JP2003531635A - ヒト・ウィングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）様遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｗｎｔ−８Ｄのポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにかかるポリペプチドを組換え技術によって製造するための方法が開示される。また、診断アッセイにおいて、該Ｗｎｔ−８Ｄのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、以降、時に、「ｗｉｎｇｌｅｓｓ／ｉｎｔ ８Ｄ（Ｗｎｔ−８Ｄ）
」と称する、新たに同定されたポリペプチド、およびかかるポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、診断ならびに、治療において潜在的に有用なアゴニス
ト、アンタゴニストとなりえる化合物の同定におけるそれらの使用、ならびに、
かかるポリヌクレオチドの製造に関する。

【０００２】 （発明の背景） 医薬探索プロセスは、現在、「機能的ゲノミクス」、すなわち、ハイ・スルー
プットな、ゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を取り込むことで、根本的な革新
を経験しつつある。治療の標的として、遺伝子および遺伝子産物を同定する手段
として、この方法は、急速に、「ポジショナル・クローニング」に基づく従前の
方法に取って代わりつつある。表現型、すなわち、生物学的機能または遺伝子的
疾患を同定し、その後、その遺伝子地図の位置に基づいて、その原因となる遺伝
子の探知がなされる。

【０００３】 機能的ゲノミクスは、ハイ・スループットなＤＮＡ配列決定技術、および現に
利用可能な多くの分子生物学データベースから、潜在的な重要性を有する遺伝子
配列を同定するためのバイオ・インフォマティクスの様々なツールに、大きく頼
っている。医薬探索の標的として、さらなる遺伝子およびその関連するポリペプ
チド／タンパク質を同定し、その特定を行うことが引き続き求められている。

【０００４】 （発明の概要） 本発明は、Ｗｎｔ−８Ｄ、特には、Ｗｎｔ−８ＤポリペプチドおよびＷｎｔ−
８Ｄポリヌクレオチド、組換え体およびその製造方法に関する。かかるポリペプ
チドおよびポリヌクレオチドは、それらに限定はされないものの、喘息、アルツ
ハイマー、ガン、心筋症、鬱病、統合失調症、一般的な精神異常、虚血症、卒中
、創傷治癒、腎臓疾患、肺疾患、異常なアポトーシス、組織の改造および幹細胞
治療を含む、特定の疾患（以降、「本発明の疾患」と称する）を治療する方法に
関連して、注目されている。さらなる形態において、本発明は、本発明により提
供される材料を使用して、アゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、阻害剤）
を同定するための方法、ならびにその同定された化合物を用いて、Ｗｎｔ−８Ｄ
の不均衡に関連する症状を治療するための方法に関する。さらに他の形態におい
て、本発明は、不適当なＷｎｔ−８Ｄの活性および濃度に付随する疾患を検出す
るための診断アッセイにも関する。

【０００５】 （発明の説明） 第１の形態において、本発明はＷｎｔ−８Ｄポリペプチドに関する。かかるポ
リペプチドには、 （ａ）配列番号：１の配列を含んでなるポリヌクレオチドによってコードされ
る単離されたポリペプチド； （ｂ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含んでなる
単離されたポリペプチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチド配列を含んでなる単離されたポリペプチド
； （ｄ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％の同一性を有する単離されたポリペプチド； （ｅ）配列番号：２のポリペプチド配列；ならびに （ｆ）配列番号：２のポリペプチド配列と比較して、０．９５、０．９６、０
．９７、０．９８または０．９９の同一性指標を有するポリペプチド配列を有す
るか、または含んでなる単離されたポリペプチド； （ｇ）（ａ）〜（ｆ）に記載のかかるポリペプチドのフラグメントおよび変異
体 が含まれる。

【０００６】 本発明のポリペプチドは、ｗｉｎｇｌｅｓｓ／ｉｎｔファミリーのポリペプチ
ドの一員であると考えられる。マウスｉｎｔ−１遺伝子は、本来はマウス乳腺腫
瘍ウイルスの挿入により遺伝子活性座として確認されていた。該マウス遺伝子を
クローンし、さらに配列決定した結果、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ）断片極性遺伝子ウィングレスと高い割合で相同性を示し、フライ（ｆｌｙ）
を生み出す断片において、パターンの形成に関与する（ＭｃＭａｈｏｎ Ａ．Ｐ
．及びＭｏｏｎ Ｒ．Ｔ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０７Ｓｕｐｐｌ．、１
６１−１６７、１９８９）。最近の数年間においては、ｉｎｔ−１およびＷｉｎ
ｇｌｅｓｓは、脊椎動物および無脊椎動物において見られる、糖タンパク質に関
連する大きなファミリーに属していることが確認されている。この認識により、
該ファミリーのメンバーはＷｎｔと改名され、ｉｎｔおよびＷｉｎｇｌｅｓｓの
アマルガムである。

【０００７】 Ｗｎｔシグナルは、線虫、ハエ、カエルおよびヒトと様々な種において、細胞
の増殖および分化を調節する（例えば、Ｃａｄｉｇａｎ，Ｋ．Ｍ．およびＮｕｓ
ｓｅ，Ｒ．、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１、３２８６−３３０５、１９９７）。Ｗ
ｎｔは、縮れた７ＴＭドメイン受容体ファミリーのメンバーにより認識される。
細胞において、シグナルは、他のタンパク質とは異なる乱雑な、ａｘｉｎ、ＧＳ
Ｋ−３、大腸線種様ポリポーシス（ＡＰＣ）、β−カテニン／アルマジロおよび
ＨＭＧ−タンパク質ファミリーＬＥＦ／ＴＣＦを合体した複雑なタンパク質クラ
スターを介して形質導入される（例えば、ｗｎｔシグナルに関する最近の参照文
献、Ｐｆｅｉｆｅｒ，ＭおよびＰｏｌａｋｉｓ，Ｐ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７
、１６０６−１６０９、２０００）。

【０００８】 多くの実験の結果から、様々なヒトの疾患が指摘され、それらにおいて異常な
ｗｎｔシグナルが発見された。最も目立った疾患の関連性は、ｗｎｔシグナルと
ガンの間においてである。原型癌遺伝子ｉｎｔ−１は、スコア可能な表現型を基
にして定義されており、乳がんの原因となるウイルス誘発異所性発現である。し
たがって、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ｂおよびＷｎｔ１０ｂはヒト乳がんに
関連している（Ｈｕｇｕｅｔ，Ｅ．Ｌ． ｅｔ ａｌ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５４、２６１５−２６２１、１９９４；Ｂｕｉ，Ｔ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．、Ｏｎ
ｃｏｇｅｎｅ １４、１２４９−１２５３、１９９７）。かなり多くの場合、ｗ
ｎｔ遺伝子（もしくはその異常な発現）においてではなく、分子内シグナル形質
導入カスケード関連の構成物質において、突然変異に関連しているが、ヒト結腸
直腸ガンは異常ｗｎｔシグナルと関連している（主に、ＡＰＣまたはβ−カテニ
ンにおける突然変異；Ｓｍｉｔｈ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ ８１、４９６−５０２、１９９９；Ｌａｕｒｅｎｔ−Ｐｕｉｇ Ｐ．ｅｔ
ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．Ｓｕｐｐｌ、Ｓ３９−４７、１
９９９）。一方、異常なｗｎｔシグナルは肺、乳房および前立腺ガン、メラノー
マ（ｌｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ． ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５、３４
９５−３４９９、１９９５）、髄芽細胞腫（Ｈｕａｎｇ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．、
Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６、４３３−４３７、２０００）、散発性肝芽種
（Ｓａｔｏｈ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４、２４５−２５
０、２０００；Ｊｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１５２
、４５−５１、２０００）または子宮内膜腫瘍（Ｂｕｉ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．
、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７５、１１３１−１１３６、１９９７）に及ぶ腫瘍組
織において見られる。興味深いことに、ｗｎｔシグナルの分泌阻害剤として公知
のＤｋｋ遺伝子は、分化組織において高い濃度で発現していることが見られ、腫
瘍組織において調整低下が起こっており（Ｗａｎｇ，Ｊ． ｅｔ ａｔ．、Ｏｎ
ｃｏｇｅｎｅ １９、１８４３−１８４８、２０００；Ｔｓｕｊｉ，Ｔ． ｅｔ
ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６８、
２０−２４、２０００）、さらには増殖においてｗｎｔシグナルの役割を果たす
。

【０００９】 この癌関連性とは別に、ｗｎｔシグナルは発達において基本的な役割を果たし
ている。それゆえに、成人における多くの組織の再改造の過程では、このシグナ
ルカスケードによって影響を受けている。ｗｎｔシグナルは、例えば以下に示す
ような機能を有する。筋発生（Ｃｏｓｓｕ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ
．１８、６８６７−６８７２、１９９９）、心臓形成（Ｊａｓｐａｒｄ，Ｂ．
ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０、２６３−２６７、２０００）、腎臓形
成（Ｖａｉｎｉｏ，Ｓ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．
４３、４１９−４２３、１９９９）、軸系リモデリングおよびシナプス発生なら
びに脳の発達（Ｓａｌｉｎａｓ，Ｐ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．Ｓｙｍｐ．６５、１０１−１０９、１９９９；Ｂｕｒｄｅｎ，Ｓ．Ｊ．
ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １００、４９５−４９７、２０００）。興味深いこと
に、ｗｎｔシグナルは心臓疾患において弱体化しているように見える（Ｓｃｈｕ
ｈｍａｎｎ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４５、７２
０−７２８、２０００）。

【００１０】 ｗｎｔシグナルのもう１つの面は、精神異常とのその可能な関連性である。鬱
病の治療には１００年以上もの間リチウムイオンが用いられている（Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓ，Ｒ．Ｓ．およびＨａｒｗｏｏｄ，Ａ．Ｊ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１、６１−６４、２０００およびその中の参考文献）。こ
の治療の分子作用はまだ知られていないが、細胞キナーゼであるグリコーゲン・
シンターゼ・キナーゼ−３β（ＧＳＫ３β）の阻害が、リチウムイオンの実質的
な標的となっているという証拠は集められている（Ｃｈｅｎ，Ｇ． ｅｔ ａｌ
．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７２、１３２７−１３３０、１９９９）。このキ
ナーゼを完全に阻害することは、ｗｎｔシグナルの主要な作用の１つであり、さ
らに、異常なｗｎｔシグナルが両極的障害に関連するという考えをサポートして
いる。この仮定はさらに間接的な方向からもサポートされており、ｗｎｔシグナ
ル経路のいくつかのメンバーの染色体位置は、双極性障害および統合失調症、同
様に神経発達起源の障害に対する感受性をもつものとして知られている範囲に与
えられている（Ｒｈｏａｄｓ，Ａ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉ
ａｔｒｙ ４、４３７−４４２、１９９９）。ＧＳＫ−３βの機能は、ｗｎｔシ
グナルにおいて阻害され、細胞質において、およびＨＭＧタンパク質グループ（
上記参照）のメンバーに関連する遺伝子発現を促す原子核において、β−カテニ
ンの濃度の上昇を導く。興味深いことに、最近の出版において、細胞質カテニン
濃度は、統合失調症のうち、海馬ＣＡ３およびＣＡ４の小区域において減少する
（Ｃｏｔｔｅｒ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ９、１３７９
−１３８３、１９９８）。

【００１１】 該Ｗｎｔ−８Ｄの生物学的性質を、以降、「Ｗｎｔ−８Ｄの生物学的活性」、
または「Ｗｎｔ−８Ｄ活性」と称する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、
少なくとも１つのＷｎｔ−８Ｄの生物学的活性を示す。

【００１２】 本発明のポリペプチドには、全ての対立遺伝子型およびスプライス変異体を含
む、上記ポリペプチドの変異体もまた含まれる。かかるポリペプチドは、挿入、
欠失、ならびに保存的または非保存的であってもよい置換、あるいはそれらの任
意の組合せによって、基準のポリペプチドから変異している。特に好ましい変異
体は、幾つかの、例えば、５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５
〜３、３〜２、２〜１、または１個のアミノ酸が、任意の組合せで、挿入、置換
または欠失されているものである。

【００１３】 本発明のポリペプチドの好ましいフラグメントには、配列番号：２のアミノ酸
配列に由来する、少なくとも３０、５０または１００個の連続したアミノ酸を有
するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、あるいは配列番号：２のアミノ酸
配列から、少なくとも３０、５０または１００の連続したアミノ酸が末端から除
去または欠失しているアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが含まれる。好ま
しいフラグメントは、Ｗｎｔ−８Ｄの生物学的活性をもたらす、生物学的に活性
なフラグメントであり、類似する活性または改善された活性を有するか、もしく
は望ましくない活性の低下したものも含まれる。また、動物、特に、ヒトにおい
て抗原性または免疫原性である、それらのフラグメントも好ましい。

【００１４】 本発明のポリペプチドのフラグメントは、対応する完全長型ポリペプチドをペ
プチド合成によって製造するために用いることができ；従って、これらの変異体
は、本発明の完全長型ポリペプチドを製造するための中間体として用いることが
できる。本発明のポリペプチドは、「成熟型」タンパク質の形態であってもよく
、あるいは、前駆体または融合タンパク質などの、より大きなタンパク質の一部
であってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、精製に役立つ配列、例え
ば、反復するヒスチジン残基、あるいは組換え生産の間の安定性に利する付加配
列が含まれる、付加的なアミノ酸配列を含むことは、しばしば、有益である。

【００１５】 本発明のポリペプチドは、何れかの好適な方法、例えば、天然に存在する提供
源や、発現システム（下記参照）を含んでなる遺伝子操作された宿主細胞からの
単離、または、例えば、自動化されたペプチド合成機を使用した化学合成によっ
て、あるいは、かかる方法の組合せによって、調製することができる。かかるポ
リペプチドを調製するための手段は、当該分野では十分に理解されている。

【００１６】 さらなる形態において、本発明は、Ｗｎｔ−８Ｄポリヌクレオチドに関する。
かかるポリヌクレオチドには、 （ａ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％、９
６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含
んでなるポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１のポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：１のポリヌクレオチドに対して、少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：１の単離されたポリヌクレオチド； （ｅ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードする
ポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド； （ｆ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含ん
でなるポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードする
ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｉ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列と比較して、０．９５、０．９６
、０．９７、０．９８または０．９９の同一性指標を有するポリヌクレオチド配
列を有するか、または含んでなるポリヌクレオチド； （ｊ）配列番号：２のポリペプチド配列と比較して、０．９５、０．９６、０
．９７、０．９８または０．９９の同一性指標を有するポリペプチド配列をコー
ドするポリヌクレオチド配列を有するか、または含んでなるポリヌクレオチド；
ならびに 上記のポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体である、またはその全長
にわたって、上記のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド が含まれる。

【００１７】 本発明のポリヌクレオチドの好ましいフラグメントには、配列番号：１の配列
に由来する、少なくとも１５、３０、５０または１００の連続した塩基を有する
塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド、あるいは配列番号：１の配列から、少
なくとも３０、５０または１００個の連続した塩基が末端から削除または欠失し
ている配列を含んでなるポリヌクレオチドが含まれる。

【００１８】 本発明のポリヌクレオチドの好ましい変異体には、スプライス変異体、対立遺
伝子変異体、および１つまたは複数の単一塩基多型（ＳＮＰ）を有するポリヌク
レオチドを含む多型体が含まれる。

【００１９】 本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなり、
かつ幾つかの、例えば、５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜
３、３〜２、２〜１、または１個のアミノ酸残基が、任意の組合せで置換、欠失
または付加されているポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドもまた
含まれる。

【００２０】 さらなる形態において、本発明は、本発明のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物である
ポリヌクレオチドを提供する。従って、 （ａ）配列番号：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を
含んでなる； （ｂ）配列番号：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物で
ある； （ｃ）配列番号：１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含んでなる；あるいは （ｄ）配列番号：１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるＲＮＡポリヌクレオチ
ド； ならびにそれらに対して相補的であるＲＮＡポリヌクレオチド が提供される。

【００２１】 配列番号：１のポリヌクレオチド配列は、ＭＭＷＮＴ８ＤＰＴ（Ｂｏｕｉｌｌ
ｅｔ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．、ｄｉｒｅｃｔ ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｂａ
ｎｋ；ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）との相同性を示す。配列番号：１のポリヌクレ
オチド配列は、配列番号：２のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。
配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号：
１の配列をコードするポリペプチドと同一であってもよく、あるいは遺伝子暗号
の縮退（縮重性）の結果によって、同じく配列番号：２のポリペプチドをコード
する、配列番号：１以外の配列であってもよい。配列番号：２のポリペプチドは
、ＭＷＮ８Ｄ＿ＭＯＵＳＥ（Ｂｏｕｉｌｌｅｔ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｃｈ
．Ｄｅｖ．５８、１４１−１５２、１９９６）との相同性および／または構造的
類似性を有する、ｗｉｎｇｌｅｓｓ／ｉｎｔ・ファミリーの他のタンパク質と類
縁している。

【００２２】 本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、それらの相
同的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似する生物学的な機能／性質を
有することが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌ
クレオチドは、少なくとも１つのＷｎｔ−８Ｄ活性を有する。

【００２３】 本発明のポリヌクレオチドは、ヒトの骨髄、脳、結腸、心臓、腎臓、肺、筋、
腎臓、膵臓、前立腺、子宮および胎児の組織の細胞中のｍＲＮＡに由来するｃＤ
ＮＡライブラリーから標準的なクローニング技術およびスクリーニング技術を使
用して取得することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）参照）。本発明のポ
リヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然の供給源から取得
することもでき、あるいは、周知の、市販の手法を使用して合成することもでき
る。

【００２４】 本発明のポリヌクレオチドを、本発明のポリペプチドの組換え製造に使用する
際には、該ポリヌクレオチドは、成熟型ポリペプチドのコード配列、それ自体、
あるいはリーダーまたは分泌配列、プレ−、もしくはプロ−またはプレプロ−タ
ンパク質配列、あるいは、他の融合ペプチド部分をコードするコード配列などの
、他のコード配列と読み枠を合わせた成熟型ポリペプチドのコード配列を含むこ
とができる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にする、マーカー配列がコ
ードされていてもよい。本発明のこの形態の幾つかの好ましい実施態様において
、該マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に提供され
、そしてＧｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，（１９８９）８６：８２１〜８２４に記載されている、ヘキサ・ヒスチ
ジン・ペプチド、あるいはＨＡタグである。該ポリヌクレオチドはまた、転写さ
れる非翻訳の配列、スプライシングならびにポリアデニレーション・シグナル、
リボソーム結合部位、ならびにｍＲＮＡを安定化させる配列などの、非コードの
５’ならびに３’配列を含んでもよい。

【００２５】 配列番号：１のポリヌクレオチド配列に対して、同一であるか、または十分な
同一性を有するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイ
ブリダイゼーション・プローブとして、あるいは核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ
）用のプライマーとして、利用することができる。かかるプローブおよびプライ
マーは、本発明のポリペプチドをコードする完全長型ｃＤＮＡおよびゲノム・ク
ローンを単離するために、ならびに、配列番号：１に対して、高い配列類似性、
典型的には、少なくとも９５％の同一性を有する他の遺伝子（ヒトの供給源に由
来するパラログ、ならびにヒト以外の種に由来するオルソログおよびパラログを
コードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノム・クローンを単離するために
使用してもよい。好ましいプローブおよびプライマーは、一般に、少なくとも１
５塩基、好ましくは少なくとも３０塩基を含み、そして少なくとも１００塩基で
はなくとも、少なくとも５０塩基を有してもよい。特に好ましいプローブは、３
０〜５０塩基を有するであろう。特に好ましいプライマーは、２０〜２５塩基を
有するであろう。

【００２６】 ヒト以外の種に由来するホモログをも含む、本発明のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは、配列番号：１の配列、またはそのフラグメントを有する
、好ましくは少なくとも１５塩基の標識されたプローブを用いて、厳格なハイブ
リダイゼーション条件下で、ライブラリーをスクリーニングする過程；および前
記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長型ｃＤＮＡクローンおよびゲノム・ク
ローンを単離する過程を含んでなる工程によって取得してもよい。かかるハイブ
リダイゼーション技術は、当業者には周知である。好ましい厳格なハイブリダイ
ゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、
１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６
）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸および２０マイクログラム
／ｍｌの変性させた剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中で、４２℃、一晩イ
ンキュベーションし、その後、０．１×ＳＳＣ中で、約６５℃にてフィルターを
洗浄することが含まれる。従って、本発明にはまた、配列番号：１の配列、また
はそのフラグメントを有する、好ましくは少なくとも１５塩基の標識されたプロ
ーブを用いて、厳格なハイブリダイゼーション条件下で、ライブラリーをスクリ
ーニングすることによって取得される、単離されたポリヌクレオチド、好ましく
は少なくとも１００塩基の塩基配列を有する単離されたポリヌクレオチドも含ま
れる。

【００２７】 当業者は、多くの場合において、該ポリペプチドをコードする領域は、５’末
端に至るまで完全には伸長していない点で、単離されたｃＤＮＡ配列は不完全で
あることもあることを理解している。これは、第１鎖のｃＤＮＡ合成の際に、ｍ
ＲＮＡテンプレートのＤＮＡコピーを完成させることができない、逆転写酵素、
すなわち、本来、低い「プロセシング能」（ポリメリゼーション反応の間、テン
プレートに結合した状態を維持する酵素の能力の指標）を有する酵素の結果であ
る。

【００２８】 完全長型ｃＤＮＡを取得する、あるいは短いｃＤＮＡを伸長させるために利用
でき、かつ当業者に周知の方法がいくつかあり、例えば、ｃＤＮＡ端の迅速な増
幅（ＲＡＣＥ）方法に基づく方法がある（例えば、Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ
．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、８９９８〜９００
２、１９８８参照）。例えば、Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標）法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）で例示される、この技術の最近の改良
は、より長いｃＤＮＡの探索を著しく簡単としている。Ｍａｒａｔｈｏｎ（商標
）法では、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡと、その両端に連結された「
アダプター」配列とから、ｃＤＮＡが調製される。その後、遺伝子特異的ななら
びにアダプター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを使用して、ｃ
ＤＮＡの「失われている」５’端を増幅するために、核酸増幅（ＰＣＲ）を実施
する。その後、「ネスティッド（入れこ型）」プライマー、すなわち、増幅産物
の内部にアニーリングするように設計されたプライマー（典型的には、アダプタ
ー配列においてさらに３’側にアニーリングするアダプター特異的なプライマー
、および既知の遺伝子配列においてさらに５’側にアニーリングする遺伝子特異
的なプライマー）を使用して、ＰＣＲ反応を繰り返す。そして、この反応の生成
物をＤＮＡ配列決定によって分析することができ、また、完全な配列を与えるよ
うに、既存のｃＤＮＡに該生成物を直接結合させる、あるいは、５’プライマー
の設計のために新しい配列情報を利用して、別途に完全長のＰＣＲを実施するこ
とのいずれかによって、完全長型のｃＤＮＡを構築することができる。

【００２９】 本発明の組換えポリペプチドは、発現システムを含んでなる遺伝子操作された
宿主細胞から、当該分野で周知の製法によって調製することができる。従って、
さらなる形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数
を含んでなる発現システム、かかる発現システムで遺伝子操作されている宿主細
胞、ならびに、組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。無細胞
翻訳システムもまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用して、かか
るタンパク質を製造するために使用することができる。

【００３０】 組換え製造のために、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドに対する発現シ
ステムまたはその一部を取り込むように、遺伝子操作することができる。ポリヌ
クレオチドは、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．（前述）などの、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されてい
る方法によって宿主細胞中に導入することができる。ポリヌクレオチドを宿主細
胞中に導入する好ましい方法には、例えば、リン酸カルシウム・トランスフェク
ション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクショ
ン、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エ
レクトロポレーション、トランスダクション、スクレイプ負荷、バリスティック
導入または感染が含まれる。

【００３１】 適当な宿主の代表的な例には、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属
、大腸菌、ストレプトミセス属ならびに枯草菌細胞などの細菌細胞；酵母細胞や
アスペルギルス属細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ
ａ）Ｓ２細胞やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３ならびにＢｏｗｅｓ
メラノーマ細胞などの動物細胞；および植物細胞が含まれる。

【００３２】 非常に多様な発現システムを使用することができ、例えば、染色体、エピソー
ムおよびウイルスに由来するシステム、例えば、細菌プラスミド、バクテリオフ
ァージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメ
ント、バキュロウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）、ワクシニアウイル
ス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスやレトロウイルスなどの
ウイルスに由来するベクター、ならびに、コスミドやファージミドなどの、プラ
スミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントから誘導されたものなどの
、それらの組合せに由来するベクターを使用することができる。該発現システム
は、発現を生じさせるとともに、調節をする制御領域を含有してもよい。一般に
、宿主内において、ポリペプチドを生産するためのポリヌクレオチドを維持、増
殖、または発現させることが可能である、システムまたはベクターはいずれも使
用することができる。適切なポリヌクレオチド配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ ｅｔ ａｌ．（前述）中に示されているものなどの、周知で慣用の手法種々
のいずれかによって発現システムに挿入することができる。適当な分泌シグナル
を、小胞体の内腔、ペリプラズム腔または細胞外環境への翻訳タンパク質の分泌
を可能にするために、所望するポリヌクレオチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルは、該ポリペプチドに対して内因性であってもよく、あるいは異種
のシグナルであってもよい。

【００３３】 スクリーニング・アッセイにおいて使用するために、本発明のポリペプチドを
発現させる際には、該ポリペプチドは細胞の表面で産生されることが、一般に好
ましい。この場合、スクリーニング・アッセイにおいて使用するに先立ち、細胞
を集菌してもよい。該ポリペプチドが培地内に分泌される場合には、該ポリペプ
チドの回収および精製を行うため、培地を回収することができる。細胞内で産生
される場合には、ポリペプチドを回収する前に、細胞を予め溶解しなければなら
ない。

【００３４】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、
アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロース・クロマトグ
ラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティー・クロマトグラフィ
、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィおよびレクチン・クロマトグラフ
ィを含む、周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製することが
できる。最も好ましくは、ハイ・パフォーマンス・液体クロマトグラフィが精製
のために使用される。該ポリペプチドが、細胞内合成、単離および／または精製
の間に変性する際には、周知のタンパク質のリフォールディング方法を、活性な
立体配座を再生させるために使用することができる。

【００３５】 本発明のポリヌクレオチドは、関連する遺伝子における変異の検出を通して、
診断試薬として使用することができる。ｃＤＮＡ配列またはゲノム配列において
、配列番号：１のポリヌクレオチドによって特定され、また、機能不全に関連し
ている、変異体型遺伝子の検出は、その遺伝子の過少な発現、過剰発現、あるい
は変更された空間的または時間的な発現に起因する、疾患または疾患に対する感
受性の診断に付加、あるいは、確定させることができる診断ツールを提供する。
遺伝子に変異を有する個体は、当該分野で周知な様々な手法によって、ＤＮＡレ
ベルで検出することができる。

【００３６】 診断に供する核酸は、対象の細胞、例えば、血液、尿、唾液、組織生検または
剖検試料などから得ることできる。ゲノムＤＮＡを、直接、検出のために使用し
てもよく、あるいは、分析に先立ち、ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、または
他の増幅技術を使用して、酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもま
た、同様な手順で使用することができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と
比較して、増幅産物のサイズにおける変化によって検出することができる。点変
異は、増幅されたＤＮＡを、標識されたＷｎｔ−８Ｄの塩基配列に対して、ハイ
ブリダイゼーションさせることによって同定することができる。完全に一致する
配列は、ミスマッチした二重鎖と、ＲＮａｓｅ消化、あるいは融解温度における
差によって、弁別することができる。ＤＮＡ配列の相違はまた、変性剤の存在下
または非存在下での、ゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化
によって、あるいは、直接的なＤＮＡ配列決定によって検出してもよい（例えば
、Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１９８５）２３０：１２４２
参照）。特定の位置における配列の変化もまた、ＲＮａｓｅならびにＳ１保護な
どの、ヌクレアーゼ保護アッセイ、あるいは化学的な切断方法によって、明らか
にすることもできる（Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９８５）８５：４３９７〜４４０１参照）。

【００３７】 Ｗｎｔ−８Ｄのポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含んでなるオ
リゴヌクレオチド・プローブのアレイを、例えば、遺伝子変異の効率的なスクリ
ーニングを行うために構築することができる。かかるアレイは、好ましくは、高
密度のアレイまたは格子状である。アレイ化技術の方法は、周知であり、一般的
な適用性を有しており、また、遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変動性を含
む、分子遺伝学における様々な問題を解明するために使用することができ、例え
ば、Ｍ．Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、６１０〜６１３（
１９９６）およびそれに引用されている他の参考文献を参照する。

【００３８】 異常に、低下または増大しているポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現レベルの
検出もまた、本発明の疾患に対する、被験体の感受性を診断または検出するため
に使用することができる。低下、または増大した発現は、例えば、核酸増幅、例
えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザン・ブロットおよび他の
ハイブリダイゼーション法などの、当該分野で周知の、ポリヌクレオチドの定量
方法のいずれかを使用して、ＲＮＡレベルで測定することができる。宿主に由来
するサンプルにおける、本発明のポリペプチドなどのタンパク質レベルを決定す
るために使用することができるアッセイ手法は、当業者には周知である。かかる
アッセイ方法には、放射免疫アッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタン・ブロ
ット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。

【００３９】 したがって、別の形態において、本発明は、 （ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号：１のヌクレオチド
配列またはそのフラグメントもしくはそのＲＮＡ転写物； （ｂ）（ａ）の配列に対して相補的なヌクレオチド配列； （ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号：２のポリペプチドまた
はそのフラグメント；あるいは （ｄ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号：２のポリペプチドに対す
る抗体 を含んでなる診断キットに関する。

【００４０】 かかるキットの何れにおいても、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は、実
質的な成分を構成することできることは理解される。かかるキットは、疾患また
は疾患に対する感受性、中でも、特に本発明の疾患を診断する際に有用である。

【００４１】 本発明のポリヌクレオチド配列は、染色体局在化の研究に有益である。該配列
は、個々のヒト染色体上の特定位置に対して、特異的に標的化されており、そし
て、ハイブリダイゼーションすることができる。本発明に従って、関連する配列
を染色体にマッピングすることは、それらの配列を遺伝子関連疾患と相関させる
上での、重要な最初の過程である。一度、配列を正確な染色体位置にマッピング
されると、染色体上における該配列の物理的な位置を、遺伝地図データと相関さ
せることができる。かかるデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ、ヒトにお
けるメンデル遺伝（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ大学 Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンラインで利用可能である）中で、見出される
。同じ染色体領域にマッピングされている、遺伝子と疾患と間の関係は、その後
、連鎖解析（物理的に隣り合う遺伝子の同時遺伝）を通して、同定される。ゲノ
ム配列（遺伝子フラグメントなど）に関する、正確なヒト染色体上の局在化は、
放射ハイブリッド（ＲＨ）マッピングを使用して決定することができる（Ｗａｌ
ｔｅｒ，Ｍ．、Ｓｐｉｌｌｅｔｔ，Ｄ．、Ｔｈｏｍａｓ，Ｐ．、Ｗｅｉｓｓｅｎ
ｂａｃｈ，Ｊ．およびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｐ．、（１９９４）、ゲノム全体
の放射ハイブリッド・マップを構築するための方法、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、７、２２〜２８）。多数のＲＨパネルを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、米国）から、例えば、ＧｅｎｅＢｒｉ
ｄｇｅ４ ＲＨパネル（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９６，Ｍａｒ；５
（３）：３３９〜４６、ヒトゲノムの放射ハイブリッド・マップ。Ｇｙａｐａｙ
Ｇ．、Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｋ．、Ｆｉｚａｍｅｓ Ｃ．、Ｊｏｎｅｓ Ｈ．、Ｖ
ｅｇａ−Ｃｚａｒｎｙ Ｎ．、Ｓｐｉｌｌｅｔｔ Ｄ．、Ｍｕｓｅｌｅｔ Ｄ．
、Ｐｒｕｄ’Ｈｏｍｍｅ Ｊ．Ｆ．、Ｄｉｂ Ｃ．、Ａｕｆｆｒａｙ Ｃ．、Ｍ
ｏｒｉｓｓｅｔｔｅ Ｊ．、Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ，Ｊ．およびＧｏｏｄｆｅ
ｌｌｏｗ，Ｐ．Ｎ．）を入手可能である。このパネルを使用して遺伝子の染色体
上の位置を決定するためには、ＲＨ ＤＮＡ上の関心のある遺伝子から設計され
たプライマーを使用して、９３回のＰＣＲが行われる。これらのＤＮＡのそれぞ
れは、ハムスターのバックグラウンド（ヒト／ハムスターのハイブリッド細胞株
）中に維持された、ランダムなヒト・ゲノム・フラグメントを含んでいる。この
ようなＰＣＲは、目的とする遺伝子のＰＣＲ産物の存在または非存在を示す、９
３のスコアをもたらす。これらのスコアは、既知の位置のゲノム配列に由来する
ＰＣＲ産物を使用して作製されたスコアと比較される。この比較は、ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／において行われる。本発明
の遺伝子はヒト染色体５ｑ３１−５ｑ３３（Ｄ５Ｓ５００−Ｄ５Ｓ４３６）にマ
ッピングされている。

【００４２】 本発明のポリヌクレオチド配列はまた、組織発現の研究に対する有益なツール
である。かかる研究は、それらをコードするｍＲＮＡを検出することによって、
コードされたポリペプチドの組織内の発現パターンに関する指標を与える、本発
明のポリヌクレオチドの発現パターンの決定を可能とする。使用される技術は、
当該分野では周知であり、また、ｃＤＮＡマイクロアレイ・ハイブリダイゼーシ
ョン（Ｓｃｈｅｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０、４６７〜４７０
、１９９５およびＳｈａｌｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、６、
６３９〜６４５、１９９６）などの、格子上に配列されたクローンに対する系内
・ハイブリダイゼーション技術、ならびにＰＣＲなどの塩基増幅技術を含む。好
ましい方法は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＴＡＱＭＡＮ（商標）
法を使用する。これらの研究による結果は、生物におけるポリペプチドの正常な
機能の指標を提供する。加えて、ｍＲＮＡの正常な発現パターンと、同じ遺伝子
の別の形態（例えば、潜在的または調節的な変異をコードするポリペプチドにお
ける変化を有するもの）によってコードされるｍＲＮＡの発現パターンとの比較
研究は、本発明のポリペプチドの役割、または疾患におけるその不適切な発現の
役割に対する有益な見識を提供することができる。かかる不適切な発現は、時間
的、空間的または単に量的な性質のものであってもよい。

【００４３】 本発明のポリペプチドは、骨髄、脳、結腸、心臓、腎臓、肺、筋、腎臓、膵臓
、前立腺、子宮および胎児の組織において発現される。

【００４４】 本発明のさらなる形態は、抗体に関する。本発明のポリペプチドまたはそのフ
ラグメント、あるいはそれらを発現している細胞は、本発明のポリペプチドに対
して免疫特異的である抗体を作製するための免疫原として、使用することができ
る。「免疫特異的」の用語は、抗体が、先行技術における他の関連するポリペプ
チドに対するそれらの親和性よりも、本発明のポリペプチドに対して、実質的に
より大きな親和性を有することを意味する。

【００４５】 本発明のポリペプチドに対して生成される抗体は、慣用的なプロトコルを使用
して、該ポリペプチドまたはエピトープ保持したフラグメント、あるいは細胞を
、動物、好ましくは、非ヒト動物に、投与することによって取得することができ
る。モノクローナル抗体の調製には、継代的な細胞株培養物によって産生される
抗体を提供する技術のいずれをも、使用することができる。例には、ハイブリド
ーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ（
１９７５）、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ
（１９８３）、４：７３）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅ
ｔ ａｌ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、７７〜９６、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９
８５）が含まれる。

【００４６】 米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているものなどの、一本鎖抗体を
製造するための技術もまた、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造す
る上で応用することができる。また、トランスジェニック・マウス、あるいは、
他の哺乳動物を含む他の生物を、ヒト化抗体を発現させるために使用してもよい
。

【００４７】 上記の抗体は、該ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するため
に、あるいはアフィニティー・クロマトグラフィによって該ポリペプチドを精製
するために使用してもよい。本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、中で
も、本発明の疾患を治療するために使用することができる。

【００４８】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、ワクチンとして使用す
ることができる。従って、さらなる形態において、本発明は、その疾患が個体に
おいて既に慢性化しているか否かに関わらず、前記動物を疾患から保護するため
に、抗体および／またはＴ細胞免疫応答（例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞また
は細胞傷害性Ｔ細胞を含む）を生じさせるに適する、本発明のポリペプチドを哺
乳動物に接種することを含んでなる、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する
ための方法に関する。哺乳動物における免疫学的応答はまた、本発明にかかる疾
患から前記動物を保護するための抗体を産生するような、かかる免疫学的応答を
誘導するために、ｉｎ ｖｉｖｏで、該ポリヌクレオチドの発現を支配し、かつ
該ポリペプチドをコードしているベクターによって、本発明のポリペプチドを送
達することを含んでなる方法によって誘導してもよい。該ベクターを投与する１
つの方法は、粒子またはそれ以外のものの上へのコーティング物として、所望す
る細胞中へのそれを促進することによる。かかる核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、修飾型核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むことができる。用途に
よって、ワクチン、ポリペプチドまたは核酸ベクターは、通常、ワクチン配合物
（組成物）として提供される。該配合物はさらに、適合するキャリアを含むこと
ができる。ポリペプチドは胃において分解されることもあるため、それは、好ま
しくは非経口的に投与される（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、あるいは皮内注
射）。非経口投与に好適な配合物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、ならびに配
合物を接種者の血液と等張性にする溶質を含んでもよい、水性および非水性の無
菌注射液；ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでもよい、水性および非水性の無
菌懸濁剤が含まれる。該配合物は、単位用量または多回用量容器、例えば、密封
されたアンプルならびにバイアルに入れて提供することができ、また、使用直前
に無菌の液体キャリアを添加するだけでよい、凍結乾燥状態で保存することがで
きる。該ワクチン配合物はまた、水中油型システムや当該分野で既知のその他の
システムなどの、配合物の免疫原性を増強するためのアジュバント・システムを
含むことができる。投与量は、該ワクチンの比活性に依存し、型どおりの実験に
よって容易に決定することができる。

【００４９】 本発明のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の疾患状態、特に、既に記載し
た本発明の疾患に関連している、１つまたはそれ以上の生物学的機能を有する。
従って、該ポリペプチドの機能または濃度を刺激または阻害する化合物を同定す
ることは有用である。従って、さらなる形態において、本発明は、該ポリペプチ
ドの機能または濃度を刺激または阻害する化合物を同定するために、化合物をス
クリーニングする方法を提供する。かかる方法は、上記のような本発明の疾患に
対する治療および予防目的のために使用することができる、アゴニストまたはア
ンタゴニストを同定する。化合物は、様々な供給源、例えば、細胞、無細胞調製
物、化学的ライブラリー、化学化合物のコレクション、および天然産物混合物か
ら同定することができる。このように同定される、かかるアゴニストまたはアン
タゴニストは、場合によっては、ポリペプチド自体の、天然または修飾された基
質、リガンド、受容体、酵素など；その構造的または機能的な模倣体（Ｃｏｌｉ
ｇａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ、１（２）：５章（１９９１）参照）あるいは小分子であってもよ
い。

【００５０】 該スクリーニング方法は、候補化合物に直接的または間接的に連結されている
標識を利用して、該ポリペプチド、あるいは該ポリペプチドまたはその融合タン
パク質を表出している細胞または膜に対する候補化合物の結合を単に測定するこ
とでもよい。代わりに、該スクリーニング方法は、標識された競合剤（例えば、
アゴニストまたはアンタゴニスト）に対して、候補化合物のポリペプチドに対す
る競合的な結合の（定性的または定量的に）測定または検出を含んでもよい。さ
らに、これらのスクリーニング方法では、該ポリペプチドを表出している細胞に
適する検出システムを使用して、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害
によって誘起されるシグナルをもたらすか否かを調べることでもよい。活性化の
阻害剤は、一般には既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして、候補化
合物の存在による、アゴニストによる活性化に対する作用を観測する。さらに、
該スクリーニング方法は、候補化合物を、本発明のポリペプチドを含有する溶液
と混合して、混合体を形成させる工程、混合物におけるＷｎｔ−８Ｄ活性を測定
する工程、および混合物のＷｎｔ−８Ｄを、候補化合物を含有しないコントロー
ル混合物と比較する工程を単に含んでなることでもよい。

【００５１】 本発明のポリペプチドは、従来の低い容量のスクリーニング方法、そして、ま
た、ハイ・スループットなスクリーニング（ＨＴＳ）形態においても、使用する
ことができる。かかるＨＴＳ形態には、十分に確立された、９６−、また、最近
では、３８４−ウエル・マイクロ・タイター・プレートの使用のみでなく、Ｓｃ
ｈｕｌｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４６，２０〜２
９（１９９７）に記載されている、ナノウエル法などの開発途上の方法もまた含
まれる。

【００５２】 既に記載したような、Ｆｃ部分およびＷｎｔ−８Ｄポリペプチドから作製され
るものなどの、融合タンパク質もまた、本発明のポリペプチドに対するアンタゴ
ニストを同定するための、ハイ・スループットなスクリーニング・アッセイのた
めに使用することができる（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、８：５２〜５８（１９９５）；ならびにＫ．Ｊｏｈａ
ｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０（１６）：９４５
９〜９４７１（１９９５）参照）。

【００５３】 スクリーニング技術 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および該ポリペプチドに対する抗
体はまた、細胞内におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に対する、添加さ
れた化合物の影響を検出するためのスクリーニング方法を形成するために使用す
ることができる。例えば、当該分野で公知の標準的な方法によって、モノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体を使用して、ポリペプチドの分泌または細胞結合
している濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを構築することができる。
これは、適当に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害また
は増強することができる薬剤（また、それぞれアンタゴニストまたはアゴニスト
とも呼ばれる）を発見するために使用することができる。

【００５４】 本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の標準的な受容体結合手法を通して
、存在する場合には、膜結合型または可溶性の受容体を同定するために使用する
ことができる。これらには、それに限定されないものの、ポリペプチドを、放射
性同位体（例えば、¹²⁵Ｉ）で標識、化学修飾（例えば、ビオチン化され）、あ
るいは検出または精製に好適なペプチド配列と融合して、そして推定される受容
体の供給源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液）とインキュベーショ
ンする、リガンド結合ならびにクロスリンク・アッセイが含まれる。他の方法に
は、表面プラズモン共鳴および分光測定法などの、生物物理学的技術が含まれる
。これらのスクリーニング方法はまた、存在する場合には、ポリペプチドのその
受容体に対する結合と競合する、該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニ
ストを同定するために使用することができる。かかるアッセイを行うための標準
的な方法は、当該分野では十分に理解されている。

【００５５】 本発明のポリペプチドのアンタゴニストの例には、抗体、あるいは、ある場合
には、該ポリペプチド自体のリガンド、基質、受容体、酵素などに密接に関連す
るオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、場合により、例えば、該リガンド、基
質、受容体、酵素などのフラグメント；あるいは本発明のポリペプチドに結合す
るものの、応答を誘発せず、その結果、ポリペプチドの活性が妨げられる、小分
子が含まれる。

【００５６】 スクリーニング方法はまた、トランスジェニック技術およびＷｎｔ−８Ｄ遺伝
子の使用を含んでもよい。トランスジェニック動物を構築する手法は、十分に確
立されている。例えば、受精した卵母細胞の雌性前核へのマイクロインジェクシ
ョン、移植前または移植後の胚へのレトロウイルス移入、エレクトロポレーショ
ンなどによって、遺伝子操作された胚性幹細胞の宿主胚盤胞への注入を通して、
Ｗｎｔ−８Ｄ遺伝子を導入することができる。特に有用なトランスジェニック動
物は、その動物のゲノム内において、動物の遺伝子がヒトの等価体によって置き
換えられている、所謂「ノック・イン」動物である。ノック・イン・トランスジ
ェニック動物は、医薬探索のプロセスにおいて、化合物はヒトの標的に対して特
異的であるという、標的の妥当性検証用に有用である。他の有用なトランスジェ
ニック動物は、内因性ＤＮＡ配列によってコードされている、本発明のポリペプ
チドに対する動物オルソログの発現が細胞内で部分的または完全に無効とされて
いる、所謂「ノック・アウト」動物である。遺伝子のノック・アウトは、技術の
限界の結果として、特異的な細胞または組織を対象とする、特定の細胞または組
織においてのみ起きていてもよく、あるいは、動物内の全て、または実質的に全
ての細胞において生じてもよい。トランスジェニック動物の手法はまた、導入さ
れた遺伝子が、本発明のポリペプチドを大量に供するために発現させられる動物
全体の発現−クローニング・システムを提供する。

【００５７】 上記の方法において使用されるスクリーニング・キットは、本発明のさらなる
形態をなす。かかるスクリーニング・キットは、 （ａ）本発明のポリペプチド； （ｂ）本発明のポリペプチドを発現している組換え細胞； （ｃ）本発明のポリペプチドを発現している細胞膜；または （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体； を含んでなり、好ましくは、前記のポリペプチドは、配列番号：２のものである
。

【００５８】 かかるキット何れの中においても、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は、
実質的な構成要素を構成することは理解される。

【００５９】 （用語集） 下記の定義は、本明細書中で既に頻繁に使用されているいくつかの用語の理解
を容易にするために提供される。

【００６０】 本明細書中に用いられる「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗
体、キメラ、一本鎖、ならびにヒト化抗体、同様に、Ｆａｂフラグメントをも包
含し、Ｆａｂまたは他の免疫グロブリンの発現ライブラリー生成物をも包含する
。

【００６１】 「単離（された）」は、その天然の状態から、「ヒトの手によって」変化して
いること、すなわち、自然界に存在する場合、その本来の環境から変化、または
移動されているか、あるいは、その両方であることを意味する。例えば、生きた
生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離」され
てはいないが、その天然状態の共存物質から分離された、同じポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、この用語の本明細書中での用法に従うと、「単離」され
ている。さらに、形質転換、遺伝子操作、または何らかの他の組換え方法によっ
て、生物中に導入されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その生物
が生存または非生存かのいずれでも、前記生物中に依然として存在している場合
でさえ、「単離」されている。

【００６２】 「ポリヌクレオチド」は、一般には、非改変型または改変型のＲＮＡあるいは
ＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオ
キシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を指す。「ポリヌクレオチド」には、限定では
ないものの、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域の混合物であ
るＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖と二本鎖の領域の混合
物であるＲＮＡ、一本鎖、または、より典型的には、二本鎖の、あるいは、一本
鎖と二本鎖の領域の混合物であってもよい、ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハ
イブリッド分子が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤ
ＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含んでなる三重鎖領域をもいう。用語
「ポリヌクレオチド」はまた、１つまたは複数の修飾された塩基を含有するＤＮ
ＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾（された）」塩基には、例えば、トリチル化
された塩基、ならびに、イノシンなどの非通常型の塩基が含まれる。様々な修飾
をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができ、従って、「ポリヌクレオチド」
は、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態と同様に、
自然界に典型的に見出されるような、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または
代謝的に修飾された形態をも包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしば
オリゴヌクレオチドと称される、比較的短いポリヌクレオチドをも包含する。

【００６３】 「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち
、ペプチド等配電子体）によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含んで
なるポリペプチドのいずれをも指す。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペ
プチドまたはオリゴマーと広く呼ばれる短い鎖、ならびに、一般にはタンパク質
と呼ばれる、より長い鎖の双方ともをいう。ポリペプチドは、遺伝子によってコ
ードされる２０種のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することができる。「ポ
リペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、あるいは当該分
野で周知の化学的な修飾方法のいずれかによって、修飾がなされたアミノ酸配列
が含まれる。かかる修飾は、基本的な教本、およびより詳細な専門書、ならびに
数多くの研究文献中に、広く記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸
側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド内のいずれ
の位置に生じさせることもできる。同じタイプの修飾が、所与ポリペプチド内の
いくつかの部位に同じ程度または異なる程度で存在してもよいことが理解される
。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含んでもよい。ポリペプ
チドは、ユビキチン化の結果として分枝がなされてもよく、また、分枝を有する
、または有していない、環状であってもよい。環状、分枝状および分枝した環状
のポリペプチドは、翻訳に続く天然のプロセスに起因しても、あるいは合成的方
法によって作製されてもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボ
シル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌ
クレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有
結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、クロス・リンク形成、環化、ジス
ルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピ
ログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰ
Ｉ・アンカー形成、ヒドロキシ化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化
、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質へのトランスファー・Ｒ
ＮＡ媒介付加、ならびユビキチン化が含まれる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第
２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｗｏｌｄ，Ｆ．、翻訳後のタンパク質
修飾：全体像および展望、１〜１２、Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ
Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．
Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１
９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、「タンパク質修飾および非タンパク質
補助因子の分析」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２、６２６〜６４６、１９
９０；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．、「タンパク質合成：翻訳後修飾およびエー
ジング」、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６３、４８〜６２、１９９２
参照）。

【００６４】 ポリペプチド配列の「フラグメント」は、基準の配列よりも短いものの、基準
となるポリペプチドと同一の生物学的な機能または活性を本質的に保持している
ポリペプチド配列をいう。ポリヌクレオチド配列の「フラグメント」は、配列番
号：１の基準配列よりも短いポリヌクレオチド配列をいう。

【００６５】 「変異体」は、基準となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるも
のの、その本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを
いう。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、基準となるポリヌクレオチドに対
して、塩基配列に相違がある。変異体の塩基配列における変異は、基準となるポ
リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させて
も、させなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、下記に説明するように、基準の
配列によってコードされるポリペプチド中における、アミノ酸の置換、付加、欠
失、融合および末端の短縮化を引き起こしてもよい。ポリペプチドの典型的な変
異体は、基準となるポリペプチドに対して、アミノ酸配列に相違がある。一般に
、改変は、基準となるポリペプチドおよび変異体の配列が全体的には非常に類似
し、そして多くの領域において同一となるように制限される。変異体ならびに基
準となるポリペプチドは、アミノ酸配列において、１つまたは複数の置換、挿入
、欠失の任意の組合せによって相違してもよい。置換または挿入されるアミノ酸
残基は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸残基であっても、なくても
よい。典型的な、保存的置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ； Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ
； Ａｓｐ、Ｇｌｕ； Ａｓｎ、Ｇｌｎ； Ｓｅｒ、Ｔｈｒ； Ｌｙｓ、Ａｒｇ
； ならびにＰｈｅおよびＴｙｒが含まれる。ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの変異体は、対立遺伝子などの天然に存在するものであってもよく、あるい
は天然では存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの天然には存在しない変異体は、変異誘発方法によって
、あるいは直接合成によって作製することもできる。また、１つまたは複数の翻
訳後の修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化
などを有するポリペプチドも、また変異体には含まれる。実施態様には、Ｎ末端
アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化、ならびにＣ末端グリ
シンの修飾が含まれる。

【００６６】 「対立遺伝子」は、ゲノム中の所与の遺伝子座に存在する遺伝子の、２つまた
はそれ以上の選択的な形態の１つをいう。

【００６７】 「多型」は、集団内における、ゲノムにおける所与の位置における塩基配列（
仮に関連する場合には、コードされるポリペプチド配列）の変動をいう。

【００６８】 「単一塩基多型」（ＳＮＰ）は、集団内においてゲノム内の１つの塩基位置に
おける、塩基変動の発生をいう。ＳＮＰは、遺伝子内で、あるいはゲノムの遺伝
子間領域内で起こってもよい。ＳＮＰは、対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）を使
用してアッセイすることができる。該プロセスには、少なくとも３つのプライマ
ーが必要とされる。共通プライマーが、アッセイされる多型に対して、逆方向に
相補となるように使用される。この共通プライマーは、多型な塩基から５０ｂｐ
から１５００ｂｐの間で隔たったものとできる。それ以外の２つ（またはそれ以
上）のプライマーは、最後の３’塩基が、多型を構成する２つ（またはそれ以上
）の対立遺伝子の１つと一致するように変化している点を除いて、互いに同一で
ある。そして、それぞれ、共通プライマーおよび１つの対立遺伝子特異的プライ
マーを使用して、２つ（またはそれ以上）のＰＣＲ反応を、サンプルＤＮＡにつ
いて行う。

【００６９】 本明細書中で使用されている「スプライス変異体」は、同じゲノムＤＮＡ配列
から一旦転写され、ただし、択一的なＲＮＡスプライシングを受けている、ＲＮ
Ａ分子から作製されたｃＤＮＡ分子をいう。択一的なＲＮＡスプライシングは、
一般には、イントロンを除くために、一次ＲＮＡ転写物がスプライシングを受け
る際に生じ、それぞれ、異なるアミノ酸配列をコードしてもよい、１つ以上のｍ
ＲＮＡ分子の産生を引き起こす。スプライス変異体の用語はまた、上記のｃＤＮ
Ａ分子によってコードされるタンパク質をもいう。

【００７０】 「同一性」は、その配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリ
ペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間における相互関係を反
映している。一般に、同一性は、対比がなされている配列の長さにわたって、２
つのポリヌクレオチド配列、あるいは２つのポリペプチド配列の、それぞれ塩基
毎またはアミノ酸毎の厳密な一致をいう。

【００７１】 「％同一性」−正確な一致が存在しない配列については、「％同一性」を決定
することができる。一般に、対比すべき２つの配列を、配列間で最大の相関を与
えるようにアラインメントされる。これには、アラインメントの程度を高めるた
めに、「ギャップ」をいずれか一方の配列または両方の配列に挿入することを含
んでもよい。％同一性は、比較されている配列のそれぞれの全長にわたって、決
定してもよく（所謂、全体的なアラインメント）、同じ長さまたは非常に類似す
る長さの配列に対して、特に適している；あるいは、より短い、限定された長さ
にわたって、決定してもよく（所謂、局所的なアラインメント）、不ぞろいな長
さの配列において、より好適である。

【００７２】 「類似性」は、２つのポリペプチド配列の間における関係に対する、より精巧
な、さらなる尺度である。一般に、「類似性」は、残基毎に基づき、（同一性に
関してと、同様に）比較されている配列それぞれからの、相互に対をなす残基間
における正確な一致だけでなく、正確な一致が存在しない場合にも、進化的な基
準に基づいて、１つの残基は、他方に対する適当な置換であるかどうかをも考慮
する、２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間での比較を意味する。この蓋然性は、
付随した「スコア」を有し、２つの配列の「％類似性」は、それに基づき決定す
ることができる。

【００７３】 ２つ以上の配列の同一性および類似性を比較するための方法は、当該分野では
周知となっている。従って、例えば、ウイスコンシン配列分析パッケージ バー
ジョン ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２、３８７〜３９５、１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）中の
利用可能なプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ およびＧＡＰ プログラムを
、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、ならびに２つのポリペプチド配列間の
％同一性および％類似性を決定するために使用してもよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、
ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの「局所的相同性」アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．、１４７、１９５〜１９７、１９８１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、２、４８２〜４８９、１９８１）
を使用して、２つの配列間における、類似性の最も良い１つの領域を見出す。Ｂ
ＥＳＴＦＩＴは、長さが類似していない２つのポリヌクレオチド配列または２つ
のポリペプチド配列の比較に対してより適しており、該プログラムは、より短い
配列は、より長いものの一部を表すことを仮定している。一方、ＧＡＰは、Ｎｅ
ｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、
４８、４４３〜４５３、１９７０）に従って、「最大の類似性」を見出しつつ、
２つの配列をアラインメントする。ＧＡＰは、ほぼ同じの長さであり、また、ア
ラインメントが長さ全体にわって期待される配列の比較に対してより適している
。好ましくは、比較されるものを、最適にアラインメントするための、各プログ
ラムにおいて使用される「ギャップ加重」および「長さ加重」のパラメーターは
、それぞれ、ポリヌクレオチド配列に対しては、５０および３であり、ポリペプ
チド配列に対しては、１２および４である。好ましくは、比較されている２つの
配列を最適にアラインメントした上で、％同一性および類似性を決定する。

【００７４】 配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた
、当該分野では知られており、例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Ａ
ｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、
４０３〜４１０、１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３８９〜３４０２、１９９７；Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）か
ら入手することができ、またｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣ
ＢＩのホームページからアクセス可能である）、およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓ
ｏｎ ＷＲ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３、６３〜９
９、１９９０；Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５、２４４４〜２４４８、１９８
８；ウイスコンシン配列分析パッケージの一部として入手可能である）。

【００７５】 好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２ アミノ酸置換行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ
ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８９、１０９１５〜１０９１９、１９９２）を、比較の前に、ヌクレオチド
配列をアミノ酸配列に予め翻訳する場合をも含み、ポリペプチド配列の比較にお
いて使用する。

【００７６】 好ましくは、プログラム ＢＥＳＴＦＩＴが、基準とするポリヌクレオチドま
たはポリペプチド配列に関して、検討するポリヌクレオチドまたはポリペプチド
配列の％同一性を決定するために使用され、前記のように、検討と基準とする配
列とは、最適にアラインメントされ、また、プログラムのパラメーターは、暫定
の値に設定されている。

【００７７】 「同一性指標」は、候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）と基準
の配列とを比較するために使用することができる、配列関連性の尺度である。す
なわち、例えば、基準とするポリヌクレオチド配列と比較して、例えば０．９５
の同一性指標を有する候補ポリヌクレオチド配列は、該候補ポリヌクレオチド配
列は、基準の配列の各１００塩基あたり平均して５個までの相違を含んでもよい
点を除いて、基準の配列と同一である。かかる相違は、少なくとも１つの塩基欠
失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる
群から選択される。これらの相違は、基準となるポリヌクレオチド配列の５’ま
たは３’末端部位に、あるいはこれら末端部位の間の任意な位置で、基準配列内
の塩基間に個々に、あるいは基準配列内において１つまたは複数の連続した群中
で点在して、起こってもよい。換言すると、基準となるポリヌクレオチド配列と
比較した際、０．９５の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を得るために
は、既に記載したように、基準配列内の塩基１００個毎に、平均して５個までが
、任意の組合せで、欠失、置換または挿入されていてもよい。同じことが、同一
性指標の他の値、例えば、０．９６、０．９７、０．９８および０．９９につい
ても、必要に応じて変更して適用される。

【００７８】 同様に、ポリペプチドの場合には、基準のポリペプチド配列と比較したときに
、例えば、０．９５の同一性指標を有する候補ポリペプチド配列は、基準の配列
の各１００アミノ酸あたり、平均して５個までの違いを該ポリペプチド配列が含
んでもよいことを除いて、基準の配列と同一である。かかる相違は、少なくとも
１つのアミノ酸の欠失、保存的ならびに非保存的な置換を含む置換、または挿入
からなる群から選択される。これらの相違は、基準となるポリペプチド配列のア
ミノ末端またはカルボキシ末端部位に、あるいはこれら末端部位間の任意の位置
に、基準配列内のアミノ酸間に個々に、あるいは基準配列内において１つまたは
複数の連続した群中に点在して、起こってもよい。換言すると、基準のポリペプ
チド配列と比較した際、０．９５の同一性指標を有するポリペプチド配列を得る
ためには、既に記載したように、基準配列内のアミノ酸の１００個毎に、平均し
て５個まで、任意の組合せで、欠失、置換または挿入がなされてもよい。同じこ
とが、同一性指標の他の値、例えば、０．９６、０．９７、０．９８および０．
９９についても、必要に応じて変更して適用される。

【００７９】 塩基またはアミノ酸の相違数と同一性指標との関係は、下記の式で表記でき、
ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・Ｉ） 式中、 ｎ_aは、塩基またはアミノ酸の相違数であり、 ｘ_aは、配列番号：１あるいは配列番号：２における塩基またはアミノ酸のそ
れぞれの総数であり、 Ｉは、同一性指標であり、 ・は、乗算演算子に対する記号であり、 その際、ｘ_aとＩとの非整数の積は、ｘ_aから減ずるに先立ち、最も近い整数に
切り捨てられる。

【００８０】 「ホモログ」は、基準の配列に対して、高度の配列関連性を有するポリヌクレ
オチド配列またはポリペプチド配列を示すために、当該分野で使用されている一
般的な用語である。かかる関連性は、既に定義されているように、２つの配列間
の同一性および／または類似性の程度を決定することによって、定量化すること
もできる。この総称的な用語には、「オルソログ」および「パラログ」の用語が
含まれる。「オルソログ」は、別の種中における、該ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの機能的等価体であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
「パラログ」は、機能的に類似している、同じ種内にあるポリヌクレオチドまた
はポリペプチドをいう。

【００８１】 「融合タンパク質」は、２つの、関連しない、融合された遺伝子またはそのフ
ラグメントによってコードされるタンパク質をいう。その例が、米国特許第５５
４１０８７号、米国特許第５７２６０４４号に開示されている。Ｆｃ−Ｗｎｔ−
８Ｄの場合、融合タンパク質の一部として、免疫グロブリンのＦｃ領域の使用は
、治療に使用する際のかかる融合タンパク質の薬物動態学的性質を改善するため
、ならびに、二量体型のＷｎｔ−８Ｄを形成させるために、Ｆｃ−Ｗｎｔ−８Ｄ
または該Ｗｎｔ−８Ｄの断片の機能的発現を行う上で好都合である。Ｆｃ−Ｗｎ
ｔ−８ＤのＤＮＡ構築物は、５’から３’の方向に、分泌カセット、すなわち、
哺乳動物細胞からの細胞外への輸送を誘起するシグナル配列、融合パートナーと
して、免疫グロブリンのＦｃ領域フラグメントをコードするＤＮＡ、およびＷｎ
ｔ−８ＤをコードするＤＮＡまたはその断片を含んでなる。ある用途では、融合
タンパク質の残部には手を触れることなく、機能的なＦｃ側を変異させ、その固
有的な機能的性質（補体結合、Ｆｃ受容体結合）を変える、あるいは発現後にＦ
ｃ部分を完全に除くことを可能とすることが望ましい。

【００８２】 特許および特許出願に限らず、これらを含む、本明細書中で引用されている刊
行物および参考文献の全ては、十分に述べているように、個々の刊行物または参
考文献を、参照して組み込むために、明示的かつ個別的に示唆されているように
、その全部を、参照することで、本明細書中に組み込まれる。本出願が優先権を
主張する特許出願はいずれも、先に刊行物および参考文献に関して記載したと同
様に、その全部を、参照することで、本明細書中に組み込まれる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８４ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/543 ５４５Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 48/00 33/543 ５４５ Ａ６１Ｐ 9/00 // Ａ６１Ｋ 38/00 9/08 48/00 11/00 Ａ６１Ｐ 9/00 11/06 9/08 13/12 11/00 17/02 11/06 21/00 13/12 25/18 17/02 25/24 21/00 25/28 25/18 35/00 25/24 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 25/28 5/00 Ａ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250， Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 デュエッケル、 クラウス ドイツ連邦共和国 64291 ダルムシュタ ット エッテステルシュトラーセ ５ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA09 CA12 GA11 HA01 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ08 QQ20 QQ53 QR32 QR56 QR77 QS34 QS36 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC24 DA01 4B065 AA19X AA26X AA49X AA50X AA53X AA60X AA72X AA88X AA90X AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA06 AA07 AA13 AA14 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 BA35 CA18 CA53 CA56 NA14 ZA022 ZA122 ZA182 ZA362 ZA392 ZA592 ZA812 ZA892 ZA942 ZB212 ZB262 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71 FA74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：１の配列を含んでなるポリヌクレオチドに
   よってコードされるポリペプチド； （ｂ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％の同一性
   を有するポリペプチド配列を含んでなるポリペプチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％の同一性
   を有するポリペプチド； （ｄ）配列番号：２のポリペプチド配列、および （ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載のかかるポリペプチドのフラグメントおよび変異
   体 からなる群から選択されるポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号：２のポリペプチド配列を含んでなる、請求項１に
   記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号：２のポリペプチド配列である、請求項１に記載の
   ポリペプチド。
4. 【請求項４】 （ａ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列に対して、少な
   くとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオ
   チド； （ｂ）配列番号：１のポリヌクレオチドに対して、少なくとも９５％の同一性
   を有するポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％の同一性
   を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるポリ
   ヌクレオチド； （ｄ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％の同一性
   を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌク
   レオチド、 （ｅ）配列番号：１の配列または少なくとも１５塩基長を有するそのフラグメ
   ントを有する、標識されたプローブを用いて、厳格なハイブリダイゼーション条
   件下でライブラリーをスクリーニングすることによって得られる、少なくとも１
   ００塩基長の塩基配列を有するポリヌクレオチド； （ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドのＲＮＡ等価体であるポリヌクレオ
   チド； （ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの前記ポリヌクレオチドに対して相補的
   なポリヌクレオチド配列、および （ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つのポリヌクレオチドの変異体またはフラ
   グメントであるか、あるいは前記のポリヌクレオチドに対して、その全長にわた
   って相補的であるポリヌクレオチド からなる群から選択されるポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 （ａ）配列番号：１のポリヌクレオチドを含んでなるポリヌ
   クレオチド； （ｂ）配列番号：１のポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含ん
   でなるポリヌクレオチド、および （ｄ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド からなる群から選択される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 該発現ベクターが適合性宿主細胞に存在する際、請求項１〜
   ３のいずれか一項に記載されるポリペプチドの生産が可能なポリヌクレオチドを
   含んでなる発現システム。
7. 【請求項７】 請求項１〜３のいずれか一項に記載されるポリペプチドを発
   現している、請求項６に記載される発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞ま
   たはその膜。
8. 【請求項８】 請求項１〜３のいずれか一項に記載されるポリペプチドを製
   造するための方法であって、 請求項７に記載される宿主細胞を前記ポリペプチドの産生に十分な条件下で培養
   して、該培養培地から該ポリペプチドを回収する工程を含んでなる方法。
9. 【請求項９】 免疫グロブリンのＦｃ領域と請求項１〜３のいずれか一項に
   記載されるポリペプチドとからなる融合タンパク質。
10. 【請求項１０】 請求項１〜３のいずれか一項に記載されるポリペプチドに
    対して免疫特異的な抗体。
11. 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれか一項に記載されるポリペプチドの
    機能または濃度を刺激または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方
    法であって、 （ａ）該ポリペプチド（または該ポリペプチドを発現している細胞もしくは膜
    ）あるいはその融合タンパク質に対する、候補化合物の結合を、該候補化合物に
    直接的または間接的に結合している標識によって、定量的または定性的に測定ま
    たは検出すること； （ｂ）標識された競合剤の存在下で、該ポリペプチド（または該ポリペプチド
    を発現している細胞あるいは膜）あるいはその融合タンパク質に対する、候補化
    合物の結合の競合を測定すること； （ｃ）該ポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを、該候補
    化合物がもたらすか否かを、該ポリペプチドを発現している細胞または細胞膜に
    適合している検出システムを使用して試験すること； （ｄ）候補化合物を、請求項１〜３のいずれか一項に記載されるポリペプチド
    を含有する溶液に混合して、混合物を作製し、該混合物中の該ポリペプチドの活
    性を測定し、そして、何らの候補化合物をも含有しないコントロールの混合物に
    対して、該混合物の活性を比較すること、または （ｅ）細胞中における前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたは前記ポリ
    ペプチドの産生に対する候補化合物の作用を、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを使
    用して検出すること、 からなる群から選択される方法と、 （ｆ）生物工学的または化学的な標準的な手法に従って、前記化合物を製造す
    ること とを含んでなる方法。