ES2616362T3 - Novedosos polipéptidos que tienen similitud de secuencia con GDNFR y ácidos nucleicos que los codifican - Google Patents
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Abstract
Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que tiene: (a) la secuencia de los restos de aminoacido de 1 a 394 de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2); o (b) los restos de aminoacido 1 a X de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier aminoacido de 347-377 de la Figura 2.
Description
identifican conforme a los criterios empleados de forma rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero muy probablemente, en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada extremo del dominio identificado inicialmente. Por tanto, en una realización de la presente invención, el dominio extracelular de un polipéptido PRO34128 que comprende los
5 aminoácidos 1 a X, donde X es cualquier aminoácido de los aminoácidos 347-377 de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), con o sin el péptido señal asociado, y el ácido nucleico que los codifica, se contemplan por la presente invención.
La localización aproximada de los "péptidos señal" de los diversos polipéptidos PRO34128 descritos en este documento se muestra en la presente memoria descriptiva y/o en las figuras adjuntas. Se aprecia, sin embargo, que el límite C-terminal de un péptido señal puede variar, pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado del límite C-terminal del péptido señal identificado inicialmente en este documento, donde el límite C-terminal del péptido señal puede identificarse conforme a los criterios empleados de forma rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Además, también se reconoce que, en
15 algunos casos, la escisión de una secuencia señal desde un polipéptido secretado no es completamente uniforme, produciendo más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, donde el péptido señal se escinde en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado del límite C-terminal del péptido señal identificado en este documento, y los polinucleótidos que los codifican, se contemplan por la presente invención.
"Polipéptido variante PRO34128" significa un polipéptido PRO34128 activo como se define a continuación que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de
(a) los restos 1 a 394 del polipéptido PRO34128 mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), (b) 1 a X de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier aminoácido del aminoácido 347-377 de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2). 25 Dichos polipéptidos variantes PRO34128 incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO34128 donde uno o más restos de aminoácido están añadidos, o delecionados, en extremo N- y/o C-terminal, así como dentro de uno o más dominios internos, de la secuencia de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2). Normalmente, un polipéptido variante PRO34128 tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 82 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 83 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 84 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 87 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa 35 al menos aproximadamente un 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 89 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 91 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, como alternativa al menos aproximadamente un 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos y como alternativa al menos aproximadamente un 99 % de 45 identidad de secuencia de aminoácidos con (a) los restos 1 a 394 del polipéptido PRO34128 mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2). (b) 1 a X de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier aminoácido del aminoácido 347-377 de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2). Los polipéptidos variantes PRO34128 no abarcan la secuencia del polipéptido PRO34128 nativo. Normalmente, los polipéptidos variantes PRO34128 son de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 80 nucleótidos de
55 longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, como alternativa de al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, o más.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a secuencias del polipéptido PRO34128 identificadas en este documento se define como el porcentaje de restos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácido en una secuencia de PRO34128, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con propósitos 65 de determinación de un porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversos modos que pertenecen a las habilidades de la técnica, por ejemplo, usando un software informático disponible al
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La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida de forma funcional en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y
5 potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido de forma funcional" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una pre-secuencia o para un líder de secreción está unido de forma funcional a ADN para un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador está unido de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido de forma funcional a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido de forma funcional" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se consigue por ligamiento en sitios
15 convenientes de restricción. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales individuales anti-PRO34128 (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes), composiciones de anticuerpo anti-PRO34128 con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-PRO34128 de cadena sencilla y fragmentos de anticuerpos anti-PRO34128 (véase a continuación). La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias.
25 La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por un experto en la materia, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado y de la concentración salina. En general, sondas más largas requieren temperaturas mayores para una hibridación apropiada, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de re-hibridar cuando están presentes hebras complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas más altas tenderán a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas inferiores menos rigurosas. Para detalles adicionales y una explicación de la rigurosidad de las
35 reacciones de hibridación, véase, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
Las "condiciones rigurosas" o las "condiciones de alta rigurosidad", como se definen en este documento, pueden identificarse por aquellos que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M /citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1 % a 50 ºC; (2) emplean, durante la hibridación, un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50 % (v/v) con albúmina sérica bovina al 0,1 %/Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1 %/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42 ºC; o (3) emplean formamida al 50 %, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1 %, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón
45 sonicado (50 µg/ml), SDS al 0,1 %, y sulfato de dextrano al 10 % a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en SSC (cloruro sódico/citrato sódico) 0,2 x y formamida al 50 % a 55 ºC, seguido por un lavado de alta rigurosidad que consiste en SSC 0,1 x que contiene EDTA a 55 ºC.
Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es incubación durante una noche a 37 ºC en una solución que comprende: formamida al 20 %, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10 % y 20 mg/ml de ADN de esperma de
55 salmón cortado desnaturalizado, seguido por lavado de los filtro en SSC 1 x a aproximadamente 37-50 ºC. Los expertos en la técnica reconocerán el modo de ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. según lo necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.
La expresión "epítopo marcado" cuando se usa en este documento, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PRO34128 fusionado a un "polipéptido marcador". El polipéptido marcador tiene suficientes restos para proporcionar un epítopo frente al cual puede prepararse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto de modo que no interfiera con la actividad del polipéptido al que está fusionado. El polipéptido marcador preferiblemente también es bastante único de modo que el anticuerpo no reaccione de forma cruzada sustancialmente con otros epítopos. Los polipéptidos marcadores adecuados generalmente tienen al menos seis
65 restos de aminoácido y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 restos de aminoácido (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 restos de aminoácido).
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