ES2258090T3 - Gen humano de tipo wingless. - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado seleccionado de uno de los grupos que consisten en: (a) polipéptido aislado codificado por un polinucleótido que comprende esta secuencia de SEQ ID NO: 1; (b) polipéptido aislado que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 95% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2; (c) polipéptido aislado que tiene al menos el 95% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2; y

Description

Gen humano de tipo wingless.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polipéptidos recientemente identificados y polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos algunas veces denominados en lo sucesivo "wingless/int 8D (Wnt-8D)" en el presente documento, a su uso en el diagnóstico y en la identificación de compuestos que pueden ser agonistas, antagonistas que son potencialmente útiles en tratamiento, y a la producción de tales polipéptidos y polinucleótidos.

Antecedentes de la invención

El proceso de descubrimiento de fármacos experimenta actualmente una revolución fundamental ya que abarca la "genómica funcional", es decir, biología basada en genomas o genes de alto rendimiento. Este enfoque como medio para identificar genes y productos génicos como dianas terapéuticas está sustituyendo rápidamente enfoques anteriores basados en la "clonación posicional". Un fenotipo, es decir, una función biológica o enfermedad genética, se identificaría y entonces se le seguiría la pista hasta el gen responsable, basado en su posición en el mapa genético.

La genómica funcional se basa fuertemente en tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento y las diversas herramientas de bioinformática para identificar secuencias de genes de interés potencial a partir de las muchas bases de datos de biología molecular ahora disponibles. Existe una continua necesidad de identificar y caracterizar genes adicionales y sus polipéptidos/proteínas relacionados, como dianas para el descubrimiento de fármacos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a Wnt-8D, en particular polipéptidos Wnt-8D y polinucleótidos Wnt-8D, materiales recombinantes y métodos para su producción. Tales polipéptidos y polinucleótidos son de interés en relación con los métodos de tratamiento de ciertas enfermedades, que incluyen, pero no se limitan a, asma, alzheimer, cáncer, cardiomiopatías, depresión, esquizofrenia, trastornos psicóticos generales, isquemia, accidente cerebrovascular, cicatrización, enfermedades renales, trastornos pulmonares, apoptosis aberrante, reestructuración tisular, tratamientos con células madre, denominadas en lo sucesivo "enfermedades de la invención" en el presente documento. En un aspecto adicional, la invención se refiere a métodos para identificar agonistas y antagonistas (por ejemplo, inhibidores) que usan los materiales proporcionados por la invención, y tratar estados asociados con desequilibrio de Wnt-8D con los compuestos identificados. Todavía en un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con actividad o niveles de Wnt-8D inapropiados.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos de Wnt-8D. Tales polipéptidos incluyen:

(a) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, o el 99% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2;

(c) un polipéptido que comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2;

(d) un polipéptido que tiene al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, o el 99% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2;

(e) la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2; y

(f) un polipéptido que tiene o comprende una secuencia de polipéptidos que tiene un índice de identidad de 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, o 0,99 comparado con la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2;

(g) fragmentos y variantes de tales polipéptidos en (a) a (f).

Se cree que los polipéptidos de la presente invención son miembros de la familia de polipéptidos wingless/int. El gen int-1 de ratón se identificó originalmente como un locus activado mediante inserción de virus de tumor mamario del ratón. La clonación y secuenciación del gen del ratón mostró su elevado grado de homología con el gen wingless de polaridad de segmentos de la Drosophila, un gen implicado en la formación de patrones en segmentos de la mosca en desarrollo (McMahon A.P. y Moon R.T., Development 107 Sup., 161-167, 1989). En los últimos años se ha reconocido que int-1 y wingless pertenecen a una amplia familia de glucoproteínas relacionadas encontradas en vertebrados e invertebrados. En reconocimiento de esto, los miembros de esta familia se han renombrado como Wnt, una amalgama de int y wingless.

La señalización de Wnt regula la proliferación y diferenciación celular en especies tan divergentes como nematodos, moscas, ranas, y seres humanos (para una revisión, véase Cadigan, K. M. y Nusse, R., Genes & Dev. 11, 3286-3305, 1997). La percepción de Wnt está mediada por miembros de la familia de receptores de 7 dominios transmembranales con bucle ("frizzled 7TM domain receptor family"). De manera citoplásmica, la señal se transduce mediante un grupo de proteínas complejo que incorpora además de otras proteínas "dishevelled", axina, GSK-3, de poliposis adenomatosa de colon (APC), \beta-catenina/armadillo y miembros de la familia de proteínas HMG LEF/TCF (para una revisión reciente sobre la señalización de wnt, remítase a Pfeifer, M. y Polakis, P., Science 287, 1606-1609, 2000).

Una plétora de resultados experimentales apuntan hacía diversas enfermedades humanas, en las que se ha identificado una señalización de wnt aberrante. La asociación de enfermedades más prominente es entre la señalización de wnt y el cáncer. El protooncogen int-1 se identificó basándose en su fenotipo puntuable, que es una expresión ectópica inducida por virus que provoca tumores mamarios. Por consiguiente, Wnt2, Wnt4, Wnt7 y Wnt10b se han asociado con carcinomas de mama humanos (Huguet, E. L. et al., Cancer Res. 54, 2615-2621, 1994; Bui, T. D. et al., Oncogene 14, 1249-1253, 1997). Los cánceres colorrectales humanos también se han asociado claramente con una señalización de wnt aberrante, aunque bastante a menudo esos tumores se asocian con mutaciones no en el gen wnt (o su expresión aberrante), sino en componentes de la cascada de transducción de la señal intracelular descendente (principalmente mutaciones en APC o \beta-cateninas; Smith, K. et al., Br. J. Cancer 81, 496-502, 1999; Laurent-Puig P. et al., Eur. J. Cancer Prev Sup., S39-47, 1999). Mientras tanto, se ha encontrado señalización de wnt aberrante en tejidos tumorales que abarcan tumores de pulmón, mama, carcinomas de próstata, melanomas (Lozzo, R. V. et al., Cancer Res. 55, 3495-3499, 1995), meduloblastomas (Huang, H. et al., Am. J. Pathol. 156, 433-437, 2000), hepatoblastoma esporádico (Satoh, S. et al., Nat. Genet. 24, 245-250, 2000; Jeng, Y. et al., Cancer Lett. 152, 45-51, 2000) o de endometrio (Bui, T.D. et al., Br. J. Cancer 75, 1131-1136, 1997). De manera interesante, los genes Dkk (inhibidores secretados conocidos de la señalización de wnt) muestran un alto nivel de expresión en tejidos diferenciados y que se regulan por disminución en tejidos tumorales (Wang, J. et al., Oncogene 19, 1843-1848, 2000; Tsuji, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 268, 20-24, 2000), favoreciendo el papel de la señalización de wnt en la proliferación.

Además de esta asociación con el cáncer, la señalización de wnt desempeña un papel fundamental en el desarrollo. Por tanto, muchos procesos de reestructuración tisular en el adulto podrían verse afectados por esta cascada de señalización. Una función de la señalización de wnt se ha mostrado, por ejemplo, para la miogéneis (para una revisión, véase Cossu, G. et al., EMBO J. 18, 6867-6872, 1999), formación de corazón (Jaspard, B. et al., Mech. Dev. 90, 263-267, 2000) y riñón (Vainio, S. J. et al., Int. J. Dev. Biol. 43, 419-423, 1999), el desarrollo cerebral así como la reestructuración axónica y sinaptogéneis (Salinas, P. C. et al., Biochem. Soc. Symp. 65, 101-109, 1999; Burden, S. J. et al., Cell 100, 495-497, 2000). De manera interesante, parece que la señalización de wnt se atenúa en un corazón con insuficiencia (Schuhmann, H. et al., Cardiovasc. Res. 45, 720-728, 2000).

Otro aspecto de la señalización de wnt es su posible asociación con trastornos psicóticos. Los iones litio se han usado durante más de 100 años para tratar la depresión (para una revisión reciente, véase Williams, R. S. y Harwood, A. J., Trends Pharmacol. Sci. 21, 61-64, 2000 y referencias en el mismo). Aunque todavía se desconoce la acción molecular de este tratamiento, se han recogido evidencias de que la inhibición de una cinasa citoplásmica, glucógeno sintasa cinasa 3\beta (GS3\beta) podría representar la diana real de los iones litio (Chen, G. et al., Neurochem. 72, 1327-1330, 1999). La inhibición de exactamente esta cinasa es una de las principales actividades de la señalización de wnt, y apoya la idea de que una señalización de wnt aberrante participa en trastornos bipolares. Esta suposición está apoyada adicionalmente por un enfoque indirecto, en el que las localizaciones cromosómicas de algunos miembros de la ruta de señalización de wnt se han asignado a regiones que se sabe que albergan susceptibilidad para trastornos bipolares y esquizofrenia así como trastornos con origen en el neurodesarrollo (Rhoads, A. R. et al., Mol. Psychiatry 4, 437-442, 1999). La función de la GSK-3\beta se inhibe con la señalización de wnt, lo que conduce a niveles elevados de \beta-catenina en el citoplasma y en el núcleo en el que estimula la expresión de los genes junto con miembros del grupo de proteínas de HMG (véase anteriormente). De manera interesante, una publicación reciente reivindica que los niveles de catenina citoplásmica se reducen en las subregiones del hipocampo CA3 y CA4 en sujetos esquizofrénicos (Cotter, D. et al., Neuroreport 9, 1379-1383, 1998).

Las propiedades biológicas del Wnt-8D se denominan en lo sucesivo "actividad biológica del Wnt-8D" o "actividad del Wnt-8D" en el presente documento. Preferiblemente, un polipéptido de la presente invención muestra al menos una actividad biológica del Wnt-8D.

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente, incluyendo todas las formas alélicas y variantes de corte y empalme. Tales polipéptidos varían a partir de los polipéptidos de referencia mediante inserciones, deleciones, y sustituciones que pueden ser conservativas o no conservativas, o cualquier combinación de las mismas. Variantes particularmente preferidas son aquellas en las que se insertan, sustituyen o delecionan varios, por ejemplo desde 50 hasta 30, desde 30 hasta 20, desde 20 hasta 10, desde 10 hasta 5, desde 5 hasta 3, desde 3 hasta 2, desde 2 hasta 1 o 1 aminoácido en cualquier combinación.

Fragmentos preferidos de polipéptidos de la presente invención incluyen un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 30, 50 o 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 30, 50 o 100 aminoácidos contiguos truncados o delecionados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos que median la actividad biológica de Wnt-8D, incluyendo aquellos con una actividad similar o una actividad mejorada o con una actividad disminuida indeseable. También se prefieren aquellos fragmentos que son antigénicos o inmunogénicos en un animal, especialmente en un ser humano.

Los fragmentos de polipéptidos de la invención pueden emplearse para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, estas variantes pueden emplearse como productos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden estar en forma de proteína "madura" o pueden ser una parte de una proteína mayor tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias conductoras o de secreción, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación, por ejemplo residuos de múltiples histidinas, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada, por ejemplo mediante aislamiento a partir de fuentes que se producen en la naturaleza, a partir de células huésped modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión (véase a continuación) o mediante síntesis química, usando por ejemplo sintetizadores de péptidos automatizados, o una combinación de tales métodos... Los medios para preparar tales polipéptidos se entienden bien en la técnica.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a polinucleótidos de Wnt-8D. Tales polinucleótidos incluyen:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, o el 99% de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1;

(b) un polinucleótido que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 1;

(c) un polinucleótido que tiene al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, o el 99% de identidad con respecto al polinucleótido de SEQ ID NO: 1;

(d) el polinucleótido de SEQ ID NO: 1;

(e) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica para una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, o el 99% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2;

(f) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(g) un polinucleótido que tiene una secuencia de polinucleótidos que codifica para una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, o el 99% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2;

(h) un polinucleótido que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(i) un polinucleótido que tiene o comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene un índice de identidad de 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, o 0,99 comparado con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1;

(j) un polinucleótido que tiene o comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica para una secuencia de polipéptidos que tiene un índice de identidad de 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, o 0,99 comparado con la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2; y

polinucleótidos que son fragmentos y variantes de los polinucleótidos mencionados anteriormente o que son complementarios para los polinucleótidos mencionados anteriormente, sobre la longitud entera de los mismos.

Fragmentos preferidos de polinucleótidos de la presente invención incluyen un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que tiene al menos 15, 30, 50 ó 100 nucleótidos contiguos de la secuencia de SEQ ID NO: 1, o un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene al menos 30, 50 ó 100 nucleótidos contiguos truncados o delecionados de la secuencia de SEQ ID NO: 1.

Variantes preferidas de polinucleótidos de la presente invención incluyen variantes de corte y empalme, variantes alélicas, y polimorfismos, incluyendo polinucleótidos que tienen uno o más polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).

Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos que codifican para variantes de polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y en los que varios, por ejemplo desde 50 hasta 30, desde 30 hasta 20, desde 20 hasta 10, desde 10 hasta 5, desde 5 hasta 3, desde 3 hasta 2, desde 2 hasta 1 o 1 residuo de aminoácidos se sustituye, deleciona o añade, en cualquier combinación.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que son transcriptos de ARN de las secuencias de ADN de la presente invención. En consecuencia, se proporciona un polinucleótido de ARN que:

(a) comprende un transcripto de ARN de la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(b) es el transcripto de ARN de la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2;

(c) comprende un transcripto de ARN de la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1; o

(d) es el transcripto de ARN de la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1;

y polinucleótidos de ARN que son complementarios a los mismos.

La secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1 muestra homología con MMWNT8DPT (Bouillet, P. et al. sometimiento directo a Genbank; no publicado). La secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADNc que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2. La secuencia de polinucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 1 o puede ser una secuencia distinta de SEQ ID NO: 1, la cual, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2. El polipéptido de la SEQ ID NO: 2 está relacionado con otras proteínas de la familia wingless/int, que tienen homología y/o similitud estructural con MWN8D_MOUSE (Bouillet, P. et al., Mech Dev. 58, 141-152, 1996).

Se espera que los polipéptidos y polinucleótidos preferidos de la presente invención tengan, entre otros, funciones/propiedades biológicas similares a sus polipéptidos y polinucleótidos homólogos. Además, los polipéptidos y polinucleótidos preferidos de la presente invención tienen al menos una actividad del Wnt-8D.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden obtenerse usando técnicas de clonación y selección habituales a partir de una biblioteca de ADNc derivada a partir de ARNm en células humanas de médula ósea, cerebro, colon, corazón, riñón, pulmón, músculo, riñón, páncreas, próstata, útero y tejido fetal, (véase por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Los polinucleótidos de la invención también pueden obtenerse a partir de fuentes naturales tales como bibliotecas de ADN genómico o pueden sintetizarse usando técnicas bien conocidas y disponibles comercial-
mente.

Cuando los polinucleótidos de la presente invención se usan para la producción recombinante de polipéptidos de la presente invención, el polinucleótido puede incluir la secuencia codificante para el polipéptido maduro, en sí misma, de la secuencia codificante para el polipéptido maduro en el marco de lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que codifican para una secuencia de secreción o conductora, una pre, o pro o preprosecuencia de proteínas, u otras partes de péptido de fusión. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido hexahistidina, tal como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe por Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 821-824, o es una cola de HA. El polinucleótido también puede contener secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como secuencias transcritas, no traducidas, señales de corte y empalme y de poliadenilación, sitios de unión a ribosoma y secuencias que estabilizan el ARNm.

Los polinucleótidos que son idénticos, o tienen suficiente identidad con respecto a una secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1, pueden usarse como sondas de hibridación para ADNc y ADN genómico o como cebadores para una reacción de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR). Tales sondas y cebadores pueden usarse para aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican para los polipéptidos de la presente invención y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes (incluyendo genes que codifican para parálogos a partir de fuentes humanas y ortólogos y parálogos a partir de especies distintas a la humana) que tienen una elevada similitud de secuencia con respecto a SEQ ID NO: 1, normalmente de al menos el 95% de identidad. Las sondas y cebadores preferidos comprenderán generalmente al menos 15 nucleótidos, preferiblemente, al menos 30 nucleótidos y pueden tener al menos 50, si no al menos 100 nucleótidos. Las sondas particularmente preferidas tendrán entre 30 y 50 nucleótidos. Los cebadores particularmente preferidos tendrán entre 20 y 25 nucleótidos.

Un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos a partir de especies distintas de los seres humanos, puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de seleccionar en una biblioteca en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma, preferiblemente de al menos 15 nucleótidos; y aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos. Tales técnicas de hibridación se conocen bien por los expertos en la técnica. Las condiciones de hibridación rigurosas preferidas incluyen incubación durante la noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10%, y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, cortado; seguido de un lavado de los filtros en SSC 0,1 x a aproximadamente 65ºC. Por tanto, la presente invención también incluye polinucleótidos aislados, preferiblemente con una secuencia de nucleótidos de al menos 100, obtenidos mediante la selección en una biblioteca en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma, preferiblemente de al menos 15 nucleótidos.

El experto en la técnica apreciará que, en muchos casos, una secuencia de ADNc aislada será incompleta, en cuanto a que la región que codifica para el polipéptido no se extiende completamente hasta el extremo 5’. Esto es una consecuencia de la transcriptasa inversa, una enzima con una "procesividad" inherentemente baja (una medida de la capacidad de la enzima para permanecer unida al molde durante la reacción de polimerización), no completando una copia de ADN del molde de ARNm durante la síntesis de la primera cadena de ADNc.

Hay diversos métodos disponibles y bien conocidos por los expertos en la técnica para obtener ADNc de longitud completa, o extender ADNc cortos, por ejemplo los basados en el método de rápida amplificación de extremos de ADNc (RACE) (véase por ejemplo, Frohman et al., Proc Nat Acad Sci USA 85, 8998-9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon (marca comercial) (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon (marca comercial), se preparan los ADNc a partir de ARNm, extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada a cada extremo. Entonces se lleva a cabo la amplificación de ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "que falta" del ADNc usando una combinación de cebadores de oligonucleótido específico al gen y específico al adaptador. Entonces se repite la reacción de PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para hibridarse dentro del producto amplificado (normalmente un cebador específico al adaptador que hibrida además con 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico al gen que hibrida además con 5' en la secuencia de genes conocida). Entonces pueden analizarse los productos de esta reacción mediante secuenciación de ADN y ADNc de longitud completa construido o bien uniendo el producto directamente al ADNc existente para dar una secuencia completa, o bien llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica a partir de células huésped modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que están modificadas por ingeniería genética con tales sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas usando ARN derivados de constructos de ADN de la presente invención.

Para la producción recombinante, pueden modificarse por ingeniería genética células huésped para incorporar sistemas de expresión o partes de los mismos para polinucleótidos de la presente invención. Pueden introducirse polinucleótidos en células huésped mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio habituales, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al. (citado anteriormente). Métodos preferidos de introducción de polinucleótidos en células huésped incluyen, por ejemplo, transfección por fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, carga de raspaduras, introducción balística o infección.

Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insectos tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y de melanoma de Bowes; y células de plantas.

Pueden usarse una gran variedad de sistemas de expresión, por ejemplo, sistemas cromosómicos, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de seudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los descritos a partir de elementos genéticos de bacteriófagos y plásmidos, tales como cósmidos y fagómidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como generan expresión. Generalmente, puede usarse cualquier sistema o vector que puede mantener, propagar o expresar un polinucleótido para producir un polipéptido en un huésped. La secuencia de polinucleótidos apropiada puede insertarse en un sistema de expresión por cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, aquellas expuestas por Sambrook et al., (citado anteriormente). Señales de secreción apropiadas pueden incorporarse en el polipéptido deseado para permitir la secreción de la proteína traducida en la luz del retículo endoplasmático, el espacio periplasmático o el entorno extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Si un polipéptido de la presente invención debe expresarse para su uso en ensayos de selección, generalmente se prefiere que se produzca el polipéptido en la superficie celular. En este caso, las células pueden recogerse antes de su uso en el ensayo de selección. Si se secreta el polipéptido en el medio, el medio puede recuperarse con el fin de recuperar y purificar el polipéptido. Si se produce de manera intracelular, en primer lugar deben lisiarse las células antes de recuperar el polipéptido. Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen precipitación por etanol o sulfato de amonio, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía por fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía por hidroxilapatito y cromatografía por lectina. Lo más preferiblemente, se emplea cromatografía de líquidos de alta resolución para la purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para el replegamiento de proteínas para regenerar la conformación activa cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o la purificación.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse como reactivos de diagnóstico, mediante la detección de mutaciones en el gen asociado. La detección de una forma mutada del gen caracterizada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 1 en la secuencia genómica o de ADNc y que está asociada con una disfunción proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadirse a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, o la susceptibilidad a una enfermedad, lo cual resulta de una subexpresión, sobreexpresión o expresión temporal o espacial alterada del gen. Los individuos que portan mutaciones en el gen pueden detectarse a nivel del ADN mediante una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica.

Los ácidos nucleicos para el diagnóstico pueden obtenerse de las células de un sujeto, tales como de la sangre, orina, saliva, biopsia tisular o material de autopsia. El ADN genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente mediante el uso de PCR, preferiblemente RT-PCR, u otras técnicas de amplificación previas al análisis. También puede usarse ARN o ADNc de una manera similar. Las deleciones e inserciones pueden detectarse mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden identificarse mediante la hibridación de ADN amplificado con secuencias de nucleótidos de Wnt-8D marcadas. Las secuencias perfectamente apareadas pueden distinguirse de los dúplex mal apareados mediante digestión por ARN-asa o mediante diferencias en las temperaturas de fusión. La diferencia en la secuencia de ADN también puede detectarse mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles, con o sin agentes desnaturalizantes, o mediante secuenciación de ADN directa (véase, por ejemplo, Myers et al., Science (1985) 230:1242). Los cambios de secuencia en localizaciones específicas también pueden revelarse mediante ensayos de protección de la nucleasa, tales como protección de la ARN-asa y S1 o el método de escisión química (véase Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401).

Puede construirse una serie de sondas de oligonucleótidos que comprenden secuencia de polinucleótidos de Wnt-8D o fragmentos de la misma para realizar una selección eficaz, por ejemplo, de mutaciones genéticas. Tales series son preferiblemente series o redes de alta densidad. Los métodos de tecnología de series se conocen bien y tienen una aplicabilidad general y pueden usarse para tratar una variedad de cuestiones en genética molecular incluyendo la expresión de los genes, conexión genética, y variabilidad genética, véase, por ejemplo, M. Chee et al., Science, 274, 610-613 (1996) y otras referencias citadas en la misma.

También puede usarse la detección de niveles anormalmente disminuidos o aumentados de expresión de polipéptido o ARNm para el diagnóstico o determinación de la susceptibilidad de un sujeto frente a una enfermedad de la invención. La expresión disminuida o aumentada puede medirse a nivel del ARN usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección de la ARN-asa, northern blot (inmunotransferencia) y otros métodos de hibridación. Técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de una proteína, tal como un polipéptido de la presente invención, en una muestra derivada de un huésped se conocen bien por los expertos en la técnica. Tales métodos de ensayo incluyen radioinmunoanálisis, ensayos de unión competitiva, análisis de western y ensayos ELISA.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 1, o un fragmento o un transcripto de ARN del mismo;

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c) un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de SEQ ID NO: 2 o un fragmento del mismo; o

(d) un anticuerpo frente a un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

Se apreciará que en cualquier kit así, (a), (b), (c) o (d) pueden comprender un componente sustancial. Un kit así será útil en el diagnóstico de una enfermedad o susceptibilidad frente a una enfermedad, particularmente enfermedades de la invención, entre otras.

Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención son valiosas para estudios de localización de cromosomas. La secuencia se dirige específicamente hacia, y puede hibridarse con, una localización particular en un cromosoma humano individual. El mapeo de secuencias relevantes frente a cromosomas según la presente invención es un primer paso importante para correlacionar esas secuencias con enfermedades asociadas a genes. Una vez que se ha mapeado una secuencia frente a una localización cromosómica precisa, puede correlacionarse la posición física de la secuencia en el cromosoma con datos del mapa genético. Tales datos se encuentran en, por ejemplo, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre los genes y las enfermedades que se han mapeado con respecto a la misma región cromosómica se identifican entonces mediante análisis de conexión (herencia conjunta de genes físicamente adyacentes). Las localizaciones cromosómicas humanas precisas para una secuencia genómica (fragmento de gen, etc.) pueden determinarse usando un mapeo de radiación híbrido (RH) (Walter, M., Spillet, D., Thomas, P., Weissenbach, J. y Goodfellow, P., (1994) A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes, Nature Genetics 7, 22-28). Una cantidad de paneles de RH están disponibles de Research Genetics (Huntsville, AL, EE.UU.) por ejemplo, el panel de RH GeneBridge4 (Hum Moi Genet marzo de 1996; 5 (3): 339-46 A radiation hybrid map of the human genome. Gyapay G, Schmitt K, Fizames C, Jones H, Vega-Czarny N, Spillet D, Muselet D, Prud'Homme JF, Dib C, Auffray C, Morissette J, Weissenbach J, Goodfellow PN). Para determinar la localización cromosómica de un gen usando este panel, se realizan 93 PCR usando cebadores diseñados a partir del gen de interés en ADN de RH. Cada uno de estos ADN contiene fragmentos genómicos humanos aleatorios mantenidos en un fondo de hámster (líneas celulares híbridas humano/hámster). Estas PCR dan como resultado 93 puntuaciones que indican la presencia o ausencia del producto de PCR del gen de interés. Estas puntuaciones se comparan con puntuaciones creadas usando productos de PCR a partir de secuencias genómicas de localización conocida. Esta comparación se realiza en http://www.genome.wi.mit.edu/. El gen de la presente invención mapea con respecto al cromosoma humano 5q31-5q33 (D5S500-D5S436).

Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención también son herramientas valiosas para los estudios de expresión tisular. Tales estudios permiten la determinación de patrones de expresión de polinucleótidos de la presente invención que pueden dar una indicación en cuanto a los patrones de expresión de los polipéptidos codificados en tejidos, mediante la detección de los ARNm que codifican para ellos. Las técnicas usadas se conocen bien en la técnica e incluyen técnicas de hibridación in situ con respecto a clones dispuestos en serie sobre una red, tal como hibridación de micromatriz de ADNc (Schena et al., Science, 270, 467-470, 1995 y Shalon et al., Genome Res, 6, 639-645, 1996) y técnicas de amplificación de nucleótidos tales como PCR. Un método preferido usa la tecnología TAQMAN (marca comercial) disponible de Perkin Elmer. Los resultados de estos estudios pueden proporcionar una indicación de la función normal del polipéptido en el organismo. Además, estudios comparativos del patrón de expresión normal de ARNm con el de ARNm codificados mediante una forma alternativa del mismo gen (por ejemplo, una que tiene una alteración en el potencial de codificación para el polipéptido o una mutación reguladora) pueden proporcionar revelaciones valiosas en el papel de los polipéptidos de la presente invención, o el de la expresión inapropiada de los mismos en la enfermedad. Tal expresión inapropiada puede ser de naturaleza temporal, espacial o simplemente cuantitativa.

Los polipéptidos de la presente invención se expresan en la médula ósea, cerebro, colon, corazón, riñón, pulmón, músculo, riñón, páncreas, próstata, útero y tejido fetal.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a anticuerpos. Los polipéptidos de la invención o sus fragmentos, o células que los expresan, pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos que son inmunoespecíficos para polipéptidos de la presente invención. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen una afinidad sustancialmente mayor por los polipéptidos de la invención que su afinidad por otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior.

Los anticuerpos generados frente a polipéptidos de la presente invención pueden obtenerse mediante la administración de los polipéptidos o fragmentos que portan epítopos, o células a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuos. Ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler, G. y Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de linfocito B humano (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4: 72) y la técnica del hibridoma del EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc, 1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla, tales como los descritos en la patente de los EE.UU. número 4.946.778, también pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla de esta invención. También, pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos, incluyendo otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresen el polipéptido o para purificar los polipéptidos mediante cromatografía de afinidad. Los anticuerpos frente a polipéptidos de la presente invención también pueden emplearse para tratar enfermedades de la invención, entre otras.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención también pueden usarse como vacunas. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para introducir una respuesta inmunológica en un mamífero que comprende inocular al mamífero con un polipéptido de la presente invención, adecuado para producir respuesta inmunológica del anticuerpo y/o linfocito T, incluyendo, por ejemplo, linfocitos T que producen citocina o linfocitos T citotóxicos, para proteger a dicho animal de la enfermedad, tanto si esa enfermedad ya está establecida dentro del individuo como si no. También puede inducirse una respuesta inmunológica en un mamífero mediante un método que comprende administrar un polipéptido de la presente invención mediante un vector que dirige la expresión del polinucleótido y que codifica para el polipéptido in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica así para producir el anticuerpo para proteger a dicho animal de enfermedades de la invención. Una manera de administrar el vector es mediante su aceleración dentro de las células deseadas como recubrimiento sobre partículas o de otro modo. Tal vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, un ácido nucleico modificado, o un híbrido de ADN/ARN. Para su uso como vacuna, normalmente se proporcionará un polipéptido o un vector de ácido nucleico como una formulación (composición) de vacuna. La formulación puede comprender adicionalmente un vehículo adecuado. Ya que el polipéptido puede descomponerse en el estómago, es preferible administrarla por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Las formulaciones adecuadas para su administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacterióstatos y solutos que vuelven isotónica a la formulación con la sangre del receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en condiciones liofilizadas que sólo requieren la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso. La formulación de vacuna también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación, tales como sistemas de aceite en agua y otros sistemas conocidos en la técnica. La dosis dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede determinarse fácilmente mediante experimentación de rutina.

Los polipéptidos de la presente invención tienen una o más funciones biológicas que son de relevancia en uno o más estados de enfermedad, en particular las enfermedades de la invención mencionadas anteriormente en el presente documento. Por tanto, es útil identificar compuestos que estimulan o inhiben la función o nivel del polipéptido. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para seleccionar compuestos para identificar aquellos que estimulan o inhiben la función o nivel del polipéptido. Tales métodos identifican agonistas o antagonistas que pueden emplearse para fines terapéuticos y profilácticos para tales enfermedades de la invención tal como se mencionaron anteriormente en el presente documento. Los compuestos pueden identificarse a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, colecciones de compuestos químicos, y mezclas de productos naturales. Tales agonistas o antagonistas así identificados pueden ser sustratos, ligandos, receptores, enzimas, etc. naturales o modificados, según sea el caso, del polipéptido; un compuesto mimético estructural o funcional del mismo (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): capítulo 5 (1991)) o una pequeña molécula.

El método de selección puede medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido, o a células o membranas que llevan el polipéptido, o a una proteína de fusión del mismo, por medio de una etiqueta directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Alternativamente, el método de selección puede implicar medir o detectar (cualitativa o cuantitativamente) la unión competitiva de un compuesto candidato al polipéptido frente a un competidor marcado (por ejemplo, agonista o antagonista). Además, estos métodos de selección pueden probar si un compuesto candidato da como resultado una señal generada mediante activación o inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados a las células que llevan el polipéptido. Los inhibidores de activación se analizan generalmente en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista por la presencia del compuesto candidato. Además, los métodos de selección pueden simplemente comprender las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo una actividad del Wnt-8D en la mezcla, y comparar la actividad del Wnt-8D de la mezcla con una mezcla de control que no contiene compuesto candidato.

Los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse en métodos de selección convencionales de baja capacidad y también en formatos de selección de alto rendimiento (HTS- high-throughput screening). Tales formatos de HTS no sólo incluyen el uso bien establecido de placas de microvaloración de 96 y, más recientemente, de 384 pocillos sino también métodos emergentes tales como el método de nanopocillos descrito por Schullek et al., Anal Biochem., 246, 20-29, (1997).

También pueden usarse proteínas de fusión, tales como las preparadas a partir de la parte Fc y polipéptido Wnt-8D, tal como se describió anteriormente en el presente documento, para los ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas para el polipéptido de la presente invención (véase D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995); y K. Johanson et al., J Biol Chem., 270 (16): 9459-9471 (1995)).

Técnicas de selección

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos frente al polipéptido de la presente invención también pueden usarse para configurar métodos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo ELISA para medir niveles de polipéptido secretados o asociados a células usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante métodos habituales conocidos en la técnica. Esto puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamados antagonistas o agonistas, respectivamente) a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados.

Un polipéptido de la presente invención puede usarse para identificar receptores solubles o unidos a membrana, si los hay, mediante técnicas de unión a receptor habituales conocidas en la técnica. Éstas incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión a ligando y de reticulación en los que se marca el polipéptido con un isótopo radioactivo (por ejemplo, ^{125}I), químicamente modificado (por ejemplo, biotinilado), o condensado con una secuencia de péptidos adecuada para la detección o purificación, y se incuba con una fuente de receptores putativos (células, membranas celulares, sobrenadantes celulares, extractos tisulares, fluidos corporales). Otros métodos incluyen técnicas biofísicas tales como resonancia de plasmón superficial y espectroscopia. Estos métodos de selección también pueden usarse para identificar agonistas y antagonistas del polipéptido que compiten con la unión del polipéptido a sus receptores, si los hay. Los métodos habituales para realizar tales ensayos se entienden bien en la técnica.

Ejemplos de antagonistas de polipéptidos de la presente invención incluyen anticuerpos o, en algunos casos, oligonucleótidos o proteínas que están estrechamente relacionados con los ligandos, sustratos, receptores, enzimas, etc., según pueda ser el caso, del polipéptido, por ejemplo, un fragmento de los ligandos, sustratos, receptores, enzimas, etc., o una molécula pequeña que se une al polipéptido de la presente invención pero no provoca una respuesta, de manera que se impide la actividad del polipéptido.

Los métodos de selección también pueden implicar el uso de tecnología transgénica y del gen Wnt-8D. La técnica de construir animales transgénicos está bien establecida. Por ejemplo, puede introducirse el gen Wnt-8D mediante microinyección en el pronúcleo macho de ovocitos fertilizados, transferencia retroviral en embriones antes o tras la implantación, o inyección de células madre embrionarias genéticamente modificadas, tales como mediante electroporación, en blastocistos huésped. Animales transgénicos particularmente útiles son los denominados animales con incorporación génica ("knock-in") en los que un gen animal se sustituye por el equivalente humano dentro del genoma de ese animal. Los animales transgénicos knock-in son útiles en el proceso de descubrimiento de fármacos, para validación de diana, en la que el compuesto es específico para la diana humana. Otros animales transgénicos útiles son los denominados animales deficientes ("knock-out") en los que la expresión del ortólogo animal de un polipéptido de la presente invención y codificado por una secuencia de ADN endógena en una célula se anula parcial o completamente. La deficiencia del gen ("gene knock-out") puede dirigirse a células o tejidos específicos, puede producirse sólo en ciertas células o tejidos como consecuencia de las limitaciones de la tecnología, o puede producirse en todas, o sustancialmente todas, las células del animal. La tecnología de animales transgénicos también ofrece un sistema de expresión-clonación del animal entero en el que los genes introducidos se expresan para dar grandes cantidades de polipéptidos de la presente invención.

Los kits de selección para su uso en los métodos anteriormente descritos forman un aspecto adicional de la presente invención. Tales kits de selección comprenden:

(a) un polipéptido de la presente invención;

(b) una célula recombinante que expresa un polipéptido de la presente invención;

(c) una membrana celular que expresa un polipéptido de la presente invención; o

(d) un anticuerpo frente a un polipéptido de la presente invención;

polipéptido que es preferiblemente el de SEQ ID NO: 2.

Se apreciará que en cualquier kit así, (a), (b), (c) o (d) pueden comprender un componente sustancial.

Glosario

Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de ciertos términos usados con frecuencia anteriormente en el presente documento.

"Anticuerpos" tal como se usa en el presente documento incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como fragmentos Fab, incluyendo productos de Fab u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulina.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente de manera natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", tal como se emplea el término en el presente documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro método recombinante está "aislado" incluso si todavía está presente en dicho organismo, organismo que puede ser un organismo vivo o no.

"Polinucleótido" se refiere generalmente a cualquier poliribonucleótido (ARN) o polidesoxiribonucleótido (ADN), que puede ser ARN o ADN no modificado o modificado. "Polinucleótidos" incluye, sin limitación, ADN de cadena sencilla y doble, ADN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble, ARN de cadena sencilla y doble, y ARN que es una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser de cadena sencilla o, más normalmente, de cadena doble o una mezcla de regiones de cadena sencilla y doble. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. El término "polinucleótido" también incluye ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas y ADN o ARN con esqueletos modificados para estabilidad o por otras razones. Bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Pueden prepararse una diversidad de modificaciones al ADN y ARN; así, "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos tal como se encuentran normalmente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. "Polinucleótido" también abarca polinucleótidos relativamente cortos, a menudo denominados oligonucleótidos.

"Polipéptido" se refiere a cualquier polipéptido que comprende dos o más aminoácidos unidos entre ellos mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos. "Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente denominados péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente denominados proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. "Polipéptidos" incluye secuencias de aminoácidos modificadas o bien mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o bien mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Tales modificaciones se describen bien en textos básicos y en monografías más detalladas así como en una amplia bibliografía de investigación. Las modificaciones pueden producirse en cualquier parte en el polipéptido, incluyendo el esqueleto de polipéptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos terminales amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en grado igual o variables en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados como resultado de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales de postraducción o pueden prepararse mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, biotinilación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puente disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación, y ubiquitinación (véase, por ejemplo, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2ª ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, en Post-translational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990, y Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci, 663, 48-62, 1992).

"Fragmento" de una secuencia de polipéptidos se refiere a una secuencia de polipéptidos que es más corta que la secuencia de referencia pero que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido de referencia. "Fragmento" de una secuencia de polinucleótidos se refiere a una secuencia de polinucleótidos que es más corta que la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero que retiene las propiedades esenciales del mismo. Una variante típica de un polinucleótido se diferencia en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, condensaciones y truncaciones de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como se trata a continuación. Una variante típica de un polipéptido se diferencia en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia. Generalmente, las alteraciones se limitan de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares globalmente y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferenciarse en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, inserciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácidos sustituido o insertado puede o no ser uno codificado por el código genético. Las sustituciones conservativas típicas incluyen Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe y Tyr. Una variante de polinucleótido o polipéptido puede producirse en la naturaleza tal como un alelo, o puede ser una variante que no se sabe que se produzca en la naturaleza. Las variantes que no se producen en la naturaleza de polinucleótidos y polipéptidos pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa. También se incluyen como variantes los polipéptidos que tienen una o más modificaciones postraduccionales, por ejemplo, glucosilación, fosforilación, metilación, ADP-ribosilación y similares. Las realizaciones incluyen metilación del aminoácido N-terminal, fosforilaciones de serinas y treoninas y modificaciones de glicinas
C-terminales.

"Alelo" se refiere a una o dos o más formas alternativas de un gen que se produce en un locus dado en el genoma.

"Polimorfismo" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos (y secuencia de polipéptidos codificada, si es relevante) en una posición dada en el genoma dentro de una población.

"Polimorfismo de un solo nucleótido" (SNP) se refiere a la aparición de una variabilidad de nucleótidos en una sola posición de nucleótido en el genoma, dentro de una población. Un SNP puede producirse dentro de un gen o dentro de regiones intergénicas del genoma. Los SNP pueden analizarse usando la amplificación específica de un alelo (ASA). Para el proceso se requieren al menos 3 cebadores. Un cebador común se usa en el complemento inverso al polimorfismo que está analizándose. Este cebador común pueden se de entre 50 y 1500 pb de la base polimórfica. Los otros dos (o más) cebadores son idénticos entre sí excepto porque la base en 3' final se balancea para corresponder con uno de los dos (o más) alelos que forman el polimorfismo. Entonces se realizan dos (o más) reacciones PCR sobre ADN de muestra, usando cada una el cebador común y uno de los cebadores específicos de alelo.

"Variante de corte y empalme" tal como se usa en el presente documento se refiere a moléculas de ADNc producidas a partir de moléculas de ARN inicialmente transcritas a partir de la misma secuencia de ADN genómico pero que han experimentado cortes y empalmes de ARN alternativos. El corte y empalme de ARN alternativo se produce cuando un transcripto de ARN primario experimenta corte y empalme, generalmente para la retirada de intrones, lo que da como resultado la producción de más de una molécula de ARNm, cada una de las cuales puede codificar para secuencias de aminoácidos diferentes. El término variante de corte y empalme también se refiere a proteínas codificadas por las moléculas de ADNc anteriores.

"Identidad" refleja una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada mediante la comparación de las secuencias. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido con respecto a nucleótido o aminoácido con respecto a aminoácido de las dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente, a lo largo de la longitud de las secuencias que están comparándose.

"% de identidad" - Para secuencias en las que no hay correspondencia exacta, puede determinarse un "% de identidad". En general, las dos secuencias que van a compararse se alinean para dar un máximo de correlación entre las secuencias. Esto puede incluir insertar "espacios" en una o ambas secuencias, para potenciar el grado de alineación. Puede determinarse un % de identidad a lo largo de la longitud entera de cada una de las secuencias que están comparándose (denominado alineación global), esto es particularmente adecuado para secuencias de longitud igual o muy similar o a lo largo de longitudes más cortas, definidas (denominado alineación local), esto es más adecuado para secuencias de longitud diferente.

"Similitud" es una medida adicional, más sofisticada de la relación entre dos secuencias de polipéptidos. En general, "similitud" significa una comparación entre los aminoácidos de dos cadenas de polipéptidos, con un criterio de residuo con respecto a residuo, teniendo en cuenta no sólo las correspondencias exactas entre una pareja de residuos, uno de cada una de las secuencias que están comparándose (como para la identidad) sino también, cuando no hay una correspondencia exacta, si, con un criterio de evolución, es posible que un residuo sustituya al otro. Esta posibilidad tiene una "puntuación" asociada a partir de la cual puede determinarse el "% de similitud" de las dos secuencias.

Los métodos para comparar la identidad y similitud de dos o más secuencias se conocen bien en la técnica. Así, por ejemplo, pueden usarse programas disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devereux J et al., Nucleic Acids Res., 12, 387-395, 1984, disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EE.UU.), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad y el % de similitud entre dos secuencias de polipéptidos. BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (J Mol Biol, 147, 195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981) y encuentra la mejor región única de similitud entre dos secuencias. BESTFIT está más adecuado para comparar dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos que son de longitudes diferentes, asumiendo el programa que la secuencia más corta representa una parte de la más larga. En comparación, GAP alinea dos secuencias, encontrando un "máximo de similitud", según el algoritmo de Neddleman y Wunsch (J Mol Biol, 48, 443-453, 1970). GAP está más adecuado para comparar secuencias que son aproximadamente de igual longitud y se espera una alineación a lo largo de toda la longitud. Preferiblemente, los parámetros "peso de espacios" ("gap weight") y "peso de longitud" ("length weight") usados en cada programa son 50 y 3, para secuencias de polinucleótidos y 12 y 4 para secuencias de polipéptidos, respectivamente. Preferiblemente, los % de identidades y similitudes se determinan cuando las dos secuencias que están comparándose están óptimamente alineadas.

Otros programas para determinar la identidad y/o similitud entre secuencias también se conocen en la técnica, por ejemplo, la familia de programas BLAST (Altschul S F et al., J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al., Nucleic Acids Res., 25: 389-3402, 1997, disponible del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI - National Center for Biotechnology Information), Bethesda, Maryland, EE.UU. y accesible a través de la página de inicio del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R y Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 1988, disponible como parte del Wisconsin Sequence Analysis Package).

Preferiblemente, la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff S y Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992) se usa en las comparaciones de secuencias de polipéptidos incluyendo en las que las secuencias de nucleótidos se traducen en primer lugar en secuencias de aminoácidos antes de la comparación.

Preferiblemente, se usa el programa BESTFIT para determinar el % de identidad de secuencias de polinucleótidos o polipéptidos de consulta con respecto a la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos de referencia, estando las secuencias de consulta y de referencia óptimamente alineadas y los parámetros del programa fijados en los valores por defecto, tal como se describió anteriormente en el presente documento.

"Índice de identidad" es una medida de relación de secuencias que puede usarse para comparar una secuencia candidata (de polinucleótidos o polipéptidos) y una secuencia de referencia. Por tanto, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos candidata que tiene, por ejemplo, un índice de identidad de 0,95 comparada con una secuencia de polinucleótidos de referencia es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos candidata puede incluir de media hasta cinco diferencias por cada 100 nucleótidos de la secuencia de referencia. Tales diferencias se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de nucleótidos. Estas diferencias pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polinucleótidos que tiene un índice de identidad de 0,95 comparada con una secuencia de polinucleótidos de referencia, una media de hasta 5 en cada 100 de los nucleótidos de la secuencia de referencia pueden delecionarse, sustituirse o insertarse, o cualquier combinación de los mismos, tal como se describió anteriormente en el presente documento. Lo mismo se aplica por analogía a otros valores del índice de identidad, por ejemplo, 0,96, 0,97, 0,98 y 0,99.

De manera similar, para un polipéptido, una secuencia de polipéptidos candidata que tiene, por ejemplo, un índice de identidad de 0,95 comparada con una secuencia de polipéptidos de referencia es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polipéptidos puede incluir de media hasta cinco diferencias por cada 100 aminoácidos de la secuencia de referencia. Tales diferencias se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos. Estas diferencias pueden producirse en las posiciones amino o carboxi-terminales de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polipéptidos que tiene un índice de identidad de 0,95 comparada con una secuencia de polipéptidos de referencia, una media de hasta 5 en cada 100 de los aminoácidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse, sustituirse o insertarse, o cualquier combinación de los mismos, tal como se describió anteriormente en el presente documento. Lo mismo se aplica por analogía a otros valores del índice de identidad, por ejemplo, 0,96, 0,97, 0,98 y 0,99.

La relación entre el número de diferencias de nucleótidos o aminoácidos y el índice de identidad puede expresarse en la siguiente ecuación:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot I),

en la que

n_{a} es el número de diferencias de nucleótidos o aminoácidos,

x_{a} es el número total de nucleótidos o aminoácidos en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, respectivamente,

I es el índice de identidad,

\cdot es el símbolo para la operación de multiplicación, y

en la que cualquier producto no entero de x_{a} e I se redondea hacia abajo hasta el entero más próximo antes de sustraerlo de x_{a}.

"Homólogo" es un término genético usado en la técnica para indicar una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que posee un alto grado de relación de secuencias con respecto a una secuencia de referencia. Tal relación puede cuantificarse mediante la determinación del grado de identidad y/o similitud entre las dos secuencias tal como se describió anteriormente en el presente documento. Los términos "ortólogo", y "parálogo" se clasifican dentro de este término genérico. "Ortólogo" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que es el equivalente funcional del polinucleótido o polipéptido en otra especie. "Parálogo" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que dentro de la misma especie es funcionalmente similar.

"Proteína de fusión" se refiere a una proteína codificada por dos genes no relacionados, condensados o fragmentos de los mismos. Se han descrito ejemplos en los documentos US 5541087, 5726044. En el caso de Fc-Wnt-8D, emplear una región Fc de inmunoglobulina como parte de una proteína de fusión es ventajoso para realizar la expresión funcional de Fc-Wnt-8D o fragmentos de Wnt-8D, para mejorar las propiedades farmacocinéticas de una proteína de fusión tal cuando se usa para tratamiento y para generar un Wnt-8D dimérico. El constructo de Fc-Wnt-8D comprende en la dirección 5' hacia 3', un casete de secreción, es decir, una secuencia de señal que provoca la exportación a partir de una célula de mamífero, ADN que codifica para un fragmento de la región Fc de inmunoglobulina, como pareja de condensación, y un ADN que codifica para Wnt-8D o fragmentos del mismo. En algunos usos sería deseable poder alterar las propiedades funcionales intrínsecas (unión de complemento, unión Fc-receptor) mediante la mutación de los lados de Fc funcionales dejando el resto de la proteína de fusión sin tocar o delecionando la parte de Fc completamente tras la expresión.

<110> Merck Patent GmbH

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<120> Nuevo gen Wnt-8D wingless

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<130> WNT8dKDWS

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<140>

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<141>

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<160> 2

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<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1650

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (100)…(1155)

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<400> 1

1

2

3

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<210> 1

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<211> 351

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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4

Claims (11)

1. Polipéptido aislado seleccionado de uno de los grupos que consisten en:

(a) polipéptido aislado codificado por un polinucleótido que comprende esta secuencia de SEQ ID NO: 1;

(b) polipéptido aislado que comprende una secuencia de polipéptidos que tiene al menos el 95% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2;

(c) polipéptido aislado que tiene al menos el 95% de identidad con respecto a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2; y

(d) secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2.

2. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2.

3. Polipéptido aislado según la reivindicación 1, que es la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2.

4. Polinucleótido aislado seleccionado de uno de los grupos que consisten en:

(a) polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1;

(b) polinucleótido aislado que tiene al menos el 95% de identidad con respecto al polinucleótido de SEQ ID NO: 1;

(c) polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica para una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 2;

(d) polinucleótido aislado que tiene una secuencia de polinucleótidos que codifica para una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 95% de identidad con respecto a la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 2;

(e) polinucleótido que es el ARN equivalente de un polinucleótido de (a) a (d);

o secuencia de polinucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

5. Polinucleótido aislado según la reivindicación 4, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 1;

(b) polinucleótido aislado de SEQ ID NO: 1;

(c) polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2; y

(d) polinucleótido aislado que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

6. Sistema de expresión que comprende un polinucleótido que puede producir un polipéptido según la reivindicación 1, cuando dicho vector de expresión se presenta en una célula huésped compatible.

7. Célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión según la reivindicación 6 o membrana de la misma, que expresa el polipéptido de la reivindicación 1.

8. Procedimiento para producir un polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped según la reivindicación 7 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

9. Proteína de fusión que consiste en la región Fc de inmunoglobulina y un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

10. Anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Método de selección para identificar compuestos que estimulan o inhiben la función o el nivel del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende un método seleccionado del grupo que consiste en:

(a) medir, o detectar, cuantitativa o cualitativamente, la unión de un compuesto candidato al polipéptido (o a las células o membranas que expresan el polipéptido) o una proteína de fusión del mismo por medio de una etiqueta directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato;

(b) medir la competición de la unión de un compuesto candidato al polipéptido (o a las células o membranas que expresan el polipéptido) o una proteína de fusión del mismo en presencia de un competidor marcado;

(c) probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados para las células o membranas celulares que expresan el polipéptido;

(d) mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para formar una mezcla, medir la actividad del polipéptido en la mezcla, y comparar la actividad de la mezcla con respecto a una mezcla control que no contiene ningún compuesto candidato; o

(e) detectar el efecto de un compuesto candidato sobre la producción de ARNm que codifica para dicho polipéptido o de dicho polipéptido en células, usando, por ejemplo, un ensayo ELISA, y

(f) producir dicho compuesto según las técnicas biotecnológicas o químicas habituales.