PEG 20,000を含む結晶化条件(D11)から得ら
れた改善された結晶を35％エチレングリコールで処理した。多数の結晶を液体窒素中で瞬
間凍結し、X線回折データをシンクロトロン(ALS)で収集した。ある結晶は、約2.9Åの分
解能まで回折した。この結晶を用いて、完全なX線回折データセットを収集した。
GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体結晶構造を決定した。GFRAL成分の位置を、3P10及び25M22
Fabと比較した、GRAL中のより大きいα-ヘリックス含有量に基づく分子置換によって明
確に特定した。本明細書に記載される例示的な結晶において、1つのGFRAL成分と2つのFab
成分(1つの3P10 Fab及び1つの25M22 Fab)が非対称結晶単位中に三成分複合体を形成した
。
分子置換を用いて、GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体中のFabを同定した。PDB 1F8Tは、分
子置換解析に利用可能な最も近いGFRALホモログであった(GFRALとの～54％の同一性及び
～79％の類似性)。構造解明により、全てのFab及びGFRALのアミノ酸位置が明確に示され
た。1F8T GFRALホモログ構造を手段として用いて、GFRAL/3P10/25M22三成分複合体結晶構
造のFab及びGFRAL成分を解明した。この構造において、ストイキオメトリーは、1:1:1の3
P10 Fab::GFRAL::25M22 Fabであると決定された。
(A2: GFRAL/8D8/5f12 Fab複合体の複合体形成及び結晶化)
GFRAL(W115-E351)を8D8のFab及び5F12のFabと1:1.2:1.2のモル比のGFRAL: 8D8 Fab: 5F
12 Fabで混合することにより、GFRALタンパク質と8D8 Fabと5F12 Fabの複合体(GFRAL/8D8
/5F12 Fab複合体)を形成させた。この複合体をサイズ排除クロマトグラフィーカラムで余
分なFab分子から精製した。GFRAL/8D8/5F12 Fab複合体を濃縮し、次のように結晶化した
。
GFRAL/5F12/8D8 Fab複合体を、10,000 MWCO Centricon(登録商標)濃縮器を用いる遠心
分離により濃縮した。濃縮した試料を、実験1回当たり1μLのタンパク質＋1μLのリザー
バを用いる結晶化スクリーニングにすぐに供した。リザーバ含有量について階乗ベースの
製剤サンプリングにわたる96の条件のセットを最初に設定した。結晶化材料一式を室温で
インキュベートした。初回スクリーンからの陽性のリードをさらに最適化して、回折解析
に適した質の高い結晶を得た。1.5mLの容量の5F12 Fab::GFRAL::8D8 Fab複合体試料を、1
0000 MWCO Centricon濃縮器を用いて、遠心分離により、約7.8mg/mLまで濃縮する。終了
直後に、この試料を、実験1回当たり1μLタンパク質＋1μLリザーバを用いる結晶化スク
リーニングに供する。リザーバ含有量について階乗ベースの製剤サンプリングにわたる96
の条件のセットを最初に設定する。これらの材料一式を室温でインキュベートする。最初
に、Hampton Index及びPegRx結晶化スクリーンを結晶化に使用し、Index及びPegRxにより
、以下の3つの結晶化条件C6、E11、及びC2で結晶が得られた:
・C6: 0.1Mビス-Tris pH 6.5、14％PEG 3350
・E11: 1.7M AmSO4、0.1Mビス-Tris pH 6.5、3％PEG MME 550
・C2: 0.1MイミダゾールpH 7.0、20％Jeffamine 2001。
図41に示されるように、予備的結晶が得られた。
PegRx C6及びC2結晶化条件の最適化を、好適な回折単結晶を生じるマイクロシーディン
グ技法により実施した。これらの好適な回折単結晶は、0.1MイミダゾールpH 7.0、20％Je
ffamine 2001 pH 7.0を含む10％エチレングリコール中に得られる六角錐形状を有する。
これらの結晶の一部を採取し;適合する凍結保護物質で処理し;液体窒素中で瞬間凍結した
。適合する凍結保護物質の使用は、実効性のあるデータセットをもたらす試料の結晶度を
維持するために重要である。結晶を0.1MイミダゾールpH 7.0、20％Jeffamine 2001 pH 7.
0から得られる20％MPDで処理した。
(B1: GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体のデータ収集及び構造決定)
X線回折データを、GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体の20個の結晶について、シンクロトロ
ン(ALS)で収集した。最初の10個の結晶から、1つの完全なデータセットが3.17Åの分解能
で得られた。さらに最適化された10個の追加の結晶は2.9Åまで回折し、このデータセッ
トを構造決定及び精密化に使用した。X線回折データをDENZOを用いてインデキシングし、
その後、プログラムスーツHKL2000のSCALEPACKで積分及びスケーリングした。Otwinowski
Z.及びMinor W.の文献、「振動モードで収集されたX線回折データの処理(Processing of
X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode)」、Methods in Enzymology
、第276巻:高分子結晶学(Macromolecular Crystallography)、パートA、p.307-326, 1997
, C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet編、Academic Press(New York)を参照されたい。選択
された結晶のX線回折は、直方晶系ブラベ格子対称性を有するものと同定された。空間群
は、(h,0,0)軸、(0,k,0)軸、及び(0,0,l)軸に沿った消滅則に基づいてP212121であると決
定された。マシュー係数の解析から、結晶の非対称単位が約124.4kDa及び対応する56％の
溶媒含有量を有する1つの集合体を収容し得ることが示唆される。
例示的なGFRAL/3P10/25M22 Fab複合体結晶のX線回折統計は、表41に示されている。
表41
Figure 2022088355000134
 †括弧内は、最外殻に対するものである(単位はÅ)。
スケーリングしたデータセットを、先に解明されたGFRAL(実施例12、パートCを参照)及
び79％相同な1F8TのGFRAL構造とともに、プログラムPHASERにおける出発モデルとして用
いて、GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体の分子置換を行った。40～3.5Åの分解能に及ぶデー
タから、1つのGFRALと1つのFabが得られた。Molrepにより、構造解でもう1つのFabが得ら
れた。この解は、非対称単位中に1つのGFRALと2つのFabの複合体を有していた。この解を
REFMACを用いて精密化した。COOTをモデル構築に使用した。精密化密度は、Fab及びGFRAL
中の欠けたループを明確に示している。いくつかの溶媒分子を配置した後、最終的な精密
化を終了した。
GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体のx線回折パターンからの原子座標は、表50に見られる。
GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体結晶構造の例示的な精密化統計は、表42に示されている。
表42
Figure 2022088355000135
GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体中の3P10及び25M22 Fab断片の各鎖のCDR領域の明瞭な電子
密度は、図42に示されている(重み付け電子密度2mFo-DFc、1.0σ等高線レベル)。3P10鎖
及び25M22鎖は、いくつかの末端残基が電子密度中に同定されない3P10重鎖(鎖-H)の領域1
31～137を除いて、電子密度中に明瞭に同定された。
(B2: GFRAL/8D8/5F12 Fab複合体のデータ収集及び構造決定)
結晶をAPSのシンクロトロンで調べた。25個のそのような結晶をx線回折のために調べた
。16個の結晶をシンクロトロンに最初に送付し、それにより、＞5Åの回折が得られ、2回
目の最適化した結晶を構造決定及び精密化に使用される3.5Åまで回折した。X線回折デー
タをDENZOを用いてインデキシングし、プログラムスーツHKL2000のSCALEPACKで積分及び
スケーリングした(Otwinowski及びMinorの文献、1997)。選択された結晶のX線回折は、直
方晶系ブラベ格子対称性を有するものと同定された。空間群は、(h,0,0)軸に沿った消滅
則に基づいてP6522であると決定された。マシュー係数の解析から、結晶の非対称単位が
約246.6kDa及び対応する61％の溶媒含有量を有する1つの集合体を収容し得ることが示唆
される。構造解をエナンチオマー空間群P6122を用いてチェックし、これにより、剛体精
密化及び制限精密化において、極めて悪いRfactor及びRfreeが与えられた。
GFRAL/8D8/5F12複合体結晶のX線回折統計は、表43に示されている。
表43
Figure 2022088355000136
 †括弧内は、最外殻に対するものである(単位はÅ)。
スケーリングしたデータセットを、先に解明された8D8に使用されたfab pdb:3IU4(89％
相同)及び5F12に使用されたpdb:4M7K(84％相同)とともに、プログラムPHASERにおける出
発モデルとして用いて、Fab/受容体の分子置換を行った。40～5.0Åの分解能に及ぶデー
タから、1つの受容体と2つのFabの2つの集合体が得られた。この解は、非対称単位中に2
つの受容体と4つのFabの複合体を有していた。この解をREFMACを用いて精密化し、COOTを
モデル構築に使用した。
構造解をエナンチオマー空間群P6122を用いてチェックした。Molrepにより、2つの受容
体と4つのFabの複合体が得られた。精密化のためにRefmacにさらに提出されるMolrepモデ
ルにより、最終的に、極めて悪いRfactor及びRfreeが得られ、これにより、剛体精密化及
び制限精密化において、現在の空間群がP6522であることが確認される
GFRAL/8D8/5F12 Fab複合体のx線回折パターンからの原子座標は、表51に見られる。
GFRAL/8D8/5F12 Fab複合体結晶構造の例示的な精密化統計は、表44に示されている。
表44
Figure 2022088355000137
GFRAL/8D8/5F12 Fab複合体中の1つのGFRALタンパク質と8D8及び5F12 Fab断片(2つのFab
鎖)の明瞭な電子密度は、図43に示されている(重み付け電子密度2mFo-DFc、1.0σ等高線
レベル)。精密化密度は、Fab及び受容体分子中のループの大部分を明瞭に示している。5F
12及び8D8鎖は、鎖-I(5F12 vH)のアミノ酸139～142、鎖-R(8D8 vH)のアミノ酸132～136、
及び鎖-U(8D8 vL)の131～136アミノ酸の領域を除いて、電子密度中に明瞭に同定され、並
びにいくつかの末端残基は、該密度中に同定されなかった。
(C1: GFRAL/3P10/25M22 Fab複合体の結晶構造)
3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab複合体の結晶構造を決定した。
3P10 Fab及び25M22 Fabのアミノ酸配列が以下に示されており、VH及びVL配列は太字に
なっており、CDR領域は、太字でかつ下線が付されている。
Figure 2022088355000138
図44は、リボンダイアグラムによる3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab複合体の側面を示して
いる。Fab断片は、3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab複合体結晶中でGFRALの非対称単位と相互
作用する。この結晶構造は、GFRALエピトープ残基290～312が3P10抗体に提示され、GFRAL
N-末端エピトープ残基130～157が25M22抗体の重鎖CDR領域に提示されることも示した。
図45は、3P10及び25M22 FabのCDR領域を示しており、相互作用するGFRAL及びFab残基が
囲みの中で強調されている。
図46～48は、3P10及び25M22L FabとのGFRAL相互作用の側面をリボンダイアグラムで示
しており、選択されたアミノ酸残基が棒モデルとして示されている。例えば、図46は、3P
10重鎖CDR領域の近くにあるGFRALエピトープの側面を示している。3P10 HcのCDR配列は、
図45に示されている。別の例として、図47は、3P10軽鎖CDR領域の近くにあるGFRALエピト
ープの側面を示している。3P10 LcのCDR配列は、図45に示されている。別の例として、図
48は、25M22重鎖CDR領域の近くにあるGFRALエピトープの側面を示している。25M22 LcのC
DR配列は、図45に示されている。
3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab複合体結晶構造中の25M22 Fabに提示されたGFRALエピトー
プの解析により、25M22の作用機序が競合的GDF15阻害剤の作用機序であり、GFRALに対す
るGDF15結合の遮断を伴うことが示された。GFRALタンパク質上の並びに重鎖及び軽鎖の25
M22 Fab CDR上の例示的なコア相互作用界面アミノ酸は、図49に示されている。
図50A及び50Bは、GFRAL/25M22 Fab相互作用界面のコアアミノ酸残基を示している。図5
0Aは、GFRAL上のコア25M22相互作用界面アミノ酸(結合エピトープ)が空間充填表面モデル
で強調されているGFRALの構造を示している。GFRALに対する25M22 CDR上のコア界面アミ
ノ酸も空間充填表面モデルで強調されている。図50Bは、GFRAL(GFRALエピトープ残基)上
のコア25M22 Fab相互作用界面アミノ酸が空間充填表面モデルで強調されているリボンダ
イアグラム中のGFRALの構造を示している。
図51は、GFRAL/25M22 Fab結合のためのGFRAL上の境界相互作用界面アミノ酸を示してい
る。(25M22 Fab結合のための)GFRAL上の相互作用界面アミノ酸の境界は、空間充填表面モ
デルとして強調されている。
図52～53は、GFRAL上での25M22 Fab及びGDF15結合のためのGFRALエピトープの重複を示
している。GFRALリボンダイアグラムの2つの側面図は、図52の左右のパネルに示されてい
る。図53は、25M22 Fab及びGDF15結合のための重複するGFRALエピトープの上面図を示し
ている。25M22 Fab及びGDF15結合のためのGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸残基が空
間充填表面モデルで強調されている。薄灰色の表面陰影部が25M22 Fabによって覆われたG
FRAL表面を表しているのに対し、濃灰色の表面陰影部(黒の矢印で強調されている)は、GD
F15によって覆われたGFRAL表面を示している。
GFRAL/25M22 Fab複合体の界面のGFRALアミノ酸は、表45に示されている。GFRAL/25M22
Fab及びGFRAL/GDF15複合体中の相互作用界面アミノ酸を比較するために、表45は、表38に
も示されているGFRAL/GDF15複合体の界面のGFRALアミノ酸をさらに記載している。表45は
、GDF15に結合するGFRAL上の全てのコア相互作用界面アミノ酸残基がGFRAL/25M22 Fab相
互作用におけるコア相互作用界面アミノ酸でもあることを示している。
全長前駆体ヒトGFRALタンパク質のアミノ酸配列が以下に示されている(実施例12、パー
トCも参照):
Figure 2022088355000139
 表45
Figure 2022088355000140
Figure 2022088355000141
*配列番号1797によるGFRALアミノ酸付番
3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab複合体結晶構造中の3P10 Fabに提示されたGFRALエピトー
プの解析により、3P10の作用機序が非競合的GDF15阻害剤の作用機序であり、GFRALに対す
るGDF15結合の遮断を伴わないことが示された。GFRALタンパク質上の並びに重鎖及び軽鎖
の3P10 Fab CDR上の例示的なコア相互作用界面アミノ酸は、図54に示されている。
図55A～55Bは、GFRAL及び3P10 Fab上の相互作用界面残基を棒モデル(図55A)又は空間充
填表面モデル(図55B)として示している。
図56A～56Bは、3P10 Fab結合のためのGFRAL上のコア(図56A)及び境界(図56B)相互作用
界面アミノ酸(GFRALの構造的3P10結合エピトープ)を空間充填表面モデルで示している。
図57は、GFRAL上の3P10 Fab及びRETのためのGFRALエピトープの部分重複を示している
。GFRALリボンダイアグラムの2つの側面図は、図57の左右のパネルに示されている。3P10
Fab及びRET結合のためのGFRAL上の相互作用界面アミノ酸残基は、空間充填表面モデルで
強調されている。
図58は、GFRAL上での25M22 Fab及び25M22 Fab結合のためのGFRALエピトープの重複を示
している。GFRALリボンダイアグラムの上面図及び下面図は、図58の左パネル(上面図)及
び右パネル(下面図)に示されている。25M22 Fab及び25M22 Fab結合に関与するGFRAL上の
境界相互作用界面残基が空間充填表面モデルとして示されている。
GFRAL/3P10 Fab複合体の界面のGFRALアミノ酸は、表46に示されている。GFRAL/3P10 Fa
b及びGFRAL/RET複合体中の相互作用界面アミノ酸を比較するために、表446は、表40Aにも
示されているGFRAL/RET複合体の界面のGFRALアミノ酸をさらに記載している。表46は、RE
Tと3P10 Fabの両方に結合するGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸残基を太字で示してい
る。
表46
Figure 2022088355000142
Figure 2022088355000143
Figure 2022088355000144
RETと3P10 Fabの両方に結合するGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸残基は、太字で示
されている。
(C1: GFRAL/8D8/5F12 Fab複合体の結晶構造)
8D8 Fab::GFRAL::5F12 Fab複合体の結晶構造を決定した。
8D8 Fab及び5F12 Fabのアミノ酸配列が以下に示されており、VH及びVL配列は太字にな
っており、CDR領域は、太字でかつ下線が付されている。
Figure 2022088355000145
図59は、3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab複合体の側面をリボンダイアグラムによって示し
ている。Fab断片は、3P10 Fab::GFRAL::25M22 Fab複合体結晶中でGFRALの非対称単位と相
互作用する。結晶構造から、GFRALエピトープ残基290～312が3P10抗体に提示されており
、かつGFRAL N-末端エピトープ残基130～157が25M22抗体重鎖CDR領域に提示されているこ
とも示された。
図60は、GFRALタンパク質上の8D8 Fab及び5F12 Fab結合部位を示している。Fab結合に
重要であるGFRALタンパク質上の残基は、棒モデルとして示されている。
8D8 Fab::GFRAL::5F12 Fab複合体結晶構造中で8D8 Fabに提示されたGFRALエピトープの
解析により、8D8の作用機序が競合的GDF15阻害剤の作用機序であり、GFRALに対するGDF15
結合の遮断を伴うことが示された。GFRALタンパク質上の並びに重鎖及び軽鎖の8D8 Fab C
DR上の例示的なコア相互作用界面アミノ酸は、図61に示されている。
図62A、62B、62C、及び62Dは、GFRAL/8D8 Fab相互作用界面のコア及び境界アミノ酸残
基を示している。図62Aは、GFRAL上のコア8D8相互作用界面アミノ酸(GFRALエピトープ残
基)が空間充填表面モデルで強調されているGFRALの構造を示している。図62Bも、8D8によ
って覆われたGFRAL上のコア界面アミノ酸を空間充填表面モデルで示している。図62Cは、
GFRAL上の境界8D8 Fab相互作用界面アミノ酸(GFRALエピトープ残基)が空間充填表面モデ
ルで強調されているリボンダイアグラム中のGFRALの構造を示している。図62Dも、8D8に
よって覆われたGFRAL上の境界界面アミノ酸を空間充填表面モデルで示している。
図63A、63B、63C、及び63Dは、GFRAL/5F12 Fab相互作用界面のコア及び境界アミノ酸残
基を示している。図63Aは、GFRAL上のコア5F12相互作用界面アミノ酸(GFRALエピトープ残
基)が空間充填表面モデルで強調されているGFRALの構造を示している。図63Bも、5F12に
よって覆われたGFRAL上のコア界面アミノ酸を空間充填表面モデルで示している。図63Cは
、GFRAL上の境界5F12 Fab相互作用界面アミノ酸(GFRALエピトープ残基)が空間充填表面モ
デルで強調されているリボンダイアグラム中のGFRALの構造を示している。図63Dも、5F12
によって覆われたGFRAL上の境界界面アミノ酸を空間充填表面モデルで示している。
GFRAL/8D8 Fab複合体の界面のGFRALアミノ酸は、表47に示されている。GFRAL/8D8 Fab
及びGFRAL/GDF15複合体中の相互作用界面アミノ酸を比較するために、表47は、表38にも
示されているGFRAL/GDF15複合体の界面のGFRALアミノ酸をさらに記載している。表47は、
GDF15に結合するGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸残基がGFRAL/8D8 Fab相互作用にお
いてコア相互作用界面アミノ酸と重複することを示している。
全長前駆体ヒトGFRALタンパク質のアミノ酸配列が以下に示されている(実施例12、パー
トCも参照):
Figure 2022088355000146
 表47
Figure 2022088355000147
Figure 2022088355000148
GDF15と8D8 Fabの両方に結合するGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸残基が太字で示さ
れている。
5F12 Fab::GFRAL::8D8 Fab複合体結晶構造中の5F12 Fabに提示されたGFRALエピトープ
の解析により、5F12の作用機序が非競合的GDF15阻害剤の作用機序であり、GFRALに対する
GDF15結合の遮断を伴わないことが示された。GFRALタンパク質上の並びに重鎖及び軽鎖の
5F12 Fab CDR上の例示的なコア相互作用界面アミノ酸が、図64に示されている。
GFRAL/5F12 Fab複合体の界面のGFRALアミノ酸は、表48に示されている。GFRAL/5F12 Fa
b及びGFRAL/RET複合体中の相互作用界面アミノ酸を比較するために、表48は、表40Aにも
示されているGFRAL/RET複合体の界面のGFRALアミノ酸をさらに記載している。表48は、青
の背景で満たされた胞の中でRETと5F12 Fabの両方に結合するGFRAL上のコア相互作用界面
アミノ酸残基を示している。GFRAL/5F12相互作用に極めて重要なGFRAL上の残基:GFRAL上
の5F12結合エピトープから、GFRAL/RET相互作用を遮断する非競合的阻害作用機序が明ら
かになる。
表48
Figure 2022088355000149
Figure 2022088355000150
RETと5F12 Fabの両方に結合するGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸残基が太字で示され
ている。GFRAL中の灰色の背景色の残基は、GFRAL上の3P10結合エピトープとRET結合エピ
トープの間の重複残基である。
本明細書に記載される全ての参考文献の内容は、引用により本明細書中に組み込まれる
。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
GFRALタンパク質に結合し、かつ
a.該GFRALタンパク質に対するGDF15タンパク質の結合を阻害し;かつ/又は
b.該GFRALタンパク質に対するRETタンパク質の結合を阻害する、
モノクローナル抗体又はその断片。
（構成２）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のドメイン1内の1以上のアミノ酸残基に結合する
、構成1記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のドメイン2内の1以上のアミノ酸残基に結合する
、構成1記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成４）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のドメイン3内の1以上のアミノ酸残基に結合する
、構成1記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成５）
前記GDF15タンパク質、前記GFRALタンパク質、及び/又は前記RETタンパク質を含む複合
体の形成を阻害する、構成1記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成６）
前記GDF15タンパク質と前記GFRALタンパク質の相互作用を妨害する、構成1記載のモノ
クローナル抗体又はその断片。
（構成７）
前記RETタンパク質と前記GFRALタンパク質の相互作用を妨害する、構成1記載のモノク
ローナル抗体又はその断片。
（構成８）
前記GDF15タンパク質の活性、又は該GDF15タンパク質、前記GFRALタンパク質、及び/も
しくは前記RETタンパク質を含む複合体の活性及び/もしくはシグナル伝達を調節する、構
成1記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成９）
GFRALタンパク質に結合し、かつ以下の特徴のうちの1つ又は複数を含む、モノクローナ
ル抗体又はその断片:
a.該GFRALタンパク質(配列番号1797)のドメイン1内の1以上のアミノ酸残基に結合する;
b.該GFRALタンパク質(配列番号1797)のドメイン2内の1以上のアミノ酸残基に結合する;
c.該GFRALタンパク質(配列番号1797)のドメイン3内の1以上のアミノ酸残基に結合する;
d.該GFRALタンパク質に対するGDF15タンパク質の結合を阻害する;
e.該GFRALタンパク質に対するRETタンパク質の結合を阻害する;
f. GDF15タンパク質、GFRALタンパク質、及び/又はRETタンパク質を含む複合体の形成
を阻害する;
g. GDF15タンパク質と該GFRALタンパク質の相互作用を妨害する;
h. RETタンパク質と該GFRALタンパク質の相互作用を妨害する;
i. GDF15タンパク質、GFRALタンパク質、及び/又はRETタンパク質を含む複合体の活性
及び/又はシグナル伝達を調節する。
（構成１０）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)の残基Q20～E351の間の及び該残基Q20～E351を含
むアミノ酸配列に結合する、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１１）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)の残基Q20～S130の間の及び該残基Q20～S130を含
むアミノ酸配列に結合する、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１２）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)の残基C131～C210の間の及び該残基C131～C210を
含むアミノ酸配列に結合する、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１３）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)の残基C220～C316の間の及び該残基C220～C316を
含むアミノ酸配列に結合する、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１４）
a.以下のもの:
i.配列番号49、57、488、489、490、491、492、493、494、495、496、1795、及び179
6からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、
510、511、512、513、及び514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;
並びに
iii.配列番号515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527
、528、529、及び530からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、5
44、545、及び546からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、及び557からなる
群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号558、559、560、561、562、563、534、565、566、567、568、及び569か
らなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１５）
a.以下のもの:
i.配列番号49、57、488、489、490、491、492、493、494、495、496、1795、及び179
6からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、
510、511、512、513、及び514からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;
並びに
iii.配列番号515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527
、528、529、及び530からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3
を含む重鎖可変(VH)領域
:を含む、構成14記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１６）
a.以下のもの:
i.配列番号531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、5
44、545、及び546からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、及び557からなる
群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号558、559、560、561、562、563、534、565、566、567、568、及び569か
らなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成14記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１７）
a.以下のもの:
i.配列番号570～578からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR1;
ii.配列番号579～602からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR2;
iii.配列番号603～1726からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR3、及
び
iv.配列番号1727及び1728からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR4;
を含むVH領域
並び/又は
b.以下のもの:
i.配列番号1729～1750からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR1;
ii.配列番号1751～1777からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR2;
iii.配列番号1778～1792からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR3、及
び
iv.配列番号1793及び1794からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR4
を含むVL領域
:をさらに含む、構成14～16のいずれか一項記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１８）
a.以下のもの:
i.配列番号570～578からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR1;
ii.配列番号579～602からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR2;
iii.配列番号603～1726からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR3、及
び
iv.配列番号1727及び1728からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR4
を含むVH領域
:をさらに含む、構成17記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成１９）
a.以下のもの:
i.配列番号1729～1750からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR1;
ii.配列番号1751～1777からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR2;
iii.配列番号1778～1792からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR3、及
び
iv.配列番号1793及び1794からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR4
を含むVL領域
:をさらに含む、構成17記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２０）
a.以下のもの:
i.配列番号41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65
、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103
、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118、及び119からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、
155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、
172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204、及び220か
らなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241
、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277
、278、279、280、281、282、283、及び284からなる群から選択されるアミノ酸配列を有
するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、3
18、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、3
54、355、356、357、358、359、及び360からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、
392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414、及び415からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441
、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469、及び470からな
る群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２１）
a.以下のもの:
i.配列番号41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65
、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103
、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118、及び119からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、
155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、
172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204、及び220か
らなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241
、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277
、278、279、280、281、282、283、及び284からなる群から選択されるアミノ酸配列を有
するVH CDR3
を含む重鎖可変(VH)領域
:を含む、構成20記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２２）
a.以下のもの:
i.配列番号297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、3
18、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、3
54、355、356、357、358、359、及び360からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、
392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414、及び415からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441
、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469、及び470からな
る群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成20記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２３）
a.以下のもの:
i.配列番号49、60、61、62、63、69、70、及び71からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号152、153、154、155、156、161、162、163、164、及び165からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号237、238、239、240、245、246、247、及び248からなる群から選択され
るアミノ酸配列を有するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号313、314、315、316、321、322、323、及び324からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号385、386、387、391、及び392からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号435、436、437、441、442、及び443からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２４）
a.以下のもの:
i.配列番号41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、64、65、66、67、68、72
、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、1
14、115、116、117、118、及び119からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CD
R1;
ii.配列番号132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、157、158、159、
160、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、
201、202、203、204、及び220からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;
並びに
iii.配列番号221、222、223、224、229、230、231、232、241、242、243、244、249
、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283、及び284
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号297、298、299、300、305、306、307、308、317、318、319、320、325、3
26、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、及び360から
なる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号373、374、375、379、380、381、386、388、389、390、393、394、398、
399、400、407、410、411、412、413、414、及び415からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号423、424、425、429、430、431、438、439、440、444、445、446、450
、451、452、465、466、467、468、469、及び470からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２５）
a.以下のもの:
i.配列番号72、73、74、75、及び76からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VH CDR1;
ii.配列番号166、167、168、169、及び170からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号249、250、251、及び252からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH CDR3;
を含むVH領域
並びに
b.以下のもの:
i.配列番号325、326、327、及び328からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号386、393、及び394からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL C
DR2;並びに
iii.配列番号444、445、及び446からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
CDR3
を含むVL領域
:を含む、構成24記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２６）
a.以下のもの:
i.配列番号64、65、66、67、及び68からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VH CDR1;
ii.配列番号157、158、159、160、及び220からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号241、242、243、及び244からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH CDR3;
を含むVH領域
並びに
b.以下のもの:
i.配列番号317、318、319、及び320からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号388、389、及び390からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL C
DR2;並びに
iii.配列番号438、439、及び440からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
CDR3
を含むVL領域
:を含む、構成24記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２７）
a.以下のもの:
i.配列番号570～572及び578からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR1;
ii.配列番号579～581、589、590、592、601、及び602からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を有するVH FR2;
iii.配列番号603～1643、1679～1714、1723～1726からなる群から選択されるアミノ
酸配列を有するVH FR3、並びに
iv.配列番号1727及び1728からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR4;
を含むVH領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号1729～1732、1735～1740、1749、及び1750からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を有するVL FR1;
ii.配列番号1751～1773、1776、及び1777からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVL FR2;
iii.配列番号1778～1780及び1792からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
FR3、並びに
iv.配列番号1793及び1794からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR
を含むVL領域
:をさらに含む、構成20～26のいずれか一項記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２８）
a.以下のもの:
i.配列番号570～572及び578からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR1;
ii.配列番号579～581、589、590、592、601、及び602からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を有するVH FR2;
iii.配列番号603～1643、1679～1714、1723～1726からなる群から選択されるアミノ
酸配列を有するVH FR3、並びに
iv.配列番号1727及び1728からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR4
を含むVH領域
:をさらに含む、構成27記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成２９）
a.以下のもの:
i.配列番号1729～1732、1735～1740、1749、及び1750からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を有するVL FR1;
ii.配列番号1751～1773、1776、及び1777からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVL FR2;
iii.配列番号1778～1780及び1792からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
FR3、並びに
iv.配列番号1793及び1794からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR4
を含むVL領域
:をさらに含む、構成27記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３０）
a.以下のもの:
i.配列番号46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96
、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130、及び131からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、
185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218、及び2
19からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269
、270、271、272、289、290、291、292、293、294、295、及び296からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、3
46、347、348、365、366、367、368、369、370、371、及び372からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、
419、420、421、及び422からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474
、475、476、477、478、及び479からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成9記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３１）
a.以下のもの:
i.配列番号46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96
、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130、及び131からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、
185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218、及び2
19からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269
、270、271、272、289、290、291、292、293、294、295、及び296からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有するVH CDR3
を含む重鎖可変(VH)領域
:を含む、構成30記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３２）
a.以下のもの:
i.配列番号301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、3
46、347、348、365、366、367、368、369、370、371、及び372からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、
419、420、421、及び422からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474
、475、476、477、478、及び479からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成30記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３３）
a.以下のもの:
i.配列番号46、47、48、49、及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VH CDR1;
ii.配列番号137、138、139、140、及び141からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号225、226、227、及び228からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH CDR3;
を含むVH領域
並びに
b.以下のもの:
i.配列番号301、302、303、及び304からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号376、377、及び378からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL C
DR2;並びに
iii.配列番号426、427、及び428からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
CDR3
を含むVL領域
:を含む、構成30記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３４）
a.以下のもの:
i.配列番号49、56、57、58、及び59からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VH CDR1;
ii.配列番号147、148、149、150、及び151からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号233、234、235、及び236からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH CDR3;
を含むVH領域
並びに
b.以下のもの:
i.配列番号309、310、311、及び312からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号382、383、及び384からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL C
DR2;並びに
iii.配列番号432、433、及び434からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
CDR3
を含むVL領域
:を含む、構成30記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３５）
a.以下のもの:
i.配列番号572～577からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR1;
ii.配列番号581～600からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR2;
iii.配列番号1643～1685、1715～1722からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH FR3、並びに
iv.配列番号1727及び1728からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR4;
を含むVH領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号1729、1730、1733、1734、1741～1748からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するVL FR1;
ii.配列番号1751、1752、1755、1758、1774～1776からなる群から選択されるアミノ
酸配列を有するVL FR2;
iii.配列番号1778、1780～1791からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL F
R3、並びに
iv.配列番号1793及び1794からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR4
を含むVL領域
:をさらに含む、構成30～34のいずれか一項記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３６）
a.以下のもの:
i.配列番号572～577からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR1;
ii.配列番号581～600からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR2;
iii.配列番号1643～1685、1715～1722からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH FR3、並びに
iv.配列番号1727及び1728からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH FR4
を含むVH領域
:をさらに含む、構成35記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３７）
a.以下のもの:
i.配列番号1729、1730、1733、1734、1741～1748からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するVL FR1;
ii.配列番号1751、1752、1755、1758、1774～1776からなる群から選択されるアミノ
酸配列を有するVL FR2;
iii.配列番号1778、1780～1791からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL F
R3、並びに
iv.配列番号1793及び1794からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL FR4
を含むVL領域
:をさらに含む、構成35記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成３８）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のドメイン2内の1以上のアミノ酸残基に結合し、かつG
FRALタンパク質に対するGDF15タンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はそ
の断片。
（構成３９）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)の残基C131～C210の間の及び該残基C131～C210を
含むアミノ酸配列に結合する、構成38記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成４０）
a.以下のもの:
i.配列番号41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、60、61、62、63、64、65
、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103
、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118、及び119からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、152、153、154、
155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、
172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、201、202、203、204、及び220か
らなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号221、222、223、224、229、230、231、232、237、238、239、240、241
、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、257、258、259、260、277
、278、279、280、281、282、283、及び284からなる群から選択されるアミノ酸配列を有
するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号297、298、299、300、305、306、307、308、313、314、315、316、317、3
18、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、333、334、335、336、353、3
54、355、356、357、358、359、及び360からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号373、374、375、379、380、381、385、386、387、388、389、390、391、
392、393、394、398、399、400、407、410、411、412、413、414、及び415からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号423、424、425、429、430、431、435、436、437、438、439、440、441
、442、443、444、445、446、450、451、452、465、466、467、468、469、及び470からな
る群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成38又は39記載の抗体。
（構成４１）
a.以下のもの:
i.配列番号49、60、61、62、63、69、70、及び71からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号152、153、154、155、156、161、162、163、164、及び165からなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号237、238、239、240、245、246、247、及び248からなる群から選択され
るアミノ酸配列を有するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号313、314、315、316、321、322、323、及び324からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号385、386、387、391、及び392からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号435、436、437、441、442、及び443からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成45～48のいずれか一項記載の抗体。
（構成４２）
a.以下のもの:
i.配列番号41、42、43、44、45、49、51、52、53、54、55、64、65、66、67、68、72
、73、74、75、76、82、83、84、85、100、101、102、103、104、110、111、112、113、1
14、115、116、117、118、及び119からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CD
R1;
ii.配列番号132、133、134、135、136、142、143、144、145、146、157、158、159、
160、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、196、197、198、199、200、
201、202、203、204、及び220からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;
並びに
iii.配列番号221、222、223、224、229、230、231、232、241、242、243、244、249
、250、251、252、257、258、259、260、277、278、279、280、281、282、283、及び284
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号297、298、299、300、305、306、307、308、317、318、319、320、325、3
26、327、328、333、334、335、336、353、354、355、356、357、358、359、及び360から
なる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号373、374、375、379、380、381、386、388、389、390、393、394、398、
399、400、407、410、411、412、413、414、及び415からなる群から選択されるアミノ酸
配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号423、424、425、429、430、431、438、439、440、444、445、446、450
、451、452、465、466、467、468、469、及び470からなる群から選択されるアミノ酸配列
を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成45～48のいずれか一項記載の抗体。
（構成４３）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のドメイン3内の1以上のアミノ酸残基に結合し、かつG
FRALタンパク質に対するRETタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその
断片。
（構成４４）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)の残基C220～C316の間の及び該残基C220～C316を
含むアミノ酸配列に結合する、構成43記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（構成４５）
a.以下のもの:
i.配列番号46、47、48、49、50、56、57、58、59、73、75、91、92、93、94、95、96
、97、98、99、124、125、126、127、128、129、130、及び131からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するVH CDR1;
ii.配列番号137、138、139、140、141、147、148、149、150、151、182、183、184、
185、186、187、188、189、190、210、211、212、213、214、215、216、217、218、及び2
19からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号225、226、227、228、233、234、235、236、265、266、267、268、269
、270、271、272、289、290、291、292、293、294、295、及び296からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有するVH CDR3;
を含む重鎖可変(VH)領域
並びに/又は
b.以下のもの:
i.配列番号301、302、303、304、309、310、311、312、341、342、343、344、345、3
46、347、348、365、366、367、368、369、370、371、及び372からなる群から選択される
アミノ酸配列を有するVL CDR1;
ii.配列番号376、377、378、382、383、384、385、386、403、404、405、406、418、
419、420、421、及び422からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR2;並びに
iii.配列番号426、427、428、432、433、434、456、457、458、459、460、461、474
、475、476、477、478、及び479からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL CDR3
を含む軽鎖可変(VL)領域
:を含む、構成43又は44記載の抗体。
（構成４６）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145
、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196
、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつGDF15タンパ
ク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成４７）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のSER156、GLN147、SER150、TYR151、ALA154、CYS155
、PHE174、TYR175、ALA137、CYS138、ASP141、VAL143、CYS144、LEU186、CYS189、CYS191
、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、CYS198、GLN199、LYS202、GLU203、HIS206、SER207
、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、及びVAL134からなる群から選択される1以上の残基
に結合し、かつGDF15タンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクロ
ーナル抗体又はその断片。
（構成４８）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のSER156、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151
、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139
、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191
、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201
、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133
、VAL134、及びALA135からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつGDF15タンパ
ク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成４９）
a.以下のもの:
i.配列番号72、73、74、75、及び76からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VH CDR1;
ii.配列番号166、167、168、169、及び170からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号249、250、251、及び252からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH CDR3;
を含むVH領域
並びに
b.以下のもの:
i.配列番号325、326、327、及び328からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号386、393、及び394からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL C
DR2;並びに
iii.配列番号444、445、及び446からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
CDR3
を含むVL領域
:を含む、構成46～48のいずれか一項記載の抗体。
（構成５０）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLU136、ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142
、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181
、ILE182、及びMET185からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつGDF15タンパ
ク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成５１）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のLEU132、GLU133、VAL134、ALA135、CYS138、LEU148
、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、GLN176
、PHE180、ALA183、GLN184、LEU186、ALA187、PHE188、及びCYS189からなる群から選択さ
れる1以上の残基に結合し、かつGDF15タンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻
害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成５２）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のLEU132、GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137
、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147
、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172
、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184
、MET185、LEU186、ALA187、PHE188、及びCYS189からなる群から選択される1以上の残基
に結合し、かつGDF15タンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクロ
ーナル抗体又はその断片。
（構成５３）
a.以下のもの:
i.配列番号64、65、66、67、及び68からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VH CDR1;
ii.配列番号157、158、159、160、及び220からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号241、242、243、及び244からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH CDR3;
を含むVH領域
並びに
b.以下のもの:
i.配列番号317、318、319、及び320からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号388、389、及び390からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL C
DR2;並びに
iii.配列番号438、439、及び440からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
CDR3
を含むVL領域
:を含む、構成50～52のいずれか一項記載の抗体。
（構成５４）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255
、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、GLN298、及びSE
R299からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRA
Lタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成５５）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244
、TRP245、VAL248、THR249、HIS253、GLU254、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267
、THR268、THR295、ILE296、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307、及びME
T310からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRA
Lタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成５６）
GFRALタンパク質(配列番号1797)のILE224、ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244
、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254
、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264
、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300
、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307、及びMET310からなる群から選択される1以
上の残基に結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モ
ノクローナル抗体又はその断片。
（構成５７）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のMET214、PRO216、PRO217、GLN290、CYS291、THR
292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU301、LYS305、GLN
308、HIS309、HIS312、及びSER315からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつ
RETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はそ
の断片。
（構成５８）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLN298及びGLU301からなる群から選択される1以
上の残基に結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モ
ノクローナル抗体又はその断片。
（構成５９）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のLEU164、LYS208、VAL212、ASN213、VAL215、PRO
218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN288、VAL289、GLU
300、SER302、LEU303、CYS304、ILE306、PHE307、MET310、LEU311、ARG313、LYS314、CYS
316、及びPHE317からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつRETタンパク質に
対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成６０）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のLEU164、LYS208、VAL212、ASN213、MET214、VAL
215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS
269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR2
97、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE3
07、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG313、LYS314、SER315、CYS316、PHE3
17からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRAL
タンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成６１）
a.以下のもの:
i.配列番号46、47、48、49、及び50からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VH CDR1;
ii.配列番号137、138、139、140、及び141からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号225、226、227、及び228からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH CDR3;
を含むVH領域
並びに
b.以下のもの:
i.配列番号301、302、303、及び304からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号376、377、及び378からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL C
DR2;並びに
iii.配列番号426、427、及び428からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
CDR3
を含むVL領域
:を含む、構成57～60のいずれか一項記載の抗体。
（構成６２）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のARG234、ARG238、GLN241、SER242、LYS243、TRP
245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、ASP255、ASN257、CYS258、SER
260、THR261、及びLEU262からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつRETタン
パク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片
。
（構成６３）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLN246、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、ASN
257、CYS258、SER260、THR261、及びLEU262からなる群から選択される1以上の残基に結合
し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗
体又はその断片。
（構成６４）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のCYS233、ARG235、HIS236、TYR237、THR239、PHE
240、CYS244、ARG247、VAL248、GLU254、GLU256、ILE259、SER263、LYS264、ASP266、LEU
267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE
306、HIS309、LEU311、MET310、SER315、及びCYS316からなる群から選択される1以上の残
基に結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクロ
ーナル抗体又はその断片。
（構成６５）
前記GFRALタンパク質(配列番号1797)のCYS233、ARG234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG
238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL
248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS
258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER
272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU
311、MET310、SER315、及びCYS316からなる群から選択される1以上の残基に結合し、かつ
RETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はそ
の断片。
（構成６６）
a.以下のもの:
i.配列番号49、56、57、58、及び59からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VH CDR1;
ii.配列番号147、148、149、150、及び151からなる群から選択されるアミノ酸配列を
有するVH CDR2;並びに
iii.配列番号233、234、235、及び236からなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
るVH CDR3;
を含むVH領域
並びに
b.以下のもの:
i.配列番号309、310、311、及び312からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する
VL CDR1;
ii.配列番号382、383、及び384からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL C
DR2;並びに
iii.配列番号432、433、及び434からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するVL
CDR3
を含むVL領域
:を含む、構成62～65のいずれか一項記載の抗体。
（構成６７）
GFRALタンパク質のエピトープであって、該GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLY140、
LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、
SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択され
る1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつGDF15タンパク質に対する該GFRALタン
パク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成６８）
GFRALタンパク質のエピトープであって、該GFRALタンパク質(配列番号1797)のSER156、
GLN147、SER150、TYR151、ALA154、CYS155、PHE174、TYR175、ALA137、CYS138、ASP141、
VAL143、CYS144、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、CYS198、
GLN199、LYS202、GLU203、HIS206、SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、及びVAL1
34からなる群から選択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつGDF15タンパ
ク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成６９）
GFRALタンパク質のエピトープであって、該GFRALタンパク質(配列番号1797)のSER156、
GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、LEU152、LYS153、ALA154、CYS155、PHE174、
TYR175、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、
ASN145、ALA146、LEU186、CYS189、CYS191、ALA192、GLN193、SER194、ASP195、ILE196、
PRO197、CYS198、GLN199、GLN200、SER201、LYS202、GLU203、ALA204、LEU205、HIS206、
SER207、SER130、CYS131、LEU132、GLU133、VAL134、及びALA135からなる群から選択され
る1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつGDF15タンパク質に対する該GFRALタン
パク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成７０）
GFRALタンパク質のエピトープであって、該GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLU136、
ALA137、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、
PHE173、ASN177、ILE178、PRO179、ASN181、ILE182、及びMET185からなる群から選択され
る1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつGDF15タンパク質に対する該GFRALタン
パク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成７１）
GFRALタンパク質のエピトープであって、該GFRALタンパク質(配列番号1797)のLEU132、
GLU133、VAL134、ALA135、CYS138、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、TYR175、
ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、GLN176、PHE180、ALA183、GLN184、LEU186、ALA187、
PHE188、及びCYS189からなる群から選択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し
、かつGDF15タンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗
体又はその断片。
（構成７２）
GFRALタンパク質のエピトープであって、該GFRALタンパク質(配列番号1797)のLEU132、
GLU133、VAL134、ALA135、GLU136、ALA137、CYS138、VAL139、GLY140、ASP141、VAL142、
VAL143、CYS144、ASN145、ALA146、GLN147、LEU148、ALA149、SER150、TYR151、PHE174、
TYR175、ALA169、ALA170、ILE171、ARG172、PHE173、GLN176、ASN177、ILE178、PRO179、
PHE180、ASN181、ILE182、ALA183、GLN184、MET185、LEU186、ALA187、PHE188、及びCYS1
89からなる群から選択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつGDF15タンパ
ク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成７３）
GFRALタンパク質のエピトープであって、該GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLN246、
ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、
THR261、LEU262、THR297、GLN298、及びSER299からなる群から選択される1以上の残基を
含む、エピトープに結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害
する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成７４）
GFRALタンパク質のエピトープであって、該GFRALタンパク質(配列番号1797)のILE224、
ARG225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、VAL248、THR249、HIS253、GLU254、
SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、ILE296、GLU300、GLU301、
SER302、LEU303、ILE306、PHE307、及びMET310からなる群から選択される1以上の残基を
含む、エピトープに結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害
する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成７５）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のILE224、AR
G225、GLN241、SER242、LYS243、CYS244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、AR
G250、LYS251、CYS252、HIS253、GLU254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SE
R260、THR261、LEU262、SER263、LYS264、GLN265、ASP266、LEU267、THR268、THR295、IL
E296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU303、ILE306、PHE307、及
びMET310からなる群から選択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつRETタ
ンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断
片。
（構成７６）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のMET214、PR
O216、PRO217、GLN290、CYS291、THR292、CYS293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GL
N298、SER299、GLU301、LYS305、GLN308、HIS309、HIS312、及びSER315からなる群から選
択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRAL
タンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成７７）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLN298又は
GLU301からなる群から選択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつRETタン
パク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片
。
（構成７８）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のLEU164、LY
S208、VAL212、ASN213、VAL215、PRO218、THR219、CYS220、LEU221、VAL223、TRP245、LE
U267、CYS269、GLN288、VAL289、GLU300、SER302、LEU303、CYS304、ILE306、PHE307、ME
T310、LEU311、ARG313、LYS314、CYS316、及びPHE317からなる群から選択される1以上の
残基を含む、エピトープに結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合
を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成７９）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のLEU164、LY
S208、VAL212、ASN213、MET214、VAL215、PRO216、PRO217、PRO218、THR219、CYS220、LE
U221、VAL223、TRP245、LEU267、CYS269、GLN28、VAL289、GLN290、CYS291、THR292、CYS
293、ARG294、THR295、ILE296、THR297、GLN298、SER299、GLU300、GLU301、SER302、LEU
303、CYS304、LYS305、ILE306、PHE307、GLN308、HIS309、MET310、LEU311、HIS312、ARG
313、LYS314、SER315、CYS316、PHE317からなる群から選択される1以上の残基を含む、エ
ピトープに結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モ
ノクローナル抗体又はその断片。
（構成８０）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のARG234、AR
G238、GLN241、SER242、LYS243、TRP245、GLN246、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HI
S253、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261、及びLEU262からなる群から選択される
1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRALタンパク
質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成８１）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のGLN246、AR
G250、LYS251、CYS252、ASP255、ASN257、CYS258、SER260、THR261、又はLEU262からなる
群から選択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつRETタンパク質に対する
該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成８２）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のCYS233、AR
G235、HIS236、TYR237、THR239、PHE240、CYS244、ARG247、VAL248、GLU254、GLU256、IL
E259、SER263、LYS264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CY
S269、SER270、SER302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315、及びCYS316
からなる群から選択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつRETタンパク質
に対する該GFRALタンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成８３）
GFRALタンパク質のエピトープであって、GFRALタンパク質(配列番号1797)のCYS233、AR
G234、ARG235、HIS236、TYR237、ARG238、THR239、PHE240、GLN241、SER242、LYS243、CY
S244、TRP245、GLN246、ARG247、VAL248、THR249、ARG250、LYS251、CYS252、HIS253、GL
U254、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、SER263、LY
S264、ASP266、LEU267、THR268、SER272、ASP274、CYS275、ALA278、CYS269、SER270、SE
R302、LEU303、ILE306、HIS309、LEU311、MET310、SER315、及びCYS316からなる群から選
択される1以上の残基を含む、エピトープに結合し、かつRETタンパク質に対する該GFRAL
タンパク質の結合を阻害する、モノクローナル抗体又はその断片。
（構成８４）
5×10-9M以下のKDでGFRALに結合する、構成1～83のいずれか一項記載のモノクローナル
抗体。
（構成８５）
GDF15タンパク質のドメイン又はRETタンパク質のドメインに対する前記GFRALタンパク
質の結合を少なくとも80％阻害する、構成1～84のいずれか一項記載のモノクローナル抗
体。
（構成８６）
ヒト化、ヒト、又はキメラ抗体である、構成1～85のいずれか一項記載のモノクローナ
ル抗体又は断片。
（構成８７）
前記断片が、抗体断片から形成されるFab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、(scFv)2、単鎖
抗体分子、二重可変領域抗体、単一可変領域抗体、直鎖抗体、V領域、又は多重特異性抗
体である、構成1～85のいずれか一項記載の抗体又はその断片。
（構成８８）
検出可能マーカーにコンジュゲートされている、構成1～87のいずれか一項記載の抗体
又は断片。
（構成８９）
前記検出可能マーカーが、放射性同位体、金属キレーター、酵素、蛍光化合物、生体発
光化合物、及び化学発光化合物から選択される、構成88記載の抗体又は断片。
（構成９０）
構成1～87のいずれか一項記載の抗体を産生するトランスジェニック動物。
（構成９１）
構成1～87のいずれか一項記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（構成９２）
構成1～87のいずれか一項記載の抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含
むベクター。
（構成９３）
構成1～87のいずれか一項記載の抗体又はその断片及び医薬として許容し得る担体を含
む医薬組成物。
（構成９４）
対象のGDF15媒介性疾患又は障害を調節する方法であって、該対象に、GFRALに結合する
抗体もしくはその断片又は該抗体もしくはその断片を含む医薬組成物を投与することを含
む、前記方法。
（構成９５）
前記抗体又はその断片が、構成1～87のいずれか一項記載の抗体又はその断片である、
構成94記載の方法。
（構成９６）
対象の不随意の体重減少を治療するか、又は不随意の体重減少のリスクのある対象の不
随意の体重減少を予防する方法であって、該対象に、GFRALに結合する抗体もしくはその
断片又は該抗体もしくはその断片を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（構成９７）
前記抗体又はその断片が、構成1～87のいずれか一項記載の抗体又はその断片である、
構成96記載の方法。
（構成９８）
前記対象が悪液質に罹患している、構成96又は97記載の方法。
（構成９９）
前記対象が慢性疾患に罹患している、構成96又は97記載の方法。
（構成１００）
前記慢性疾患が、肝硬変、甲状腺機能亢進症、パーキンソン病、癌、慢性腎疾患、慢性
閉塞性肺疾患、AIDS、結核症、慢性炎症性疾患、敗血症、筋消耗、及び神経性無食欲から
なる群から選択される、構成98記載の方法。
（構成１０１）
対象のGDF15活性を調節する方法であって、該対象に、GFRALに結合する抗体もしくはそ
の断片又は該抗体もしくはその断片を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
（構成１０２）
前記抗体又はその断片が、構成1～87のいずれか一項記載の抗体又はその断片である、
構成102記載の方法。
（構成１０３）
前記方法がGDF15活性を低下させ、かつ前記対象が、増大したGDF15活性を有するか、又
は増大したGDF15活性を生じるリスクに曝されている、構成101又は102記載の方法。
（構成１０４）
前記方法がGDF15活性を増大させ、かつ前記対象が、減少したGDF15活性を有するか、又
は減少したGDF15活性を生じるリスクに曝されている、構成101又は102記載の方法。
（構成１０５）
対象のGDF15媒介性疾患、障害、又は疾病において使用するためのものである医薬の製
造における構成1～87のいずれか一項記載の抗体又はその断片の使用であって、前記抗体
又は断片を該対象に投与することを含む、前記使用。
（構成１０６）
対象のGDF15媒介性疾患、障害、又は疾病の治療又は予防のための、構成93記載の医薬
組成物の使用。
他の実施態様は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
表49
Figure 2022088355000151
Figure 2022088355000152
Figure 2022088355000153
Figure 2022088355000154
Figure 2022088355000155
Figure 2022088355000156
Figure 2022088355000157
Figure 2022088355000158
Figure 2022088355000159
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Figure 2022088355000190
Figure 2022088355000191
Figure 2022088355000192
Figure 2022088355000193
カラム1－記録名;カラム2－原子通し番号;カラム3－原子名;カラム4 アミノ酸残基名;カ
ラム5－鎖識別子;カラム6－アミノ酸残基配列番号;カラム7－Xの直交座標(単位はÅ);カ
ラム8－Yの直交座標(単位はÅ);カラム9－Zの直交座標(単位はÅ);カラム10－占有;カラ
ム11－温度因子;カラム12－元素記号。
表50
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カラム1－記録名;カラム2－原子通し番号;カラム3－原子名;カラム4 アミノ酸残基名;カ
ラム5－鎖識別子;カラム6－アミノ酸残基配列番号;カラム7－Xの直交座標(単位はÅ);カ
ラム8－Yの直交座標(単位はÅ);カラム9－Zの直交座標(単位はÅ);カラム10－占有;カラ
ム11－温度因子;カラム12－元素記号。
表51
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カラム1－記録名;カラム2－原子通し番号;カラム3－原子名;カラム4 アミノ酸残基名;カ
ラム5－鎖識別子;カラム6－アミノ酸残基配列番号;カラム7－Xの直交座標(単位はÅ);カ
ラム8－Yの直交座標(単位はÅ);カラム9－Zの直交座標(単位はÅ);カラム10－占有;カラ
ム11－温度因子;カラム12－元素記号。

Claims (31)

  1. GDNFファミリー受容体アルファ様(GFRAL)タンパク質に結合する抗体又はその断片であ
    って、該抗体又はその断片が、重鎖可変(VH)領域及び軽鎖可変(VL)領域を含み、
    (i)該VH領域が、それぞれ配列番号46、137、及び225に記載されるアミノ酸配列を含む
    相補性決定領域(CDR)1、CDR2及びCDR3を含み；かつ
    (ii)該VL領域が、それぞれ配列番号301、376、及び426に記載されるアミノ酸配列を含
    むCDR1、CDR2及びCDR3を含む、前記抗体又はその断片。
  2. (a)前記VH領域が、配列番号3に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である；
    (b)前記VL領域が、配列番号4に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である；
    (c)前記VH領域が、配列番号3に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり、
    かつ前記VL領域が、配列番号4に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である；
    (d)前記VH領域が、配列番号3に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ前記VL領域が、配
    列番号4に記載されるアミノ酸配列を含む；
    (e)前記VH領域が、配列番号1982に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であ
    る；
    (f)前記VL領域が、配列番号1997に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であ
    る；又は
    (g)前記VH領域が、配列番号1982に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であ
    り、かつ前記VL領域が、配列番号1997に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一で
    ある、請求項1記載の抗体又はその断片。
  3. (a)前記VH領域が、配列番号1978～1988のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含
    む；及び/又は
    (b)前記VL領域が、配列番号1990～2000のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含
    む、請求項1記載の抗体又はその断片。
  4. (a)前記VH領域が、配列番号1982に記載されるアミノ酸配列を含む；又は
    (b)前記VL領域が、配列番号1997に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体
    又はその断片。
  5. GDNFファミリー受容体アルファ様(GFRAL)タンパク質に結合する抗体又はその断片であ
    って、該抗体又はその断片が、配列番号1982に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変(V
    H)領域、及び配列番号1997に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変(VL)領域を含む、前
    記抗体又はその断片。
  6. ヒトGDNFファミリー受容体アルファ様(GFRAL)タンパク質に結合する抗体又はその断片
    であって、
    (a)それぞれ配列番号56、147、及び233に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変(VH)
    領域相補性決定領域(CDR)1、VH CDR2、及びVH CDR3を含む重鎖可変(VH)領域；及びそれぞ
    れ配列番号309、382、及び432に記載されるアミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及びV
    L CDR3を含む軽鎖可変(VL)領域；
    (b)それぞれ配列番号86、177、及び261に記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH C
    DR2、及びVH CDR3を含むVH領域；及びそれぞれ配列番号337、401、及び453に記載される
    アミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むVL領域；
    (c)それぞれ配列番号91、182、及び265に記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH C
    DR2、及びVH CDR3を含むVH領域；及びそれぞれ配列番号341、385、及び456に記載される
    アミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むVL領域；
    (d)それぞれ配列番号95、187、及び269に記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH C
    DR2、及びVH CDR3を含むVH領域；及びそれぞれ配列番号345、404、及び459に記載される
    アミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むVL領域；
    (e)それぞれ配列番号124、210、及び289に記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH
    CDR2、及びVH CDR3を含むVH領域；及びそれぞれ配列番号365、418、及び474に記載される
    アミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むVL領域；又は
    (f)それぞれ配列番号127、215、及び293に記載されるアミノ酸配列を含むVH CDR1、VH
    CDR2、及びVH CDR3を含むVH領域；及びそれぞれ配列番号369、421、及び477に記載される
    アミノ酸配列を含むVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含むVL領域
    を含む、前記抗体又はその断片。
  7. (i)前記VH領域が、配列番号7に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり、
    かつ前記VL領域が、配列番号8に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である；
    (ii)前記VH領域が、配列番号21に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり
    、かつ前記VL領域が、配列番号22に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である
    ；
    (iii)前記VH領域が、配列番号23に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であ
    り、かつ前記VL領域が、配列番号24に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であ
    る；
    (iv)前記VH領域が、配列番号25に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり
    、かつ前記VL領域が、配列番号26に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である
    ；
    (v)前記VH領域が、配列番号37に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり
    、かつ前記VL領域が、配列番号38に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である
    ；又は
    (vi)前記VH領域が、配列番号39に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一であり
    、かつ前記VL領域が、配列番号40に記載されるアミノ酸配列と少なくとも80％同一である
    、
    請求項6記載の抗体又はその断片。
  8. (i)前記VH領域が、配列番号7及び1957～1965のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列
    を含み、かつ前記VL領域が、配列番号8及び1967～1976のいずれか１つに記載されるアミ
    ノ酸配列を含む；
    (ii)前記VH領域が、配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ前記VL領域が、
    配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含む；
    (iii)前記VH領域が、配列番号23に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ前記VL領域が
    、配列番号24に記載されるアミノ酸配列を含む；
    (iv)前記VH領域が、配列番号25に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ前記VL領域が、
    配列番号26に記載されるアミノ酸配列を含む；
    (v)前記VH領域が、配列番号37に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ前記VL領域が、
    配列番号38に記載されるアミノ酸配列を含む；又は
    (vi)前記VH領域が、配列番号39に記載されるアミノ酸配列を含み、かつ前記VL領域が、
    配列番号40に記載されるアミノ酸配列を含む、
    請求項6記載の抗体又はその断片。
  9. 配列番号1797に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸残基220～316内に結合する、ヒトGF
    RALに特異的に結合する抗体又はその断片。
  10. 配列番号1797に記載されるアミノ酸配列のMet214、Pro216、Pro217、Gln290、Cys291、
    Thr292、Cys293、Arg294、Thr295、Ile296、Thr297、Gln298、Ser299、Glu301、Lys305、
    Gln308、His309、His312、及びSer315からなる群から選択される1以上の残基に結合する
    、ヒトGFRALに特異的に結合する抗体又はその断片。
  11. 配列番号1797に記載されるアミノ酸配列のThr297、Gln298、及びSer299に結合する、ヒ
    トGFRALに特異的に結合する抗体又はその断片。
  12. (a)ヒトIgG1抗体、ヒトIgG2抗体、又はヒトIgG4抗体であり；かつ(b)ヒトカッパ軽鎖定
    常領域、又はヒトラムダ軽鎖定常領域を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の抗体又
    はその断片。
  13. 前記断片が、抗体断片から形成されるFab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、(scFv)2、単鎖
    抗体分子、二重可変領域抗体、又は多重特異性抗体である、請求項1～11のいずれか一項
    記載の抗体又はその断片。
  14. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片をコードする、単離されたポリヌ
    クレオチド又は複数のポリヌクレオチド。
  15. 請求項14記載のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドを含む、ベクター又は複
    数のベクター。
  16. 請求項14記載のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド、又は請求項15記載のベ
    クター又は複数のベクターを含む、宿主細胞。
  17. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片を産生する、宿主細胞。
  18. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片を含む、医薬組成物。
  19. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片を含む、ヒト対象の不随意の体重
    減少を治療するための医薬組成物。
  20. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片を含む、ヒト対象の不随意の体重
    減少を予防するための医薬組成物。
  21. 前記ヒト対象が、悪液質、神経性無食欲、又は慢性疾患を有する、請求項19又は20記載
    の医薬組成物。
  22. 前記慢性疾患が、肝硬変、甲状腺機能亢進症、パーキンソン病、癌、慢性腎疾患、慢性
    閉塞性肺疾患、AIDS、結核症、慢性炎症性疾患、敗血症、筋消耗、及び神経性無食欲から
    なる群から選択される、請求項21記載の医薬組成物。
  23. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片を含む、ヒト対象の悪液質、神経
    性無食欲、又はGDF15媒介性疾患もしくは障害を治療するための医薬組成物。
  24. 前記GDF15媒介性疾患又は障害が、サルコペニア、筋消耗、骨消耗、心血管疾患、又は
    慢性炎症性疾患である、請求項23記載の医薬組成物。
  25. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片を含む、上昇したGDF15レベルを有
    するヒト対象の癌を治療するための医薬組成物。
  26. 前記癌が、黒色腫、胃癌、膵癌又は前立腺癌である、請求項25記載の医薬組成物。
  27. 前記癌が、膵癌である、請求項25記載の医薬組成物。
  28. 1以上の追加の治療剤との組合せ療法を含む、請求項19～27のいずれか一項記載の医薬
    組成物。
  29. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片を含む、GFRALの発現と関連する障
    害の診断において使用するための医薬組成物であって、該抗体又はその断片が、検出可能
    な薬剤にコンジュゲートされており、該診断が、(a)(i)該医薬組成物を該対象に投与する
    こと、又は(ii)該対象から得られた試料を該医薬組成物と接触させること、及び(b)該対
    象又は試料における該抗体又はその断片の存在又は局在を確認することを含む、前記医薬
    組成物。
  30. 請求項1～13のいずれか一項記載の抗体又はその断片を製造する方法であって、請求項1
    6又は17記載の宿主細胞を培養すること、及び該抗体又はその断片を精製することを含む
    、前記方法。
  31. 請求項30記載の方法により製造された抗体又はその断片を、滅菌医薬組成物として製剤
    化することを含む、滅菌医薬組成物の製造方法。
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