ES2351685T3 - Proteína similar a la proteína específica neuroendocrina y adnc codificante. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con la de la SEC ID Nº: 4 en toda la longitud de la SEC ID Nº: 4.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos recientemente identificados y a polinucleótidos que codifican a dichos polipéptidos, a su uso en el diagnóstico y en la identificación de compuestos que pueden ser agonistas, antagonistas que son potencialmente útiles en terapia y a la producción de dichos polipéptidos y polinucleótidos. Antecedentes de la invención

Actualmente el procedimiento de descubrimiento de fármacos experimenta una revolución fundamental ya que abarca “genómica funcional”, es decir, biología basada en el genoma o en genes de alto rendimiento. Esta estrategia, como un medio para identificar genes y productos génicos como dianas terapéuticas, está sustituyendo rápidamente a las estrategias iniciales basadas en “clonamiento posicional”. Podría identificarse un fenotipo, que fuera una función biológica o una enfermedad genética, y después este podría volver a rastrearse hasta el gen responsable, basándose en su posición en el mapa genético.

La genómica funcional se basa en gran medida en las tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento y en las diversas herramientas de bioinformática para identificar secuencias génicas de posible interés a partir de gran cantidad de bases de datos de biología molecular actualmente disponibles. Existe una necesidad permanente para identificar y caracterizar otros genes y sus polipéptidos/proteínas relacionados, como dianas para el descubrimiento de fármacos.

La presente invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con la de la SEC ID Nº 4 en toda la longitud de la SEC ID Nº 4. En el presente documento, estos polipéptidos se denominan “MAGI”. Estos polipéptidos y polinucleótidos son de interés en relación con procedimientos de tratamiento de determinadas enfermedades, que incluyen, pero sin limitación, neuropatías, lesión medular, degeneración neuronal, trastornos neuromusculares, trastornos psiquiátricos y trastornos del desarrollo, cáncer, ictus y trastornos inflamatorios, en lo sucesivo en el presente documento denominadas “enfermedades de la invención”.

Se cree que los polipéptidos de la presente invención son miembros de la familia de polipéptidos del reticulon. Por lo tanto, son de interés porque se ha demostrado que los miembros de esta familia presentan una prominente, pero no exclusiva, expresión en células del sistema nervioso. Se ha demostrado que la expresión de una isoforma de estos polipéptidos, la proteína C específica neuroendocrina (NSP-C) (J. Hens y col. Cell Tissue Res. 292:229-237,1998), se correlaciona con la diferenciación neuronal. Se sabe que el corte y empalme alternativo de los genes de esta familia de polipéptidos genera isoformas diferencialmente expresadas con funciones solapantes y distintas en tejidos diferentes (Geisler y col. Mamm. Genome 9:164-173, 1998). La similitud de aminoácidos entre los miembros de esta familia de polipéptidos con fragmentos de una proteína de elevado peso molecular, purificada de la médula espinal bovina (Spillmann y col. J. Biol. Chem. 273:15487, 1998) indica una posible función en la función de inhibición del crecimiento axonal para estas proteínas. De manera similar, la expresión de la proteína A específica neuroendocrina (NSP-A) en células cancerosas específicas (Senden y col. Histochem. Cell Biol. 108:155-165, 1997) puede indicar un posible uso de estos polipéptidos en el diagnóstico y o tratamiento de cánceres.

La detección de polinucleótidos que comprenden partes de MAGI en ADNc del cerebro fetal humano y en la médula espinal humana adulta y una isoforma de ARNm abundante > 5 kb en el cerebro adulto humano junto con diferentes transcritos posiblemente originados por corte y empalme alternativo en corazón, pulmón, hígado, riñón y músculo esquelético sugiere que las isoformas MAGI pueden realizar, de manera similar, funciones de solapamiento y distintas en estos tejidos. Por analogía con la semaforina de la familia de polipéptidos moduladores de neuritas puede postularse que estas isoformas diferentes funcionarían en cada uno de estos tejidos para controlar la inervación local por poblaciones neuronales distintas. Podría predecirse la expresión aberrante de isoformas específicas, por ejemplo, en el músculo esquelético para modificar la inervación neuronal motora y sensorial en enfermedades tales como esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

La presencia de polipéptidos distintivos característicos y de regiones altamente hidrófobas en el polipéptido de la presente invención sugiere que su expresión en regiones del sistema nervioso y en tejidos que forman límites para el crecimiento, puede modular el crecimiento y encontrar la trayectoria durante el desarrollo y después de procedimientos patológicos o perjudiciales.

La expresión del polipéptido de la invención, fragmentos del mismo o, de manera alternativa, variantes del polipéptido cortadas y empalmadas, en la superficie de las células, bien de manera natural como una proteína secretada, o después de la liberación por lesión celular, pueden actuar sobre otras células bien a través de receptores específicos o patológicamente a través de interacciones no específicas para modular la adhesión, dispersión, migración o crecimiento celular Podría esperarse que esta inhibición fuera bien reversible o posiblemente permanente produciendo la muerte celular.

En lo sucesivo, en el presente documento, las propiedades biológicas de MAGI se denominan “actividad biológica de MAGI” o “actividad MAGI”. Preferentemente, un polipéptido de la presente invención presenta al menos una actividad biológica de MAGI.

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente que tienen una identidad de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4, incluyendo todas las formas alélicas y variantes de corte y empalme. Dichos polipéptidos varían del polipéptido de referencia por inserciones, deleciones y sustituciones que pueden ser conservativas o no conservativas o cualquier combinación de las mismas. Las variantes particularmente preferidas son aquellas en las que se insertan, sustituyen o delecionan varios aminoácidos, por ejemplo de 20 a 10, de 10 a 5, de 5 a 3, de 3 a 2, de 2 a 1 ó 1, en cualquier combinación.

Los fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos que median la actividad biológica de MAGI, incluyendo aquellos con una actividad similar o una actividad mejorada, o con una actividad no deseable disminuida. También se prefieren aquellos fragmentos que son antigénicos o inmunogénicos en un animal, especialmente en un ser humano.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden usarse para la producción del correspondiente polipéptido de longitud completa por síntesis peptídica; por lo tanto, estas variantes pueden usarse como intermediarias para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden estar en forma de proteína “madura” o pueden formar parte de una proteína más grande tal como una proteína precursora o de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contenga secuencias secretoras o líder, pro-secuencias, secuencias que ayuden en la purificación, por ejemplo restos de histidina múltiples o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada, por ejemplo aislando formas de fuentes de origen natural, procedentes de células huéspedes modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión (véase a continuación) o mediante síntesis química, usando, por ejemplo, sintetizadores peptídicos automatizados o una combinación de dichos procedimientos. En la técnica se conocen bien medios para la preparación de dichos polipéptidos.

La secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº 1 muestra homología con la proteína C específica neuroendocrina Humana (Roebroek y col, J. Biol. Chem. 268: 13439-13447, 1993). La secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº 1 es una secuencia de ADNc que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2. La secuencia polinucleotídica que codifica al polipéptido de la SEC ID Nº 2 puede ser idéntica a la del polipéptido que codifica la secuencia de la SEC ID Nº 1

o puede ser una secuencia distinta de la SEC ID Nº 1, que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2. El polipéptido de la SEC ID Nº 2 está relacionado con otras proteínas de la familia reticulon, que tienen homología y/o similitud estructural con la proteína C específica neuroendocrina Humana (Roebroek y col., J. Biol. Chem. 268: 13439-13447, 1993). El polinucleótido de la SEC ID Nº 5 y el polipéptido codificado por la misma, SEC ID Nº 6, es una variante del polinucleótido de la SEC ID Nº 1 y su polipéptido codificado, SEC ID Nº 2.

Se espera que los polipéptidos preferidos de la presente invención, tengan, entre otras, funciones/propiedades biológicas similares a las de sus polipéptidos homólogos. Además, los polipéptidos y polinucleótidos preferidos de la presente invención tienen al menos una actividad MAGI.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un polipéptido que:

(a)

comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad, preferentemente al menos el 97-99 % de identidad, con la SEC ID Nº 4 sobre toda la longitud de la SEC ID Nº 4;

(b)

tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica, preferentemente al menos el 97-99 % idéntica, a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 4 sobre toda la longitud de la SEC ID Nº 4;

(c)

comprende los aminoácidos de la SEC ID Nº 4; y

(d)

es el polipéptido de la SEC ID Nº 4.

La secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 y la secuencia peptídica codificada por la misma derivan de secuencias EST (Etiquetas de Secuencia Expresada). Los expertos en la técnica reconocen que serán inevitables algunos errores de lectura en la secuencia de nucleótidos en las secuencias EST (véase Adams, M.D. y col, Nature 377 (sup) 3, 1995). Por consiguiente, la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 y la secuencia peptídica codificada a partir de la misma están por lo tanto sometidas a las mismas limitaciones intrínsecas en la exactitud de secuencia. Adicionalmente, la secuencia peptídica codificada por la SEC ID Nº 3 comprende una región de identidad o de estrecha homología y/o de estrecha similitud estructural (por ejemplo, una diferencia de aminoácidos conservativos) con la proteína homóloga más cercana o similar estructuralmente.

Como se describe en el presente documento, los polinucleótidos, pueden obtenerse usando técnicas de clonación y exploración convencionales a partir de una genoteca de ADNc derivada de ARNm en células de cerebro fetal y de médula espinal humanas (véase por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). Los polinucleótidos también pueden obtenerse a partir de fuentes naturales tales como genotecas de ADN genómico o pueden sintetizarse usando técnicas bien conocidas y disponibles en el mercado.

Cuando polinucleótidos de la invención se usan para la producción recombinante de polipéptidos de la presente invención, el polinucleótido puede incluir la secuencia codificante para el polipéptido maduro, por si mismo, o la secuencia codificante para el polipéptido maduro en marco de lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre-, o pro-o prepro-proteína u otras partes de péptidos de fusión. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilite la purificación de los polipéptidos fusionados. En determinadas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz y col., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821-824, o es una etiqueta de HA. El polinucleótido también puede contener secuencias 5’ y 3’ no codificantes, tales como secuencias transcritas, no traducidas, señales de corte y empalme y poliadenilación, sitios de unión a ribosomas y secuencias que estabilizan ARNm.

Los polinucleótidos que son idénticos, o que tienen suficiente identidad con una secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 5, pueden usarse como sondas de hibridación para el ADNc y ADN genómico o como cebadores para una reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR). Dichas sondas y cebadores pueden usarse para aislar los ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican polipéptidos de la presente invención y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes (incluyendo genes que codifican parálogos de fuentes humanas y ortólogos y parálogos de especies distintas al ser humano) que tienen una elevada similitud de secuencia con la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 5, típicamente al menos el 95 % de identidad. Generalmente, las sondas y cebadores preferidos comprenderán al menos 15 nucleótidos, preferentemente, al menos 30 nucleótidos y pueden tener al menos 50, si no al menos 100 nucleótidos. Las sondas particularmente preferidas tendrán entre 30 y 50 nucleótidos. Los cebadores particularmente preferidos tendrán entre 20 y 25 nucleótidos.

Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos de especies distintas al ser humano, mediante un procedimiento que comprende las etapas de explorar una genoteca, en condiciones de hibridación rigurosas, con una sonda marcada que tenga la secuencia de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 5 o un fragmento de las mismas, preferentemente al menos de 15 nucleótidos; y aislar el ADNc de longitud completa y los clones genómicos que contengan dicha secuencia polinucleotídica. El experto en la materia conoce bien estas técnicas de hibridación. Las condiciones de hibridación rigurosas preferidas incluyen incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50 %, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado; seguido de lavado de los filtros en 0,1 x SSC aproximadamente 65ºC.

El experto en la materia apreciará que, en muchos casos, una secuencia de ADNc aislada estará incompleta, ya que la región que codifica al polipéptido no se extiende a todo lo largo del extremo 5’. Esta es una consecuencia de la transcriptasa inversa, una enzima con “procesividad” intrínsecamente baja (una medición de la capacidad de la enzima para permanecer unida al molde durante la reacción de polimerización), no completando una copia de ADN del molde de ARNm durante la síntesis de la primera cadena de ADNc.

Existen diversos procedimientos disponibles y bien conocidos por los expertos en la materia para obtener los ADNc de longitud completa o ampliar los ADNc cortos, por ejemplo los basados en el procedimiento de Amplificación Rápida de los extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman y col, Proc Nat Acad Sci USA 85, 8998-9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ilustradas, por ejemplo, por la tecnología Marathon (marca registrada) (Clontech Laboratories Inc.), han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Maratón (marca registrada), los ADNc se han preparado a partir de ARNm extraído de un tejido seleccionado y una secuencia ‘adaptadora’ ligada sobre cada extremo. Después, se realiza la amplificación del ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5’ “perdido” del ADNc usando una combinación de cebadores oligonucleotídicos específicos de genes y específicos de adaptadores. Después, la reacción PCR se repite usando cebadores ‘anidados’, es decir, cebadores diseñados para hibridar dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico adaptador que híbrida además 3’ en la secuencia adaptadora y un cebador específico del gen que híbrida además 5’ en la secuencia génica conocida). Después, los productos de esta reacción pueden analizarse secuenciando ADN y un ADNc de longitud completa construido bien uniendo el producto directamente al ADNc existente para proporcionar una secuencia completa o realizando una PCR de longitud completa distinta usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5’.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden prepararse por procedimientos bien conocidos en la técnica a partir de células huéspedes, modificadas por ingeniería genética, que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, en el presente documento también se describen sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican a un polipéptido de la presente invención, células huéspedes que se modifican por ingeniería genética con dichos sistemas de expresión y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. También pueden usarse sistemas de traducción a celulares para producir dichas proteínas usando los ARN derivados de las construcciones de ADN.

Para la producción recombinante, las células huéspedes pueden modificarse por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o partes de los mismos para polinucleótidos. Los polinucleótidos pueden introducirse en las células huéspedes por procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis y col, Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook y col., (anteriormente). Los procedimientos preferidos de introducción de polinucleótidos en células huéspedes incluyen, por ejemplo, transfección por fosfato cálcico, transfección mediada con DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por legrado, introducción balística o infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de Streptococci, Staphylococci, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fúngicas, tales como células de levadura y células de Aspergillus; células de insecto tales como células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y células de melanoma de Bowes y células de plantas.

Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión, por ejemplo, sistemas derivados de cromosomas, de episomas, de virus; por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, papova virus, tales como el SV40, virus de vacunas, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulen, así como que generen expresión. Por lo general, puede usarse cualquier sistema

o vector que pueda mantener, propagar o expresar un polinucleótido para producir un polipéptido en un huésped. La secuencia de polinucleótidos apropiada puede insertarse en un sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook y col, (anteriormente). En el polipéptido deseado, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas, para permitir la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Si un polipéptido de la presente invención va a expresarse para su uso en ensayos de exploración, generalmente se prefiere que el polipéptido se produzca en la superficie de la célula. En este caso, las células pueden recogerse antes de su uso en el ensayo de exploración. Si el polipéptido se secreta en el medio, el medio puede recuperarse para recuperar y purificar el polipéptido. Si se produce intracelularmente, las células deben lisarse primero antes de recuperar el polipéptido.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes a través de procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación por sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónica o catiónica, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Para la purificación se usa, más preferentemente, la cromatografía líquida de alto rendimiento. Para replegar proteínas pueden usarse técnicas bien conocidas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, aislamiento y/o purificación.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la presente invención pueden usarse como reactivos de diagnóstico, mediante la detección de mutaciones en el gen asociado. La detección de una forma mutada del gen caracterizada por el polinucleótido de la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 5 en el ADNc o secuencia genómica y que está asociada con una disfunción proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadirse para, o definir, un diagnóstico de una enfermedad o susceptiblemente para una enfermedad, que produce la infra-expresión, sobre-expresión o expresión espacial o temporal modificada del gen. Los individuos portadores de mutaciones en el gen pueden detectarse al nivel de ADN mediante una diversidad de técnicas bien conocidas en la técnica.

Para el diagnóstico, los ácidos nucleicos pueden obtenerse a partir de células de sujetos, tales como de sangre, orina, saliva, biopsia tisular o material procedente de autopsia. Para la detección, puede usarse ADN genómico directamente o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR, preferentemente RT-PCR u otras técnicas de amplificación antes del análisis. También puede usarse ARN o ADNc de un modo similar. Las deleciones e inserciones pueden detectarse por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Pueden identificarse mutaciones puntuales hibridando ADN amplificado con secuencias de nucleótidos MAGI marcadas. Las secuencias perfectamente emparejadas pueden diferenciarse de los dúplex no emparejados por digestión con RNasa o por diferencias en las temperaturas de fusión. Las diferencias en las secuencias de ADN también puede detectarse por modificaciones en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles, con o sin agentes desnaturalizantes, o por secuenciación directa de ADN (véase, por ejemplo, Myers y col, Science (1985) 230:1242). Los cambios en la secuencia en localizaciones específicas también pueden ponerse de manifiesto por ensayos de protección con nucleasa, tales protección con RNasa y S1 o el procedimiento de escisión química (véase Cotton y col., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401).

Puede construirse una matriz de sondas oligonucleotídicas que comprenda la secuencia polinucleotídica MAGI o fragmentos de la misma para dirigir la exploración eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas. Dichas matrices son preferentemente matrices o rejillas de elevada densidad. Los procedimientos de la tecnología de matriz se conocen bien y tienen aplicabilidad general y pueden usarse para abordar una diversidad de cuestiones en genética molecular incluyendo la expresión génica, el ligamiento genético y la variabilidad genética, véase, por ejemplo, M.Chee y col., Science, 274, 610-613 (1996) y otras referencias indicadas en el presente documento.

La detección de niveles anómalamente aumentados o disminuidos del polipéptido o expresión de ARNm también puede usarse para diagnosticar o determinar la susceptibilidad de un sujeto en relación con una enfermedad de la invención. La expresión disminuida o aumentada puede medirse al nivel del ARN usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos tales como, por ejemplo, amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección con RNasa, transferencia de Northern y otros procedimientos de hibridación. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar niveles de una proteína, tales como un polipéptido de la presente invención, en una muestra derivada de un huésped. Dichos procedimientos de ensayo incluyen radio-inmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western y ensayos ELISA.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican a los polipéptidos de la presente invención son valiosas para estudios de localización de cromosomas. La secuencia se dirige especialmente a, y puede hibridarse con, una localización particular en un cromosoma humano individual. El mapeo de secuencias relevantes para cromosomas de acuerdo con la presente invención es una primera etapa importante en la correlación de aquellas secuencias con enfermedades asociadas a genes. Una vez que se ha mapeado una secuencia en una localización cromosómica exacta, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en

V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible on-line a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). Después, la relación entre genes y enfermedades que se han mapeado, con respecto a la misma región cromosómica, se identifica mediante análisis de ligamiento (co-herencia de genes físicamente adyacentes). Las localizaciones cromosómicas humanas exactas para una secuencia genómica (fragmento génico etc.) puede determinarse usando Mapeo Hibrido por Radiación (RH) (Walter, M. Spillett, D., Thomas, P., Weissenbach, J., and Goodfellow, P., (1994) A method for constructing radiation hybrid maps of wole genomes, Nature Genetics 7, 22-28). Una serie de paneles RH se encuentran disponibles en Research Genetics (Huntsville, AL, USA) por ejemplo el panel RH de GeneBridge4 (Hum Mol Genet 1996 Mar; 5(3): 339-46 A radiation hibrid map of the human genome. Gyapay G, Schmitt k, Fizames C, Jones H, Vega-Czarny N, Spillet D, Muselet D, Prud´Homme JF, Dib C, Morissette J, Weissenbach J, Goodfellow PN). Para determinar la localización cromosómica de un gen usando este panel, se realizaron 93 PCR usando cebadores diseñados a partir del gen de interés en los ADN de RH. Cada uno de estos ADN contienen fragmentos genómicos humanos aleatorios mantenidos en un fondo de hámster (líneas celulares híbridas ser humano/hámster). Estas PCR dan lugar a 93 valores que indican la presencia o ausencia del producto PCR del gen de interés. Estos valores se comparan con valores creados usando productos PCR a partir de secuencias genómicas de localización conocida. Esta comparación se realiza en http://www.genome.wi.mit.edu/. El gen de la presente invención mapea en el cromosoma 2p21 humano.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican a los polipéptidos de la presente invención son también herramientas valiosas para estudios de expresión en tejidos. Dichos estudios permiten la determinación de modelos de expresión de dichos polinucleótidos que pueden proporcionar una indicación en cuanto a los modelos de expresión de los polipéptidos codificados en los tejidos, detectando los ARNm que los codifica. Las técnicas usadas se conocen bien en la técnica e incluyen técnicas de hibridación in situ para clones ordenados sobre una rejilla, tal como hibridación en micromatriz de ADNc (Schena y col., Science, 270, 467-470, 1995 y Shalon y col., Genomo Res, 6, 639-645, 1996) y técnicas de amplificación de nucleótidos tal como PCR. Un procedimiento preferido usa la tecnología TAQMAN (marca Registrada) disponible de Perkin Elmer. Los resultados de estos estudios pueden proporcionar una indicación de la función normal del polipéptido en el organismo. Además, estudios comparativos del modelo de expresión normal de los ARNm con los ARNm codificados por una forma alternativa del mismo gen (por ejemplo, uno que tiene una modificación en el polipéptido que codifica una posible mutación o reguladora) pueden proporcionar ideas valiosas dentro de la función de los polipéptidos de la presente invención o aquellos de expresión inapropiada de los mismos en enfermedades. Dicha expresión inapropiada puede ser de una naturaleza temporal, espacial o simplemente cuantitativa. Los polipéptidos de la presente invención se expresan en el cerebro, corazón, hígado, músculo esquelético, páncreas y riñón, basándose en

datos de transferencia de Northern proporcionados en la Figura 1.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a anticuerpos. Los polipéptidos de la invención o sus fragmentos, o células que los expresan, pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos que son inmunoespecíficos para los polipéptidos de la presente invención. La expresión “inmunoespecífico” significa que los anticuerpos tienen afinidad sustancialmente mayor para los polipéptidos de la invención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos de la presente invención pueden obtenerse administrando a un animal, preferentemente un animal no humano, los polipéptidos

o los fragmentos portadores del epítope, o células, usando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del híbridoma (Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma con linfocitos B humanos (Kozbor y col., Inmunology Today (1983) 4: 72) y la técnica del hibridoma con el VEB (Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

También pueden adaptarse técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios, tales como las descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778, para producir anticuerpos monocatenarios contra los polipéptidos de la presente invención. Además, también pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos, incluyendo otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden usarse para aislar o identificar clones que expresan el polipéptido o para purificar los polipéptidos por cromatografía de afinidad. También pueden usarse anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención para tratar, entre otras, enfermedades de la invención.

Los polipéptidos de la presente invención también pueden usarse como vacunas. Por consiguiente, en el presente documento también se describe un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un mamífero que comprende inocular al mamífero un polipéptido de la presente invención, adecuado para producir anticuerpos y/o respuesta inmune de linfocitos T, incluyendo, por ejemplo, linfocitos T productores de citocina o linfocitos T citotóxicos, para proteger al animal de la enfermedad, tanto si la enfermedad ya se ha establecido en el individuo como si no. También puede inducirse una respuesta inmunológica en un mamífero, mediante un procedimiento que comprende suministrar un polipéptido de la presente invención mediante un vector que dirige la expresión del polinucleótido y que codifica el polipéptido in vivo para inducir dicha respuesta inmunológica para producir anticuerpos que protejan al animal de las enfermedades de la invención. Una forma de administrar el vector es acelerando el mismo hacia el interior de las células deseadas como un revestimiento sobre partículas o de otra manera. Dicho vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, un ácido nucleico modificado o un hibrido de ADN/ARN. Para su uso como vacuna, un polipéptido o vector de ácido nucleico se proporcionará normalmente como una formulación de vacuna (composición). La formulación puede comprender adicionalmente un vehículo adecuado. Dado que un polipéptido puede degradarse en el estómago, este se administrará, preferentemente, por vía parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales precintados y pueden conservarse en un estado liofilizado que únicamente requiere la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso. La formulación de vacuna también puede incluir sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación, tales como sistemas de aceite en agua y otros sistemas conocidos en la técnica. La dosificación dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede determinarse fácilmente por experimentación rutinaria.

Los polipéptidos de la presente invención tienen una o más funciones biológicas que son de interés en una o más patologías, en particular las enfermedades de la invención mencionadas anteriormente en el presente documento. Por lo tanto, es útil identificar compuestos que estimulen o inhiban la función o el nivel del polipéptido. Por consiguiente, en el presente documento, también se describe un procedimiento de exploración de compuestos para identificar aquellos que estimulen o inhiban la función o nivel del polipéptido. Dichos procedimientos identifican agonistas o antagonistas que pueden usarse para fines terapéuticos y profilácticos para dichas enfermedades de la invención como se ha mencionado anteriormente en el presente documento. Los compuestos pueden identificarse a partir de una diversidad de fuentes, por ejemplo, células, preparaciones acelulares, bibliotecas químicas, colecciones de compuestos químicos y mezclas de productos naturales. Dichos agonistas o antagonistas, identificados de esta manera, pueden ser sustratos naturales o modificados ligando, receptores, enzimas etc., como puede ser el caso del polipéptido; un mimético estructural funcional del mismo (véase Coligan y col., Current Protocols in Inmunology 1 (2): Capítulo 5 (1991)) o una molécula pequeña.

El procedimiento de exploración puede medir simplemente la unión de un compuesto

candidato con el polipéptido o con células o membranas portadoras del polipéptido o con una proteína de fusión del mismo, por medio de un marcador directa o indirectamente asociado con el compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de exploración puede implicar la medición o detección (cuantitativa o cualitativa) de la unión competitiva de un compuesto candidato con el polipéptido contra un competidor marcado (por ejemplo agonista o antagonista). Además, estos procedimientos de exploración pueden ensayarse si el compuesto candidato produce una señal generada por activación o inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados para las células portadoras del polipéptido. Los inhibidores de activación generalmente se ensayan en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto del agonista sobre la activación mediante la presencia del compuesto candidato. Adicionalmente, los procedimientos de exploración pueden comprender simplemente las etapas de, mezclar un compuesto candidato con una solución que contenga un polipéptido de la presente invención, para formar una mezcla, medir una actividad MAGI en la mezcla y comparar la actividad de la mezcla que contiene MAGI, con una mezcla de control que no contiene compuesto candidato.

Los polipéptidos de la presente invención pueden usarse en procedimientos de exploración convencionales de baja capacidad y también en formatos de exploración de alto rendimiento (EAR). Dichos formatos de EAR no solamente incluyen el uso bien establecido de placas de microtitulación de 96, más recientemente, 384 pocillos sino también nuevos procedimientos tales como el procedimiento del nanopocillo descrito por Shulleck y col., Anal Biochem., 246, 20-29, (1997).

También pueden usarse proteínas de fusión, tales como las fabricadas a partir de fragmentos de Fc y el polipéptido MAGI, como se ha descrito anteriormente en el presente documento, para ensayos de exploración de alto rendimiento para identificar antagonistas para el polipéptido de la presente invención (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995); and K. Johanson y col., J Biol Chem, 270(16): 9459-9471 (1995)).

También pueden usarse polipéptidos y anticuerpos para el polipéptido de la presente invención, para configurar procedimientos de exploración para detectar el efecto de compuestos añadidos en la producción de ARNm y de polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ELISA para medir niveles, secretados o asociados a células, del polipéptido usando anticuerpos monoclonales y policlonales por procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Este puede usarse para descubrir agentes que puedan inhibir o potenciar la producción del polipéptido (también denominado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente.

También puede usarse un polipéptido de la presente invención para identificar

receptores unidos a membrana o solubles, si los hubiere, mediante técnicas de unión a receptor convencionales conocidas en la técnica. Estas incluyen, pero sin limitación, ensayos de unión a ligando y de entrecruzamiento, en los que el polipéptido se marca con un isótopo radioactivo (por ejemplo, 125I), químicamente modificado (por ejemplo, biotinilado), o fusionado con una secuencia peptídica adecuada para la detección o purificación, y se incuba con una fuente del supuesto receptor (células, membranas celulares, sobrenadantes celulares, extractos tisulares, fluidos corporales). Otros procedimientos incluyen técnicas biofísicas tales como resonancia de plasmón superficial y espectroscopia. Estos procedimientos de exploración también pueden usarse para identificar agonistas y antagonistas del polipéptido que compiten con la unión del polipéptido a sus receptores, si los hubiere. En la técnica se conocen bien procedimientos convencionales para realizar dichos ensayos.

Los ejemplos de antagonistas de polipéptidos de la presente invención incluyen anticuerpos o, en algunos casos, oligonucleótidos o proteínas que están estrechamente relacionados con los ligandos, sustratos, receptores, enzimas etc., como puede ser el caso del polipéptido, por ejemplo, un fragmento de los ligandos, sustratos, receptores, enzimas, etc.; o una molécula pequeña que se une al polipéptido de la presente invención pero no provoca una respuesta, de manera que se impide la actividad del polipéptido.

Los procedimientos de exploración también pueden implicar el uso de tecnología transgénica y genes MAGI. La técnica de construcción de animales transgénicos está bien establecida. Por ejemplo, el gen MAGI puede introducirse mediante microinyección en el pronúcleo macho de oocitos fertilizados, transferencia retroviral en embriones pre-o post-implantados, o inyección de células madre embriónicas, modificadas genéticamente, tales como por electroporación, en blastocistos huéspedes. Los animales transgénicos particularmente útiles se denominan animales “knock-in” en los que un gen de un animal se sustituye por el equivalente de un ser humano dentro del genoma de ese animal. Los animales transgénicos knock-in son útiles en los procedimientos de descubrimiento de fármacos, para la validación de dianas, en las que el compuesto es específico para la diana humana. Otros animales transgénicos útiles se denominan animales “knock-out” en los que la expresión de ortólogo del animal de un polipéptido de la presente invención y codificado por una secuencia de ADN endógena en una célula, está parcial o completamente anulada. El gen knock-out puede dirigirse a células o tejidos específicos, puede producirse solamente en determinadas células o tejidos, como una consecuencia de las limitaciones de la tecnología, o puede producirse en todas, o sustancialmente en todas, las células del animal. La tecnología de animales transgénicos también ofrece un sistema de clonación -expresión del animal completo, en el que los genes introducidos se expresan para proporcionar grandes cantidades de polipéptidos de la presente invención.

Glosario

Para facilitar la comprensión de algunos términos usados con frecuencia, anteriormente en el presente documento, se proporcionan las siguientes definiciones.

“Anticuerpos”, como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos, monocatenarios anticuerpos inmunizados, así como fragmentos de Fab, incluyendo los productos de una librería de expresión de Fab u otra inmunoglobulina.

“Aislado” significa modificado, “por la mano del hombre”, de su estado natural, es decir, si está presente en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su entorno natural o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo, no está “aislado”, pero el mismo polinucleótido o polipéptido está “aislado” si se separa de los materiales con los que coexiste en su estado natural, como se usa el término en el presente documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante está “aislado” incluso si este aún está presente en dicho organismo, que puede ser un organismo vivo o no vivo.

“Polinucleótido” generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido (ARN) o polidesoxirribonucleótido (ADN), que puede ser un ARN o un ADN no modificado o modificado. Los “polinucleótidos” incluyen, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que sea una mezcla de regiones mono-y bicatenarias, ARN mono-y bicatenario y ARN que sea una mezcla de regiones mono-y bicatenarias, moléculas híbridas que comprendan ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios o una mezcla de regiones mono-y bicatenarias. Además, “polinucleótido” se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o ARN y ADN. El término “polinucleótido” también incluye los ADN o los ARN que contienen una o más bases modificadas y los ADN o los ARN con estructuras modificadas para conferir estabilidad o para otras razones. Las bases “modificadas” incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Pueden realizarse diversas modificaciones con respecto al ADN y al ARN; por lo tanto, “polinucleótido” incluye formas de polinucleótidos química, enzimática o metabólicamente modificadas, como típicamente se encuentran en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. “Polinucleótido” también incluye polinucleótidos relativamente cortos, frecuentemente denominados oligonucleótidos.

“Polipéptido” se refiere a cualquier polipéptido que comprende dos o más aminoácidos

unidos entre sí por enlaces peptídicos o por enlaces peptídicos modificados, es decir isoésteres peptídicos. “Polipéptido” se refiere a cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros y a cadenas más largas, generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos que codifican un gen. Los “polipéptidos” incluyen secuencias de aminoácidos modificadas por procedimientos naturales, tales como procesamiento postraduccional o por técnicas de modificación química bien conocidas en el campo técnico. Dichas modificaciones se describen bien en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación. Las modificaciones pueden darse en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la estructura peptídica, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios de un polipéptido determinado. Además, un polipéptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, como resultado de una ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificaciones. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procedimientos naturales postraduccionales o pueden obtenerse por procedimientos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, biotinilación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclización, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gammacarboxilación, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilización, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, fenilación, racemización, selenilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, tales como argilinación y ubiquitinación (véase, por ejemplo. Proteins – Structure and Molecular Propoerties. 2ª Ed.. T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York. 1993; Wold. F.. Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects. 1-12. In Post-translational Covalent Modification of Proteins. B. C. Johnson, Ed.. Academic Press. New York. 1983; Seifter y col., “Analysis for proteins modifications and nonprotein cofactors”. Meth Enzimol, 182. 626-646, 1990, and Rattan y col., “Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci. 663. 48-62. 1992).

“Fragmento” de una secuencia polipeptídica se refiere a una secuencia polipeptídica que es más corta que la secuencia de referencia pero que conserva esencialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido de referencia. “Fragmento” de una secuencia polinucleotídica se refiere a una secuencia polinucleotídica que es más corta que la secuencia de referencia de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº:5.

“Variante” se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva las propiedades esenciales de los mismos. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no modificar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polipéptido de referencia. Cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de los aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se indica a continuación. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia. Generalmente, las modificaciones están limitadas de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son muy similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, inserciones, deleciones en cualquier combinación. El código genético puede codificar o no un resto aminoacídico sustituido o insertado. Las sustituciones típicas conservativas incluyen, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu: Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe y Tyr. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como un alelo, o puede ser una variante que se sabe que no es de origen natural. Las variantes de origen no natural de polinucleótidos o polipéptidos pueden obtenerse por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa. Como variantes también se incluyen los polipéptidos que incluyen una o más modificaciones postraduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación, metilación, ADP riboxilación y similar. Las realizaciones incluyen metilación del aminoácido N-terminal, fosforilación de serinas y treoninas y modificación de glicinas C-terminales.

“Alelo” se refiere a una de dos o más formas alternativas de un gen que se produce en un locus determinado en el genoma.

“Polimorfismo” se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos (y secuencia polipeptídica codificada, si es relevante) en una posición determinada en el genoma dentro de una población.

“Polimorfismo de un solo Nucleótido” (SNP) se refiere a la aparición de variabilidad de nucleótidos en una sola posición de nucleótido en el genoma, dentro de una población. Un SNP puede producirse dentro de un gen o dentro de regiones intergénicas del genoma. El SNP pueden ensayarse usando Amplificación Específica de Alelos (ASA). Para el procedimiento se necesitan al menos 3 cebadores. Para el polimorfismo que se está ensayando se usa un cebador común en complemento inverso. Este cebador común puede estar entre 50 y 1.500 pb a partir de la base polimórfica. Los otros dos (o más) cebadores son idénticos entre sí excepto que la base final 3’ baila para coincidir con uno de los dos (o más) alelos que constituyen el polimorfismo. Después, se realizan dos (o más) reacciones PCR en el ADN muestra, usando cada una el cebador común y uno de los Cebadores Específicos de Alelo.

“Variante de corte y empalme”, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de ADNc producidas a partir de moléculas de ARN inicialmente transcritas a partir de la misma secuencia de ADN genómico pero que han experimentado corte y empalme de ARN alternativo. El corte y empalme de ARN alternativo se produce cuando un transcrito de ARN primario se somete a corte y empalme, generalmente para la eliminación de intrones, dando como resultado la producción de más de una molécula de ARNm cada una de las cuales puede codificar diferentes secuencias de aminoácidos. El término variante de corte y empalme también se refiere a proteínas codificadas por las anteriores moléculas de ADNc.

“Identidad” refleja una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas, o dos o más secuencias polinucleotídicas, determinada comparando las secuencias. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido con nucleótido o aminoácido con aminoácido de las dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, respectivamente, sobre la longitud de las secuencias a comparar.

“% de Identidad” – Para secuencias en las que no existe una correspondencia exacta, puede determinarse un “% de identidad”. En general, las dos secuencias a comparar se alinean para proporcionar una máxima correlación entre las secuencias. Esto puede incluir la inserción de “huecos” en una o en las dos secuencias, para potenciar el grado de alineamiento. Puede determinarse un % de identidad sobre toda la longitud de cada una de las secuencias a comparar (denominado alineamiento global), que es particularmente adecuado para secuencias de la misma longitud o muy similar o sobre longitudes definidas más cortas (denominadas alineamiento local) que es más adecuado para secuencias de distinta longitud.

“Similitud” es una medición adicional, más sofisticada, de la relación entre dos secuencias polipeptídicas. En general, “similitud” significa una comparación entre los aminoácidos de dos cadenas polipeptídicas, basada en resto por resto, teniendo en cuenta no solamente las correspondencias exactas entre un par de restos, uno de cada una de las secuencias a comparar (como para la identidad) sino también, cuando no hay una correspondencia exacta, ya sea sobre una base evolutiva, un resto es un sustituto probable para el otro. Esta probabilidad tiene una “puntuación” asociada a partir de la cual puede determinarse el % de similitud de las dos secuencias.

En la técnica se conocen bien procedimientos para comparar la identidad y similitud de dos o más secuencias. Por lo tanto, programas disponibles, por ejemplo, en el Paquete Informático de Análisis de Secuencia Wisconsin, versión 9.1 (Devereux J. y col., Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984, disponible de Genetics Computer Group, Madison. Wisconsin. USA), por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP pueden usarse para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de similitud entre dos secuencias polipeptídicas. BESTFIT usa el algoritmo de “homología local” de Smith y Waterman (J Mol Biol, 147, 195-197, 1981. Advances in Aplied Mathematics. 2, 482-459, 1981) y encuentra la región similitud más sencilla entre dos secuencias. BESTFIT es más apropiado para comparar dos polinucleótidos o dos secuencias polipeptídicas de distinta longitud, el programa supone que la secuencia más corta representa una parte de la más larga. En comparación, GAP alinea dos secuencias, buscando una “máxima similitud”, de acuerdo con el algoritmo de Neddleman y Wunsch (J Mol Biol, 48, 443-453. 1970). GAP es más apropiado para comparar secuencias que tienen, aproximadamente, la misma longitud y se espera un alineamiento sobre toda la longitud. Preferentemente, los parámetros “Ponderación de Hueco” y “Ponderación de longitud” usados en cada programa es 50 y 3, para secuencias polinucleotídicas y 12 y 4 para secuencias polipeptídicas, respectivamente. Preferentemente, los % de identidad y similitud se determinan cuando las dos secuencias a comparar están óptimamente alineadas.

En la técnica también se conocen otros programas para determinar la identidad y/o similitud entre secuencias, por ejemplo la familia de programas BLAST (Altschul S F y col. J Mol Biol, 215, 403-410. 1990. Altschul S F y col. Nucleic Acids Res.. 25: 389-3402, 1997, disponible en el National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda. Maryland, USA y accesible a través de la página principal de la NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R. Methods in Enzymology, 183, 63-99. 1990: Pearson W R and Lipman D J. Proc Nat Acad Sci USA. 85. 2444-24488, 1988, disponible como parte del Paquete Informático de Análisis de Secuencia Wisconsin).

Preferentemente, se usa la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff S and Henikoff J G, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 89, 10915-10919, 1992) en comparaciones de secuencias polipeptídicas que incluyen las secuencias de nucleótidos que se traducen primero en las secuencias de aminoácidos antes de la comparación.

Preferentemente, el programa BESTFIT se usa para determinar el % de identidad de un polinucleótido de secuencia problema o una secuencia polipeptídica con respecto a un polinucleótido de referencia o una secuencia polipeptídica, estando la secuencia problema y la secuencia de referencia óptimamente alineadas y los parámetros del programa establecidos en el valor por defecto, como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

“Índice de Identidad” es una medición de relación de secuencia que puede usarse para comparar una secuencia candidata (polinucleótido o polipéptido) y una secuencia de referencia. Por lo tanto, por ejemplo, una secuencia polinucleotídica candidata que tiene, por ejemplo, un Índice de Identidad de 0,95 comparada con una secuencia polinucleotídica de referencia es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polinucleotídica candidata puede incluir por término medio hasta cinco diferencias por cada 100 nucleótidos de la secuencia de referencia. Dichas diferencias se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución de nucleótido, incluyendo transición y la transversión o inserción. Estas diferencias pueden producirse en las posiciones terminales 5’ o 3’ de la secuencia polinucleotídica de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia polinucleotídica que tenga un Índice de Identidad del 0.95 en comparación con una secuencia polinucleotídica de referencia, un promedio de hasta 5 de cada 100 de los nucleótidos en la secuencia de referencia, puede estar delecionado, sustituido o insertado o una combinación de estos, como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Lo mismo se aplica, con los cambios necesarios, para otros valores del Índice de Identidad, por ejemplo 0,96, 0,97, 0,98 y 0,99.

De manera similar, para un polipéptido, una secuencia polipeptídica candidata que tenga, por ejemplo, un Índice de Identidad de 0,95 en comparación con una secuencia polipeptídica de referencia, es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia polipeptídica puede incluir un promedio de hasta cinco diferencias por cada 100 aminoácidos de la secuencia de referencia. Dichas diferencias se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa o inserción. Estas diferencias pueden producirse en las posiciones amino-y o carboxi-terminal de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia polipeptídica que tenga un Índice de Identidad de 0,95 en comparación con una secuencia polipeptídica de referencia, un promedio de hasta 5 en cada 100 de los aminoácidos en la secuencia de referencia puede delecionarse, sustituirse o insertarse, o cualquier combinación de estos, como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Lo mismo se aplica, con los cambios necesarios, para otros valores del Índice de Identidad, por ejemplo 0,96, 0,97, 0,98 y 0,99.

La relación entre el número de diferencias de nucleótidos o de aminoácidos y el índice de identidad puede expresarse en la siguiente ecuación:

en la que:

na es el número de diferencias de nucleótidos o aminoácidos,

xa es el número total de nucleótidos o aminoácidos en la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 5 o

SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 6, respectivamente,

I es el Índice de Identidad.

• es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de xae I se redondea a la baja hasta el entero más próximo antes de restarlo de xa.

“Homologo” es un término genérico usado en la técnica para indicar una secuencia polinucleotídica o polipeptídica que posee un alto grado de relación de secuencia con respecto a una secuencia referencia. Dicha relación puede cuantificarse determinando el grado de identidad y/o similitud entre las dos secuencias como se ha definido anteriormente en el presente documento. Incluidos dentro de este término genérico se encuentran los términos “ortólogo” y “parálogo”. “Ortólogo” se refiere a un polinucleótido o polipéptido que es el equivalente funcional del polinucleótido o polipéptido en otra especie. “Parálogo” se refiere a un polinucleótido o polipéptido que dentro de la misma especie es funcionalmente similar.

“Proteína de fusión” se refiere a una proteína codificada por dos genes fusionados, a menudo no relacionados, o fragmentos de los mismos. En un ejemplo, EP-A-0 464*** describe proteínas de fusión que comprenden diversas partes de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, el uso de una región Fc de inmunoglobulina como una parte de una proteína de fusión es ventajosa para su uso en terapia y diagnosis dando como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas [véase, por ejemplo el documento EP-A 0232 262]. Por otro lado, para algunos usos sería deseable poder suprimir la parte Fc después de que las proteínas de fusión se hayan expresado, detectado y purificado.

Ejemplo -Distribución Tisular de MAGI humano

Se hibridó una sonda de ADN marcada radiactivamente que corresponde a las 2kb de C-terminal del marco de lectura abierto de MAGI con un filtro Clontech MTN-1 que contenía cargas equivalentes de ARNm de cada uno de los tejidos indicados y después se lavó con elevada rigurosidad para detectar solamente los transcritos de MAGI. Los resultados se muestran en la Figura 1. Al menos tres bandas son visibles (>5 kb, 2,2 kb y <2 kb). El transcrito más largo está presente en el cerebro adulto y en menor grado en el corazón y músculo esquelético. El transcrito del medio está presente a niveles esencialmente similares en todos los tejidos mientras que los transcritos más cortos se expresan más específicamente, más abundantemente en el músculo esquelético, cerebro y riñón con niveles más bajos

5 detectables en el páncreas.

La Figura 1 representa una transferencia de Northern mostrando la distribución tisular de MAGI humano. El carril 1 contiene ARN de corazón de adulto humano. El carril 2 contiene ARN de cerebro de adulto humano. El carril 3 contiene ARN de placenta humana. El carril 4 contiene ARN de pulmón de adulto humano, el carril 5 contiene ARN de hígado de adulto

10 humano, el carril 6 contiene ARN de músculo esquelético de adulto humano, el carril 7 contiene ARN de riñón de adulto humano y el carril 8 contiene ARN de páncreas de adulto humano.

23

INFORMACIÓN DE SECUENCIA SEC ID Nº:1

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SEC ID Nº:3

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SEC ID Nº:5

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SEC ID Nº:6

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5

LISTA DE SECUENCIAS

<110> SmithKline Beecham plc

<120> Nuevos Compuestos 10 <130> GP30165

<160> 6

<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

<210> 1 <211> 3579

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<210> 2

<211> 1192

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5 <400> 2

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<210> 3

<211> 868

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

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<210> 4

<211> 289

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

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<210> 5

<211> 1122

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<210> 6

<211> 373

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

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Claims (5)

1.

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con la de la SEC ID Nº: 4 en toda la longitud de la SEC ID Nº: 4.

2.

Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

5

3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es el polipéptido de la SEC 10 ID Nº: 4.

4. Un anticuerpo que es inmunoespecífico para un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 3.

15 5. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, que es un anticuerpo monoclonal.

6. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, que es un anticuerpo monocatenario.

20 7. Una línea celular que expresa un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.